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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510735684.4 (22)申请日 2015.11.02 A61K 36/62(2006.01) (71)申请人 华中农业大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街 1 号 (72)发明人 徐晓云 李慧 潘思轶 王可兴 (74)专利代理机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 代理人 徐绍新 (54) 发明名称 一种莲子心黄酮提取物的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种莲子心黄酮提取物的制备 方法， 它以莲子心为主要原料， 先用乙醇浸提得到 莲子心粗提取物， 然后再采用高速逆流色谱分离 富集黄酮类成分， 。
2、其中高速逆流色谱分离溶剂体 系为乙酸乙酯正丁醇水 (1 2) (1 5)(38)。 本发明可分离出三个色谱峰， 同时 获得三个黄酮类组分， 所得到的提取物中黄酮含 量和产率均明显高于现有的制备方法。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 105343190 A 2016.02.24 CN 105343190 A 1/1 页 2 1.一种莲子心黄酮提取物的制备方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 1) 将莲子心粉用温度为 70 80、 重量为莲子心粉 10 30 倍的 65 85乙醇水溶 液浸提 1 3h， 。
3、提取液真空浓缩至相对密度为 1.1 1.2， 然后用非极性有机溶剂萃取 3 5 次， 将水相浓缩后冻干， 得莲子心粗提取物 ； 2) 将乙酸乙酯、 正丁醇、 水按 (1 2) (1 5) (3 8) 的体积比混合后静置过 夜， 分离上相和下相， 真空脱气 ； 3)取莲子心粗提取物， 用下相将其溶解成4080mg/mL的溶液， 使用TBE-300C高速逆 流色谱仪进行分离， 分离时溶剂体系温度为 25 30， 以上相为固定相， 以下相为流动相， 具体操作步骤为 ： 先将固定相以 30 50mL/min 的流速泵入高速逆流色谱仪， 待检测器出 口端流出固定相后停泵 ； 然后再设置主机正转转速为 6。
4、00 1000rpm/min， 将流动相以 5 15mL/min的流速泵入高速逆流色谱仪， 并设置紫外检测器波长为254nm和350nm ； 待出口端 流出流动相且紫外信号稳定不变， 体系达到平衡时再通过进样阀注入 10 20mL 莲子心粗 提取物溶液， 按照检测器和工作站显示的色谱峰收集流分， 冻干后得到莲子心黄酮提取物。 2.如权利要求 1 所述的莲子心黄酮提取物的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 1) 中， 取莲 子心粉用温度为 75、 重量为莲子心粉 20 倍的 75乙醇水溶液浸提 1h， 提取液真空浓缩 至相对密度为 1.15， 然后用非极性有机溶剂萃取 4 次， 将水相浓缩后冻干，。
5、 得莲子心粗提取 物。 3.如权利要求 1 或 2 所述的莲子心黄酮提取物的制备方法， 其特征在于 ： 所述非极性 有机溶剂为石油醚。 4.如权利要求 1 所述的莲子心黄酮提取物的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 2) 中， 所述 乙酸乙酯、 正丁醇、 水的体积比为 1 4 6。 权 利 要 求 书 CN 105343190 A 2 1/4 页 3 一种莲子心黄酮提取物的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及莲子心黄酮提取物的制备方法。 背景技术 0002 莲子心是莲子 ( 植物莲的成熟种子 ) 的绿色干燥幼叶及胚根， 莲子心中含有的黄 酮类成分具有较好的抗氧化活性。 目前关于莲子心中黄酮类。
6、化合物的分离提纯主要采用大 孔树脂分离方法， 大孔树脂在分离时存在不易吸附或者解析不完全等问题， 而且分离的产 物纯度不高， 而高速逆流色谱是近年来兴起的天然活性成分分离技术， 具有制备量大、 前处 理简单、 无吸附损失、 单次分离时间短且分离效果好等优点。 目前未见使用高速逆流色谱从 莲子心中分离黄酮类活性成分的文献报导。 发明内容 0003 本发明的目的是为了提高莲子心黄酮类活性成分的提取效率， 提供一种采用高速 逆流色谱制备莲子心黄酮提取物的方法。 0004 本发明所提供的制备方法包括以下步骤 ： 0005 1) 将莲子心粉用温度为 70 80、 重量为莲子心粉 10 30 倍的 65 。
