发明背景
发明领域
本发明总的涉及药理学和癌症治疗领域。特别是，本发明提供了通过吸入携 带抗癌药的脂质体水分散液来释放小颗粒气雾剂进入呼吸道的制剂和方法。
相关技术描述
小颗粒脂质体气雾剂治疗由包入脂质体的脂溶性的或水溶性的抗癌药构成， 它可用从喷嘴喷雾器从水分散液进行给药(参见美国专利5,049,388)。喷雾时 产生的总的中位空气动力学直径为1-3微米的气雾剂能靶向释放到呼吸道的表 面。沉积的脂质体接着在肺里局部释放药物或在血液循环里将药物释放到肺外组 织。若药物是脂溶的，它可能与脂质分子缔合，缔合的方式将所用的脂质、所用 的抗癌药物可能具特异性，它也可能被悬浮的水性介质里包含的各种可溶性组分 进一步改变。这类可溶性组分包括缓冲盐和可能的肌醇，从而增加具表面活性的 磷脂的合成和分泌入肺部组织，并使已存在的呼吸窘迫或由气雾剂治疗可能引起 的窘迫减到最小(Hallman，M.等，患有呼吸窘迫综合征的早产儿的肌醇补充 (Inositol Supplementation in Premature Infants with Respiratory Distress Syndrome)，N.Eng.J.Med.1992 326：1233-1239)。
若药物是水溶的，可通过合适的过程包入存在于多层的脂质体层(薄层)之 间的同心空间里的水性囊泡里。可制备单层脂质体；但是，它们包容脂溶或水溶 性药物的能力会减少，因为截留被限制在中央囊泡里。
气雾剂水滴可含一种或多种药物脂质体。喷雾将脂质体剪切成易于从喷雾器 的喷嘴里排出的大小。最大直径达数微米的脂质体典型地被剪切成直径小于 500nm，根据喷雾器的操作特征和其它变量直径可变得更小。剪切包含于脂质体 里的水溶性药物能释放明显数量的水溶性化合物，可能是50％。这不是它们使 用的禁忌征象，而表示给予了两种形式的药物制剂，其作用包括两种形式中的每 一种单狡给予时所产生的治疗作用。
美国专利5,049,388揭示了脂质体气雾剂治疗的许多其它细节。此外，也可 通过混合含不同药物的脂质体，或使用几种药物已被混合并一起包入脂质体而可 能在气雾剂脂质体治疗时包括一种以上的药物。该专利特别是以L-α-肉豆蔻酰 磷脂酰胆碱(DMPC)、L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、L-α-二硬脂酰磷 脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱或二亚油酰磷脂酰胆碱的磷脂酰胆碱类 作为脂质体中的脂质。熟悉该技术领域的技术人员都知道，在低于室温的特定温 度下，喷雾通过剪切力降低脂质体—药物的粒径，这是一个低效率的过程，脂质 体可再循环到贮库里，再经受剪切以降低粒径直到被气雾化。因此，相转变温度 低于喷雾温度是有效喷雾的关键，相转变温度低于喷雾温度的磷脂酰胆碱较为柔 软，能有效地通过喷雾器口挤出。由于脂质体会再循环到喷雾器中的药物贮库， 用较高相转变温度的磷脂酰胆碱配制的脂质体更易于成为固体且坚硬，挤出时在 贮库里聚集或破裂，从而将药物留在了贮库里。该专利中使用的脂质的相转变温 度还是偏高，因此，存在着喷雾过程中脂质体易破碎，从而将药物留在贮库里的 问题。
美国专利5,552,156揭示的脂质体是通过静脉内释放的，这不如通过肺部给 药有效，另外，通过静脉释放的脂质体的设计方案也不同于通过喷雾给药的脂质 体的设计方案子，通过静脉给药的脂质体需要选择具有较高相转变温度的L-α- 二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱和L-α-二硬脂酰磷脂酰胆碱 来保证含有药物的脂质体通过血管释放。相转变温度低的磷脂酰胆碱/喜树碱脂 质体静注时会马上液化，从而即刻释放药物，影响给药。
现有技术在供小颗粒气雾剂释放含抗癌药的脂质体水分散液的制剂和方法上 是有缺陷的。本发明满足了本技术领域中该长期的需求。
发明综述
本发明的小颗粒脂质体气雾剂化合物和治疗方法涉及包入脂质体里的脂溶或 水溶的抗癌药物。然后脂质体以水分散液从喷射喷雾器给药。本发明显示，通过 气雾剂肺部给药后，药物的全身吸收速度和效率比肌肉注射或口服给药的更快、 更有效。
