技术领域
本发明涉及费城染色体阳性(Ph+)白血病包括慢性髓样白血病的治疗方法， 特别地，本发明涉及用于这种骨髓增殖性疾病治疗的联合治疗。
背景技术
许多白血病类型，包括慢性髓样白血病(CML)和急性淋巴细胞白血病(ALL) 可以表现出被称为费城染色体(Ph)的染色体异常。这种异常由t(9；22)(q34； q11)的特异相互易位产生，其融合了9号染色体的埃布尔森激酶基因(ABL)与 22号染色体的断点簇区(BCR)基因，导致BCR-ABL蛋白质产物：组成性激活 的酪氨酸激酶2。BCR-ABL通过几个细胞内的信号转导途径促进细胞的存活和增 殖，并参与疾病中的恶性转化(参见Savona M和Talpaz M.Nature Reviews Cancer，May 2008)。
BCR-ABL酪氨酸激酶分子结构和疾病机制的知识引起了酪氨酸激酶抑制剂 (TKIs)的开发，也许是源于转化医学的迄今最成功的结果。伊马替尼(如甲磺 酸伊马替尼；格列维克或格列卫；诺华，巴塞尔，瑞士)是有效用于CML患者 的第一种TKI。20世纪90年代末将其引进到临床医药后，CML的自然病程对许 多患者已变得非常顺利。而且，由于靶向治疗的相对准确性，TKI治疗将对正 常细胞的间接影响降到最低。然而，即使有这样的成功，伊马替尼治疗往往不 是治愈性的，起抑制作用但不能消除疾病。
此外，由于耐药或不耐受，并非所有患者均能受益于伊马替尼。因此，开 发了另外两种TKIs，达沙替尼(Sprycel；百时美施贵宝)和尼洛替尼(Tasigna； 诺华)。达沙替尼是325倍伊马替尼体外效力的BCR-ABL抑制剂，并能抑制Src 家族激酶。尼洛替尼是具有增强的BCR-ABL特异性的伊马替尼类似物。然而， 在这个时候伊马替尼作为第一线CML治疗选择TKI的地位是建立在这种药物几 乎不产生明显副作用上的。副作用的问题是非常重要的，因为CML患者通常需 要长期依赖伊马替尼，由于其并不总能治愈CML，而只是在连续服用(例如， 每天)的基础上仅仅稳定病情。
据认为，伊马替尼和其它TKIs是一种慢性或长期治疗的原因是，尽管TKIs 在消减细胞方面有效，但白血病干细胞对这些TKIs不太敏感，并且，已揭示这 反映了这些干细胞在相关突变BCR-ABL的要求下降。表现为难以应用伊马替尼 进行TKI治疗的原始Ph+白血病干细胞提供了BCR-ABL突变的避难所，并在缺 乏TKIs的情况下将这种突变传递给其后代，从而保持这种疾病。由于费城染色 体以及随之的白血病细胞功能失调的分子生物学已经阐明，后代白血病细胞中 的“干性(stemness)”性质已被确认。
因此，仍然有必要开发降低TKIs局限性，诸如长期应用需要以及TKI抗性 和TKI不耐受发展的治疗方案。
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发明概述
一方面，本发明提供了用于治疗Ph+白血病患者的方法，所述方法包括给 患者施用：(i)BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂，和(ii)选择性结合在Ph+白血病 干细胞的细胞表面受体上表达的药物。
另一个方面，本发明提供(i)BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂，和(ii)选择性 结合在Ph+白血病干细胞的细胞表面受体上表达的药物在Ph+白血病患者治疗 或药剂制备中的应用。
本发明还提供了用于治疗Ph+白血病患者的药物，其包括(i)BCR-ABL酪 氨酸激酶抑制剂，和(ii)选择性结合被Ph+白血病干细胞表达的细胞表面受体 的药物。
又一个方面，本发明还提供了试剂盒，其包含(i)BCR-ABL酪氨酸激酶抑 制剂，和(ii)选择性结合在Ph+白血病干细胞的细胞表面受体上表达的药物； 以及任选的(iii)依照用于患者Ph+白血病治疗的方法施用所述酪氨酸激酶抑 制剂和所述药物的说明书。
附图说明
图1是应用3例患者的CML样本，观察在各种细胞培养条件下细胞p-STAT5 水平实验的图解。在这些实验中使用的CD123抗体是7G3(人IL-3Rα的鼠源抗 体)。
图2是图1所示数据的图形表示(注意，为辅助演示，涉及到以下组的数 据未在图1的流式细胞图中显示：IL-3联合BM4)。
图3表明了基于4例患者的与图1所述相类似的实验。在这些实验中使用 的抗体是CSL362，具有增强的Fc效应功能的人源化7G3。
图4是图3所示数据的图形表示(注意，为辅助演示，涉及到以下组的数 据末在图3的流式细胞图中表明：IL-3联合BM4；IL-3联合CSL362；以及IL-3 联合达沙替尼和BM4)。
图5是图2和图4数据相组合的图形表示。
图6是表明在以GM-CSF刺激的KU812细包系中，应用命名为BION-1的抗 体阻断β-common受体(CD131)，在pSTAT5水平上的图解表示。KU812是一种由 处于CML原始细胞危象患者的外周血建立的髓样前体细胞株。
发明详述
本发明基于Ph+白血病干细胞亚群能够通过添加经BCR-ABL的酪氨酸激酶 (TK)活化而存活的实现。作为结果，这种干细胞亚群被抑制但不被诸如伊马替 尼的BCR-ABL抑制剂杀死。
此外，伊马替尼和其它TKIs抗性的发展是Ph+白血病特别是CML治疗中一 个逐步增长的临床问题，其中通常需要长期连续施用TK1以稳定病情(参见 Bhalla等人的美国专利7799788)。
这导致符合本发明的治疗方案的开发，其将伊马替尼的直接抗白血病效应 与能够根除Ph+白血病干细胞的药物相组合。这种方法靶向所谓的“异常细胞 的储藏库”，其在应用TKIs的Ph+白血病治疗期间残留，并且如果TKI治疗停 止，导致这种疾病再现。
