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一种红枣树叶标准化提取物及其制备和应用.pdf

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文档编号：8224706

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610066031.6 (22)申请日 2016.01.25 A61K 36/725(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61K 127/00(2006.01) (71)申请人西北大学地址 710000 陕西省西安市碑林区太白北路 229 号 (72)发明人白乃生白璐吴勇刘庆超张丽郭森崔雪琴江咪 (54) 发明名称一种红枣树叶标准化提取物及其制备和应用 (57) 摘要本发明公开了一种红枣树叶标准化提取物及其制备方法和应用，该提取物包含以下组分：朦胧木酸 -3-O- 反式 - 对。

2、 - 香豆酰酯 134.96g/g ；朦胧木酸 -3-O- 顺式 - 对 - 香豆酰酯 5.27g/ g ；苯甲酸 6.75g/g ； 2， 4- 二羟基苯酚 6.47g/ g ；对羟基苯甲酸 77.14g/g ；邻羟基苯甲酸 2.24g/g ；芦丁 25.13g/g ；对羟基苯甲醛 10.25g/g ；山楂酸 -3-O- 反式 - 对 - 香豆酰酯 3.84g/g ；对羟基顺式桂皮酸 1.71g/g ；对羟基反式桂皮酸 9.38g/g ； 3， 4- 二羟基苯甲酸： 1.85g/g。经活性测试结果表明，此红枣树叶提取物具有保肝活性，可用作制成保肝药物。。

3、 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图4页 CN 105687367 A 2016.06.22 CN 105687367 A 1.一种红枣树叶标准化提取物，其特征在于，包含以下组分：朦胧木酸-3-O-反式-对-香豆酰酯： 134.96 g/g；朦胧木酸-3-O-顺式-对-香豆酰酯： 5.27 g/g；苯甲酸： 6.75 g/g； 2， 4-二羟基苯酚： 6.47 g/g；对羟基苯甲酸： 77.14 g/g；邻羟基苯甲酸： 2.24 g/g；芦丁： 25.13 g/g；对羟基苯甲醛： 10.25 g。

4、/g；山楂酸-3-O-反式-对-香豆酰酯： 3.84 g/g；对羟基顺式桂皮酸： 1.71 g/g；对羟基反式桂皮酸： 9.38 g/g； 3， 4-二羟基苯甲酸： 1.85 g/g。 2.一种红枣树叶标准化提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： S1、取红枣树叶5kg，并粉碎； S2、将粉碎的红枣树叶先用无水乙醇渗漉提取两次，每次24h，过滤，将两次乙醇提取液合并得到红枣树叶-EtOH提取液；滤渣再用水提取两次，每次24h，合并后得到红枣树叶- Water提取液； S3、将上述两种提取液合并，并浓缩，即得到红枣树叶-EtOH-Water提取物。 3.。

5、如权利要求1所述的一种红枣树叶标准化提取物的应用，其特征在于，所述提取物可用作制备保肝药物。权利要求书 1/1 页 2 CN 105687367 A 2 一种红枣树叶标准化提取物及其制备和应用技术领域 0001 本发明涉及一种药物技术领域的提取物及其提取方法、用途，具体是一种枣树枝叶提取物及其提取方法、定量分析方法和用途。背景技术 0002 枣树为鼠李科枣属落叶灌木或小乔木植物。高达十余米，树冠卵形，树皮灰褐色，有条形裂纹。枝有长枝、短枝和无芽小枝，长枝红褐色，光滑，呈之字形弯曲，具2个托叶刺；短枝在两年生以上的长枝上互生；脱落性小枝较纤细，。

6、绿色，无芽，簇生于短枝上，秋后同叶一起掉落。叶子呈卵形或卵状椭圆形，前端较短且尖，自基部生出三个主叶脉，叶两面无毛，有光泽，边缘有细齿。 5-6月开花，聚伞花序腋生，花黄绿色，两性。果实长卵圆形，肉厚味甜，成熟时呈红色，后脱水变成紫红色，果核坚硬，两端较尖。其干燥成熟的果实名为大枣，是一种我国常用的传统中药，药性温和，有镇静安神，养血补气，缓和药性的功效，本草纲目和神农本草经中记载，大枣可治气血不足，胃虚厌食，心悸失眠，体倦乏力等症1。此外，大枣还是一种富合营养，甜美可口的水果，有我国古代五果之一的美誉。除果实可作。

