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一种调节TH1/TH2细胞比例的组合物及制法.pdf

  • 上传人：Y948****062
  • 文档编号：8237638
  • 上传时间：2020-02-19
  • 格式：PDF
  • 页数：12
  • 大小：604.11KB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201310169577.0

    		 申请日：

    20130510
    公开号：

    CN103251715B

    		 公开日：

    20140827
    当前法律状态：

    		有效性：

    失效
    法律详情：

    IPC分类号：

    A61K36/752,A23L1/29,A61P37/04

    		 主分类号：

    A61K36/752,A23L1/29,A61P37/04
    申请人：

    南京中医药大学
    发明人：

    潘苏华,高青
    地址：

    210023 江苏省南京市栖霞区仙林大道138号
    优先权：

    CN201310169577A
    专利代理机构：

    		代理人：

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    内容摘要

    本发明涉及一种调节Th1/Th2细胞比例的组合物，它所含的活性成分由下列重量份的原料制备而成：蛹虫草40-80份，太子参300-700份，香橼100-300份，佛手100-300份，银杏叶提取物1-5份，经提取后按常规工艺制备成颗粒剂、散剂、片剂或胶囊剂，本发明还公开了其在制备升高Th1型细胞、降低Th2型细胞和调节Th1/Th2细胞比例的健康食品中的应用。

    权利要求书

    1.一种调节Th1/Th2细胞比例的组合物，其特征在于：所述的组合物中的活性成分由下列重量份的原料药制备而成：蛹虫草40-80份，太子参300-700份，香橼100-300份，佛手100-300份，银杏叶提取物1-5份。 2.如权利要求1所述用于调节Th1/Th2细胞比例的组合物，其特征在于：所述的组合物中的活性成分由下列重量份的原料药制备而成：蛹虫草60份，太子参500份，香橼150份，佛手150份，银杏叶提取物3份。 3.如权利要求1所述用于调节Th1/Th2细胞比例的组合物，其特征在于：所述的组合物是健康食品，剂型是颗粒剂、散剂、胶囊剂、片剂。 4.一种如权利要求1所述组合物的制备方法，其特征在于制备步骤为：取太子参，香橼和佛手，加入4-8倍药材总重量的水，浸泡20-40min，加热煮沸后改为小火煎煮20-50min，连续煎煮3-5次，过8层纱布，收集滤液，合并滤液，浓缩至稠膏，60-80℃烘干，即得太子参、香橼以及佛手的混合提取物稠膏；另取蛹虫草打成细粉后，加入到太子参、香橼以及佛手的混合提取物稠膏中，再加入银杏叶提取物，混合之后80℃烘干，打粉，按常规工艺制备成颗粒剂、散剂、片剂或胶囊剂。 5.根据权利要求4所述组合物的制备方法，其特征在于：太子参、香橼和佛手加水煎煮提取，每次加水量都为药材总重量的6倍，每次煎煮30min，连续3次。 6.如权利要求1所述的组合物在制备升高Th1型细胞的健康食品中的应用。 7.如权利要求1所述的组合物在制备降低Th2型细胞的健康食品中的应用。 8.如权利要求1所述的组合物在制备调节Th1/Th2细胞比例的健康食品中的应用。

    说明书

    技术领域

    本发明属于中药保健技术领域，具体涉及一种调节Th1/Th2细胞比例的组合物及 制法。

    背景技术

    机体免疫系统主要由免疫细胞、免疫器官以及免疫分子组成，其中T淋巴细胞亚 群是机体免疫细胞中比较活跃的免疫细胞，根据其表面分子和作用的不同分为不同的 亚群，主要包括人白细胞抗原4(CD4)，人白细胞抗原8(CD8)等，其中CD4细胞根 据分泌细胞因子的不同又分为Th1、Th2型细胞。Th1型细胞主要分泌γ-干扰素(IFN- γ)、白介素-2(IL-2)等细胞因子，介导细胞免疫应答，在自身免疫病的诱导过程中 起重要作用，其中IFN-γ可诱导Th1细胞分化，同时抑制Th2细胞增殖；Th2型细胞主 要分泌IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10和IL-13等细胞因子，与B细胞增殖、分化、成熟 有关，能促进抗体生成。目前的研究多采用IFN-γ和IL-4分别代表Th1、Th2型免疫应 答水平。在正常情况下，Th1/Th2细胞比例处于一种相对平衡的状态，但是由于环境 污染、饮食不当、情志改变等多因素刺激，机体出现Th1/Th2细胞比例紊乱，导致多 种免疫性疾病，如过敏性疾病，系统系红斑狼疮，全身性硬化病，多发性硬化病，特 异性皮炎等，机体主要表现为Th2型细胞占优势，Th1/Th2细胞比例降低等。