7、85乙醇 水溶液浸提 1 3h， 提取液真空浓缩至相对密度为 1.1 1.2， 然后用非极性有机溶剂萃取 3 5 次， 将水相浓缩后冻干， 得莲子心粗提取物 ； 0006 2) 将乙酸乙酯、 正丁醇、 水按 (1 2) (1 5) (3 8) 的体积比混合后静置 过夜， 分离上相和下相， 真空脱气 ； 0007 3)取莲子心粗提取物， 用下相将其溶解成4080mg/mL的溶液， 使用TBE-300C高 速逆流色谱仪进行分离， 分离时溶剂体系温度为 25 30， 以上相为固定相， 以下相为流 动相， 具体操作步骤为 ： 先将固定相以 30 50mL/min 的流速泵入高速逆流色谱仪， 待检测 器。
8、出口端流出固定相后停泵 ； 然后再设置主机正转转速为 600 1000rpm/min， 将流动相以 515mL/min的流速泵入高速逆流色谱仪， 并设置紫外检测器波长为254nm和350nm ； 待出 口端流出流动相且紫外信号稳定不变， 体系达到平衡时再通过进样阀注入 10 20mL 莲子 心粗提取物溶液， 按照检测器和工作站显示的色谱峰收集流分， 冻干后得到莲子心黄酮提 取物。 0008 优选地， 步骤 1) 中， 取莲子心粉用温度为 75、 重量为莲子心粉 20 倍的 75乙醇 水溶液浸提1h， 提取液真空浓缩至相对密度为1.15， 然后用非极性有机溶剂萃取4次， 将水 相浓缩后冻干， 得。
9、莲子心粗提取物。 0009 进一步优选地， 所述非极性有机溶剂为石油醚。 0010 优选地， 步骤 2) 中， 所述乙酸乙酯、 正丁醇、 水的体积比为 1 4 6。 0011 本发明中所涉及的乙醇浓度， 均是指重量浓度， 如 75乙醇水溶液， 指的是每 100g 乙醇水溶液中， 含有乙醇 75g。 0012 本发明的有益效果是 ： 与大孔树脂吸附法相比， 高速逆流色谱分离无吸附损失， 除 说 明 书 CN 105343190 A 3 2/4 页 4 了将粗提取物用溶剂体系溶解外， 基本无需其他处理， 因此工艺更加简单， 提取效率更高 ； 本发明可分离出三个色谱峰， 同时获得三个黄酮类组分， 其。
10、中峰二和峰三的黄酮含量最高 可达到 640.06mg/g 和 891.51mg/g， 产率最高可达到 6.16g/kg 和 16.5g/kg， 黄酮回收率均 明显高于现有的制备方法。 附图说明 0013 图 1 是莲子心粗提物经分离纯化后的高速逆流色谱图。 具体实施方式 0014 以下结合具体实施例对本发明进行详细地说明。 0015 实施例 1 0016 一种莲子心黄酮提取物的制备方法， 其步骤如下 ： 0017 1)取莲子心粉1Kg， 用20Kg温度为75的75乙醇水溶液浸提1h， 提取液真空浓 缩至相对密度为 1.15， 然后用石油醚萃取 4 次， 弃去有机相， 将水相浓缩后冻干， 得莲子。
11、心 粗提取物 ； 0018 2) 将乙酸乙酯、 正丁醇、 水按 1 4 6 的体积比混合后静置过夜， 分离上相和下 相， 真空脱气 30 分钟 ； 0019 3) 取莲子心粗提取物， 用下相将其溶解成 50mg/mL 的溶液， 使用 TBE-300C 高速逆 流色谱仪进行分离， 分离时溶剂体系温度为 25， 以上相为固定相， 以下相为流动相， 具体 操作步骤为 ： 先将固定相以 40mL/min 的流速泵入高速逆流色谱仪， 待检测器出口端流出固 定相后停泵 ； 然后再设置主机正转转速为 800rpm/min， 将流动相以 10mL/min 的流速泵入高 速逆流色谱仪， 并设置紫外检测器波长为 。
12、254nm 和 350nm， 进行紫外检测， 待出口端流出流 动相且紫外信号稳定不变， 体系达到平衡时再通过进样阀注入 20mL 莲子心粗提取物溶液， 按照检测器和工作站显示的色谱峰收集流分， 冻干后得到莲子心黄酮提取物。 0020 实施例 2 0021 一种莲子心黄酮提取物的制备方法， 其步骤如下 ： 0022 1)取莲子心粉1Kg， 用30Kg温度为70的85乙醇水溶液浸提3h， 提取液真空浓 缩至相对密度为 1.1， 然后用石油醚萃取 3 次， 将水相浓缩后冻干， 得莲子心粗提取物 ； 0023 2) 将乙酸乙酯、 正丁醇、 水按 2 5 8 的体积比混合后静置过夜， 分离上相和下 相，。
13、 真空脱气 ； 0024 3) 取莲子心粗提取物， 用下相将其溶解成 40mg/mL 的溶液， 使用 TBE-300C 高速逆 流色谱仪进行分离， 分离时溶剂体系温度为 30， 以上相为固定相， 以下相为流动相， 具体 操作步骤为 ： 先将固定相以 30mL/min 的流速泵入高速逆流色谱仪， 待检测器出口端流出固 定相后停泵 ； 然后再设置主机正转转速为 600rpm/min， 将流动相以 5mL/min 的流速泵入高 速逆流色谱仪， 并设置紫外检测器波长为 254nm 和 350nm ； 待出口端流出流动相且紫外信号 稳定不变， 体系达到平衡时再通过进样阀注入 18mL 莲子心粗提取物溶液。