因此，在通往本发明的工作中，已开发了涉及选择性结合表达在Ph+白血 病干细胞表面受体药物的应用的联合治疗，特别是在Ph+白血病治疗中，通过 涉及经由Ph+白血病干细胞中白细胞介素3(IL-3)、粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)和/或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)中至少一种的信号途径 的受体的结合，与TKI联合。
白细胞介素3(IL-3)是一种刺激造血细胞从多个谱系生产的细胞因子， 并且在对某些寄生虫感染的宿主防御中也有重要作用。IL-3刺激多能造血干细 胞(多能)分化成髓样祖细胞以及刺激髓样细胞包括嗜酸性粒细胞、单核细胞、 嗜碱性粒细胞和B细胞增殖。IL-3主要由响应免疫刺激的活化T淋巴细胞产生 和分泌。
IL-3通过结合一个被称为白细胞介素3受体(IL-3R)的特定细胞表面受 体发挥其活性。IL-3R是一个由70kDa的IL-3Rα(CD 123)和120-140kDa 的共用β链(也被称为IL-3Rβ或CD131)组成的异二聚体结构。IL-3Rα链有一 个非常短的胞内结构域而所述共用β链有一个非常大的细胞质域。IL-3Rα以相 对较低的亲和力结合IL-3。然而，在共用β链的存在下，IL-3Rα具有相对较高 的对IL-3的亲和力。尚不清楚IL-3结合后信号转导如何发生，但是最近的研 究表明，信号转导需要形成一个高阶的包含脱氧十二核苷酸(dodecamer)的复 合物。所述共用β链也为IL-5和GM-CSF受体所拥有。已知表达IL-3受体的细 胞包括正常的造血祖细胞以及各种造血谱系更加成熟的细胞包括单核细胞、巨 噬细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和CD5+B细胞亚群。非造血 细胞也已表明表达所述受体，包括一些内皮细胞、基质细胞、树突状细胞和睾 丸间质细胞。
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)通过与一个特定的细胞表面受体G-CSF受体 (G-CSF-R)(CD114)相互作用，刺激中性粒细胞前体增殖和分化。所述G-CSF-R 已被克隆，并在数种不同类型细胞中功能活跃。据信，G-CSF-R是由单链组成， 所述单链通过配体诱导的同型二聚活化，如同促红细胞生成素和生长激素受体 (EPO-R，GH-R)显示的那样。C-CSF-R不包含内在的蛋白激酶结构域，虽然酪 氨酸激酶活性似乎是G-CSF信号转导所需的。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是多种造血祖细胞(包括中性粒 细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞和红系细胞的那些祖细胞)的生长 和分化因子，也可以功能性激活成熟中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞。 GM-CSF的所有行为被认为是通过GM-CSF与特定细胞表面受体的相互作用介导 的。这些受体由一个特定的以低亲和力结合GM-CSF的α链GM-CSFRα(CD116)， 和一个自身不能以可检测到的亲和力结合GM-CSF的共用β链(CD131)组成， 并且与白细胞介素-3和IL-5受体(如上所述)共享α链。所述α-β复合物产 生GM-CSF的高亲和力结合位点，并且为细胞信号转导所需。
本发明的联合治疗的优点是，它通过提供以选择性结合表达于Ph+白血病 干细胞的细胞表面受体的药物(诸如单克隆抗体)治疗患者的疗法解决了应用 TKI单一疗法相关的问题，如耐药性问题。另一个优势是，许多患者不能忍受 应用诸如那些应用于本发明联合治疗的TKIs或抗体的长期治疗，这种联合治疗 方法可以减少TKIs或抗体施用给患者的时间过程。
一方面，本发明提供了用于治疗患者Ph+白血病的方法，所述方法包括给 患者施用(i)BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂，和(ii)选择性结合表达于Ph+白血病 干细胞的细胞表面受体的药物。
所述患者可以是人类。
所述Ph+白血病可选自慢性髓样白血病(CML)、急性淋巴样白血病(ALL) 和急性髓样白血病(AML)。更特别的，Ph+白血病可以是慢性髓样白血病(CML)。
此处提到的“治疗”应当在其最广义的语境内考虑。术语“治疗”并不一 定意味着治疗患者直至康复。因此，治疗包括患者Ph+白血病症状的减少或改 善，以及停止或至少延缓其进程、降低其严重程度或消除Ph+白血病。
本发明的治疗方案是用于Ph+白血病的联合治疗。因此，给患者施用TKI 通常会是连续的，例如每天，给患者治疗和施用选择性结合表达于Ph+白血病 干细胞的细胞表面受体的药物可以与TKL施用同时进行，例如每天、每两天或 每三天，或每周或更不经常。在一个替代的联合治疗方案中，给患者施用TKI 直到患者被认为已经达到了临床缓解阶段以及所述病情已经稳定，然后将结合 表达于Ph+白血病干细胞的细胞表面受体的药物加入所述治疗方案。就这一点 而言，如果患者骨髓样品中的细胞少于5％，CML患者可以被认为处于“临床缓 解”。
