技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种Lin28a基因过表达腺相关病毒在促进创 伤修复中的应用。
背景技术
目前，各种创伤、烧伤、手术切口的愈合仍然是临床存在的一大难题，尤其是局部 放疗伤口的愈合、糖尿病人伤口的愈合、大面积烧伤或褥疮等难愈合伤口的愈合，给患者造 成巨大痛苦，也给医疗工作带来巨大负担。创伤修复是个复杂而渐进的过程，而以往的研究 基本停留在等待伤口自愈阶段，而缺乏促进创伤修复的积极措施。
Lin28是存在于高等真核生物中的一种保守RNA结合蛋白，它是可以将人类体细胞 重新编程为多潜能干细胞的四种多能性因子之一，在调节细胞生长分化、新陈代谢以及细 胞多能性等方面起重要作用。在哺乳动物基因组中，存在两个同源基因Lin28a与Lin28b，两 者序列相似度高达76%。Lin28a与Lin28b虽然在核酸序列上具有极高的相似性，但其在细胞 中的定位及具体功能却有差异。在人类基因组中Lin28a定位于染色体1p36.11，蛋白质编码 区含有209个氨基酸残基，其同源蛋白基因Lin28b定位于染色体6p21，编码一个含有250个 氨基酸残基的小分子蛋白质。由于Lin28a与Lin28b在功能上存在一定的差异，导致表达细 胞的类型也具有一定的特异性：Lin28b与多种癌症的触发、转移相关，并在多种癌细胞系中 呈现出高表达状态，提示其可能成为癌症发生预测的标志性分子；Lin28a的主要功能是调 控细胞的分化过程，因此广泛表达于胚胎干细胞与早期胚胎形成时的细胞中，Lin28a基因 可通过调控糖酵解和氧化磷酸化反应加强葡萄糖氧化代谢，能激活胶原蛋白，新生的胶原 蛋白能重新建立起胶原支架，提示Lin28a基因具有促进创伤修复能力。
腺相关病毒（AAV）是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的细小单链DNA病毒。 近年来用AAV作基因转移载体已成为基因治疗研究的热点。这是由于AAV具有以下特点：（1） 安全性好：迄今从未发现野生型AAV对人体致病；重组AAV去除了野生型AAV基因组的96%，进 一步保证了安全性；（2）宿主范围广：不仅可转导分裂细胞，而且可转导静止期细胞；（3）野 生型AAV可整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置，利用这一特点，有可能研制出具有 特异性整合功能的AAV载体；（4）AAV-2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技 术进行操作；（5）物理性质稳定：在60°C不能被灭活，能抗氯仿；（6）重组AAV（rAAV）可长期稳 定地表达外源基因。腺相关病毒对许多哺乳动物细胞都比较易感，能够转染的细胞种类也 比较多，无论是细胞系，还是原代培养的贴壁细胞，亦或是常规转染试剂难以转染的细胞类 型，腺相关病毒都有很好的转染效率，与质粒转染相比，具有瞬时转染基因转移效率更高的 优点。
发明内容
本发明的目的在于提供携带Lin28a基因的重组腺相关病毒（AAV-Lin28a），将 Lin28a基因构建入腺相关病毒载体，用于Lin28a基因的过表达，该AAV-Lin28a能促进创伤 修复。
本发明提供的Lin28a基因过表达腺相关病毒在促进创伤修复中的应用，通过以下 技术方案来实现：
1.人工合成Lin28a全基因组；
2.将Lin28a基因插入到腺相关病毒载体上，利用pHelper质粒包装系统共转染细胞，获 得重组腺相关病毒AAV-Lin28a，进一步得到病毒浓缩液；
3.建立皮肤表面创伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进皮肤创 伤愈合；
4.建立度烧伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进深度烧伤的真皮再生，并能抑制皮肤瘢痕形成；
5.建立骨损伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进骨损伤修复；
6.建立软组织损伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进软组织损 伤修复。
本发明的有益效果在于：本发明将Lin28a基因插入到腺相关病毒载体上，获得一 携带Lin28a基因的重组腺相关病毒。该重组腺相关病毒制备方法简单，能有效促进皮肤创 伤的愈合，能显著促进部分深度烧伤的真皮再生，能促进骨损伤和软组织损伤修复，并能抑 制瘢痕形成。
