[技术领域]
本发明涉及稳定的培美曲塞制剂，更具体来讲，涉及包括乙酰半胱氨酸作为抗氧 化剂以及柠檬酸钠作为缓冲剂的稳定培美曲塞制剂，以及其制备方法。另外，本发明涉及填 装于密封容器内的培美曲塞制剂，其包括培美曲塞或其药学可接受盐作为活性成分，其中 容器顶部空间内的氧气含量为3v/v％或更少。
[背景技术]
具有特定抗叶酸活性的化合物被称为化疗剂。美国专利号5,344,932描述了制备 特定取代吡咯并[2,3-d]嘧啶基抗叶酸衍生物(包括培美曲塞)的方法，并且欧洲专利申请 公开号0434426公开了一系列4-羟基吡咯并[2,3-d]嘧啶-L-谷氨酸衍生物。
培美曲塞，5-取代的吡咯并[2,3-d]嘧啶，是多靶向抗叶酸剂，其通过抑制参与各 种癌(包括非小细胞肺癌)中叶酸代谢的代谢产物的活性而呈现抗癌活性。
已知培美曲塞当其通过叶酰聚谷氨酸合成酶活化成聚谷氨酸衍生物时靶向胸苷 酸合成酶(TS)和二氢叶酸还原酶(DHFR)，在这之前其通过还原叶酸载体(RFC)引入细胞，还 原叶酸载体是叶酸胞内运输的重要途径。
培美曲塞，已经以品牌ALIMTATM进行开发，目前可以在市场上作为恶性胸膜间皮瘤 和非小细胞肺癌的治疗剂获得(Physicians’DeskReference,60thed.,pp.1722-1728 (2006))。ALIMTATM目前以冻干制剂的形式(100mg或500mg)在市场上进行销售，其在给药前 需要重构(reconstitution)，即当病人服药时，需要用0.9％氯化钠溶液进行重构并且最后 用0.9％氯化钠溶液稀释(最终浓度为0.25mg/mL)。
冻干粉剂型的制剂的生产过程复杂并且其加工需要高成本。另外，在冻干制剂重 构期间存在微生物污染风险，并且参与制备药物的药师、医生、护士等极可能被暴露于细胞 破坏材料。因此，在细胞毒性抗癌剂如培美曲塞的情况下，需要开发能够长时间保存的即用 型(ready-to-use)液体制剂，而不是冻干制剂。
很多情况下，液体制剂的问题存在于其在储存期间的不稳定性。由于不稳定性，很 多注射制剂以冻干制剂的形式使用，在注射前即刻进行溶解。在已经以冻干制剂的形式提 供的培美曲塞或其药学可接受盐的情况下，以水溶液形式制备可能导致未知杂质的量增 加，因此在室温长时间储存可能是不可能的。由于稳定性原因，在临床研究中它们仍然以冻 干制剂的形式使用。
已经提出若干制剂以克服上述问题。例如，美国专利号6,686,365(韩国专利申请 公开号号2002-0081293)公开了稳定的培美曲塞液体制剂，其是包含治疗有效量的培美曲 塞、有效量的抗氧化剂和药学上可接受的赋形剂的培美曲塞液体制剂，其中抗氧化剂选自 硫代甘油、L-半胱氨酸和巯基乙酸。
然而，以上专利报道的一个问题在于在25℃长期储存稳定性测试的进行期间发生 沉淀，并且因此它不能在期望时期内确保稳定性(国际专利公开号号WO2012/015810)。直 到今天，在实验或商业上还没有成功地开发出具有长期储存稳定性的培美曲塞液体制剂。 本发明人利用L-半胱氨酸(上述抗氧化剂)制备包括培美曲塞的液体制剂，对其进行稳定性 测试，并且发现在压力(stress)测试条件下自第二周出现问题，例如特性变化如变色等、杂 质增加、pH下降等。此外，本发明人利用超过60种稳定剂(包括抗坏血酸、硫代硫酸钠、丁基 化羟基苯甲醚、没食子酸丙酯、EDTA、L-甲硫氨酸、乙酰半胱氨酸等)制备包括培美曲塞的液 体制剂。但是，这些制剂均没有适合的稳定性。
[公开内容]
[技术问题]