该实施方案中本发明的提供了具有BCR-ABL特异性的其它TKIs如达沙替 尼、尼洛替尼、波舒替尼、阿昔替尼、西地尼布、克卓替尼(crizotinib)、虎 刺素(damnacanthal)、吉非替尼、拉帕替尼、来妥替尼、萘拉替尼、司马沙尼、 舒尼替尼、托西尼布、酪氨酸磷酸化抑制剂、凡德他尼、瓦他拉尼、INNO-406、 AP24534(Ariad制药)、XL228(Exelixis公司)、植物PHA-739358(Nerviano)、 MK-0457、SGX393和DC2036的应用。TKIs诸如伊马替尼或尼洛替尼治疗Ph+白 血病如CML的有效口服方案是每天400毫克的剂量，高剂量方案由每天600或 800毫克构成。在一个实施方案中，所述TKI是伊马替尼。在另一个实施方案 中，所述TKI不是伊马替尼。在一个相关方面，所述TKI是尼洛替尼。在另一 方面，所述TKI是达沙替尼。
本发明的方法包括选择性结合在Ph+白血病干细胞的细胞表面受体上表达 的药物的施用，并且，在一个实施方案中，所述药物能够结合通过IL-3、G-CSF 和GM-CSF中的至少一种参与信号途径的受体。所述药物可以是一种结合参与 IL-3信号途径的受体的药物，然而所述方法还包括结合参与G-CSF和/或GM-CSF 信号转导的受体的其它药物单独或联合施用。因此，给予患者的联合治疗可以 包括结合参与IL-3、G-CSF或GM-CSF信号的受体的单个药物，或者其可包含这 些药物的组合。在某些实施方案中，可以采样患者的Ph+白血病干细胞并测试 其对IL-3、G-CSF或GM-CSF的响应，以便选择适当的药物用于治疗患者。
本文所使用的术语“选择性结合在Ph+白血病干细胞的细胞表面受体上表 达的药物”，是指能够结合适当的细胞表面受体诸如IL-3、G-CSF和/或GM-CSF 受体的药物，并且其可选择性地促进Ph+白血病干细胞死亡而不导致间接损伤 或患者治疗过程中不可接受的副作用。
在一个本发明联合治疗的实施方案中，据信所述选择性结合表达于Ph+白 血病干细胞的细胞表面受体的药物，可通过阻断或抑制干细胞中的IL-3、G-CSF 和/或GM-CSF的信号发生增强TKI的效力，或通过Fc效应或细胞毒活性或其组 合或通过其它任何机制直接清除“抗性”干细胞。
一方面，所述药物是一种选择性结合选自IL-3Rα、G-CSFR、GM-CSFRα的 受体，以及IL-3与GM-CSF共用β受体的抗原结合分子。
本文所使用的术语“抗原结合分子”指的是一个完整的免疫球蛋白，包括 单克隆抗体诸如双特异、嵌合、人源化或人源单克隆抗体，或抗原结合片段(包 括例如，Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2片段)和/或包含免疫球蛋白的可与完整免疫 球蛋白特异性竞争结合免疫球蛋白结合伴侣的片段的可变结构域，所述免疫球 蛋白结合伴侣如宿主细胞蛋白。与相同抗原结合的抗原结合片段被完整免疫球 蛋白所识别而不考虑结构。抗原结合片段可以合成或通过酶或化学裂解完整的 免疫球蛋白生产，或通过重组DNA的基因工程技术生产。抗原结合分子及其片 段的生产方法是本领域所熟知的，并在如Antibodies，A Laboratory Manual， 由E.Harlow和D.Lane编辑(1988)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York中有记载，其通过引用纳入本文。
在一个实施方案中，所述抗原结合分子是单克隆抗体。
在本发明的实施方案中，所述抗原结合分子可包括Fc区域或修饰的Fc区 域，特别是被修饰以提供增强的效应功能如增强Fc受体的结合亲和力、抗体依 赖性细胞价导的细胞毒活性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP) 以及补体依赖的细胞毒活性(CDC)的Fc区域。对于IgG类抗体，这些效应功 能均被Fc区域与被称为Fcγ受体(FcγRs)的受体家族的结合所支配，所述Fc γ受体在多种免疫细胞上表达。Fc/FcγR复合物的形成招募这些细胞至结合抗 原位点，通常引起信号传导及随后的免疫反应。用于优化FcγRs与抗体Fc区 域的亲和力以增强效应功能，特别是改变相对于“亲代”Fc区域的ADCC和/或 CDC活性的方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法可以包括抗体Fc区域的 修饰以加强其与相关Fc受体的相互作用，并增加其促进ADCC和ADCP的潜力。 还描述了在Fc区域保守Asn297共价结合IgGl抗体的寡糖修饰后的ADCC活性增 强。
本文所使用的术语“选择性结合”指抗原结合分子如抗体或抗体片段与其 结合伴侣如抗原的相互作用，意味着所述相互作用依赖于结合伴侣上的特定结 构如抗原决定簇或表位的存在。换句话说，抗体或抗体片段优先结合或识别结 合伴侣，即使是所述结合伴侣存在于其它分子或有机体的混合物中。
在本发明的又一实施方案中，所述药物可以是选自IL-3突变蛋白、G-CSF 突变蛋白和GM-CSF突变蛋白的突变蛋白，其中所述突变蛋白选择性结合选自 IL-3R、G-CSFR、GM-CSFR的受体但不会导致信号激活或至少使细胞因子诱导的 信号激活降低。在一个具体的实施方式中，所述突变蛋白是IL-3突变蛋白，其 结合IL-3R但不导致IL-3信号激活或至少使IL-3信号激活降低。通常，这些 “IL-3突变蛋白”包含不同的通过添加、缺失和/或替换一个或多个连续或不连 续氨基酸残基的天然或人工突变体。结合IL-3R但展示降低的IL-3信号激活的 IL-3突变蛋白的一个例子是16/84C→A突变体。IL-3突变蛋白还可以包括修 饰多肽，其中所述多肽的一个或多个残基被修饰以例如增加其体内半衰期。这 也可以通过附加其它分子如PEG基团获得。多肽PEG修饰的方法是本领域公知 的。