    以往曾有调节Th1/Th2细胞比例相关的发明专利，如：“抗过敏剂”(申请号： 200980163331.4)以青豆的溶剂提取物作为抗过敏剂。青豆的溶剂提取物具有抑制抗 体产生的作用，使Th1/Th2平衡偏向Th1侧的作用，另外，作为抗过敏剂，该发明重 点在于抗过敏，并且配方较为单一，难以达到综合调理机体免疫症状的目的。“抗过 敏的乳酸菌”(申请号：201010535315.8)，该发明含一种或多种所述乳酸菌菌株的组 合物，通过增进Th1型免疫反应，增进抗过敏的能力。“新颖乳酸菌株及其调节免疫 反应的用途”(申请号：201110404611.9)可升高IFN-γ、IL-10进而促进Th1反应， 抑制IL-4、IL-5从而抑制Th2反应，抑制过敏反应。“一种治疗哮喘的中药复方挥发 油部位及其制备方法”(申请号：200810020831.X)由甘草、麻黄、苦杏仁、半夏、 生石膏、细茶、五味子组成，能够显著显著抑制血清中炎性因子IL-4、IL-5水平、提 高血清IFN-γ水平，调节Th1/Th2的平衡，延长动物的引喘潜伏期，降低哮喘气道反 应性。由此可见，现有相关的保健品专利大多以单纯调整Th1/Th2细胞比例失衡，缓 解过敏症状为主，对于机体长期肝气郁结所致的免疫紊乱、免疫低下等症状没有明显 改善作用。因此，研究一种由药食两用原料制备的配方，调节Th1/Th2细胞比例，并 且疏肝解郁调节机体免疫状态的健康食品是非常必要的。

    发明内容

    本项发明目的：提供一种调节Th1/Th2细胞比例的组合物。本发明依据在于该组 合物能够升高Th1型细胞核转录因子T-bet mRNA的表达，升高脾脏细胞中CD4+IFN- γ+细胞表达，升高血清中IFN-γ的含量；降低Th2型细胞核转录因子GATA-3mRNA 的表达，降低脾脏细胞中CD4+IL-4+细胞表达，降低高血清中IL-4的含量；最终升高 Th1/Th2细胞比例，并且通过小鼠迟发型变态反应试验和小鼠脾脏淋巴细胞增增试验， 验证了本发明组合物具有增强免疫的功效。

    本项发明的解决方案：一种调节Th1/Th2细胞比例的组合物，它所含的活性成分 由下列重量份的原料制备而成：蛹虫草50-100份，太子参300-700份，香橼100-300 份，佛手100-300份，银杏叶提取物1-5份。

    术语“调节Th1/Th2细胞比例”是指升高Th1型细胞的数量，降低Th2型细胞的 数量，从而提高Th1/Th2细胞比例，实现Th1/Th2细胞比例平衡。

    上述用于调节Th1/Th2细胞比例的组合物，它所含的活性成分由下列重量份的原 料制备而成：蛹虫草60份、太子参500份，香橼150份，佛手150份，银杏叶提取 物3份。

