一种袋鼠骨素及其提取方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103330719 A (43)申请公布日 2013.10.02 CN 103330719 A *CN103330719A* (21)申请号 201310153713.7 (22)申请日 2013.04.27 A61K 35/32(2006.01) A23L 1/29(2006.01) A61P 3/02(2006.01) A61P 3/14(2006.01) A61P 19/10(2006.01) (71)申请人 南京优而生物科技发展有限公司 地址 210000 江苏省南京市江宁区彤天路 101 号 (72)发明人 屈贤琴 金星亮 杨五宁 金肖强 (74)专利代理机。

2、构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 柏尚春 (54) 发明名称 一种袋鼠骨素及其提取方法 (57) 摘要 本发明公开了一种袋鼠骨素及其提取方法， 取袋鼠骨清洗、 碾碎后， 酸消化以去矿物质化， 利 用蛋白质提取液进一步多次消化， 然后用有机溶 剂浸提去除杂质， 干燥获得袋鼠骨素蛋白颗粒。 本 发明的提取方法获得的蛋白颗粒每克含有蛋白质 9.5 10.7mg， 骨钙素 4.8 6.13mg， 骨形成蛋 白 4.3510-3ng。本发明的方法可从袋鼠骨中提 取五百多种蛋白质混合物， 包括骨钙素、 骨粘连蛋 白、 骨形成蛋白、 碱性磷酸酶、 胰岛素样生长因子 等， 其中。

3、与骨代谢相关的蛋白有三十多种， 对诱导 骨髓间充质干细胞分化为骨细胞和软骨细胞有较 理想的促进作用， 可用于防治骨关节疾病如骨质 疏松症等。本发明的提取方法获得的袋鼠骨素蛋 白颗粒含有的蛋白质及相关有效成分多， 提取效 果好， 可作为防治骨关节疾病的保健品和药品的 基本原料， 提高了袋鼠产品的品质和效果。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103330719 A CN 103330719 A *CN103330719A* 1/1 页。

4、 2 1. 一种袋鼠骨素的提取方法， 其特征在于包括如下步骤 ： （1） 去除与袋鼠骨相连的软组织， PBS 清洗后剁碎、 碾压获得袋鼠骨碎片 ； （2） 向所述袋鼠骨碎片中加入盐酸溶液， 于 4下封盖消化， 清洗后获得去矿化骨碎 片 ； （3） 向所述去矿化骨碎片中加入蛋白质提取液， 于 4下封盖消化， 然后离心收集上层 液 ； 该步骤再重复 12 次 ； 其中， 所述蛋白质提取液中包括 PBS、 盐酸胍、 Tris、 脱氧胆酸、 SDS、 氟化钠、 焦磷酸钠、 PMSF、 抑肽酶、 亮肽素、 胃酶抑素 A ； （4） 将所述步骤 （3） 收集到的上层液与预冷的丙酮 - 三氯乙酸混合溶液混合。

5、， 加盖密 封， 低温静置沉淀蛋白质， 然后高速离心， 除去上清液 ； （5） 开放空间挥发有机溶剂， 获得干燥的袋鼠骨素蛋白颗粒。 2.根据权利要求1所述的一种袋鼠骨素的提取方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （4） 之后还 通过加入预冷丙酮浸提有机杂质， 高速离心后出去上清液。 3.根据权利要求1所述的一种袋鼠骨素的提取方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （2） 中的盐 酸溶液浓度为 1.2 mol/L， 每克袋鼠骨碎片中加入 68 ml。 4. 根据权利要求 1 所述的一种袋鼠骨素的提取方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （3） 中， 每 克去矿化袋鼠骨碎片中加入 810 ml 所述蛋白质提取。

6、液， 所述提取液包括 PBS、 510 mol/L 盐酸胍、 0.010.2 mol/L Tris、 2030 mmol/L 脱氧胆酸、 0.2% SDS、 1525 mmol/L 氟化钠、 1525 mmol/L 焦磷酸钠、 13 mmol/L PMSF、 24 mmol/L 抑肽酶、 35 mmol/L 亮肽素、 24 mmol/L 胃酶抑素 A。 5. 根据权利要求 4 所述的一种袋鼠骨素的提取方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （3） 中， 蛋 白质提取液包括 PBS、 8 mol/L 盐酸胍、 0.1 mol/L Tris、 24 mmol/L 脱氧胆酸、 0.2% SDS、 20 m。