14、， 按照检测器和工 作站显示的色谱峰收集流分， 冻干后得到莲子心黄酮提取物。 0025 实施例 3 0026 一种莲子心黄酮提取物的制备方法， 其步骤如下 ： 说 明 书 CN 105343190 A 4 3/4 页 5 0027 1)取莲子心粉1Kg， 用10Kg温度为80的65乙醇水溶液浸提1h， 提取液真空浓 缩至相对密度为 1.2， 然后用非极性有机溶剂萃取 5 次， 将水相浓缩后冻干， 得莲子心粗提 取物 ； 0028 2) 将乙酸乙酯、 正丁醇、 水按 1 1 3 的体积比混合后静置过夜， 分离上相和下 相， 真空脱气 ； 0029 3) 取莲子心粗提取物， 用下相将其溶解成 80。
15、mg/mL 的溶液， 使用 TBE-300C 高速逆 流色谱仪进行分离， 分离时溶剂体系温度为 27， 以上相为固定相， 以下相为流动相， 具体 操作步骤为 ： 先将固定相以 50mL/min 的流速泵入高速逆流色谱仪， 待检测器出口端流出固 定相后停泵 ； 然后再设置主机正转转速为 1000rpm/min， 将流动相以 15mL/min 的流速泵入 高速逆流色谱仪， 并设置紫外检测器波长为 254nm 和 350nm ； 待出口端流出流动相且紫外信 号稳定不变， 体系达到平衡时再通过进样阀注入 20mL 莲子心粗提取物溶液， 按照检测器和 工作站显示的色谱峰收集流分， 冻干后得到莲子心黄酮提。
16、取物。 0030 实施例 4 0031 一种莲子心黄酮提取物的制备方法， 其步骤如下 ： 0032 1)取莲子心粉1Kg， 用25Kg温度为75的70乙醇水溶液浸提2h， 提取液真空浓 缩至相对密度为 1.18， 然后用石油醚萃取 3 次， 弃去有机相， 将水相浓缩后冻干， 得莲子心 粗提取物 ； 0033 2) 将乙酸乙酯、 正丁醇、 水按 1 3 5 的体积比混合后静置过夜， 分离上相和下 相， 真空脱气 30 分钟 ； 0034 3) 取莲子心粗提取物， 用下相将其溶解成 60mg/mL 的溶液， 使用 TBE-300C 高速逆 流色谱仪进行分离， 分离时溶剂体系温度为 27， 以上相为。
17、固定相， 以下相为流动相， 具体 操作步骤为 ： 先将固定相以 45mL/min 的流速泵入高速逆流色谱仪， 待检测器出口端流出固 定相后停泵 ； 然后再设置主机正转转速为 900rpm/min， 将流动相以 12mL/min 的流速泵入高 速逆流色谱仪， 并设置紫外检测器波长为 254nm 和 350nm， 进行紫外检测， 待出口端流出流 动相且紫外信号稳定不变， 体系达到平衡时再通过进样阀注入 20mL 莲子心粗提取物溶液， 按照检测器和工作站显示的色谱峰收集流分， 冻干后得到莲子心黄酮提取物。 0035 试验例 ： 0036 使用高速逆流色谱大约 90 分钟即可完成一次分离， 收集 3 。
18、个分离峰组分， 图 1 是 莲子心粗提物经分离后的高速逆流色谱图， 从图中可以看出， 峰 2 与峰 3 具有较好的分离 度， 最高可达到 1.23。 0037 使用高效液相色谱法测定实施例 1 4 收集组分中黄酮类成分含量， 并将黄酮含 量与各组分的产量与 X-5 大孔树脂分离物及莲子心粗提物进行比较。结果见表 1 和表 2。 0038 表 1 各分离组分中黄酮类成分的含量 0039 编号峰 1 黄酮含量 (mg/g) 峰 2 黄酮含量 (mg/g) 峰 3 黄酮含量 (mg/g) 实施例 136.33640.06891.51 实施例 256.30360.01589.23 说 明 书 CN 1。
19、05343190 A 5 4/4 页 6 实施例 359.41354.46654.34 实施例 447.26358.12653.48 0040 从表 1 结果可以看出， 本发明能显著提高提取物中黄酮类成分的含量， 且以实施 例 1 分离效果最好。依据极性大小的不同， 实施例 1 共得到三个黄酮类化合物组分， 其中峰 二、 峰三两个组分黄酮含量分别达到640.06mg/g和891.51mg/g。 而莲子心粗提取物中黄酮 类化合物的含量仅为100150mg/g， 采用X-5大孔树脂吸附法制备的莲子心黄酮提取物的 含量也仅为 250 300mg/g。 0041 表 2 各分离组分的产量 0042 编号峰 1 组分产量 (g) 峰 2 组分产量 (g) 峰 3 组分产量 (g) 实施例 1 195.806.1616.5 实施例 2 187.0012.5412.54 实施例 3 192.068.588.58 实施例 4 183.4821.1221.12 0043 从表 1 结果可以看出， 本发明不仅能提高峰二和峰三中黄酮类成分的含量， 而且 还具有较高的产量， 其中， 实施例 1 的峰二组分产率达 6.16g/Kg， 峰三组分产率达 16.5g/ Kg。 说 明 书 CN 105343190 A 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 105343190 A 7 。