本发明人在努力克服存在于含培美曲塞液体制剂中的稳定性问题时，发现以乙酰 半胱氨酸作为抗氧化剂同时以柠檬酸钠作为缓冲剂能够制备这样的培美曲塞制剂，其能够 有效降低或排除培美曲塞异构体杂质以及未知杂质的产生，并且在储存期间能够维持透明 溶液不产生沉淀状态下的高稳定性，从而完成了本发明。此外，本发明人确认，在大规模生 产上述制剂的情况下，可以通过控制容器上部空的空间(顶部空间内的氧气含量)来确保制 剂稳定性，从而完成本发明。
[技术方案]
本发明的目的是提供稳定的培美曲塞制剂。
[发明效果]
本发明能够提供提高给药方便性和稳定性的培美曲塞制剂，其可以从商业方面容 易生产并且避免冻干或重构期间伴随的微生物污染。此外，相比常规含培美曲塞注射用液 体制剂，因为本发明的培美曲塞制剂包含乙酰半胱氨酸作为抗氧化剂以及柠檬酸钠作为缓 冲剂，稳定培美曲塞制剂满足标准要求而无异常特性，例如变色或沉淀。此外，本发明通过 控制顶部空间内的氧气含量，能够阻止可在顶部空间内发生的氧化，从而提供更稳定的培 美曲塞制剂。
[附图说明]
图1展示了4周压力稳定测试(60℃/80％)后常规含培美曲塞注射用液体制剂(对 照样品1、12和14)和根据本发明的含培美曲塞注射用液体制剂(样品11)之间的稳定性对比 特征。
[具体实施方式]
为了实现上述目的，本发明提供了培美曲塞制剂，其包括作为活性成分的培美曲 塞或其药学可接受盐、N-乙酰基-L-半胱氨酸和柠檬酸钠。
本发明中，培美曲塞或其药学可接受盐、N-乙酰基-L-半胱氨酸和柠檬酸钠的浓度 比可以是1-30：0.15-2.0：1.0-15.0。
优选地，培美曲塞或其药学可接受盐、N-乙酰基-L-半胱氨酸和柠檬酸钠的浓度比 可以是1-30：1.5：1.0-15.0。
本发明中，制剂可以是以溶液状态储存的液体制剂。
本发明中，制剂可以是填装在密封即用型容器内的注射用液体制剂。
但是，本发明的范围可以不必限于注射用液体制剂，还可以包括其它类型液体制 剂和非液体制剂，其能够基于本领域普通技术人员的公知常识或用于本领域的常规方法构 成。
此外，本发明提供了填装在密封容器中的培美曲塞制剂，其包括培美曲塞或其药 学可接受盐作为活性成分，其中制剂在容器顶部空间内包括的氧气含量相对于顶部空间的 总体积为3v/v％或更少。
本发明中，优选地，制剂可以进一步包括N-乙酰基-L-半胱氨酸和柠檬酸钠。
本发明中，培美曲塞或其药学可接受盐、N-乙酰基-L-半胱氨酸和柠檬酸钠的浓度 比可以是1-30:0.15-2.0:1.0-15.0。
优选地，培美曲塞或其药学可接受盐、N-乙酰基-L-半胱氨酸和柠檬酸钠的浓度比 可以是1-30:1.5:1.0-15.0。
本发明中，制剂可以是以溶液状态储存的液体制剂。
本发明中，制剂可以是填装在密封即用型容器内的注射用液体制剂。
本发明中，制剂可以是这样的，其中通过用惰性气体替换容器顶部空间内的氧气 而将该氧气含量调节至3v/v％或更低的水平。
本发明中，惰性气体可以是氮气或氩气，但并不限制于此。
下文对本发明进行详细描述。
存在各种可通常用于稳定制剂的抗氧化剂，并且这些抗氧化剂的实例可以包括对 羟基苯甲酸酯衍生物、醇、苯酚衍生物、乙基汞硫代水杨酸钠、乙酸酐、羧酸钠、月桂基硫酸 钠、抗氧化剂、硫化物、亚硫酸盐、胱氨酸、半胱氨酸、半胱胺、氨基酸和有机酸如抗坏血酸、 视黄醇、生育酚、丁基羟基苯甲醚等。
此外，韩国专利号10-0774366公开了N-乙酰氨基酸作为紫杉醇的抗氧化剂，并且 韩国专利公开号号10-2007-0028331公开了硫代甘油和乙二胺四乙酸作为包括双氯芬酸组 合物的抗氧化剂。
在本发明中，培美曲塞注射用制剂的稳定化试验使用上述抗氧化剂进行。结果，可 以确认上述一般抗氧化剂存在每天剂量受限的问题，特别是当他们替代注射用制剂活性成 分被用作赋形剂(抗氧化剂)时，并且抗氧化剂独自也不能提高制剂的稳定性。此外，当使用 抗坏血酸、乳酸等(经常被用在常规注射剂中)时，注射溶液呈现酸不稳定性，如部分变色 和/或沉淀等(实验实施例1和2)。