    上述用于调节Th1/Th2细胞比例的组合物，它是健康食品，剂型是颗粒剂、散剂、 胶囊剂、片剂。

    上述用于调节Th1/Th2细胞比例的组合物的制备方法，制备步骤为：取太子参， 香橼，佛手，加入4-8份药材总重量的水，浸泡20-40min，加热煮沸后改为小火煎煮 20-50min，连续煎煮3-5次，过8层纱布，合并滤液浓缩至稠膏，60-80℃烘干即得 太子参、香橼、佛手的混合提取物稠膏；另取蛹虫草打成细粉后，加入到太子参、香 橼以及佛手的混合提取物稠膏中，再加入银杏叶提取物，混合之后80℃烘干打粉，按 常规工艺制备成颗粒剂、散剂、片剂或胶囊剂。

    上述调节Th1/Th2细胞比例的组合物的制备方法，其中太子参、香橼和佛手加水 煎煮提取，每次加水量为药材总重量的6倍，浸泡30min，加热煮沸后改为小火煎煮 30min，连续3次。

    本发明通过大量试验证明了该组合物能够升高Th1型细胞核转录因子T-bet  mRNA的表达，升高脾脏细胞中CD4+IFN-γ+细胞表达，升高血清中IFN-γ的含量； 降低Th2型细胞核转录因子GATA-3mRNA的表达，降低脾脏细胞中CD4+IL-4+细胞 表达，降低高血清中IL-4的含量。因此，本发明还提供了该组合物的三种工业化用途， 即：

    (1)上述的组合物在制备升高Th1型细胞健康食品中的应用。

    (2)上述的组合物在制备降低Th2型细胞健康食品中的应用。

    (3)上述的组合物在制备调节Th1/Th2细胞比例的健康食品中的应用。

    有益效果：本方以蛹虫草、太子参、银杏叶、香橼、佛手为方。本方以蛹虫草为 君，入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，调节阴阳平衡；臣以太子参补脾益肺， 生津；佐用银杏叶、香橼和佛手起到化瘀通络、宽中理气、舒肝健脾的作用。本发明 相伍发挥调节免疫、宽中理气、疏肝健脾之功。拟通过升高Th1型的细胞的表达，同 时降低Th2型的细胞的表达，来调整Th1/Th2细胞比例。本发明调节免疫紊乱机体 Th1/Th2细胞的比例，改善机体免疫紊乱症状。

    附图说明

    图1为各组小鼠脾脏T-bet mRNA表达水平柱状图。

    图2为各组小鼠脾脏GATA-3mRNA表达水平柱状图。

    具体实施方式：

    实施例1(颗粒剂)

    主料：

    蛹虫草又名北冬虫夏草、北虫草等，子囊菌亚门麦角菌目麦角菌科虫草属，购 自无锡山野菌物有限公司。太子参石竹目石竹科植物孩儿参的干燥块根，味甘微苦， 性微寒，归脾、肺经，购自句容市金五鑫中药材合作社。银杏叶提取物购自邳州富伟 生化制品有限公司，其中黄酮≥24％，萜内酯≥6％，符合药典标准。

    本发明制备方法：

    取太子参500份，香橼150份，佛手150份，加入药物总重量6倍的水，每次煎 煮30min，连续3次，收集滤液浓缩至稠膏。另取60份蛹虫草打成细粉后，加入到 稠膏中，再加入3份银杏叶提取物，混合之后80℃烘干，打粉。置于混合容器内混匀， 以85％的乙醇润湿，混匀制成软材，转移至摇摆式制粒机中，制粒，经80℃烘干， 整粒，分装，制成1000袋，2.5g/每袋。即得本发明的颗粒剂。

    实施例2(散剂)

    主料：同实施例1一致。

    制备方法：

    取太子参300份，香橼100份，佛手100份，加入药物总重量6倍的水，每次煎 煮30min，连续3次，收集滤液浓缩至稠膏。另取50份蛹虫草打成细粉后，加入到 稠膏中，再加入1份银杏叶提取物，混合之后80℃烘干，打粉。置于混合容器内混匀， 分装成1000袋，每袋2.5g。

    实施例3(胶囊剂)