7、药用外，枣树的果核、树皮、根及叶均可入药。近年来，随着经济的发展和人民生活水平的提高，人们更加注重养生，使得保健食品的市场需求迅速增加，给枣树资源的开发利用带来了广阔的前景。大枣不仅作药用具有显著的疗效与优良的保健作用，而且还是一种营养丰富的食品，以其特有的药食同源性，被人们誉为 “天然的保健食品” ，成为国内外研究的热点之一，有关大枣的基础研究已取得一定进展。 0003 经对现有技术的文献检索发现，对于枣树果实红枣的研究很深入，但尚未见红枣枝叶提取物及其提取方法、用途有关的报道。发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种红枣。

8、树叶标准化提取物及其制备和应用。本发明涉及的枣树枝叶提取物具有较好的保肝活性，可用于制备保肝类药物。 0005 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为： 0006 一种红枣树叶标准化提取物，包含以下组分： 0007 朦胧木酸-3-O-反式-对-香豆酰酯： 134.96 g/g； 0008 朦胧木酸-3-O-顺式-对-香豆酰酯： 5.27 g/g； 0009 苯甲酸： 6.75 g/g； 0010 2， 4-二羟基苯酚： 6.47 g/g； 0011 对羟基苯甲酸： 77.14 g/g； 0012 邻羟基苯甲酸： 2.24 g/g； 0013 芦丁： 25.13 g/g； 0014 对。

9、羟基苯甲醛： 10.25 g/g； 0015 山楂酸-3-O-反式-对-香豆酰酯： 3.84 g/g；说明书 1/5 页 3 CN 105687367 A 3 0016 对羟基顺式桂皮酸： 1.71 g/g； 0017 对羟基反式桂皮酸： 9.38 g/g； 0018 3， 4-二羟基苯甲酸： 1.85 g/g。 0019 一种红枣树叶标准化提取物的制备方法，包括以下步骤： 0020 S1、取红枣树叶5kg，并粉碎； 0021 S2、将粉碎的红枣树叶先用无水乙醇渗漉提取两次，每次24h，过滤，将两次乙醇提取液合并得到红枣树叶-EtOH提取液；滤渣再用水提取两次，每次2。

10、4h，合并后得到红枣树叶-Water提取液； 0022 S3、将上述两种提取液合并，并浓缩，即得到红枣树叶-EtOH-Water提取物。 0023 本发明所述的枣树枝叶提取物可用于制备保肝药物。 0024 本发明具有以下有益效果：所得的枣树枝叶提取物具有较好的保肝活性，可用于制备保肝类药物，并从红枣树叶中分离鉴定了13个天然化合物。附图说明 0025 图1为本发明实施例中枣树叶的提取流程图。 0026 图2为本发明实施例中枣树叶中部分化合物的分离流程图。 0027 图3为本发明实施例中枣树叶中部分化合物的分离流程图。 0028 图4为本发明实施例中红枣树叶标准化EtOH-W。

11、ater提取物的高效液相色谱图。 0029 图5为本发明实施例中分离的13个天然化合物的结构式。具体实施方式 0030 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 0031 如图1所示，本发明实施例提供了一种红枣树叶标准化提取物的制备方法，包括以下步骤： 0032 步骤1、取红枣树叶5kg，并粉碎； 0033 步骤2、将粉碎的红枣树叶先用无水乙醇渗漉提取两次，每次24h，过滤，将两次乙醇提取液合并得到红枣树叶-EtOH提取液；滤渣再用水提取两次，每。