然而，出人意料的是，本发明者发现当包括培美曲塞或其药学可接受盐作为活性 成分的组合物进一步包括乙酰半胱氨酸和柠檬酸钠两种成分时，活性成分没有发生任何实 质性变化并且4周内在压力测试条件下(60℃/80％)也没有变色或产生沉淀，因而确认该组 合物具有满足所需验收标准的适当稳定性(实验实施例1和2)。因为乙酰半胱氨酸和柠檬酸 钠两者经常使用并且它们的价格便宜，所以它们具有商业优势。
本发明培美曲塞制剂包括培美曲塞或其药学可接受盐作为活性成分。培美曲塞包 含药理学有效药物，或者通过体内化学或酶促方法而药理学有效的药物，并且具体而言，培 美曲塞药物自身和其药学可接受盐可以被使用。
如本文所用，术语“培美曲塞”是指以5-取代吡咯并[2,3-d]嘧啶命名的化合物，并 且具体而言，是指通过式1所示的在各种癌症(包括非小细胞肺癌、恶性胸膜间皮瘤等)中呈 现抗癌作用的多靶向抗叶酸剂。
[式1]
培美曲塞通过抑制参与各种癌症(包括非小细胞肺癌、恶性胸膜间皮瘤等)中叶酸 代谢的代谢产物的活性来呈现抗癌作用。
如本文所用，术语“药学可接受盐”是指根据本领域常规方法制备的盐，并且该方 法对于本领域普通技术人员来说是已知的。具体而言，药学可接受盐可以包括源自下面的 药理学或生理学可接受的无机酸、有机酸和碱的盐类，但不局限于此。适当酸的实例可以包 括盐酸、溴酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥 珀酸、对-甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺 酸等。源自适当碱的盐的实例可以包括碱金属如钠或钾，碱土金属如镁，但不局限于此。
如本文所用，术语“乙酰半胱氨酸”是指以N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC,C5H9NO3S, CAS号616-91-1)命名的化合物，并且是指用作本发明培美曲塞制剂的抗氧化剂的化合物。 在本发明中，“乙酰半胱氨酸”和“N-乙酰基-L-半胱氨酸”可以互换使用。
乙酰半胱氨酸作为抗氧化剂被描述于美国药典35卷(国家处方集10卷2069页 (NationalFormulary10,p2069))。乙酰半胱氨酸是L-半胱氨酸的前体，是存在食品中的 一种氨基酸，其中半胱氨酸氧化后易变性成疏水材料，而乙酰半胱氨酸是稳定且难于变性 的，并且因而适合口服给药或静脉注射。
如本文所用，术语“柠檬酸钠”是指柠檬酸的钠盐，并且是指在本发明培美曲塞制 剂中被用作缓冲剂的化合物。
本发明的特征在于能够提供通过同时使用乙酰半胱氨酸作为抗氧化剂并且柠檬 酸钠作为缓冲剂而实现培美曲塞在1℃-30℃温度范围内长期药学稳定性储存的培美曲塞 制剂。
在本发明的培美曲塞制剂中，培美曲塞或其药学可接受盐、N-乙酰基-L-半胱氨酸 和柠檬酸钠浓度比优选为1-30:0.15-2.0:1.0-15.0，更优选的浓度比为1-30:1.5:1.0- 15.0。特别是，浓度单位可以分别为mg/mL。浓度比与上述范围不同的培美曲塞制剂被显示 随着储存时间杂质的生成增加超过了验收标准(实验实施例1)。
本发明中，培美曲塞制剂可以包括药学可接受载体和pH调节剂。
本发明中，培美曲塞制剂可以优选为以溶液状态储存的液体制剂，并且更优选地， 可以是填装于密封即用型容器中的注射用液体制剂。
本发明中，当培美曲塞制剂是注射用液体制剂时，药学可接受载体可以是注射用 水。