7、mol/L 氟化钠、 20 mmol/L 焦磷酸钠、 2 mmol/L PMSF、 3.08 mmol/L 抑肽酶、 4.2 mmol/ L 亮肽素、 2.91 mmol/L 胃酶抑素 A。 6. 根据权利要求 1 所述的一种袋鼠骨素的提取方法， 其特征在于 ： 所述袋鼠骨取自东 部灰大袋鼠 （Macropus giganteus） 。 7. 如权利要求 1 所述一种袋鼠骨素的提取方法获得的袋鼠骨素蛋白颗粒， 其特征在 于 ： 所述袋鼠骨素蛋白颗粒每克含有蛋白质 9.510.7 mg。 8. 根据权利要求 7 所述的一种袋鼠骨素的提取方法获得的袋鼠骨素蛋白颗粒， 其特征 在于 ： 所述袋鼠骨素。

8、蛋白颗粒中每克含有骨钙素 4.86.13 mg， 骨形成蛋白 4.3510-3 ng。 权 利 要 求 书 CN 103330719 A 2 1/4 页 3 一种袋鼠骨素及其提取方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体地说涉及一种袋鼠骨素及其提取方法。 背景技术 0002 袋鼠是澳洲的特有的物种， 袋鼠工业也因此得到重视。目前袋鼠皮革和袋鼠肉都 得到广泛的开发， 而袋鼠骨的应用则很少， 尽管目前市场上有些公司出售袋鼠骨胶囊， 但该 保健品仅仅通过简单的研磨制成， 价格昂贵且保健效果低。 0003 动物骨骼中含有如骨钙素、 骨粘连蛋白、 骨形成蛋白、 碱性磷酸酶、 胰岛素样生长 。

9、因子等， 对于钙质补充、 防治骨质疏松、 增强体质有较好的效果， 可用于补钙， 治疗骨质疏松 症。而袋鼠骨中含有较多的有效成分， 却没有进行很好的开发。 发明内容 0004 发明目的 ： 本发明的目的是提供一种袋鼠骨素的提取方法 ； 本发明的另一个目的 是提供前述方法提取获得的袋鼠骨素蛋白。 0005 技术方案 ： 为了实现上述发明目的， 本发明的一种袋鼠骨素的提取方法包括如下 步骤 ： 0006 （1） 去除与袋鼠骨相连的软组织， PBS 清洗后剁碎、 碾压获得袋鼠骨碎片 ； 0007 （2） 向所述袋鼠骨碎片中加入盐酸溶液， 于 4下封盖消化， 清洗后获得去矿化骨 碎片 ； 0008 （3。

10、） 向所述去矿化骨碎片中加入蛋白质提取液， 于 4下封盖消化， 然后离心收集 上层液 ； 该步骤再重复 1 2 次 ； 0009 其中， 所述蛋白质提取液中包括 PBS、 盐酸胍、 Tris、 脱氧胆酸、 SDS、 氟化钠、 焦磷酸 钠、 PMSF、 抑肽酶、 亮肽素、 胃酶抑素 A ； 0010 （4） 将所述步骤 （3） 收集到的上层液与预冷的丙酮 - 三氯乙酸混合溶液混合， 加盖 密封， 低温静置沉淀蛋白质， 然后高速离心， 除去上清液 ； 0011 （5） 开放空间挥发有机溶剂， 获得干燥的袋鼠骨素蛋白颗粒。 0012 作为本发明的进一步优化， 所述步骤 （4） 之后还通过加入预冷丙酮。

11、浸提有机杂质， 高速离心后出去上清液。该步骤与所述步骤 （4） 优选条件下， 是在零下 20 摄氏度浸提， 效 果最好。 0013 为符合袋鼠骨细胞特质， 所述步骤 （2） 中的盐酸溶液浓度为 1.2mol/L， 每克袋鼠 骨碎片中加入68ml。 在该浓度下盐酸消化速度较快， 且可较完整地保留活性物质的有效 性。 0014 所述步骤 （3） 中， 每克去矿化袋鼠骨碎片中加入 8 10ml 所述蛋白质提取液， 所 述提取液包括PBS、 510mol/L盐酸胍、 0.010.2mol/L Tris、 2030mmol/L脱氧胆酸、 0.2%SDS、 15 25mmol/L 氟化钠、 15 25mm。