    主料：同实施例1一致。

    制备方法：

    取太子参700份，香橼300份，佛手300份，加入药物总重量6倍的水，每次煎 煮30min，连续3次，收集滤液浓缩至稠膏。另取100份蛹虫草打成细粉后，加入到 稠膏中，再加入5份银杏叶提取物，混合之后80℃烘干，打粉。置于混合容器内混匀， 加入85％的乙醇适量，混匀制成软材，转移至摇摆式制粒机中，制粒，经80℃烘干， 整粒，混匀，以硬胶囊填充机填充于0号胶囊内，制成1000粒，每粒0.5g。

    实施例4(片剂)

    主料：同实施例1一致。

    制备方法：

    取太子参600份，香橼200份，佛手200份，加入药物总重量6倍的水，每次煎 煮30min，连续3次，收集滤液浓缩至稠膏。另取80份蛹虫草打成细粉后，加入到 稠膏中，再加入4份银杏叶提取物，混合之后80℃烘干，打粉。置于混合容器内混匀， 加入85％的乙醇适量，混匀制成软材，转移至摇摆式制粒机中，制粒，经80℃烘干， 整粒，加入适量滑石粉、硬脂酸镁、干淀粉，混匀，压片，制成1000片，0.5g/每片。 实施例5：本发明对IFN-γ、IL-4的影响

    目的：

    用氢化可的松腹腔注射造成免疫低下模型小鼠，比较受试样品组和模型组小鼠血 清中IFN-γ、IL-4含量的差别，来判断受试样品是否对Th1、Th2有不同的调节作用。

    方法：

    受试物溶液配制：取按上述实施例1方法制备的颗粒剂1.43g，加蒸馏水研磨定 容至10ml，即得灌胃本发明的高剂量组，生药浓度为1.43g/kg；取高剂量2ml加入 4ml蒸馏水，混合均匀即得灌胃本发明的中剂量组，生药浓度为0.48g/kg；取高剂量 1ml加入5ml蒸馏水，混合均匀即得灌胃本发明的低剂量组，生药浓度为0.24g/kg；

    氢化可的松的配制：准确称取0.025g氢化可的松溶于10mL生理盐水中，充分 溶解。

    香菇多糖菌溶液的配制：取1片香菇多糖菌片(10mg)，加入20mL蒸馏水研磨 均匀，既得到5mg/mL的香菇多糖菌溶液。

    实验步骤：

    BALB/C小鼠按随机区组分组法将小鼠分组，每组10只。正常组、模型组、阳性 药组，每天灌胃给水；复方低、中、高剂量组分贝给予0.24，0.48，1.43g/kg本受试物溶 液，各组0.1mL/10gBW，连续灌胃四周，第三周开始正常组腹腔注射生理盐水同时灌 胃给水；模型组腹腔注射25mg/kg氢化可的松注射液同时灌胃给水；阳性药组腹腔注 射氢化可同时灌胃给香菇菌多糖片混悬液；复方低、中、高剂量组腹腔注射氢化可的 松同时灌胃给本受试物溶液，腹腔注射剂量为0.2mL/只，连续7d。灌胃结束之后实 验前禁食12h，眼眶取血，室温静置2h，3500r·min-1离心15min，取上清检测IFN-γ、 IL-4。

    结果：

    本受试样品显著升高模型小鼠血清中IFN-γ浓度，升高IFN-γ/IL-4的比值，如 下表所示。

    表1血清中IL-4、IFN-γ的含量()

    注：与正常组相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组相比

    P＜0.05，

    P＜0.01

    结论：

    本受试品能够上调IFN-γ浓度，下调IFN-γ/IL-4比值，也就是本品可以调节IFN- γ/IL-4的比例。

    实施例6：脾脏细胞中CD4+IFN-γ+、CD4+IL-4+细胞的阳性表达率。

    目的：

    用氢化可的松腹腔注射造成免疫低下模型小鼠，比较受试样品组和模型组小鼠脾 淋巴细胞中CD4+IFN-γ+、CD4+IL-4+含量的差别，来判断受试样品是否对CD4+IFN- γ+、CD4+IL-4+有不同的调节作用。