本发明中，培美曲塞注射用液体制剂的pH范围可以优选为约6.0-约8.0，并且更优 选地，约7.2-约7.8。溶液的pH可能可以用酸如盐酸或碱如氢氧化钠进行调节。
本发明培美曲塞制剂除了上述的乙酰半胱氨酸和柠檬酸钠可以不必包括其它添 加剂，但还可以包括药学可接受赋形剂。药学可接受赋形剂的实例包括已知的添加剂，如乳 糖、葡萄糖、环糊精及其衍生物、蔗糖、甘油、碳酸钠等，和优选地，氯化钠、甘露糖醇等。
此外，本发明提供了制备稳定培美曲塞制剂的方法，其包括混合培美曲塞或其药 学可接受盐、N-乙酰基-L-半胱氨酸和柠檬酸钠。
本发明中，培美曲塞或其药学可接受盐、N-乙酰基-L-半胱氨酸和柠檬酸钠的混合 浓度比可以是1-30:0.15-2.0:1.0-15.0。
优选地，培美曲塞或其药学可接受盐、N-乙酰基-L-半胱氨酸和柠檬酸钠的混合浓 度比可以是1-30:1.5:1.0-15.0。
在制备本发明制剂中，为了维持低氧气水平条件，制剂用惰性气体如氮气或氩气 吹扫并且随后过滤灭菌。
此外，本发明的稳定培美曲塞制剂可以被封装于本领域已知的适合容器内，如玻 璃小瓶、玻璃瓶、盒、预填充注射器或类似物，并且优选玻璃小瓶。根据本发明的培美曲塞注 射用液体制剂被分装在预先清洗和灭菌的容器内，并且容器被表面不会与液体制剂反应的 聚四氟乙烯塞(瓶塞，stopper)密封。
特别是，如果必要时，注射用液体制剂与瓶塞之间的空间可以用惰性气体填充。瓶 塞可以用卷曲机将其附着并且装有注射用液体制剂的小瓶可以通过加热灭菌，当必要时。
此外，本发明涉及包括培美曲塞或其药学可接受盐作为活性成分的培美曲塞制 剂，并且提供其中容器顶部空间内氧气含量被控制为3v/v％或更少范围内的培美曲塞制 剂。
如本文所用，术语“顶部空间”是指在培美曲塞制剂已经填装完毕后密闭容器内剩 余的上部空间。顶部空间的体积取决于所使用容器的整个内部体积和向其填装培美曲塞的 量。
如本文所用，术语“顶部空间内的氧气含量”是指氧气所占的空间体积与顶部空间 的整个体积的体积比。因此，代表氧气含量的单位％是指体积(v/v)％。
在本发明中，顶部空间内的氧气含量可以是3v/v％或更少，即在0v/v％-3v/v％范 围内，并且具体而言，0.001v/v％-3v/v％。在示范性实施方式中，顶部空间的氧气含量可以 是3v/v％。
本发明中要使用的容器与上所述相同，优选的是玻璃小瓶。
本发明中，优选地，制剂可进一步包括N-乙酰基-L-半胱氨酸和柠檬酸钠。特别是， 培美曲塞或其药学可接受盐、N-乙酰基-L-半胱氨酸和柠檬酸钠的优选浓度比与上面的说 明相同。
优选地，本发明中的制剂可以是以溶液状态储存的液体制剂，并且特别是，可以是 填装于密封即用型容器中的注射用液体制剂。
本发明中，可以通过利用惰性气体替换容器顶部空间内的氧气来控制氧气含量。 惰性气体可以是氮气或氩气，但不局限于此。
本发明中，为了最小化因容器顶部空间内的氧气导致的杂质生成问题，在制备填 装于密闭容器内的包括培美曲塞或其药学可接受盐作为活性成分的培美曲塞制剂期间，尤 其在大规模生产培美曲塞制剂期间，顶部空间内的氧气含量被控制至3v/v％水平或更低， 从而显著提高了培美曲塞制剂的稳定性(实验实施例1和表10)。
本发明中，如上所述，利用控制顶部空间内氧气含量的方法，并且更具体地，利用 用氮气替换其中氧气的方法，可以避免顶部空间内可能发生的氧化。根据本发明，廉价且稳 定的培美曲塞注射用制剂的生产能够利用当今广泛应用的自动化系统放大到商业水平，从 而实现制剂的大量生产。
[发明详细描述]
以下，本发明将参照下面实施例更细致地进行描述。但是，这些实施例仅供示例， 并且本发明不会局限于这些实施例。