本发明的一个目的是提供治疗癌症的方法，包括通过小颗粒气雾剂，向需要 这类治疗的个体的呼吸道释放抗癌药物的水分散液。用于本发明这个实施方案的 抗癌药物例子包括，但不限于，20-S-喜树碱、9-硝基-喜树碱、9-氨基-喜 树碱、10，11-亚甲基二氧基-喜树碱、紫杉醇、紫杉醇-A、米托坦、甲氨蝶呤、 巯嘌呤、洛莫司汀、干扰素、5-氟尿嘧啶和依托泊甙。在更优选的实施方案中， 抗癌药选自20-S-喜树碱、9-硝基-喜树碱、9-氨基-喜树碱、10，11-亚 甲基二氧基-喜树碱和紫杉醇。另外，在本发明优选的实施方案里，通过喷射喷 雾器释放抗癌药。
本发明的另一个目的是提供通过含抗癌药和脂质的小颗粒气雾剂释放抗癌药的 脂质体，其中抗癌药的浓度不超过制剂总体积的约10％，抗癌药与合适溶剂的比 率范围是约1∶1到约1∶200，优选的是约1∶10到约1∶100，最好是约1∶10 到约1∶50(重量∶重量)。一个特别好的实施方案包括9-硝基-喜树碱和二月 桂酰磷脂酰胆碱，其比率为约1∶10到1∶50(重量∶重量)；特别优选的实施 方案是约1∶50wt∶wt的9-硝基-喜树碱和二月桂酰磷脂酰胆碱。另一个实施方 案提供了通过含约1∶30wt∶wt的紫杉醇和二月桂酰磷脂酰胆碱的小颗粒气雾剂释 放抗癌药物的脂质体。
本发明另一个实施方案提供了由下列步骤产生的脂质体：将脂溶性的抗癌药物 溶于适合溶解抗癌药物的溶剂里得到溶解的抗癌药；将溶解的抗癌药物加入溶解 的适合配制并通过气雾剂释放药物的脂质，以形成溶液，其中溶解的抗癌药物浓 度不超过溶液总体积的约10％，抗癌药物与脂质的比的范围为约1∶1到约1∶200， 优选的是约1∶10到约1∶100，最优选的范围是约1∶10到约1∶50(wt∶wt)；冷 冻和冻干此溶液。此时，溶液可冷冻贮存供以后使用，或溶于无菌水供使用，形 成悬浮液，其中抗癌药物在悬浮液无菌水里的浓度不超过约5.0mg/ml。
本发明优选的实施方案提供了由下列步骤制备的20-S-喜树碱(CPT)、9 -硝基喜树碱(9-NC)和其它脂溶性喜树碱衍生物的脂质体制剂：制备所述20 -S-喜树碱(CPT)、9-硝基喜树碱(9-NC)或其它脂溶的喜树碱衍生物和脂 质在相容溶剂里的浓储备溶液；将合适体积的20-S-喜树碱(CPT)、9-硝基 喜树碱(9-NC)或其它脂溶喜树碱衍生物和脂质的浓储备溶液加入一定体积的叔 丁醇中，形成第二种溶液，其中所述20-S-喜树碱(CPT)、9-硝基喜树碱(9 -NC)和其它脂溶喜树碱衍生物的浓度不超过所述第二种溶液的10％，其中第二 种溶液里的药物与脂质的比范围为约1∶1到约1∶200，优选的范围为约1∶10 到约1∶100，最好范围为约1∶10到约1∶50(wt∶2t)；冷冻所述的第二种溶液； 冻干所述的第二种溶液，以形成粉末制剂。此时，粉末制剂可冷冻贮存供以后使 用或溶于无菌水，形成悬浮液，其中所述抗癌药物在所述悬浮液里的浓度不超过 约5毫克/毫升。
更特定的实施方案提供了由下列步骤制备的脂质体：制备抗癌药的浓储备溶 液，如100毫克CPT在1毫升叔丁醇里，或100毫克9-NC在DMSO里，制备脂质 的储备溶液，如100毫克DLPC在1毫升叔丁醇里；将合适体积的所述浓储备溶液 加到一定体积的叔丁醇里，形成第二种溶液，其中最终体积约10毫升，DMSO的 体积不超过所述最终体积的10％(体积∶体积)，抗癌药物的浓度不超过最终体 积的10％(wt∶wt)，其中药物与脂质的比范围约为1∶1到1∶200，优选的范围是 约1∶10到约1∶100，最好的范围比约1∶10到约1∶50(wt∶wt)；冷冻所述的第 二种溶液；冻干所述的冷冻溶液，制备粉末制剂。然后粉末制剂可冷冻贮存供以 后使用，或溶于无菌水，形成悬浮液。一般来说，悬浮液里的抗癌药物浓度不超 过约5毫克/毫升。