12、次24h，合并后得到红枣树叶-Water提取液； 0034 步骤3、将上述两种提取液合并，并浓缩，即得到红枣树叶-EtOH-Water提取物。 0035 本发明实施例还提供了一种红枣树叶标准化提取物的定量分析方法，包括以下步骤： 0036 步骤一：用电子天平准确称取各对照品化合物1.0mg，用适宜的溶剂溶解并用甲醇稀释定容到1mL，摇匀，配制成1mg/mL的对照品溶液，放入4冰箱中保存。分别精密吸取上述各化合物对照品溶液10 L、 40 L、 80 L、 150 L、 200 L，并用甲醇定容至1mL，摇匀，配制成浓度为10mg/L、 40mg/L、 80。

13、mg/L、 150mg/L、 200mg/L的系列标准溶液， 4冰箱中保存待用。 0037 步骤二：用高效液相色谱仪分别对浓度为80mg/L的12种标准品溶液进行检测，选择不同的流动相梯度洗脱方法，根据检测结构不断调整色谱条件，确定最佳色谱条件和吸说明书 2/5 页 4 CN 105687367 A 4 收波长，最佳色谱条件为：色谱柱： Prodigy 5 ODS 100A(2504.60mm 5micron)，流动相：甲醇-水(含0.2磷酸)系统，流速： 1mL/min，柱温： 30，进样量： 40 L，检测波长： 254nm和 320nm。 0038 用高效。

14、液相色谱仪分析上述配制的各化合物的系列标准溶液，进样量40 L，分别记录各化合物的峰面积，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，各化合物标准曲线及其参数见表1。结果表明，各化合物浓度在10-200mg/L范围内时峰面积与浓度呈良好的线性关系， R2值均大于0.999。 0039 表1 各化合物标准曲线 0040 0041 0042 步骤三：精密称取已粉碎好的枣树叶10.0g，放入100mL带塞锥形瓶中，加入90的乙醇溶液40mL，称重。放置过夜后，超声提取1h，待提取液冷却至室温后，补重，摇匀。上清夜经0.45 m微孔滤膜过滤，取。

15、1mL注入HPLC样品瓶中， 4下保存待用。 0043 分别精密吸取40 L各对照品溶液和供试品溶液，用高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，找出各对照品化合物对应的峰，记录其峰面积并用标准曲线法计算各化合物的含量，测定结果见表2。 0044 表2 枣树枝叶标准化EtOH-Water提取物中各化合物含量说明书 3/5 页 5 CN 105687367 A 5 0045 0046 本发明实施例还提供了一种红枣树叶的提取分离过程，包括以下步骤： 0047 步骤一，取枣树枝叶，乙醇渗透提取，得提取液； 0048 步骤二，浓缩提取液，得浸膏，加水稀释，依次用二氯甲烷。

16、、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，减压回收各萃取部分，得浸膏， 0049 步骤三，硅胶柱色谱洗脱，得枣树枝叶提取物。 0050 步骤一中，所述乙醇的体积分数为90。 0051 步骤二中，所述二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取的次数均为3次。 0052 步骤二中，所述减压回收具体为45、 0.09Mpa条件下进行回收。 0053 步骤三中，所述色谱洗脱使用的硅胶柱的目数为200300目。 0054 步骤三中，所述洗脱具体为：以二氯甲烷与甲醇的体积比为(2001)1的梯度进行洗脱。 0055 运用硅胶、 CHP-20P、大孔树脂、 Sephadex LH-20等柱层析技术从红枣。

17、枝叶中分离得到13个化合物，通过核磁共振技术(1H NMR、 13C NMR、1H-1H COSY、 DEPT、 HMBC、 HMQC)，紫外光谱技术(UV)，质谱技术(MS)等现代波谱技术确定了其结构。包括6个三萜类化合物， 3个黄酮类化合物， 2个酚酸类化合物， 1个苯丙素苷类化合物， 1个甾体类化合物；分别为： 3 -羟基-齐墩果-5(6)-烯(化合物1)、 5(6)， 20(29)-羽扇二烯-3 醇(化合物2)、豆甾醇(化合物 3)、白桦酸(化合物4)、 3-氧代齐墩果酸(化合物5)、齐墩果酸(化合物6)、二氢查尔酮-4 - - D-葡萄糖苷(化合物7)、槲。