    方法：

    受试物溶液配制：同实施例5一致。

    香菇菌多糖片混悬液，氢化可的松注射液的配制：同实施例5一致。

    实验步骤：

    BALB/c小鼠按随机分组法，每组12只。正常组、模型组、阳性药组，每天灌胃 给水；复方低、中、高剂量组分别给予：0.24，0.48，1.43g/kg本受试物溶液，各组0.1 mL/10gBW，连续灌胃三周之后，第四周开始正常组腹腔注射生理盐水同时灌胃给水； 模型组腹腔注射25mg/kg氢化可的松注射液同时灌胃给水；阳性药组腹腔注射氢化可 同时灌胃给香菇多糖菌混悬液；复方低、中、高剂量组腹腔注射氢化可的松同时灌胃 给本受试物溶液。各组灌胃剂量为0.1mL/10gBW，腹腔注射剂量为0.2mL/只，连续 7d。灌胃结束之后取出脾脏，按照常规研磨脾脏淋巴细胞，如下操作：

    (1)刺激细胞：取1×108个/mL脾脏细胞200uL，加入到2mL管中，加300uL  PRMI1640培养液，再加入2uL佛波酯/离子霉素(PMA/Ionomycin)和2uL布雷菲德菌 素A/莫能菌素(BFA/Monensin)，涡旋混匀。在37℃CO2培养箱中培养5h。另外设 CD4对照对照(PMA/Ionomcin和BFA/Monensinhe都加)和未刺激对照(不加 PMA/Ionomcin，但是加BFA/Monensinhe)，其余操作一致。

    (2)标记CD4抗体：涡旋混匀，加到2mL试管底部，然后加入5uL CD4FITC 抗体，涡旋混匀，室温避光孵育30min。

    (3)破膜：加入100uL破膜剂，室温避光孵育15min。孵育结束之后加入1.5mL 染色缓冲液，1800rpm/min离心5min，弃上清。

    (4)固定和胞内染色：加入100uL固定液，再加入5uL IFN-γPE和5uL IL-4 APC，涡旋混匀，室温避光孵育30min。孵育结束之后加入1.5mL流式缓冲液，1800 rpm/min离心5min，弃上清。CD4对照组不加IFN-γPE和IL-4APC，未刺激对照组都 加IFN-γPE和IL-4APC，其余操作一致。

    (5)检测：加150uLbuffer配制的1％的多聚甲醛，涡旋混匀，转移至相应流式管 中，上级检测。

    结果：

    本受试样品显著升高模型小鼠脾脏淋巴细胞中CD4IFN-γ+细胞的含量，显著升 高CD4+IFN-γ+/CD4+IL-4+比值，如下表所示。

    表2脾细胞中CD4+IFN-γ+、CD4+IL-4+含量变化()

    注：与正常组相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，与模型组相比

    P＜0.05，

    P＜0.01。

    实施例7：Real time PCR检测Th1、Th2型细胞核转录因子的表达水平

    目的：

    用氢化可的松腹腔注射造成免疫低下模型小鼠，比较受试样品组和模型组小鼠脾 脏组织中Th1型核转录因子T-bet以及Th2型核转录因子GATA-3mRNA表达水平的 差别，来判断受试样品是否对T-bet、GATA-3有不同的调节作用。

    方法：

    受试物溶液配制：同实施例5一致。

    香菇菌多糖混悬液，氢化可的松注射液的配制：同实施例5一致。

    实验步骤：

    BALB/c小鼠按随机区组分组，每组12只。正常组、模型组、阳性药组，每天灌 胃给水；复方低、中、高剂量组分贝给予0.24，0.48，1.43g/kg本受试物溶液，各组 0.1mL/10gBW，连续灌胃三周之后，第四周开始，正常组腹腔注射生理盐水同时灌胃 给水；模型组腹腔注射25mg/kg氢化可的松注射液同时灌胃给水；阳性药组腹腔注射 氢化可的松同时灌胃给香菇多糖菌混悬液；复方低、中、高剂量组腹腔注射氢化可的 松同时灌胃给不同浓度的本受试物溶液。各组灌胃剂量为0.1mL/10gBW，腹腔注射 剂量为0.2mL/只，连续7d。实验所用的器材都预先用焦碳酸二乙酯(DEPC)水浸 泡过夜，灭菌烘干。实验前小鼠禁食12h，处死小鼠，小心取出脾脏，用DEPC水处 理过的锡箔纸包裹放入冻存管中，迅速放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存备 用，避免反复冻融。