本发明另一个优选的技术方案提供了由下列步骤形成的脂质体：使紫杉醇与 合成的α卵磷脂：二月桂酰磷脂酰胆碱混合；使紫杉醇-DLPC溶于叔丁醇，以制 备制剂；冷冻和冻干制剂。通过在高于25℃的温度下加入无菌的纯水来制备脂质 体，其中紫杉醇与二月桂酰磷脂酰胆碱的最终浓度比为约1∶1到约1∶200，优 选的范围为约1∶10到约1∶100，最好的范围为约1∶25到1∶40(wt∶wt)。除了 α卵磷脂外，也可使用其它天然或合成的卵磷脂，包括，但不限于蛋黄磷脂酰胆 碱、氢化大豆磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰二棕榈酰油酰磷脂酰 胆碱和二棕榈酰磷脂酰胆碱。
可这样试验9-NC和其它喜树碱衍生物和抗癌药物包入脂质体的效率：使冻 干的药物—脂质体制剂的水分散液在PercollTM梯度上成层，并离心。在试管底部 收集未包入的药物，在Percoll梯度和水相之间的界面处收集包入脂质体的药物。 当在偏振光下用显微镜检查药物—脂质体分散液时，可观察药物晶体来对包裹效 率进行定性试验。其他方法是，如用分析的HPLC方法定量分析未包裹的、晶体药 物。
本发明的其它方面和进一步特征和优点从下列对本发明优选实施方案的描述 中可得以了解。这些实施方案仅供阐述用。
附图简述
所附的附图包含于本文，以便清楚和详细地理解本发明的上述特征、优点和 目的。这些附图形成了说明书的一个部分。但是，值得注意的是，附图仅描述本 发明优选的实施方案，不能认为限定本发明的范围。
图1：显示9-NC-DLPC脂质体气雾剂对裸鼠中异种移植的人体乳腺癌的治 疗作用。
图2：显示9-NC-DLPC脂质体气雾剂对选自图1的小鼠的进一步治疗的作 用。
图3：显示9-NC-DLPC脂质体气雾剂对裸鼠中异种移植人体结肠癌(Squires) 的治疗的作用。
图4：显示9-NC-DLPC通过脂质体气雾剂或通过口服治疗对裸鼠中人体肺 癌异种移植物(Spark)生长的作用，通过测量肿瘤体积来定量。
图5：显示用Aerotech II型喷雾器输出的紫杉醇-DLPC脂质体(1∶30；1 毫克/毫升)。
图6：显示从图5所述的制剂里回收的紫杉醇；紫杉醇-DLPC剂量为 15bpm，500ml TV。
发明详述
现给出下列定义。未作特别定义的术语表示含义与本技术领域常规的相同。 本文使用的术语“气雾剂”指固体或液体颗粒在空气中的分散液，所述的颗粒足 够细小，因此沉降速率低，有相对的空中漂浮稳定性(参见Knight，V.，呼吸道 的病毒和支原体感染，1973，Lea和Febiger，Phila.Pa.，pp2)。“脂质体气 雾剂”由水性液滴构成，其中分散着一种或多种含欲释放到人体或动物呼吸道的 一种或多种药物的脂质体颗粒(Knight，V.和Waldrep，J.C.供释放哮喘类药物 的脂质体气雾剂；也参见Kay，B.，过敏和过敏性疾病，1997，Blackwell Publications，英国牛津，第I卷，pp730-741)。本申请气雾剂液滴的大小如美 国专利5,049,338所述，即总的中位空气动力学直径(MMAD)为1-3微米，几何 标准偏差约1.8-2.2。但是，对于低浓度9-NC和可能的其它喜树碱衍生物，MMAD 会低于1微米，如0.8微米。基于本发明揭示的研究，当脂质体与周围相对湿度 平衡时，脂质体可基本上构成所有体积的液滴。
本文使用的“Weibel肺模型”指一类人体肺结构，它可识别出人体气道的23 个连续的分支。气管标记为0，支气管和细支气管延伸到16。气道的这些部分含 纤毛上皮和粘液腺体。它们一起构成了粘膜纤毛覆盖物。分支17-23构成了肺部 的肺泡，没有粘膜纤毛覆盖物。因此，沉积在此的颗粒不会沿着气管上升而被吞 下。
本文使用的术语“20-S-喜树碱”或“CPT”指具有抗癌性质的植物生物碱。
本文使用的术语“9-硝基-喜树碱”或“9-NC”、“9-氨基-喜树碱”或 “9-AC”和“10，11-亚甲基二氧基-喜树碱”或“MDC”指衍生自20-S-喜 树碱的活性抗癌药物，它们在水里不溶，在某些脂质溶剂里可溶。
本文使用的术语“二月桂酰磷脂酰胆碱”或“DLPC”是用于配制脂质体的脂 质。
本发明涉及治疗癌症的方法，包括通过小颗粒气雾剂向需要这类治疗的个体 的呼吸道释放抗癌药物的水分散液。在本发明优选的实施方案里，抗癌药物选自 20-S-喜树碱、9-硝基-喜树碱、9-氨基-喜树碱和10，11-亚甲基二氧基 -喜树碱。另外，在本发明优选的实施方案里，优选的是通过喷射喷雾器释放抗 癌药物。