18、皮素-3-O-芸香糖苷(化合物8)、丁香酚- -D-葡萄糖苷(化合物 9)、儿茶素(化合物10)、朦胧木酸-3-O-反式-对-香豆酰酯(化合物11)、对羟基苯甲酸(化合物12)、 2， 4-二羟基-苯酚(化合物13)，已鉴定化合物的结构如图5所示。 0056 实施效果：枣树枝叶提取物的保肝活性药效学研究 0057 (1)试验材料：说明书 4/5 页 6 CN 105687367 A 6 0058 受试物为上述提取物，实验动物为雄性昆明种小白鼠，体重18-22克。取小白鼠60 只，随机分5组，每组12只，第1、 2组为正常对照组和模型组，灌胃蒸馏水20g/kg体。

19、重，第3组为阳性对照组(水飞蓟素)，灌胃0.08克g/kg体重；第4、 5组为实验组，分别灌胃枣树叶提取物4g/kg体重和8g/kg体重，在实验第42天，正常灌胃后2小时，对照组腹腔注射花生油 0.1mL/10g体重，模型组、阳性对照组和实验组腹腔注射0.1四氯化碳花生油溶液0.1mL/ 10g体重。所有动物断粮不断水， 16小时后摘眼球采血，颈部脱臼处死，取肝脏测定。血清中谷丙、谷草转氨酶的测定：采集全血， 3000转每分钟离心，分离血清，用试剂盒测定谷丙 (ALT)、谷草转氨酶(AST)。肝脏中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘。

20、肽过氧化物酶(GSH-Px)的测定：取右叶肝脏制备10肝匀浆， 43000转离心20分钟，上清液用于测定丙二醛、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶。 0059 (2)结果 0060 表3 枣树叶提取物对四氯化碳致小鼠肝脏损伤血液生化指标的影响(XSD) 0061 0062 具有不同小写字母表示有显著性差异(p0.05)。 0063 表4 枣树叶提取物对四氯化碳致小鼠肝脏损伤肝脏生化指标的影响(XSD) 0064 0065 具有不同小写字母表示有显著性差异(p0.05)。 0066 表3和表4可知，与模型对照组相比，枣树叶提取物能够显著降低小鼠血清 0067 ALT和AST的活性，。

21、同时能够提高肝脏GSH-Px和SOD的活性，降低小鼠肝脏氧化产物 MDA的含量，本发明的枣树叶标准化提取物为预防四氯化碳肝脏损伤的有效部位。 0068 以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明权利要求所限定的范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。另外，本发明对于化合物活性研究部分，主要研究的是保肝活性和抗肿瘤活性，但是对于枣树枝叶所具有的其他广泛生物活性，例如改善心血管作用，免疫作用等活性，也将落入本发明的保护范围内。说明书 5/5 页 7 CN 105687367 A 7 图1 说明书附图 1/4 页 8 CN 105687367 A 8 图2 图3 说明书附图 2/4 页 9 CN 105687367 A 9 图4 说明书附图 3/4 页 10 CN 105687367 A 10 图5 说明书附图 4/4 页 11 CN 105687367 A 11 。

摘要
申请专利号：	CN201610066031.6	申请日：	20160125
公开号：	CN105687367A	公开日：	20160622
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	A61K36/725,A61P1/16,A61K127/00	主分类号：	A61K36/725,A61P1/16,A61K127/00
申请人：	西北大学
发明人：	白乃生,白璐,吴勇,刘庆超,张丽,郭森,崔雪琴,江咪
地址：	710000 陕西省西安市碑林区太白北路229号
优先权：	CN201610066031A
专利代理机构：		代理人：
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内容摘要

本发明公开了一种红枣树叶标准化提取物及其制备方法和应用，该提取物包含以下组分：朦胧木酸-3-O-反式-对-香豆酰酯134.96μg/g；朦胧木酸-3-O-顺式-对-香豆酰酯5.27μg/g；苯甲酸6.75μg/g；2，4-二羟基苯酚6.47μg/g；对羟基苯甲酸77.14μg/g；邻羟基苯甲酸2.24μg/g；芦丁25.13μg/g；对羟基苯甲醛10.25μg/g；山楂酸-3-O-反式-对-香豆酰酯3.84μg/g；对羟基顺式桂皮酸1.71μg/g；对羟基反式桂皮酸9.38μg/g；3，4-二羟基苯甲酸：1.85μg/g。经活性测试结果表明，此红枣树叶提取物具有保肝活性，可用作制成保肝药物。