    1.转录因子T-bet mRNA的检测：

    (1)提取组织RNA

    ①准确称量50mg脾脏组织，放入10mL离心管中，冰上放置。加入1mL的Trizol 总RNA提取液，冰水中匀浆，5000s，10s连续匀浆3次。转移到一套新的1.5mL EP 管中，室温放置5min，4℃，12000rpm离心5min，小心吸出上清到一个新的1.5mLEP 管中。

    ②每个EP管中加氯仿200uL，手摇剧烈振荡混合15s，混匀之后室温放置15min， 4℃，12000rpm离心15min。

    ③小心的转移上层水相到一新的1.5mL EP管中。

    ④每管加400uL异丙醇，手摇剧烈振荡混合15s，室温放置3min，4℃12000rpm 离心10min，小心吸掉上清，不要碰及底部沉淀。

    ⑤加1mL75％无水乙醇(DEPC∶乙醇＝1∶3现用现配)，小心润洗，4℃，1000rpm离 心5min，小心吸掉上清，尽可能吸干残余乙醇。

    ⑥室温放置5-10min，使RNA沉淀风干至比较干燥。

    ⑦每个管中加20uL DEPC水，小心吹打至RNA完全溶解。

    (2)测RNA浓度

    将每个样本稀释75倍，根据试剂盒说明书检测A260、A280以及浓度(ng/uL)。

    RNA浓度＝检测浓度×稀释倍数(75倍)×10-3ug/uL。计算各个样本RNA的浓度。

    (3)逆转录

    ①稀释各个样本RNA浓度稀释为1ug/uL，小心吹打均匀，冰上放置备用。

    ②按照试剂盒说明书操作

    (4)扩增

    将T-bet基因引物以及内参β-actin基因引物分别加适量的DEPC水，将其浓度配制 为100uM(即100umol/L)，小心吹打均匀。取10uL原引物(100umol/L)加到EP管底 部，加入190uL DEPC水，小心吹打均匀，浓度为5umol/L。检测条件：95℃20-30sec， 95℃10-15sec，60℃10-30sec，35～40Cycles，65℃～95℃0.5℃increment2～5 sec/step。

    2.转录因子GATA-3mRNA的检测步骤同转录因子T-bet mRNA的检测步骤一致。

    结果：

    小鼠脾脏T-bet mRNA表达水平：本受试样品显著升高模型小鼠脾脏组织T-bet  mRNA水平的表达(见图1)。

    小鼠脾脏GATA-3mRNA表达水平：本受试样品显著升高降低小鼠脾脏组织 GATA-3mRNA水平的表达(见图2)。

    实施例8：迟发型变态反应(DTH)

    目的：

    用小鼠左右耳重量之差表示DTH的程度，比较受试样品组的左右耳差值和对照 组的差值来判断受试样品是否有阳性效果。

    方法：

    试剂配制：

    受试物溶液配制：同实施例5一致。

    2，4二硝基氟苯(DNFB)溶液的配制：称取DNFB50mg，置清洁干燥小瓶中， 将预先配好的5mL丙酮麻油溶液，丙酮∶麻油的比例为1∶1，倒入小瓶，盖好瓶塞 并用胶布密封。混匀后，用250ul注射器通过瓶盖取用。

    盐酸左旋咪唑溶液的配制：盐酸左旋咪唑(南京白敬宇制药有限责任公司，批号 100101，有效成分含量为25mg/每片)。取盐酸左旋咪唑一片加入31.25mL的蒸馏水， 研磨均匀至完全溶解。