12、ol/L 焦磷酸钠、 1 3mmol/L PMSF、 2 4mmol/ L 抑肽酶、 3 5mmol/L 亮肽素、 2 4mmol/L 胃酶抑素 A。所述步骤 （3） 的消化时间为 60 说 明 书 CN 103330719 A 3 2/4 页 4 90 小时， 作为优选方案， 消化时间为 72 小时。 0015 作为本发明的最优方案， 所述步骤 （3）中， 蛋白质提取液包括 PBS、 8mol/L 盐酸 胍、 0.1mol/L Tris、 24mmol/L 脱氧胆酸、 02%SDS、 20mmol/L 氟化钠、 20mmol/L 焦磷酸钠、 2mmol/L PMSF、 3.08mmol/L 。

13、抑肽酶、 4.2mmol/L 亮肽素、 2.91mmol/L 胃酶抑素 A。 0016 本发明所述袋鼠骨取自目前所有品种的袋鼠， 作为优选方案， 所述袋鼠骨取自东 部灰大袋鼠 （Macropus giganteus） 。 0017 对于本发明上述袋鼠骨素的提取方法获得的袋鼠骨素蛋白颗粒， 经过 Bradford 法分光光度计测定， 所述袋鼠骨素蛋白颗粒每克含有蛋白质 9.5 10.7mg。 0018 经测定， 所述袋鼠骨素蛋白颗粒中每克含有骨钙素 4.8 6.13mg， 骨形成蛋白 4.3510-3ng。 0019 有益效果 ： 本发明的袋鼠骨素提取方法可从袋鼠骨中提取五百多种蛋白质混合 物，。

14、 包括骨钙素、 骨粘连蛋白、 骨形成蛋白、 碱性磷酸酶、 胰岛素样生长因子等， 其中与骨代 谢相关的蛋白有三十多种， 对诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞和软骨细胞有较理想 的促进作用， 作为可治疗骨关节疾病保健品和药物的原料。本发明的提取方法获得的袋鼠 骨素蛋白颗粒含有的蛋白质及相关有效成分多， 提取效果好， 提高了袋鼠产品的市场品质 和效果。 附图说明 0020 图 1 是试验例 3 中人类骨髓间充质干细胞染色后下高倍显微镜成像图 ； 0021 图2是试验例3中通过加入本发明袋鼠骨素后诱导分化获得的成骨细胞在碱性磷 酸酶染色下的高倍显微镜成像图 ； 0022 图3是试验例3中通过加入本发明。

15、袋鼠骨素后诱导分化获得的软骨细胞在天狼猩 红染色下的高倍显微镜成像图。 具体实施方式 0023 下面结合实施例对本发明进行进一步说明。 0024 实施例 1 0025 一种袋鼠骨素的提取方法， 包括步骤如下 ： 0026 （1）选取健康袋鼠的骨骼， 由于澳洲袋鼠工业比较发达， 而东部灰大袋鼠 （Macropus giganteus） 的种群数量较大， 袋鼠肉和袋鼠皮加工业较发达， 因此选用其作为 袋鼠骨的原料。将袋鼠骨用利刀去除与袋鼠骨相连的软组织， PBS 清洗后剁碎、 碾压获得袋 鼠骨碎片， 碎片的长宽为 2 10 毫米， 厚度为 1 2 毫米， 然后移至玻璃容器内。 0027 （2） 向。

16、袋鼠骨碎片中加入盐酸溶液， 盐酸溶液浓度为 1.2mol/L， 每克袋鼠骨碎片中 加入 6 8ml， 于 4下封盖消化 12 小时去矿化， 用纯净水清洗 3 次后， 移液吸取洗液， 获得 去矿化骨碎片。 0028 （3） 向去矿化骨碎片中加入蛋白质提取液， 于 4下封盖消化 72 小时， 每克去矿化 袋鼠骨碎片中加入 8 10ml 蛋白质提取液， 提取液包括 PBS、 5 10mol/L 盐酸胍、 0.01 0.2mol/L Tris、 20 30mmol/L 脱氧胆酸、 0.2%SDS、 15 25mmol/L 氟化钠、 15 25mmol/ L 焦磷酸钠、 1 3mmol/L PMSF、 。

17、2 4mmol/L 抑肽酶、 3 5mmol/L 亮肽素、 2 4mmol/L 胃 说 明 书 CN 103330719 A 4 3/4 页 5 酶抑素 A。 0029 优选地， 蛋白质提取液包括 PBS、 8mol/L 盐酸胍、 0.1mol/L Tris、 24mmol/L 脱氧胆 酸、 02%SDS、 20mmol/L 氟化钠、 20mmol/L 焦磷酸钠、 2mmol/L PMSF、 3.08mmol/L 抑肽酶、 4.2mmol/L 亮肽素、 2.91mmol/L 胃酶抑素 A。 0030 然后于 7500xg25离心 10 分钟， 收集上层液 ； 该步骤再重复 1 2 次， 离心获。