另外，提供了通过小颗粒气雾剂释放抗癌药物的含抗癌药物和脂质的脂质体， 其中抗癌药物浓度不超过制剂总体积的约10％，抗癌药物与合适溶剂之比范围约 1∶1到1∶200，优选的范围约1∶10到约1∶100，最优选的范围是约1∶10到 约1∶50(wt∶wt)。本发明一个特定的实施方案包括9-硝基-喜树碱和二月桂酰 磷脂酰胆碱之比为约1∶10到约1∶50wt∶wt；特别优选的实施方案是9-硝基-喜 树碱和二月桂酰磷脂酰胆碱之比为约1∶50wt∶wt。
紫杉醇是另一种脂溶的抗癌药，可容易地包入脂质体制剂。紫杉醇和二月桂 酰磷脂酰胆碱的最佳比为约1∶1到约1∶200，较好的范围为约1∶10到约1∶100， 更好的范围为约1∶25到约1∶40(wt∶wt)。优选的形式是紫杉醇与DLPC的比为 约1∶30。紫杉醇溶于叔丁醇，不使用DMSO，而一些喜树碱使用DMSO。紫杉醇脂 质体制剂与喜树碱制剂其它方面是相似的。
进一步的是，本发明涉及通过小颗粒气雾剂释放抗癌药物的脂质体，它通过 下列步骤制备：使脂溶的抗癌药物溶于适合溶解抗癌药的溶剂里，以得到溶解的 抗癌药物；将溶解的抗癌药物加到溶解的适合配制并通过气雾剂释放药物的脂质 里，以制备溶液，其中溶解的抗癌药物的浓度不超过溶液总体积的约10％，抗癌 药物与合适溶剂的比的范围为约1∶1到约1∶200；冷冻和冻干溶液。此时，溶 液可冷冻贮存供以后使用，或溶于无菌水，以制备悬浮液，其中悬浮液里无菌水 中的抗癌药物浓度不超过约5.0毫克/毫升。本发明特别优选的实施方案提供了通 过下列步骤制备的脂质体：将选自20-S-喜树碱、9-硝基-喜树碱、9-氨基 -喜树碱和10，11-亚甲基二氧基-喜树碱的脂溶性抗癌药物溶于100％ DMSO，以 制备溶解的抗癌药物；将所述的溶解的抗癌药物加到溶于叔丁醇的二月桂酰磷脂 酰胆碱中，以制备溶液，其中溶解的抗癌药浓度不超过溶液总体积的约5％，抗 癌药与二月桂酰磷脂酰胆碱的比为约1∶50。冷冻溶液，并冻干过夜。为了使用， 将冻干的溶液悬浮于合适体积的无菌蒸馏水里。另外，可使用本技术领域公知的 其它的脂质体制备方法，如以旋转蒸发代替冻干。
这样制备9-NC-DLPC气雾剂：首先将药物溶于DMSO；为了溶解，需要加热 到50-60℃。将该溶液加到较大体积的叔丁醇里，以使DMSO溶液不超过合并的 叔丁醇和DMSO总体积的5-10％。在液氮下从溶液里蒸发除去有机溶剂DMSO和 叔丁醇，得到淡黄色粉末。为了使用，向含适当浓度药物的小瓶里加入无菌蒸馏 水，并将其加入喷雾器的容器里。使用Aerotech IITM喷雾器(CIS-USA，Inc.， 美国马里兰Bedford)，但也可使用能形成相似的气雾剂的喷雾器。
本发明特别的实施方案涉及下列步骤形成的脂质体：使紫杉醇与合成的α卵 磷脂：二月桂酰磷脂酰胆碱混合；将紫杉醇-DLPC溶于叔丁醇，以制备溶液；冷 冻和冻干溶液。通过在高于25℃的温度下加入无菌纯水制备脂质体，其中紫杉醇 与二月桂酰磷脂酰胆碱的最终浓度为约1∶1到约1∶200，优选的范围是约1∶10 到约1∶100，更优选的范围是约1∶25到1∶40(wt∶wt)。
本发明的药物组合物可用于气雾剂向呼吸道释放携带抗癌药物的脂质体的水 分散液。本技术领域人员不需经过多的实验即可容易地决定这些气雾剂制剂的合 适剂量。供体内治疗时，本发明的气雾剂制剂以治疗有效量，即能消除或减少肿 瘤负载的量给予病人。像所有的药品一样，剂量和剂型方案可根据癌症性质(原 发或转移的)、特定药物的特征(如其治疗指数)、病人、病史和其它因素而定。 气雾剂量典型的范围，对于9-NC是约8微克/kg病人体重/天到约100微克/kg 病人体重/天。剂量和剂型方案根据本技术领域公知的因素而定。参见Remington’s Pharmaceutical Sci.，第17版(1990)Mark Publishing Co.，Easton，Penn；以 及Goodman和Gilman’s：治疗的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第8版(1990)Pergamon Press.