在本发明的另一实施方案中，所述药物可以是能够结合IL-3的可溶性受 体。这种可溶性受体的例子包括IL-3Rα的胞外部分，或包含IL-3Rα胞外部分 融合共用β链胞外部分的融合蛋白。
能够结合通过IL-3、G-CSF和GM-CSF中的至少一种参与信号途径的受体的 药物以有效剂量施用。“有效剂量”是指正在治疗的特定病情的进程至少部分 获得期望的响应，或推迟或抑制进程或完全停止所必须的剂量。所述剂量变化 取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的种族背景、所需保护的程 度、药物的剂型、医疗状况的评估、以及其他相关因素。预计所述剂量落在能 够通过常规实验确定的相对较宽的范围内。如果有必要，所述药物施用可重复 一次或几次。施用的实际剂量将取决于正在接受治疗的疾病的性质和所述药物 施用的速率。
对于某些应用，设想当药物化合物连接到所述药物时是有益的，特别是细 胞每性或其它具有杀伤或抑制Ph+白血病干细胞生长或细胞分裂能力的抗细胞 药物。总的来说，本发明涵盖了任何可缀合所述药物并以活性形式递送到靶细 胞的药物化合物的应用。示例性的抗细胞化合物包括化疗化合物、放射性同位 素以及细胞毒素。就化疗化合物而言，特别优选激素化合物如类固醇，抗代谢 物如阿糖胞苷、氟尿密啶、甲氨蝶呤或氨蝶呤，蒽环类药物，丝裂霉素C，长 春花生物碱，秋水仙胺，依托泊苷，光神霉素，大环内酯类抗生素如美登素 (maytansines)，烯二炔抗生素如刺孢霉素、CC-1065及其衍生物，或烷化剂如 苯丁酸氮芥或美法仑。其它实施方案可包括化合物如凝血剂、细胞因子、生长 因子、细菌内毒素或细菌内毒素的脂质A部分。无论如何，建议这些化合物可 以以能允许其在靶Ph+白血病干细胞位点靶向、内化、释放或呈现在血液组分 中的方式，如所需地应用已知缀合技术成功缀合所述药物。
在某些实施方案中，用于治疗应用的细胞毒性化合物缀合识别IL-3Rα、 G-CSFR、GM-CSFRα或IL-3和GM-CSF的共用β受体的抗体。用于治疗应用的细 胞毒性化合物通常包括植物源、真菌源或细菌源毒素，如A链毒素、核糖体灭 活蛋白、a-次黄嘌呤、auristatin、曲霉菌素、restirictocin、核糖核酸酶、 白喉毒素或绿脓杆菌外毒素，仅举几个例子。毒素-抗体构建物的应用及其与抗 体的连接是免疫毒素领域所公知的。在这些当中，特别优选用于连接抗体的毒 素是去糖基化蓖麻毒素A链。优选去糖基化蓖麻毒素A链是因为其卓绝的效力、 较长的半衰期以及因为以临床级别和规模生产是经济可行的。
在其它实施方案中，所述细胞毒性化合物可以是放射性同位素。放射性同 位素包括α辐射源例如211砹、212铋和213铋，以及β辐射源例如131碘、 90钇、177镥、153钐和109钯，和俄歇辐射源例如111铟。
依据本发明，所述药物可通过胃肠外施用途径施用给患者。胃肠外施用包 括不经消化道(更确切地说，非肠道)的任何施用途径，包括注射施用、输液 等等。注射施用包括，例如进入静脉(静脉内)、动脉(动脉内)、肌肉(肌 内)以及皮肤下(皮下)。所述药物也可以以长效制剂或缓释制剂施用，例如 皮下、皮内或肌肉内，以足以获得所期望药理作用的剂量施用。
在一个特定的实施方案中，所述结合参与IL-3信号的受体的药物是抗原结 合分子，尤其是选择性结合IL-3Rα(CD123)的单克隆抗体。因此，所述药物 可以是抗CD123的单克隆抗体(mAb)7G3，其此前已表明可抑制IL-3介导的白血 病细胞系和原代细胞增殖与激活(参见Lopez的美国专利6,177,078)。或者， 所述药物可以是单克隆抗体CSL360，一种将小鼠单克隆抗体7G3的轻链可变区 及重链可变区移植到人IgG1恒定区上的嵌合单抗。像7G3一样，CSL360以高 亲和力结合CD123(人IL-3Rα)，与IL-3竞争结合所述受体并阻断其生物学 活性。主要的人嵌合单抗CSL360因而也能够潜在地用于靶向并消除白血病干细 胞。CSL360还具有凭借其可以在人类起始某种水平效应活性的人源IgG1Fc区 域作为人类治疗药物的潜在应用优势。此外，它很可能在人类中将显示相对于 等价物小鼠7G3的清除降低并具有较小的免疫原性。这种药物的更多例子包括 7G3的人源化抗体变体，如CSL362(其还具有增强的Fc效应功能)，全长人抗 CD123抗体以及具有增强的效应功能如ADCC活性的抗CD123抗体，这些例子公 开在国际专利申请PCT/AU2008/001797(WO 2009/070844)中。
所述结合参与G-CSF信号转导的受体的药物可以是，例如识别记载在WO 95/21864的G-CSFR的抗体。类似地，所述结合参与GM-CSF信号转导的受体的 药物可以是，例如识别国际专利申请PCT/AU93/00516(WO 94/09149)或国际专 利申请PCT/GB2007/001108(WO 2007/110631)所公开的GM-CSFRα的抗体。在 另一个实施方案中，所述药物可以是识别IL-3和GM-CSF的共用β受体的抗体， 例如国际专利申请PCT/AU97/00049(WO 97/28190)所公开的抗体。
在另一方面，本发明提供(i)BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂，和(ii)选择 性结合在Ph+白血病干细胞的细胞表面受体上表达的药物在制备治疗患者Ph+ 白血病药剂中的应用。
在另一方面，本发明提供了用于治疗患者Ph+白血病的组合物，其包含(i) BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂，和(ii)选择性结合在Ph+白血病干细胞的细胞表 面受体上表达的药物。