18、得 的沉渣丢弃。 0031 （4） 将步骤 （3） 收集到的上层液按 4:1 的体积比， 与预冷的丙酮 - 三氯乙酸混合溶 液混合， 其中丙酮 - 三氯乙酸混合溶液中， 三氯乙酸按体积占 10%。以上溶液混合后加盖密 封， 于零下 20 摄氏度静置沉淀蛋白质， 然后 15000x g 高速离心， 除去上清液。 0032 然后加入同体积的 100% 丙酮， 于零下 20 摄氏度恒温 15 分钟， 再以 15000xg 离心 5 分钟， 移除上层液。 0033 （5） 开放空间挥发有机溶剂， 1 2 小时后即可获得干燥的袋鼠骨素蛋白颗粒。 0034 对于本发明上述袋鼠骨素的提取方法获得的袋鼠骨素蛋。

19、白颗粒， 经过 Bradford 法分光光度计测定， 袋鼠骨素蛋白颗粒每克含有蛋白质 9.5 10.7mg。 0035 在将上述袋鼠骨素蛋白颗粒通过Tris-HCl/1%SDS SDS-PAGE电泳进行蛋白质组学 分析， 将凝胶上分级的蛋白质切割回收， 进行凝胶中胰蛋白酶的消化， 采用纳升级反向高效 液相色谱进行进一步分割和定性， 经测定， 该方法获得的袋鼠骨中可提取到蛋白质 532 种， 其中， 袋鼠骨素蛋白颗粒中每克含有骨钙素 4.8 6.13mg， 骨形成蛋白 4.3510-3ng。 0036 试验例 1 0037 袋鼠被誉为世界上跳得最远的哺乳动物， 现有研究发现袋鼠的骨骼中， 和骨代。

20、谢 有关的活性成分其生物活性和吸收能力较强。本发明采用袋鼠骨， 特别是采用东部灰大袋 鼠获得的袋鼠骨素， 提取效率高， 经鉴定含有的有效成分也高。 0038 本试验通过选取不同动物， 采用和实施例 1 相同的提取方法， 获得若干干燥颗粒 状样品， 然后在相同条件下进行 SDS-PAGE 电泳分级、 切割、 回收， 以骨钙素和骨形成蛋白作 为主要参考指标， 结果如表 1 所示 ： 0039 表 1 不同物种相同提取方法下蛋白提取效果 0040 0041 试验例 2 0042 现有技术往往通过碾压、 粉碎等简单的方法获得骨粉， 有的也通过加热， 导致其有 效成分损失极大， 其利用率大大受到影响。 。

21、而本发明通过先后通过酸消化和酶消化， 蛋白质 有效成分的提取效果显著。下面结合试验进行说明。 说 明 书 CN 103330719 A 5 4/4 页 6 0043 选取东部灰大袋鼠骨骼， 分为3组进行试验， 组A采用如实施例1的方式提取， 组B 采用如实施例 1 中步骤 （1） 、（2） 后， 粉碎成细末， 通过 Bradford 法分光光度计测定蛋白质 含量， 结果如表 2 所示 ： 0044 表 2 不同提取方法对蛋白质提取率的影响 0045 0046 虽然目前消化骨组织并获得骨蛋白质和有效成分的方法很多， 但本方法的蛋白质 提取液实现了骨蛋白提取的最优化。通过粉碎等机械方式获得的有效蛋。

22、白质成分极低， 而 本发明的方法提取效率高， 蛋白质在提取过程中损失少， 为其作为防治骨关节疾病保健品 和药物的原料， 推广相关产品市场奠定了有效的保障。 0047 试验例 3 0048 利用人类骨髓间充质干细胞 （如图 1 所示） 在含 10% 小牛血清 （FBS） 的 DMEN 完全 培养基 （购于 Stem Cell Technologies, 加拿大） 以 5000/cm2密度接种扩增传代， 然后加入 袋鼠骨素后诱导分化为成骨细胞和软骨细胞。成骨细胞采用碱性磷酸酶染色， 软骨细胞采 用天狼猩红染色， 染色后高倍显微镜下骨细胞图如图 2、 图 3 所示。 0049 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出 ： 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 103330719 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103330719 A 7 。