附图说明
附图1为三组动物皮肤创伤愈合率的变化趋势图。
附图2为皮肤HE染色效果图（A：AAV-Lin28a；B：AAV-MCS；C：PBS）。
具体实施方式
下面给出实施例以对本发明作更详细的说明，有必要指出的是以下实施例不能理 解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述本发明内容对本发明作出 的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。
实施例
实施例1重组腺相关病毒的制备。
构建重组腺相关病毒载体。
由上海生物工程有限公司全基因合成Lin28a基因，构建到pUC57载体中，得到 pUC57-Lin28a质粒（测序结果见SEQIDNO.1）。
采用限制性内切酶EcoRI和BamHI（购自Takara公司）双酶切pUC57-Lin28a和pAAV- MCS腺相关病毒载体(购自Stratagene公司)，酶切体系为：pAAV-MCS/pUC57-Lin28a质粒： 10ul，EcoRI：3ul，BamHI：3ul，buffer：4ul，H2O：20ul。37℃水浴30min，琼脂糖凝胶电泳检测 酶切产物，回收Lin28a基因片段和pAAV-MCS载体骨架（操作步骤参照Takara琼脂糖核酸纯 化回收试剂盒说明书）。
将Lin28a基因插入酶切回收pAAV-MCS载体中（具体步骤参照Takara公司DNA LigationKitVer.2.1试剂盒说明书），连接体系为：Lin28a回收产物：2.5ul，pAAV-MCS 回收产物：2.5ul，SolutionI：5ul。16℃孵育30min，取连接产物10ul加入100ulDH5α感受 态细胞（购自Takara公司）中吹打均匀，冰上静置20min，再放入42℃水浴90s，迅速置于冰 中，静置3min，加入500ulLB液体培养基，180rpm、37℃振荡培养1h，取菌液100ul均匀涂布 于LB固体培养基（含1/1000氨苄青霉素），37℃培养过夜。挑取单克隆菌落于5mlLB培养基 （含1/1000氨苄青霉素）中，180rpm37℃培养12h后提取质粒（操作步骤参照Takara质粒提 取试剂盒说明书）。
取样送至上海生物工程有限公司测序验证确认正确。将构建的质粒命名为pAAV- Lin28a。
细胞株293FT的复苏与培养。
取液氮冻存的293FT细胞株（购自Clontech公司），迅速放于37℃水浴中解冻，期间 不断晃动使离心管内溶液尽量受热均匀；解冻后迅速加入7mL体积分数为10%胎牛血清的 DMEM培养液中（DMEM培养液需要提前预热至37℃），枪头轻轻吹打至无细胞团存在，然后在 1300rpm条件下离心6min，弃去上清；再向离心管中加2mL提前预热至37℃体积分数为10% 胎牛血清的DMEM培养液，吹打细胞使其悬浮，按照5×104个细胞将细胞接种于培养皿，并于 37℃、含5%的CO2培养箱中培养24h，然后换液，以后每隔2天换液至细胞密度达90%时传代。
病毒包装。
转染前一天，按照每瓶4×105个293FT细胞接种到培养瓶中，培养24h后细胞约有 70%融合，转染前4h，用无双抗PBS清洗2次细胞，将含血清的培养液换为无双抗、无血清的优 化培养液Opti-MEM（2mL/瓶）；LipofectamineTM2000（购自Invitrogen公司）作为转染试剂 将Lin28a转染至293FT细胞，具体步骤依照说明书进行，转染体系为：pHelper：10ug，pAAV- RC：10ug，pAAV-Lin28a：10ug，Lipofectamine2000：60ug，Opti-MEM：2ml。
病毒收毒。
病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中。可以将细胞和培养上清都收集下来 以获得最好的收率：
1)准备一个干冰乙醇浴（将乙醇倾入装有干冰的泡沫盒即可，也可用液氮替代干冰乙 醇浴）和37°C水浴；
2)将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中。收集细胞时，将培养盘 倾斜一定角度将细胞刮到培养基中；
3)1000rpm/min，离心3分钟，分离细胞和上清，将上清液另外存放，细胞用1mlPBS重 悬；
4)将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37°C水浴中反复转移，冻融四次。每次融解后稍加震 荡。注意：每次凝固和解冻大概需要十分钟的时间。
病毒浓缩