权利要求书

1.一种红枣树叶标准化提取物，其特征在于，包含以下组分：朦胧木酸-3-O-反式-对-香豆酰酯：134.96μg/g；朦胧木酸-3-O-顺式-对-香豆酰酯：5.27μg/g；苯甲酸：6.75μg/g；2，4-二羟基苯酚：6.47μg/g；对羟基苯甲酸：77.14μg/g；邻羟基苯甲酸：2.24μg/g；芦丁：25.13μg/g；对羟基苯甲醛：10.25μg/g；山楂酸-3-O-反式-对-香豆酰酯：3.84μg/g；对羟基顺式桂皮酸：1.71μg/g；对羟基反式桂皮酸：9.38μg/g；3，4-二羟基苯甲酸：1.85μg/g。 2.一种红枣树叶标准化提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、取红枣树叶5kg，并粉碎；S2、将粉碎的红枣树叶先用无水乙醇渗漉提取两次，每次24h，过滤，将两次乙醇提取液合并得到红枣树叶-EtOH提取液；滤渣再用水提取两次，每次24h，合并后得到红枣树叶-Water提取液；S3、将上述两种提取液合并，并浓缩，即得到红枣树叶-EtOH-Water提取物。 3.如权利要求1所述的一种红枣树叶标准化提取物的应用，其特征在于，所述提取物可用作制备保肝药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种药物技术领域的提取物及其提取方法、用途，具体是一种枣树枝叶提取物及其提取方法、定量分析方法和用途。

背景技术

枣树为鼠李科枣属落叶灌木或小乔木植物。高达十余米，树冠卵形，树皮灰褐色，有条形裂纹。枝有长枝、短枝和无芽小枝，长枝红褐色，光滑，呈之字形弯曲，具2个托叶刺；短枝在两年生以上的长枝上互生；脱落性小枝较纤细，绿色，无芽，簇生于短枝上，秋后同叶一起掉落。叶子呈卵形或卵状椭圆形，前端较短且尖，自基部生出三个主叶脉，叶两面无毛，有光泽，边缘有细齿。5-6月开花，聚伞花序腋生，花黄绿色，两性。果实长卵圆形，肉厚味甜，成熟时呈红色，后脱水变成紫红色，果核坚硬，两端较尖。其干燥成熟的果实名为大枣，是一种我国常用的传统中药，药性温和，有镇静安神，养血补气，缓和药性的功效，《本草纲目》和《神农本草经》中记载，大枣可治气血不足，胃虚厌食，心悸失眠，体倦乏力等症[1]。此外，大枣还是一种富合营养，甜美可口的水果，有我国古代五果之一的美誉。除果实可作药用外，枣树的果核、树皮、根及叶均可入药。近年来，随着经济的发展和人民生活水平的提高，人们更加注重养生，使得保健食品的市场需求迅速增加，给枣树资源的开发利用带来了广阔的前景。大枣不仅作药用具有显著的疗效与优良的保健作用，而且还是一种营养丰富的食品，以其特有的药食同源性，被人们誉为“天然的保健食品”，成为国内外研究的热点之一，有关大枣的基础研究已取得一定进展。

经对现有技术的文献检索发现，对于枣树果实红枣的研究很深入，但尚未见红枣枝叶提取物及其提取方法、用途有关的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种红枣树叶标准化提取物及其制备和应用。本发明涉及的枣树枝叶提取物具有较好的保肝活性，可用于制备保肝类药物。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种红枣树叶标准化提取物，包含以下组分：