本发明的小颗粒脂质体气雾剂化合物和治疗方法涉及包入脂质体的脂溶或水 溶的抗癌药物。脂质体以喷射喷雾器放出的水分散液给药。可使用各种抗癌药， 包括20-S-喜树碱、9-硝基-喜树碱、9-氨基-喜树碱、10，11-亚甲基二 氧基-喜树碱和紫杉醇。
下列实施例供阐述本发明的各种实施方案，并非用来限定本发明：
实施例1
抗癌药物CPT和它的9-NC衍生物
本发明代表性的抗癌药物是20-S-喜树碱和它的9-NC衍生物。其它的喜 树碱，如9-AC和10，11-MDC以及本技术领域公知的其它抗癌制剂也具有适合 使用的性质。所有这些抗癌药物可用于脂质体制剂。
表1显示对人体、狗和小鼠口服给药后，9-NC的血液或血浆浓度，和达到 血药峰浓度的时间的比较。(Hinz，H.R.等，人体、狗和小鼠中9-硝基20-(S) -喜树碱体内和体外转化为9-氨基-20-(S)-喜树碱的药物动力学。癌症研 究(Cancer Research)1994 54：3096-3100)。单剂口服的剂量范围对于人体和狗 是0.1-1.0mg/kg，对于小鼠是4.1mg/kg。CPT和9-NC的药物动力学可能有些不 同，但合理的可能性是前述的不同是由两种药物的性质可以预见的。
表1 单剂口服、鼻内给药或气雾剂给药后比较
9-NC的血液浓度或血浆浓度 口服剂量(单剂) 血液或血浆浓度 达最大浓度时间 人 0.1mg/kg (7mg/剂) 483ng/ml 3.4小时 (T1/2＝2.5小时) 1.0mg/kg (70mg/剂) 1247ng/ml 5.3小时 (T1/2＝4.9小时) 狗 1.0mg/kg (10mg/剂) 19.1ng/ml 0.7小时 (T1/2＝6.4小时) 小鼠 4.1mg/kg (0.124mg/剂) 732ng/ml 6分钟 (T1/2＝10小时) *鼻内给药 小鼠 233微克/kg (7微克/小鼠) 213ng/ml 滴鼻结束时 *脂质体气雾剂吸入(30分钟) 小鼠 16.2微克/kg (486ng/小鼠) 13.9ng/ml 气雾剂给药结束时
*鼻内制剂和气溶胶从Baylor Aerosol实验室得到，其它来自Hinz，H.R.(参 见正文供参考)。
表2揭示了对小鼠计算气雾剂剂量的方法，这是确定表1中引证的剂量的基 础。由于啮齿动物复杂的鼻子结构，所以许多吸入的药物沉积在小鼠的鼻咽处。 相似的是，滴鼻导致鼻咽处沉积是大。沉积在此的物质迅速转运到食道口，并被 吞下。但吸入的气雾剂约10-15％会渗透进入外周肺部。
在用口腔呼吸的人体中，只有少量气雾剂颗粒会沉积在口腔里，事实上在鼻 咽处没有沉积。沉积在中央气道中的物质通过粘液纤毛运动会返回咽部，在此它 被吞下。对于常在支气管分支处发生的原发肺部肿瘤，药物会沉积在肿瘤的表面， 并被直接吸收进入肿瘤块。沉积在第16Weibel层次以下的物质不受纤毛上皮作 用，故不会向上移动；这样在周围肺实质中的肿瘤里，药物会沉积在相邻区域， 并直接吸收进入肿瘤块。另外，本发明最大的优点是沉积在不受纤毛上皮作用的 部位的药物被组质间隙里的毛细血管和肺部的淋巴管获得，会进入循环。
表2以气雾剂给药时，9-NC在不同种对象中沉积剂量的计算 喷雾器： AeroTechII；10升/分钟：测量1.7％效应 贮库： 9-硝基喜树碱(9NC)-DLPC脂质体：100，500或1,000微克9NC/ml，和1∶50(w/w)mgDLPC/ml 剂量计算 贮库中的 气雾剂中的 Weibel层次： 9-NC 9NC 体重 Rx时间 药物剂量 药物总量 呼吸道分泌 0-16 17-23 种类 药物 MMAD (μg/ml) (μg/L) (kg) (min/天) K* (μg/kg/min) (μg/kg/天) (μg/天) (μg/ml)** (μg/ml)*** 成人 9NC 0.8 100 1.8 70 15 0.076 0.14 2.0 142 0.68 1.4 5.8 成人 9NC 0.8 100 1.8 70 30 0.076 0.14 4.1 284 1.35 2.7 11.7 成人 9NC 1.2 500 8.5 70 15 0.076 0.64 9.6 675 3.21 6.5 27.7 成人 9NC 1.2 500 8.5 70 30 0.076 0.64 19.3 1,353 6.44 13.0 55.5 成人 9NC 1.5 1,000 15.9 70 15 0.076 1.20 18.0 1,259 6.00 12.1 51.6 成人 9NC 1.5 1,000 15.9 70 30 0.076 1.20 36.0 2,518 11.99 24.2 103.3 狗 9NC 1.2. 