1)10,000g离心去除细胞碎片，将离心上清液转移到一个新离心管中；
2)将两次收集的上清混合在一起，用0.45um滤器过滤除杂质；
3)加入1/2体积的1MNaCl，10%PEG8000溶液，混合均匀，4℃过夜；
4)12,000rpm离心2h，弃上清，病毒沉淀用适量的PBS溶液溶解，待完全溶解后用0.22um 滤器过滤除菌；
5）加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA（终浓度为50U/ml）。合上管盖，颠倒 几次以充分混合。在37℃孵育30分钟；
6）用0.45μm过滤头过滤，取滤出液，即为浓缩的AAV病毒。
病毒包装滴度测定（采用Q-PCR法）
1）取20ul浓缩病毒液，加入1ulRNase-freeDNase，混匀，37℃水浴反应30min；
2）4℃，12000rpm/min，离心10min，取10ul上清到另一个无菌的1.5mlEP管中；
3）加入90ulDilutionBuffer（1mMTris-HCl,pH8.0，0.1mMEDTA，150mMNaCl），混 匀，37℃金属浴反应30min；
4）自然冷却至室温，加入1ul蛋白酶K，65℃水浴反应1h；
5）100℃金属浴反应10min，自然冷却至室温；
6）进行Q-PCR检测滴度。
包装出的重组腺相关病毒命名为AAV-Lin28a，滴度为2.8×1011，采用同样的方法 包装空载体质粒pAAV-MCS，命名为AAV-MCS，滴度为1.9×1011。病毒颗粒同时存在于包装细 胞和培养上清中。可以将细胞和培养上清都收集下来以获得最好的收率。
收到病毒液后在很短时间内即使用腺相关病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于 4℃保存；如需长期保存请放置于-80℃保存。
实施例2Lin28a基因过表达腺相关病毒对皮肤创伤愈合的影响。
实验动物创伤模型制作。
将Wistar种健康大鼠(购自南方医院实验动物中心)随机分为3组，每组10只，称重 标记。将WISTAR大鼠适用性喂养1周，实验前一天脱毛、称重。2%戊巴比妥钠溶液（40mg/kg体 重）腹腔麻醉后，在两侧背部作3个直径1cm的圆形皮肤全层伤口，各伤口中心之间距离为 1.5cm。无菌纱布包扎创面。隔日去除包扎暴露创面，术后肌注青霉素一周预防抗炎并密切 观察局部情况。术后分别在创口基底部及灶内注射0.2×108pfu的AAV-Lin28a或0.2× 108pfu的AAV-MCS病毒液，以PBS缓冲液作为对照。致伤后大鼠单笼喂养，饮食自取。
伤口表面状态观察及伤口残余面积测定。
在伤后1、3、5、7、9、11、13、15天用透明薄膜覆盖创面，描摹创面面积，沿边缘剪膜， 置于万分之一分析天平上称重，换算创面面积，计算创面愈合率，评价大鼠创面愈合速度。
伤后第15天，用游标卡尺测量每个创口愈合后皮肤全层厚及其临近无创伤处皮肤 全层厚，计算肥大指数（HypertrophicIndex，HI）(HI=愈合皮肤全层厚/临近皮肤全层厚)。
术后1-3天，AAV-MCS组和PBS组大鼠伤口出现少量渗出和出血，伤口周围皮肤稍红 肿，3天后创面逐渐干燥，有伽形成，伤口范围逐渐变小，术后12天开始第一次脱伽；AAV- Lin28a组大鼠在注射病毒液当天伤口表面即干燥，无明显渗出和分泌物，注射后第2天创面 已出现明显收缩、变小，术后7天开始第一次脱伽，露出的肉芽组织新鲜，无明显出血，术后 大鼠平均创面愈合率变化趋势如附图1所示。同时计算每个瘢的肥大指数，作为愈合质量的 一个指标，肥大指数与瘢痕的大小呈正比，结果显示AAV-Lin28a组肥大指数较AAV-MCS组、 PBS组小，即形成的瘢痕小。实验结果表明，AAV-Lin28a能明显促进小鼠皮肤创伤愈合并能 抑制皮肤瘢痕的形成。
实施例3Lin28a基因过表达腺相关病毒对烧伤修复的影响。
实验动物度烧伤模型制作。
将C57BL/6小鼠（中科院上海实验动物中心）随机分为3组，每组10只，称重标记，体 重均在20g以上。将小鼠适用性喂养1周，实验前一天剃毛、称重。2%戊巴比妥钠溶液（40mg/ kg体重）腹腔麻醉后，将四肢和尾根部用通气胶带固定于超净台上。将水浸湿的自制控制烧 伤面积的硬纸片（取约1mm厚硬纸片，裁成7cm×9cm大小，在纸片中心用刀片刻出2cm× 1.5cm=3cm2面积的长方形窗口）放在小鼠背部，露出剃毛区，在纸片窗口内用滴管滴加95% 酒精，浸满皮肤，用大镊子压住纸片，打火机点火，着火燃烧20s后用湿纱布熄火。
烧伤表面状态观察及皮肤病理学检查。