    蛹虫草粉末混悬液的配制：称取0.3g蛹虫草细粉，加入10mL蒸馏水，在研钵 中研磨均匀。

    实验步骤：

    KM种小鼠72只，随机区组法分成6组。正常对照组小鼠灌胃给予蒸馏水；阳 性药组灌胃给予8mg/kg盐酸左旋咪唑；蛹虫草组给予0.3g/kg蛹虫草粉末混悬液； 复方低、中、高剂量组分别灌胃给予不用浓度受试物，每个、组小鼠经口按0.1ml/10g 体积连续灌胃30d，每天1次，灌胃第25d时，每鼠腹部皮肤刮毛，范围约3×3cm， 用DNFB溶液50ul均匀涂抹致敏。灌胃第30d末次给药30min之后，各组小鼠用 10ul的DNFB涂抹于小鼠右耳(两面)攻击，24h后处死小鼠，取8mm直径的耳片 称重，左右耳重量之差表示DTH的程度。

    结果：

    阳性药组小鼠的耳朵肿胀程度高于正常对照组，受试样品低、高剂量组小鼠的耳 朵肿胀程度高于正常对照组，如下表所示。

    表3本发明对DNFB诱导小鼠DTH和脏器指数的影响()

    注：与正常对照组比较，

    P＜0.01，

    P＜0.05；与蛹虫草组相比△△p＜0.01，△P＜0.05

    结论：本受试品具有增强免疫功效，并且复方优于单味蛹虫草生药。

    实施例9：脾脏淋巴细胞增殖

    目的：

    用不同浓度的本品灌胃小鼠30d，比较受试样品组和正常组小鼠受ConA诱导的 脾脏淋巴细胞增殖的差别，来判断受试样品是否增强脾脏淋巴细胞增殖。

    方法：

    受试物溶液配制：同实施例5一致。

    实验步骤：

    BALB/c小鼠，按体重分层随机分组，每组12只。如下表所示，正常组灌胃给水； 盐酸左旋咪唑组灌胃盐酸左旋咪唑；复方低、中、高剂量组分别灌胃0.24，0.48，1.43 g·kg-1本受试样品，各组连续灌胃给药30d。无菌取脾，按照常规制成单个细胞悬液， 调整细胞浓度为5×105个/mL。将脾细胞混悬液加在24孔板中，每孔1mL，每只动 物设二个复孔，一孔正常培养(加50uLPRMI1640培养液)；一孔加50uL刀豆蛋白 A(ConA)液(终浓度为4.76ug/mL)。置于5％CO2，37℃ CO2孵箱中培养48h。实 验结束前4h，每孔吸去上清液700uL，再加入700uL不含胎牛血清的PRMI1640培 养液，同时每孔加入50uL5mg/mL的MTT液。培养结束后，每孔加1mL酸性异丙 醇，小心吹打均匀至紫色的结晶全部溶解。检测前分装到96孔培养板中，每孔作4 个复孔，在570nm波长处测定其光密度值。

    实验结果：

    受试品组小鼠脾脏淋巴细胞受ConA诱导后的增殖率转化值显著高于正常组小 鼠，如下表所示。

    表4本受试物溶液对脾淋巴细胞增殖的影响()

    注：与正常组相比

    P＜0.01，

    P＜0.05。

    结论：本受试品能够增强脾脏淋巴增殖。

    实施例10：安全性实验

    目的：观察小鼠给予受试品后活动情况和死亡情况，确定本发明安全性。

    方法：

    受试品溶液的配制：取将实施例1的颗粒14.3g，加蒸馏水20mL配制成含复方 颗粒0.715g/mL的最大浓度试液。

    实验步骤：

    BALB/c小鼠雌雄各半，每组10只(由上海斯莱克提供)，受试品以最大浓度最 大体积经口灌胃给予后，连续观察7天，详细记录小鼠反应情况。灌胃后活动情况和 死亡情况，确定本发明安全性。

    结果：

    以0.2ml/10g的剂量灌胃给受试物后，小鼠活动正常，且在灌胃后小鼠未出现死 亡，无其他异常情况。连续观察7天后，无小鼠出现死亡和其他异常情况。

    结论：

    本受试品最大耐受剂量为14.3g/kg，属于无毒类范畴，具有安全性。

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    一种 调节 TH1 TH2 细胞 比例 组合 制法
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