实施例1-14：制备含培美曲塞注射用溶液，其包括不同含量的乙酰半胱氨酸作为 抗氧化剂以及柠檬酸钠作为缓冲剂。
在100mL注射用水中溶解2.5gD-甘露糖醇后，按下面表1所示浓度将乙酰半胱氨 酸和柠檬酸钠先后加入到溶液中并溶解完全。2.5g培美曲塞缓慢加入到所得溶液中(3.0g 培美曲塞缓慢加入到实施例14中)，并且搅拌混合溶液直至溶液变透明。随后，利用盐酸或 氢氧化钠水溶液调节它的pH至表1所示pH。在洁净室中将溶液利用无菌0.22μm过滤器(膜过 滤器)进行无菌过滤。将所得溶液填装进清洗且灭菌的密闭容器中，随后用氮气吹扫。
所得含培美曲塞注射用溶液的组成和pH如下面表1所示。
【表1】
实施例15和16：根据pH变化制备本发明含培美曲塞注射用溶液
在100mL注射用水中溶解2.5gD-甘露糖醇后，按下面表2所示浓度将乙酰半胱氨 酸和柠檬酸钠先后加入到溶液中并溶解完全。2.5g培美曲塞缓慢加入到所得溶液中并且搅 拌混合溶液直至变透明。随后，利用盐酸或氢氧化钠水溶液调节它的pH至表2所示pH。在洁 净室中将溶液利用无菌0.22μm过滤器(膜过滤器)进行无菌过滤。将所得溶解填装进清洗且 灭菌的密闭容器中，随后用氮气吹扫。
所得含培美曲塞注射用溶液的组成和pH如下面表2所示。
【表2】
实施例17-20：根据顶部空间内氧气含量制备含培美曲塞注射用溶液。
在100mL注射用水中溶解2.5gD-甘露糖醇后，按下面表3所示浓度将乙酰半胱氨 酸和柠檬酸钠先后加入到溶液中并溶解完全。2.5g培美曲塞缓慢加入到所得溶液中并且搅 拌混合溶液直至变透明。随后，利用盐酸或氢氧化钠水溶液调节它的pH至表3所示pH。
在洁净室中将溶液利用无菌0.22μm过滤器(膜过滤器)进行无菌过滤。将所得溶液 填装进清洗且灭菌的密闭容器中，随后用氮气吹扫直到顶部空间内氧气含量如表3所示。
所得含培美曲塞注射用溶液的组成和顶部空间内氧气含量如下面表3所示。
【表3】
对照实施例1-8：根据抗氧化剂类型制备含培美曲塞注射用溶液
根据下面表4所示组成和含量以与实施例1相同的方式制备含培美曲塞溶液。在对 照实施例1中，只利用注射用水作为载体而不添加任何抗氧化剂制备溶液。
【表4】
对照实施例9-14：根据抗氧化剂种类和缓冲剂的存在制备含培美曲塞注射用溶液
根据下面表5所示组成和含量以与实施例1相同的方式制备含培美曲塞溶液。
【表5】
对照实施例15-17：根据缓冲剂的种类制备含培美曲塞注射用溶液
根据下面表6所示组成和含量以与实施例1相同的方式制备含培美曲塞溶液。
【表6】
实验实施例：稳定性测试
对于实施例1-20和对照实施例1-17中制备的组合物，稳定性测试在压力测试条件 下(60℃/80％)进行四周。在他们之中，对于实施例11和对照实施例1、12和14中制备的组合 物，稳定性测试也在加速条件下(40℃/70％)进行四个月。稳定性评价通过利用高效液相色 谱方法在下面表7所述的条件下测量保留在水溶液中的培美曲塞含量和杂质含量进行。
【表7】
实验实施例1：在压力测试条件下(60℃/80％，4周稳定性评价)稳定性测试
如上所述在压力测试条件下进行的稳定性测试的结果如表8-13所示。
此外，以上制备的含培美曲塞注射用液体制剂中，图1提供了展示实施例11制备的 含培美曲塞注射用液体制剂和对照实施例1、12及14制备的常规含培美曲塞注射用液体制 剂之间在稳定性压力测试条件(60℃/80％)下的对比特征的图像。特别是，为了比较的目 的，注射用水外观同样被展示。
【表8】
上面表8的结果可以证实，当1.5mg/mL乙酰半胱氨酸作为抗氧化剂并且1mg/mL- 15mg/mL柠檬酸钠作为缓冲剂一起用在制剂中时，在压力测试条件下4周的稳定性测试期 间，单个杂质为0.2％或更少同时总体杂质为1.0％或更少，因此显示了优异的稳定性(实施 例9-12)。