本发明还提供了一种试剂盒，其包含(i)BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂，和(ii) 选择性结合在Ph+白血病干细胞的细胞表面受体上表达的药物，以及任选的 (iii)依照用于治疗患者Ph+白血病的方法施用所述酪氨酸激酶抑制剂和所述药 物的说明书。
这种试剂盒的每一组分可以以独立的容器提供，并且如果有说明书，其可 指导所述试剂盒的组分在不同时间点且各自以不同剂量施用。
本文所使用的短语“联合治疗”(或综合疗法)包括了BCR-ABL酪氨酸激酶 抑制剂和通过结合在白血病干细胞的细胞表面受体上表达选择性促进Ph+白血 病细胞死亡的药物的施用，其作为旨在提供一种这些治疗剂共同作用的有益效 果的特殊治疗方案的一部分。所述联合的有益效果包括但不限于药代动力学或 由治疗药物联合产生的药效共同作用。这些治疗药物的联合施用通常在一个规 定的时间内(通常是数分钟、数小时、数天或数周，或甚至数月，其取决于选 择的组合)完成。“联合治疗”旨在包括这些治疗药物以连续的方式施用，就 是说，每种治疗药物在不同时间施用，以及这些药物或至少两种治疗药物的施 用以基本上同步的方式施用。基本同步施用可通过，例如给患者施用具有固定 比例的各种药物的单个胶囊或静脉注射液或以多种单个胶囊或静脉注射各种治 疗药物来实现。各种药物的连续或基本同步施用可通过任何适宜途径实现，包 括但不限于口服途径、静脉内途径、肌肉内途径以及通过粘膜组织直接吸收。 所述治疗药物可通过相同途径或不同途径施用。例如，联合治疗所选择的第一 种治疗药物可通过口服施用而其它药物可通过静脉内注射施用。或者，例如， 所有治疗药物可通过口服施用或所有治疗药物可通过静脉内注射施用。在顺序 施用的一个实施方案中，首先施用BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂以稳定病情(即 患者骨髓中的母细胞小于5％)。一旦病情得到稳定，将通过结合表达于白血病 干细胞的细胞表面受体选择性促进Ph+白血病细胞死亡的药物加入治疗方案。
在本发明的联合治疗中，所述BCR-ABL TKI可以以口服剂型施用给患者， 其中所述选择性结合在Ph+白血病干细胞的细胞表面受体上表达的药物可胃肠 外给药。
适合口服给药的组合物可作为离散单位如片剂、胶囊、扁囊剂、囊片或锭 剂，每一单位含有预设数量或剂量的活性成分，或作为溶液或水性或非水性载 液的悬液如糖浆、酏剂或乳液。
适合胃肠外便利施用的组合物包含优选与受者血液等渗的无菌水性制剂。 这种水性制剂可通过已知方法应用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。所述 无菌可注射制剂也可以是无菌可注射溶液或处于无毒胃肠外可接受稀释剂或溶 剂中的悬液，例如聚乙二醇溶液和乳酸。可应用的可接受载体和溶剂是水、林 格氏液、合适的碳水化合物(例如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖)以及等渗 氯化钠溶液。此外，无菌、不挥发油类可方便地用做溶剂或悬浮介质。为此， 可应用的任何品牌的不挥发油包括合成的单甘油酯或双甘油酯。另外，发现了 脂肪酸如油酸在可注射剂制备中的应用。
所述治疗组合物的配制是本领域技术人员所公知的。合适的药学上可接受 的载体和/或稀释剂包括任何及所有常规溶剂、分散介质、填充物、固体载体、 水溶液、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等等。这些介质和药 物用于药学活性物质的用途是本领域公知的，并且其记载在例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company， Pennsylvania，USA中。除非任一种常规介质或药物与所述活性成分不相容，其 在本发明药物组合物中的用途均被涵盖。辅助活性成分也可以被纳入所述组合 物。
由以下非限制性实施例进一步阐释本发明。
实施例1-材料和方法
CD34+细胞
应用Lymphoprep(Axis-Shield，Norway)，通过密度梯度离心从初诊CML-CP 患者和正常供者采集的血液分离单核细胞。应用CD34单抗连接的磁性微珠 (Miltenyi Biotech，Germany)，经磁性辅助细胞分选进一步纯化CD34阳性细 胞。
pSTAT5检测(用于测量细胞因子诱导的信号转导)
在无血清培养基(SDM，含有IMDM、2mM的L-谷氨酰胺、1％的BSA、1U/ml 的胰岛素、0.2mg/ml的转铁蛋白、0.1mM的2-巯基乙醇，以及20μg/ml的低 密度脂蛋白)中培养CD34+祖细胞。为检测STAT5磷酸化水平，如上所述在细 胞以20ng/ml IL-3(Pepro Tech，USA)刺激前，应用CSL362或7G3(0.1μg/ml) 和/或达沙替尼(100nM；Symansis，New Zealand)预处理。在PFA固定和以冰预 冷的甲醇透化后，以Alexa488缀合的pY694-STAT5抗体或合适的同型对照 (Phosflow，BD Biosciences，USA)染色细胞，并应用FC500 Terpsichore (Beckman Coulter，USA)以流式细胞术分析。
数据分析
应用FCS Express V3(DeNovo Software，USA)分析流式细胞的数据。
应用GraphPad Prism 5(GraphPad Software，USA)进行进一步的数据演 示和采用双边学生t检验的统计分析。