朦胧木酸-3-O-反式-对-香豆酰酯：134.96μg/g；

朦胧木酸-3-O-顺式-对-香豆酰酯：5.27μg/g；

苯甲酸：6.75μg/g；

2，4-二羟基苯酚：6.47μg/g；

对羟基苯甲酸：77.14μg/g；

邻羟基苯甲酸：2.24μg/g；

芦丁：25.13μg/g；

对羟基苯甲醛：10.25μg/g；

山楂酸-3-O-反式-对-香豆酰酯：3.84μg/g；

对羟基顺式桂皮酸：1.71μg/g；

对羟基反式桂皮酸：9.38μg/g；

3，4-二羟基苯甲酸：1.85μg/g。

一种红枣树叶标准化提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、取红枣树叶5kg，并粉碎；

S2、将粉碎的红枣树叶先用无水乙醇渗漉提取两次，每次24h，过滤，将两次乙醇提取液合并得到红枣树叶-EtOH提取液；滤渣再用水提取两次，每次 24h，合并后得到红枣树叶-Water提取液；

S3、将上述两种提取液合并，并浓缩，即得到红枣树叶-EtOH-Water提取物。

本发明所述的枣树枝叶提取物可用于制备保肝药物。

本发明具有以下有益效果：所得的枣树枝叶提取物具有较好的保肝活性，可用于制备保肝类药物，并从红枣树叶中分离鉴定了13个天然化合物。

附图说明

图1为本发明实施例中枣树叶的提取流程图。

图2为本发明实施例中枣树叶中部分化合物的分离流程图。

图3为本发明实施例中枣树叶中部分化合物的分离流程图。

图4为本发明实施例中红枣树叶标准化EtOH-Water提取物的高效液相色谱图。

图5为本发明实施例中分离的13个天然化合物的结构式。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1所示，本发明实施例提供了一种红枣树叶标准化提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、取红枣树叶5kg，并粉碎；

步骤2、将粉碎的红枣树叶先用无水乙醇渗漉提取两次，每次24h，过滤，将两次乙醇提取液合并得到红枣树叶-EtOH提取液；滤渣再用水提取两次，每次24h，合并后得到红枣树叶-Water提取液；

步骤3、将上述两种提取液合并，并浓缩，即得到红枣树叶-EtOH-Water 提取物。

本发明实施例还提供了一种红枣树叶标准化提取物的定量分析方法，包括以下步骤：

步骤一：用电子天平准确称取各对照品化合物1.0mg，用适宜的溶剂溶解并用甲醇稀释定容到1mL，摇匀，配制成1mg/mL的对照品溶液，放入4℃冰箱中保存。分别精密吸取上述各化合物对照品溶液10μL、40μL、80μL、150μL、 200μL，并用甲醇定容至1mL，摇匀，配制成浓度为10mg/L、40mg/L、80mg/L、 150mg/L、200mg/L的系列标准溶液，4℃冰箱中保存待用。

步骤二：用高效液相色谱仪分别对浓度为80mg/L的12种标准品溶液进行检测，选择不同的流动相梯度洗脱方法，根据检测结构不断调整色谱条件，确定最佳色谱条件和吸收波长，最佳色谱条件为：色谱柱：Prodigy5μODS100A (250×4.60mm5micron)，流动相：甲醇-水(含0.2％磷酸)系统，流速： 1mL/min，柱温：30℃，进样量：40μL，检测波长：254nm和320nm。

用高效液相色谱仪分析上述配制的各化合物的系列标准溶液，进样量 40μL，分别记录各化合物的峰面积，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，各化合物标准曲线及其参数见表1。结果表明，各化合物浓度在10-200mg/L范围内时峰面积与浓度呈良好的线性关系，R2值均大于 0.999。

表1各化合物标准曲线

步骤三：精密称取已粉碎好的枣树叶10.0g，放入100mL带塞锥形瓶中，加入90％的乙醇溶液40mL，称重。放置过夜后，超声提取1h，待提取液冷却至室温后，补重，摇匀。上清夜经0.45μm微孔滤膜过滤，取1mL注入HPLC 样品瓶中，4℃下保存待用。

分别精密吸取40μL各对照品溶液和供试品溶液，用高效液相色谱仪进行检测，根据检测结果，找出各对照品化合物对应的峰，记录其峰面积并用标准曲线法计算各化合物的含量，测定结果见表2。