500 8.5 30 15 0.100 0.85 12.8 383 4.26 8.6 36.7 狗 9NC 1.2 500 8.5 30 30 0.100 0.85 25.6 767 8.52 17.2 73.4 棉鼠(大鼠) 9NC 1.2 500 8.5 0.075 30 0.350 2.98 89.5 6.71 29.8 棉鼠(大鼠) 9NC 1.2 500 8.5 0.075 60 0.350 2.98 178.9 13.42 59.6 棉鼠(大鼠) 9NC 1.2 500 8.5 0.068 30 0.350 2.98 89.5 6.08 29.8 小鼠 9NC 0.8 100 1.8 0.030 15 0.300 0.54 8.1 0.24 2.7 小鼠 9NC 0.8 100 1.8 0.030 30 0.300 0.54 16.1 0.48 5.4 小鼠 9NC 1.2 500 8.5 0.030 15 0.300 2.55 38.3 1.15 12.8 小鼠 9NC 1.2 500 8.5 0.030 30 0.300 2.56 76.7 2.30 25.6 小鼠 9NC 1.2 500 8.5 0.030 60 0.300 2.56 153.4 4.60 51.1 小鼠 9NC 1.2 500 8.5 0.030 120 0.300 2.56 306.7 9.20 102.2 小鼠 9NC 1.5 1,000 15.9 0.030 15 0.300 4.76 71.4 2.14 23.8 小鼠 9NC 1.5 1,000 15.9 0.030 30 0.300 4.77 143.1 4.29 47.7
*K(成人)：0.108L-分钟/kg×0.7；假设经鼻和口呼吸，仅经口＝1/2
K(棉鼠)：0.7L-分钟/kg×0.5
K(小鼠)：1L-分钟/kg×0.3
K(狗，金黄色)：0.2L-分钟/kg×0.5
**每次治疗后评估的峰值：分泌体积＝1毫升/kg
***来自Patton(3570)和Philadelphia info的数据：人仅经口呼吸。
表3显示DLPC脂质体气雾剂喷雾15分钟后CPT的组织分布。沉积的剂量计 算值为486ng/小鼠。肺部和肝脏的平均浓度与其它被检查的部位的较小浓度相似。 表4显示在鼻内滴入7微克/小鼠(233微克/kg)后一小时里组织的分布。药物 迅速从肺部清除，结果停止喷雾后15分钟，肺部只存在可忽略量的药物。肝脏、 肾脏和脾脏开始有明显量的药物，在研究的一小时里逐渐消除。有趣的是，血药 浓度在整个研究中极低。这些研究表明，药物在肺部大量即刻沉积，并从内脏里 迅速清除。经吞咽而吸收的药物的量是不确定的。
表3吸入CPT脂质体气雾剂15分钟后CPT的组织分布 动物 器官 CPT(ng/g)组织 1 肺 52.0 肝脏 44.3 脾脏 12.0 肾脏 29.3 血液 7.1 2 肺 48.0 肝脏 44.3 脾脏 16.4 肾脏 21.8 血液 8.3 3 肺 27.0 肝脏 21.9 脾脏 11.4 肾脏 18.0 血液 22.6 4 肺 77.5 肝脏 178.0 脾脏 25.0 肾脏 50.0 血液 17.7 平均值(±SD)CPT (ng/g组织) 肺 51.1±20.7 肝脏 72.1±71.4 脾脏 16.2±6.3 肾脏 29.8±14.3 血液 13.9±7.5
用Aerotech II喷雾器在流速10升/分时操作产生气雾剂，喷雾器中脂质体 制剂的CPT浓度为0.2mg/ml。
表4鼻内给药后CPT的时间依赖的器官分布 时间(分钟) 器官 0 15 30 60 ng/g组织 肺部 1287±657 19±3 36±23 7±3 肝脏 651±418 255±101 66±17 34±7 肾脏 542±174 190±57 49±13 24±21 脾脏 351±137 84±32 21±8 7±2 血液 213±19 53±20 8±3 4±2
说明：
CPT以脂质体制剂给药，所述的脂质体制剂用DLPC制备，最初的药物浓度为 0.2mg/ml。
每个动物滴入35微升分散液(每个时间点处理3个动物/组)。
表5显示肌肉注射CPT后药物在血液和内脏里的分布。在肌肉注射后最初12 小时里药物从注射部位的消失很慢，肝脏里只检测到极小的浓度，事实上药物在 其它部位不存在。整个研究中血液中的药物浓度可以忽略。给药剂量与滴鼻相同。 这些发现表明肺部给药比肌内途径给药的全身吸收速度更快，更有效。可能是器 官和血管腔里的沉积会增加暴露于白蛋白分子和使药物降解成羧基形式的机会。
表5肌内给药后CPT的时间依赖性器官分布 时间(分钟) 器官 0 30 60 1200 ng/g组织 肺部 2±1 4±2 3±3 4±3 肝脏 3±1 87±74 136±107 126±116 脾脏 2±1 18±9 11±5 5±1 肾脏 2±0 40±14 26±7 15±5 血液 2±1 12±5 8±1 4±1 注射部位 6918±265 4309±1548 4609±1412 1544±751
说明：
将CPT在DMSO里的5毫克/毫升原始储备液悬浮于盐水(1.4微升储液+48.6 微升盐水)，每个小鼠总共肌内注射50微升悬浮液。
每个时间点处理3个动物/组。