实施例2
这个实施例表明，单抗7G3和达沙替尼在削弱CML患者原始CD34+细胞样 本中的IL-3诱导的磷酸化上协同作用。
初诊CML慢性期(CML-CP)患者(n＝3)来源的CD34+细胞如前所述以100nM 达沙替尼、7G3(100ng/ml)孵育，并在PFA固定以及甲醇透化前以20ng/ml的 IL-3连续地刺激10分钟。应用Alexa488缀合的pY694-STAT5抗体(Phosflow， BD)经流式细胞术检测STAT5的磷酸化。(基线：代表未经刺激细胞中STAT5磷 酸化的基础水平)；IL-3：以20ng/ml IL-3培养的细胞中的P-STAT5表达；IL-3 +Das 100nM：以100nM达沙替尼和20ng/ml IL-3培养的细胞中的P-STAT5表 达；IL-3+Das 100nM+7G3：以100nM达沙替尼、20ng/ml IL-3以及7G3(110ng/ml) 培养的细胞中的P-STAT5表达。
图1和图2(如图1所示数据的图形展示)表明在IL-3存在下，达沙替尼 自身仅能部分阻断IL-3诱导的STAT5磷酸化，然而达沙替尼和7G3单抗组合能 够完全阻断IL-3诱导的STAT5磷酸化(n＝3)。
实施例3
这个实施例表明，单抗CSL362(7G3的人源化及Fc效应增强变体)和达沙 替尼在削弱CML患者原始CD34+细胞样本中的IL-3诱导的STAT5磷酸化上协同 作用。
刚解冻的初诊CML慢性期患者来源的CD34+细胞在SDM中复苏1小时后，如 前所述以100nM达沙替尼、0.1μg/ml CSL362或BM4(CSL362的同型匹配对照) 或CSL362和达沙替尼孵育，并在PFA固定以及甲醇透化前以20ng/ml的IL-3 连续地刺激10分钟。应用Alexa488缀合的pY694-STAT5抗体(Phosflow，BD) 经流式细胞术检测STAT5的磷酸化。每个患者样品的A488-pSTAT荧光柱状图如 图3所示(细胞仅仅表示这些细胞中未刺激的STAT5磷酸化水平)。图4是图 3所示数据的图形展示。标划出了相对于STAT5磷酸化基线标准化的平均荧光 密度(n＝4)。
图5是组合图2和4(n＝7)数据的图形展示，其显示了所有CML患者的包 括单抗7G3和CSL362的数据。这些数据证明抗体(7G3或CSL362)与达沙替尼 的组合比单独应用达沙替尼或抗体更为有效。
实施例4
这个实施例表明BION-1，一种抗β共用受体(CD131)抗体与达沙替尼协同 作用抑制KU812CML细胞的GM-CSF信号。KU812细胞(由处于CML爆发危险患 者外周血建立的髓性前体细胞系)在具有或没有Bion-1(100nM)的情况下以 100nM达沙替尼培养，并以GM-CSF(4ng/ml)持续刺激10分钟。应用Alexa488 缀合的DY694-STAT5抗体(Phosflow，BD)经流式细胞术检测STAT5的磷酸化。 (基线：代表未经刺激细胞中STAT5磷酸化的基础水平)；GM-CSF：以GM-CSF 培养的细胞中的p-STAT5表达；GM-CSF+Das 100nM：以100nM达沙替尼和GM-CSF 培养的细胞中的p-STAT5表达；GM-CSF+Das 100nM+Bion-1：以100nM达沙 替尼、GM-CSF以及Bion-1培养的细胞中的p-STAT5表达。
图6表明在KU812细胞中，在GM-CSF存在时，达沙替尼自身不能阻断 p-STAT5磷酸化，然而达沙替尼和Bion-1组合能够阻断GM-CSF诱导的p-STAT5 磷酸化。
实施例5
这个实施例记载了一项随机多中心研究，比较以抗CD123单克隆抗体(mAb) (或GM-CSF或G-CSF的单抗)加上达沙替尼(或其它TKI)或仅以达沙替尼处 理新确诊慢性期(CP)慢性髓样白血病(CML)患者中的恶性干细胞的效果。
研究中心和国家/地区的估计数量：澳大利亚和美国的约6-8个地点。干细 胞分析在美国(如西雅图的华盛顿大学或巴尔的摩的约翰霍普金斯Kimmel癌症 中心)以及澳大利亚(CSL/墨尔本大学)完成。
研究阶段：II
研究假设是，在6个月治疗期内，以抗CD123单克隆抗体(mAb)(其范例已 在第一期试验中被证实是安全的)加上伊马替尼治疗初诊的慢性期(CP)慢性 髓样白血病(CML)患者，结果比伊马替尼单独治疗更有效且更快速地清除费城 染色体(Ph)阳性干细胞库。所述研究持续18个月，并招募了约60名患者用 以研究。
主要目标：比较以抗CD123单抗加伊马替尼治疗和单独以伊马替尼治疗的 初诊CP CML患者干细胞区室中的费城染色体阳性细胞数。
研究设计：本研究是初诊慢性期CML患者中的开放随机II期试验。患者随 机通过静脉输注(可以每周、每两周或每月输注)3mg/kg的抗CD123单抗联 合以每天400mg的起始剂量连续口服伊马替尼，或者以每天400mg的起始剂量 单剂口服伊马替尼。
研究期限：这项研究开放报名直至计划的60例随机患者。所有患者治疗和 /或随访至18个月。每组患者的数量：在随机双组对比研究中，约40例患者进 行随机化，20例患者联合治疗而20例患者以伊马替尼单独治疗。如果由最初 40例患者获得代表性样品数、包括由治疗至少12周的患者获得的骨髓样品数 不足，将招募另外的患者。
研究群体：18岁及以上的初诊CP CML患者，以前未对CML进行任何系统 性治疗。
研究评估及终点：以抗CD123单抗加伊马替尼联合治疗白血病患者的安全 性通过在先的I期研究确定。所选择用于与伊马替尼联合应用的抗CD123单抗 剂量通过所述I期研究确定。
应用NCI-CTC第3版评估第II期的安全性。有两个治疗组的所有不良事件、 毒性以及实验室异常的发生率比较分析。