表2枣树枝叶标准化EtOH-Water提取物中各化合物含量

本发明实施例还提供了一种红枣树叶的提取分离过程，包括以下步骤：

步骤一，取枣树枝叶，乙醇渗透提取，得提取液；

步骤二，浓缩提取液，得浸膏，加水稀释，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，减压回收各萃取部分，得浸膏，

步骤三，硅胶柱色谱洗脱，得枣树枝叶提取物。

步骤一中，所述乙醇的体积分数为90％。

步骤二中，所述二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取的次数均为3次。

步骤二中，所述减压回收具体为45℃、0.09Mpa条件下进行回收。

步骤三中，所述色谱洗脱使用的硅胶柱的目数为200～300目。

步骤三中，所述洗脱具体为：以二氯甲烷与甲醇的体积比为(200～1)∶1 的梯度进行洗脱。

运用硅胶、CHP-20P、大孔树脂、SephadexLH-20等柱层析技术从红枣枝叶中分离得到13个化合物，通过核磁共振技术(1HNMR、13CNMR、1H-1HCOSY、 DEPT、HMBC、HMQC)，紫外光谱技术(UV)，质谱技术(MS)等现代波谱技术确定了其结构。包括6个三萜类化合物，3个黄酮类化合物，2个酚酸类化合物， 1个苯丙素苷类化合物，1个甾体类化合物；分别为：3β-羟基-齐墩果-5(6)- 烯(化合物1)、5(6)，20(29)-羽扇二烯-3β醇(化合物2)、豆甾醇(化合物3)、白桦酸(化合物4)、3-氧代齐墩果酸(化合物5)、齐墩果酸(化合物6)、二氢查尔酮-4′-β-D-葡萄糖苷(化合物7)、槲皮素-3-O-芸香糖苷(化合物8)、丁香酚-β-D-葡萄糖苷(化合物9)、儿茶素(化合物10)、朦胧木酸-3-O-反式-对-香豆酰酯(化合物11)、对羟基苯甲酸(化合物12)、 2，4-二羟基-苯酚(化合物13)，已鉴定化合物的结构如图5所示。

实施效果：枣树枝叶提取物的保肝活性药效学研究

(1)试验材料：

受试物为上述提取物，实验动物为雄性昆明种小白鼠，体重18-22克。取小白鼠60只，随机分5组，每组12只，第1、2组为正常对照组和模型组，灌胃蒸馏水20g/kg体重，第3组为阳性对照组(水飞蓟素)，灌胃0.08克g/kg体重；第4、5组为实验组，分别灌胃枣树叶提取物4g/kg体重和8g/kg体重，在实验第42天，正常灌胃后2小时，对照组腹腔注射花生油0.1mL/10g体重，模型组、阳性对照组和实验组腹腔注射0.1％四氯化碳花生油溶液0.1mL/10g体重。所有动物断粮不断水，16小时后摘眼球采血，颈部脱臼处死，取肝脏测定。血清中谷丙、谷草转氨酶的测定：采集全血，3000转每分钟离心，分离血清，用试剂盒测定谷丙(ALT)、谷草转氨酶(AST)。肝脏中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的测定：取右叶肝脏制备10％肝匀浆，4℃3000转离心20分钟，上清液用于测定丙二醛、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶。

(2)结果

表3枣树叶提取物对四氯化碳致小鼠肝脏损伤血液生化指标的影响(X ±SD)

具有不同小写字母表示有显著性差异(p＜0.05)。

表4枣树叶提取物对四氯化碳致小鼠肝脏损伤肝脏生化指标的影响(X±SD)

具有不同小写字母表示有显著性差异(p＜0.05)。

表3和表4可知，与模型对照组相比，枣树叶提取物能够显著降低小鼠血清

ALT和AST的活性，同时能够提高肝脏GSH-Px和SOD的活性，降低小鼠肝脏氧化产物MDA的含量，本发明的枣树叶标准化提取物为预防四氯化碳肝脏损伤的有效部位。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明权利要求所限定的范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。另外，本发明对于化合物活性研究部分，主要研究的是保肝活性和抗肿瘤活性，但是对于枣树枝叶所具有的其他广泛生物活性，例如改善心血管作用，免疫作用等活性，也将落入本发明的保护范围内。