实施例2
由DLPC和9-AC构成的脂质体的溶解度
表6显示了9-NC和DLPC重量比固定于1∶50(w/w)，但药物从浓度0.1mg/ml 增加到1.0mg/ml的脂质体的稳定性。样品在各种条件下于涡动后试验：在喷雾开 始前，喷雾1.5-2分钟后(样品取自喷雾器贮库中的液体)，以及用全玻璃冲击 器(All-Glass Impinger，Ace Glass Co.，美国新泽西Vineland)收集的气雾剂。
表6制备9-NC DLPC脂质体制剂时的脂质体粒径和药物晶体 浓度(毫克/毫升) 样品 脂质体粒径 晶体的存在 9NC DLPC nm (肉眼观察) 0.1 5.0 1 8006 - 2 798 + 3 332 - 0.2 10.0 1 6201 - 2 434 + 3 812 - 1.0 50.0 1 5448 ++ 2 718 ++ 3 816 +
最稳定的制剂是浓度最低的制剂。喷雾后少量晶体在贮库里出现。由于与喷 雾相关的剪切力，喷雾使脂质体粒径减少10倍。从气雾剂回收的脂质体颗粒的粒 径进一步减少。该发现与选择较小的颗粒供气雾剂发射是一致的。缺少晶体提示 晶体不象脂质体那样易于喷雾。脂质体剂量较大时，喷雾后粒径变小，但从气雾 剂回收的颗粒的粒径与在喷雾器的药库里循环的颗粒粒径相比并不变小。
实施例3
内酯环打开的动力学
将一些喜树碱溶于水性介质后，其抗肿瘤活性消失。这是由于α-羟基内酯 环(环E)可水解。该改变起因于酰基裂解，得到分子无生物活性的羧酸盐形式。 药物的内酯环形式在脂质体里被掩蔽(Burke，T.G.，生物化学 (Biochemistry)1993，32：5352-5364)，但药物的羧基形式对人体血清白蛋白有 高亲合力。这导致内酯在人体血清白蛋白存在下迅速转化为羧酸盐，从而失去了 抗癌活性。在几乎没有白蛋白和/或与脂质体成分物相互作用的肺内肺泡表面沉 积很显然可以保存9-NC的抗癌作用。
实施例4
9-NC对小鼠中人体乳腺癌移植物生长的作用
图1显示了用9-NC-DLPC脂质体气雾剂治疗期间皮下乳腺癌异种移植物的 生长。有6个小鼠进行9-NC治疗，另有和5个对照小鼠。每天治疗15分钟， 每周5天。剂量是8.1微克/千克/天。每一小鼠呼吸道中沉积的剂量估计为234ng/ 天。对肿瘤大小数据标准化，在治疗第17天两组肿瘤大小(最初肿瘤大小的％) 有明显的分歧(p＜0.011)。此后，由于大的坏死肿瘤块存在而使对照小鼠死亡。 图2显示其中两个经处理的小鼠于16天不处理之后，再用较高剂量药物处理， 的病程。用5倍量的9-NC脂质体气雾剂再开始治疗数天后，被治疗动物的肿瘤 迅速减小，于开始治疗后的第85天不再看到肿瘤。
实施例5
9-NC对小鼠中人体结直肠癌异种移植物的作用
在带有人体结肠癌异种移植物的裸鼠里进行相似的研究，结果如图3所示。 有15个被治疗小鼠和20个对照小鼠。10个对照动物接受空的DLPC脂质体，10 个不接受处理。不接受治疗或只接受DLPC的对照动物的肿瘤均迅速增大，到第36 天发生死亡。对照小鼠的肿瘤生长总速率比用9-NC-治疗小鼠的速率大7～11 倍。治疗小鼠被分成两组，每组10个。一组接受77微克/kg/天，每周治疗五天， 贯穿整个实验。另一组接受77微克/kg/天，每周5天，直到第35天，此时，剂 量增加到153微克/kg/天，每周治疗5天，直到第46天，此时剂量增加到307微 克/kg，给药方案相同，直到第61天。接受较高剂量的小鼠肿瘤大小增加稍慢， 但其差异统计学上不显著，图中组合了这些数据。在DLPC处理组里的四个小鼠由 于在第61天之前大肿瘤或肿瘤坏死而死亡，未处理组的6个小鼠在第61天前因 相同的原因死亡。治疗组5个小鼠因肿瘤坏死或衰弱而于第61天前死亡。高剂量 组的小鼠消瘦提示药物有毒性。另一个处理的小鼠由于直肠下垂而死亡。基于第 28天肿瘤生长速度减慢(p＜0.007，Student t-试验，双例)和死亡率减少的观 察，9-NC治疗有明确的治疗作用(p＜0.002-chi方试验)。
实施例6
9-NC对裸鼠中人体肺癌异种移植物的作用
另外，通过测量肿瘤体积来研究通过脂质体气雾剂或通过口服给药，9-NC- DLPC治疗对裸鼠中人体肺癌异种移植物(Spark)生长的作用。肿瘤移植后约2周 开始治疗。对照动物显示肿瘤的体积迅速增加。口服接受脂质体药物水悬浮液， 剂量为100微克/kg/天(为气雾剂剂量的两倍以上)动物对治疗没有反应。参见 图4。
气雾剂和口服制剂剂量在第13天加倍。增加剂量后，气雾剂治疗的小鼠中的 肿瘤变小，但口服治疗的小鼠中肿瘤大小没有减小。因此，尽管对小鼠进行气雾 剂给药有一半或更多剂量沉积在鼻、头部、气管和上部支气管，它被粘液膜纤毛 系统迅速运送到食管，在此被吞下，吸入的药物中沉积在肺部的部分主要对肿瘤 生长起作用。
气雾剂给药的清除效率最可能的解释是药物快速进入循环，由此它返回左心， 然后到大动脉和外周循环。因此，药物在“首过”时得到达肿瘤而不经过会从血 液中除去大量药物的肝脏。