通过患者骨髓样品的干细胞分析评估效能。所有干细胞分析均基于应用顺 磁珠由骨髓(BM)吸取的预选CD34+细胞。所述CD34+组分应用流式细胞分选仪以 CD38标记的表达(阳性与阴性)为基础进一步细分。应用多参数流式细胞免疫 分型鉴定含有所述白血病干细胞群体的细胞组分。
第一终点是研究组之间6个月的干细胞区室(CD34+CD38阴性以及 CD34+CD38+)中Ph-阳性细胞的比例比较。第二终点是治疗组之间的比较：
(1)1个月和3个月的所有干细胞组分内Ph阳性细胞数，
(2)应用RQ-PCR(荧光定量PCR)在1、3、6、12和18个月所取血液样 本中所测得的BCR-ABL mRNA转录水平，以及
(3)3、6、12和18个月内完全遗传学缓解(CCyR)的比率。
第II期临床实验将包括另外一组(第3组)20例患者的治疗组，其将以 伊马替尼单独治疗指定时间(如4-6个月)。伊马替尼单独治疗期结束时所取 的骨髓样品能够用于诊断干细胞组分内具有持久性/残余Ph阳性细胞的患者， 以及定量所述残余白血病细胞。这些患者将以伊马替尼(持续地)加上抗CD123 单抗另行联合治疗6个月。这些患者的第一终点评估在起始联合治疗后3个月 和6个月时间点的干细胞组分的Ph阳性细胞内改变(缩减/消除)。第二终点 是
(1)联合治疗起始的3个月和6个月内完全遗传学缓解(CCyR)的获得；
(2)主要分子反应的获得(BCR-ABL mRNA中3个数量级以上的下降)；
(3)完全分子缓解的获得(RQ-PCR阴性)。
实施例6-伊马替尼和抗细胞因子抗体体外联合治疗CML干细胞的效果： CD34+CD38-CML干细胞存活分析
应用BD FacsARIA细胞分选仪经CD34-APC和CD38-PE抗体(Becton， Dickinson and Company)染色分选所述CD34+CD38-细胞。
分选的细胞以1.5×105细胞/ml置于IMDM/10％FCS中，具有或没有额外的 细胞因子(IL-3，GM-CSF，G-CSF，SCF，IL-6，flt-3配体)，并以具有所示 终浓度的下列体系处理：
1.对照
2.1-100μg/mL抗CD123单抗
3.1-100μg/mL抗CD131单抗
4.1-100μg/mL抗CD116单抗
5.1-100μg/mL抗CD114单抗
6.0.01-10μM伊马替尼或其它TKI
7.1-100μg/mL抗CD123单抗+0.01-10μM伊马替尼或其它TKI
8.1-100μg/mL抗CD123单抗+1-100μg/mL抗CD116单抗+0.01-10 μM伊马替尼或其它TKI
9.1-100μg/mL抗CD123单抗+1-100μg/mL抗CD116单抗+1-100 μg/mL抗CD114单抗+0.01-10μM伊马替尼或其它TKI
10.1-100μg/mL抗CD131单抗+1-100μg/mL抗CD114单抗+0.01-10 μM伊马替尼或其它TKI
如(Jin，L等，Cell Stem Cell 2009，5：31-42)所述，在以Annexin-V-FITC 和7-AAD(BD Biosciences)染色后，通过流式细胞仪在24小时、48小时和72 小时分析细胞的存活率。还通过Tru-Count beads(BD Bioscences)或 Flow-Count Fluorospheres(Beckman Coulter)的加入，经流式细胞仪评估细 胞的绝对数量。
实施例7-伊马替尼和抗细胞因子抗体体外联合治疗CML细胞的效果：集落 形成细胞活性的效果分析：
大量的CML肿瘤细胞(1×105)被置于辅以BIT(Stem Cell Technologies) 的IMDM悬浮培养液中，具有或没有额外的细胞因子(IL-3，GM-CSF，G-CSF，SCF， IL-6，flt-3配体)。具有所示终浓度的实验条件包括；
1.对照
2.1-100μg/mL抗CD123单抗
3.1-100μg/mL抗CD131单抗
4.1-100μg/mL抗CD116单抗
5.1-100μg/mL抗CD114单抗
6.0.01-10μM伊马替尼或其它TKI
7.1-100μg/mL抗CD123单抗+0.01-10μM伊马替尼或其它TKI
8.1-100μg/mL抗CD123单抗+1-100μg/mL抗CD116单抗+0.01-10 μM伊马替尼或其它TKI
9.1-100μg/mL抗CD123单抗+1-100μg/mL抗CD131单抗+1-100 μg/mL抗CD116单抗+1-100μg/mL抗CD114单抗+0.01-10μM伊马替尼或 其它TKI
10.1-100μg/mL抗CD131单抗+1-100μg/mL抗CD114单抗+0.01-10 μM伊马替尼或其它TKI
培养上清每周更换两次，并通过台盼蓝排除法监测生长2-3周以上。在培 养期的终点，将细胞置于半固体甲基纤维素祖细胞基质(Stem Cell Technologies)14-18天，并如(Jiang，X等，Leukemia 2007，21：926-935) 所述评估BCR-ABL+集落的形成。
实施例8-伊马替尼和抗细胞因子抗体体外联合治疗CML干细胞的效果：在 细胞增殖上的效果分析
以CD34+分选或以CD34+CD38-分选的大量CML肿瘤细胞(1×104)被置于辅 以BIT(Stem Cell Technologies)的IMDM悬浮培养液中，具有或没有额外的细 胞因子(IL-3，GM-CSF，G-CSF，SCF，IL-6，flt-3配体)。具有所示终浓度 的实验条件包括；
1.对照
2.1-100μg/mL抗CD123单抗
3.1-100μg/mL抗CD131单抗