术后即刻将6×108pfu的AAV-Lin28a、6×108pfu的AAV-MCS病毒液以及PBS一次性 一次涂抹于伤口表面。涂抹重组腺相关病毒后，每天观察各组伤口愈合情况，并用透明薄膜 覆盖创面，描摹创面面积，沿边缘剪膜，置于万分之一分析天平上称重，换算烧伤面积，计算 烧伤愈合率，评价小鼠烧伤愈合速度。
至15天时处死全部小鼠，将烧伤创面连同周边皮肤约0.5cm取下，平铺于滤纸上， 然后固定于10%福尔马林内，纵向切取宽约3-4mm皮肤，按常规制备石蜡切片，切片厚度为5μ m，进行苏木素-伊红（HE）染色，100×显微镜下观察皮肤HE染色切片。
实验结果表明：涂抹重组腺病毒后第6天，大体外观即可观察到AAV-Lin28a组小鼠 创口愈合速度较AAV-MCS及PBS组快，至第8天时，AAV-Lin28a、AAV-MCS和PBS三组小鼠创口 未愈合率分别为69.36％，34.66％和32.58％。至第18天时，涂抹AAV-Lin28a组创口已全部 愈合(10/10)，而AAV-MCS及PBS组各有5/10和6/10个烧伤创口明显地未完全愈合。而且AAV- Lin28a组创口愈合较为平坦，有的甚至与周围邻近正常皮肤完全相同，而AAV-MCS及PBS组 均明显增厚。
到第15天时，涂抹AAV-Lin28a组小鼠表皮已全部脱伽，只有2/20个尚未完全再表 皮化，显微镜下观察到表皮及整齐排列的细胞、血管、皮脂腺、毛囊等结构完整，真皮中纤维 薄且排列整齐，细胞核、包浆等色泽良好，表皮角化轻（附图2A），说明AAV-Lin28a能促进深 度烧伤的真皮再生；而AAV-MCS组（附图2B）及PBS组（附图2C）各有5/10个和6/10未完全再表 皮化，表皮结痂及部分的真皮变性坏死，残存的毛囊、皮脂腺、汗腺、胶原纤维变得疏松且排 列紊乱。
实施例4Lin28a基因过表达腺相关病毒对骨损伤修复的影响。
将Wistar种健康大鼠(购自南方医院实验动物中心)随机分为3组，每组10只，称重 标记。2%戊巴比妥钠溶液（40mg/kg体重）腹腔麻醉后，暴露大鼠股骨，用钢锯将股骨锯开，以 达到骨髓渗出为度，将创口缝合。术后第二天开始在创口处局部注射109pfu的AAV-Lin28a、 109pfu的AAV-MCS病毒液以及PBS，每天1次。连续给药42天后，将动物处死。
取血清测定碱性磷酸酶（AKP）活性、血清钙、血清磷水平(按试剂盒说明进行，试剂 盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），同时分离被锯开的股骨进行X光拍片，用 ImagePrPlus5.1测量骨痂面积、密度和骨痂综合强度。实验结果如下表所示。
血清中碱性磷酸酶增加就表示成骨细胞的成骨活性增强，骨折愈合的标志是骨折 处出现骨痂。由上表可看出，AAV-Lin28a组大鼠血清碱性磷酸酶活性均有所提高，骨痂面 积、密度和骨痂综合强度均有增加，与AAV-MCS组和PBS比较差异均有统计学意义(P<0.05)， 显示其能促进骨痂生成，提高骨痂质量，有促进骨折愈合的作用。
实施例5Lin28a基因过表达腺相关病毒对软组织损伤修复的影响。
Wistar种健康大鼠(购自南方医院实验动物中心)30只随机分为3组，每组10只，用 自制的冲击装置在30era高处，用200g砝码，从上向下自由落下，经砧木锤间接撞击大鼠右 下肢软组织3次，造成面积约1cm2大小的非开放性软组织损伤模型。术后第二天开始在创伤 处局部注射109pfu的AAV-Lin28a、109pfu的AAV-MCS病毒液以及PBS，连续给药10天，末次给 药后24小时处死大鼠，按以下分级标准观察记录软组织损伤程度，进行评分。显微镜下观 察：“一”无明显病理组织学改变；“+”皮下及肌纤维轻度水肿、瘀血，仅见散在嗜中性白细胞 等炎性细胞浸润；“++”皮下及肌纤维间中度水肿、少许肌纤维变性坏死，有明显的嗜中性白 细胞浸润；“+++”皮下及肌纤维严重水肿、大量肌纤维变性坏死及炎性细胞浸润，或炎性肉 芽组织增生。
实验结果如下表所示，结果显示AAV-Lin28a能有效减少急性软组织损伤的水肿， 加速瘀血的吸收，促进损伤的修复。
SEQUENCELISTING
<110>重庆高圣生物医药有限责任公司
<120>Lin28a基因过表达腺相关病毒在促进创伤修复中的应用
<130>2015
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>630
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
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