实施例7
动物模型
裸鼠：这些实验中使用瑞士免疫缺陷裸鼠NIH-1高繁殖株，由Stehlin协会 哺育和安置(Giovella，B.C.等，用20-(S)-喜树碱治疗便裸鼠的人体癌异种 移植物的生长完全抑制。癌症研究(Cancer Research)1991 51：3052-3055)。
人体癌异种移植物：人体异种移植物建立于裸鼠。为了移植，将在0.5毫升 Eagles最低必需培养其中的湿重约50毫克的细细切碎的肿瘤注射到右背侧胸部 的皮肤下。在肿瘤移植后约10天对动物开始用实验药物治疗。用卡钳测量乳腺癌 的二维大小(即面积)，而结肠癌则用卡钳测量三维尺寸(即体积)。
实施例8
喜树碱脂质体气雾剂制剂和给药
由Stehlin协会(美国得克萨斯州Houston)的Beppino Giovanella博士 提供CPT和9-硝基喜树碱。从Avanti Polar Lipids(美国阿拉斯加Pelham) 得到DLPC。从Cis-USA，Inc.(美国马里兰Bedford)得到Aerotech II喷雾器。
为了配制脂质体，将9-NC(100毫克/毫升)或CPT(10毫克/毫升)溶于100 ％DMSO，并将其加到溶于叔丁醇(40℃)中的DLPC里，结果最终的DMSO浓度不 超过总体积的5％，药物与脂质体的比率为1∶50(w/w)。最终的悬浮液是澄清的。 若发生沉淀，再加热到50-60℃。使制剂在液氮里冷冻，并冻干过夜。使物质溶 于无菌水以得到合适的药物浓度供使用，任一药物均不超过1.0mg/ml。通过在偏 振光下以显微镜定性检查在脂质体里药物的包裹效率。未包入的药物为双折射晶 体。通过使脂质体的水悬浮液在PercollTM梯度中离心来考察包裹效率。1/10毫 升悬浮液在2毫升梯度上分层，以2000转/分钟离心25-30分钟。脂质体层在水 -Percoll界面上，而未包入的药物在试管的底部沉积。许多其它脂质可代替DLPC 进行配制并将脂质体通过气雾剂释放药物(Sugarman，S.M.等，与脂质复合的喜树 碱：配制以及初步生物分布和抗肿瘤活性研究。Cancer Chemotherapy Pharmacol. 1996 37：531-538)。
实施例9
HPLC分析
Waters(美国马里兰Milford)710B Wisp自动进样器和Waters Nova-Pak C18 柱在室温时用于定量CPT和9-NC。流动相是30％乙腈和70％ 0.1％冰乙酸。设置 激发波长370纳米、发射波长是440纳米，用Waters 470扫描荧光检测器检测CPT。 用Waters 440吸光检测器于254纳米检测9-NC。数据用Waters Millenium软 件分析。
实施例10
气雾剂液滴测定
根据以前的方法(Waldrep，J.C.等，J.Aerosol Med.1994 7：135-145)，气 雾剂液滴的大小用Andersen ACFM无生命环境颗粒筛析取样器测定(Andersen Instruments，Inc.Atlanta，Ga)。用KaleidaGraph 2.0(Synergy Software，Reading Pa.)测定总的中位空气动力学直径和几何标准差。气雾剂液体 由脂质体的水悬浮液构成。脂质体直径在水悬浮液里用3300型NICOMP激光颗粒 测径器测定。
实施例11
通过气雾剂释放的紫杉醇-DLPC脂质体的制备和效应
紫杉醇是另一类脂溶的、很容易包入脂质体制剂的抗癌药物。紫杉醇可直接 溶于叔丁醇而不与喜树碱相似地使用DMSO。紫杉醇脂质体制剂其它方面与喜树碱 相同。
紫杉醇与DLPC的最佳比是约1∶30wt∶wt。适合喷雾和气雾剂给药的制剂每 毫升用1毫克紫杉醇和30毫克DLPC生成。最佳的紫杉醇-DLPC脂质体，是使5 毫克紫杉醇与150毫克合成的α卵磷脂：二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)混合。在 37℃下使药物/DLPC在20毫升叔丁醇里搅拌混合。混合后，将药物/脂质制剂吸 入玻璃小瓶中，迅速冷冻，冻干过夜以除去叔丁醇，得到粉末。这样制备多层脂 质体：在DLPC相变温度(Tc)25℃之上加入5毫升超纯水，以释放最终的标准药物 浓度为每毫升1毫克紫杉醇：30毫克DLPC。使混合物在室温下保温30分钟，间 歇混合以产生多层囊小泡(MLV)脂质体。取出一分供HPLC测定药物浓度。
图5显示紫杉醇-DLPC脂质体气雾剂的粒径分布为1.4MMAD微米，几何标 准偏差为2.0，图6显示从图5所述制剂里回收的紫杉醇。在用于测量从喷雾器 (Aerotech II)喷出的紫杉醇的肺模型(Harvard呼吸器)中，87.75升气雾剂被取 样，得到3000微克紫杉醇。因此气雾剂浓度为34.2微克/升。从该信息可计算出， 吸入后沉积在呼吸道的气雾剂剂量。
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