4.1-100μg/mL抗CD116单抗
5.1-100μg/mL抗CD114单抗
6.0.01-10μM伊马替尼或其它TKI
7.1-100μg/mL抗CD123单抗+0.01-10μM伊马替尼或其它TKI
8.1-100μg/mL抗CD123单抗+1-100μg/mL抗CD116单抗+0.01-10 μM伊马替尼或其它TKI
9.1-100μg/mL抗CD123单抗+1-100μg/mL抗CD131单抗+1-100 μg/mL抗CD116单抗+1-100μg/mL抗CD114单抗+0.01-10μM伊马替尼或 其它TKI
10.1-100μg/mL抗CD131单抗+1-100μg/mL抗CD114单抗+0.01-10 μM伊马替尼或其它TKI
培养四天后，以通过台盼蓝法排除细胞的血细胞计数器或如(Jiang，X等， Proc.Nat.Acad.Sci.1999，96：12804-12809)所述的[3H]-胸腺嘧啶掺入法 所确定的存活细胞计数来测量细胞增殖。对于后者，将[3H]-胸腺嘧啶加入到孔 中，再持续12个小时，在玻璃纤维滤器上收获细胞并测量胸腺嘧啶的掺入。
实施例9-CML干细胞上的抗CD123单抗体外效果：抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)分析
测定了伊马替尼抗性CML干细胞对ADCC的敏感性。经CD34-APC和CD38-PE 抗体(Becton，Dickinson and Company)染色后应用BD FacsARIA细胞分选仪进 行分选CD34+CD38-细胞。所分选的细胞用作ADCC分析中的靶细胞，所述ADCC 分析应用如(Lazar等，Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function.Proc Natl Acad Sci U S A.2006 103(11)：4005-10)所 述由普通供体纯化的天然杀伤细胞(NK)。靶细胞(CML细胞，1×105细胞)在与 NK细胞以1∶5比例(CML∶NK)存在下，以不等量的抗CD123抗体(0.01-10μg/mL) 孵育。NK细胞应用Miltenyi Biotec′s NK Isolation Kit(Cat#130-092-657) 由普通棕黄色包装(buffy packs)纯化。所述培养物在5％CO2下37℃培养四小 时。根据制造商的说明应用Promega′s CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit(Cat#G1780)，通过培养物上清中的LDH释放测量细 胞裂解。没有抗体或没有效应细胞的靶细胞用作对照以建立细胞裂解的背景值。
实施例10-伊马替尼和抗细胞因子受体单抗体内联合治疗CML细胞的效果
所有的动物研究均在适当的技术指导和伦理认可下进行。实验如前所述 (Wolff NC和Ilaria RL Jr 2001 Blood 98，2808-2816)进行，但应用原始的 人CML细胞取代细胞系。通过尾静脉给亚致死照射(300cGy)的NOD/SCID小鼠 或NOD/SCID/IL-2Rγ敲除小鼠(6-10周龄)注射人CML细胞。所述CML细胞可 以是分离自CML患者的外周血单核细胞(PBMC)(1-10×106细胞/小鼠)或源自患 者的CD34+分选骨髓细胞(0.5-5×106细胞/小鼠)。外周血中白血病细胞的植入 通过以流式细胞仪(Lock等，2002 Blood 99，4100-4108)检测人CD45+细胞来 监测。所述肿瘤可建立2-8周，然后小鼠以如下数组所述处理，每个治疗组5-10 个动物：
1.未治疗(盐水)对照
2.伊马替尼或其它TKI(每个早晨强饲50mg/kg且每个晚上强饲100mg/kg： 药物于250μL无菌水中通过直的或弯曲的动物喂饲针施用)
3.伊马替尼或其它TKI(每个早晨强饲50mg/kg且每个晚上强饲100mg/kg： 药物于250μL无菌水中通过直的或弯曲的动物喂饲针施用)，并且，一种或多 种选自抗CD123、CD116、CD114和CD131的抗体(或相同浓度的匹配同型对照 抗体)以200-600μg/小鼠经腹膜内注射每周施用三次
4.一种选自抗CD123、CD116、CD114或CD131的抗体(或相同浓度的匹配 同型对照抗体)以200-600μg/小鼠经腹膜内注射每周施用三次
所述治疗再持续2-8周，并且每周监测两次白血病细胞的植入。在治疗期 末，处死小鼠并测定外周血、股骨骨髓和脾脏内的白血病细胞植入。
在一些实验中，伊马替尼和抗细胞因子受体单抗联合治疗在自我更新能力
(白血病干细胞活性)上的影响通过次级移植实验测定。在这些实验中，由 如上所述进行治疗的初级受者小鼠骨髓(每个小鼠两根大腿骨和两根胫骨)分 离CML细胞，并通过给每只次级受者小鼠(每组4-10只小鼠)静脉移植2-10 ×106CML细胞进行次级移植。移植4-12周后测量次级受者骨髓及脾脏内移植物 的水平。
为检验这些药物在微小残留病情况下的效力，在所述联合治疗开始前，单 独以伊马替尼(或单独以其它TKI)治疗动物以诱导微小残留病反应，一些实 验如下所述设置：在初级受者小鼠中，在具有或没有伊马替尼持续治疗的单抗 治疗(如上所述)开始前，伊马替尼(或其它TKI)治疗启动(如上所述)并 持续2-6周。监测整个实验进程中外周血内的白血病细胞移植物，在治疗终点 处死小鼠并测定外周血、股骨骨髓及脾脏内的白血病细胞移植物。还通过如上 所概述进行的次级移植实验测量这种治疗末期的残留白血病干细胞活性。
对本领域技术人员而言，许多不偏离本发明范围的修改是显而易见的。