此外，当乙酰半胱氨酸浓度在1.0mg/mL-1.5mg/mL范围内并且柠檬酸钠浓度为 2.0mg/mL时，单个杂质为0.2％或更少同时总体杂质为1.0％或更少(实施例8-10)，因此显 示了优异的稳定性。但是，当乙酰半胱氨酸浓度低于1.0-1.5mg/mL时，虽然杂质含量满足验 收标准但发生外观变化(变色)(实施例1和2)。
此外，当乙酰半胱氨酸浓度为2.0mg/mL并且柠檬酸钠浓度为5.0mg/mL时，杂质水 平满足验收标准但发生外观变化(变色)(实施例13)。
此外，当乙酰半胱氨酸浓度为0.5mg/mL并且柠檬酸钠浓度在1.0mg/mL-1.5mg/mL 范围内时，杂质水平满足验收标准但发生外观变化(变色)(实施例3-7)。
【表9】
上面表9结果可以证实，当乙酰半胱氨酸作为抗氧化剂并且柠檬酸钠作为缓冲剂 两者一起用于制剂中时，尽管pH有所变化，在压力测试条件下的4周稳定性测试期间，单个 杂质为0.2％或更少同时总体杂质为1.0％或更少，因此显示了优异的稳定性。
【表10】
如果上述制剂通过商业化大规模生产制备，可能会增加制剂接触氧气的机会，其 是生成杂质的主要原因。为了避免与氧气接触，通过控制残留在生产过程中的氧气含量能 够确保制剂的稳定性。
上面表10结果可以证实，当乙酰半胱氨酸作为抗氧化剂并且柠檬酸钠作为缓冲剂 两者一起用于制剂中时，对比常规制备的水平(实施例11)，通过控制顶部空间内氧气含量 显示减少了制剂中杂质总含量，因此显示了优异的稳定性(实施例17和18)。具体地，当顶部 空间内氧气含量控制在3v/v％或更少的水平时，在压力测试条件下4周的稳定性测试期间， 单个杂质为0.2％或更少同时总体杂质为1.0％或更少，因此显示了优异的稳定性(实施例 17)。
即使当抗氧化剂没有加入时，证实相对于当顶部空间内氧气含量没有进行控制时 (对照实施例1)，当顶部空间内氧气含量保持在3v/v％或更少水平时，在压力测试条件下， 前两周制剂稳定性得到保证(实施例19)。通过上述结果证实，顶部空间内氧气含量的调控 可以有助于提高制剂稳定性。但是，当抗氧化剂和缓冲剂被另外加入到制剂中时(实施例17 和18)，更为完善的稳定性得到保证。
【表11】
上面表11结果可以证实，当常规使用的抗氧化剂被用于制剂中，在压力条件下稳 定性测试期间，制剂外观出现变化，如沉淀或变色，或单个杂质增加至少0.2％和总体杂质 增加至少1.0％。因此，证实当使用常规使用的抗氧化剂制备含培美曲塞注射用液体制剂 时，制剂显示了在杂质、外观改变等方面不适合的稳定性。
【表12】
上面表12结果可以证实，当乙酰半胱氨酸作为抗氧化剂并且柠檬酸钠作为缓冲剂 两者一起用于制剂中，并且优选当乙酰半胱氨酸浓度为1.5mg/mL并且柠檬酸钠浓度为 5.0mg/mL时，在压力测试条件下4周的稳定性测试期间，制剂显示0.2％或更少的单个杂质 和1.0％或更少的总体杂质，因此显示了优异的稳定性(实施例11)。
相反，当只有缓冲剂柠檬酸钠被使用时，溶液的颜色从压力测试条件下第2周开始 变为深黄色(对照实施例9和10)。此外，当只有抗氧化剂L-半胱氨酸和乙酰半胱氨酸被使用 时，溶液的颜色从压力测试条件下第2周开始变为浅黄色并且在4周压力测试条件期间它们 的pH下降明显(对照实施例11和12-14)。也就是说，这证实当乙酰半胱氨酸和柠檬酸钠两者 同时被使用时，杂质稳定性明显提高，不像当乙酰半胱氨酸或柠檬酸钠单独使用时。
此外，仅仅用L-半胱氨酸制备的对照实施例13和14的制剂，从压力测试条件下第2 周产生异常气味，如臭鸡蛋的恶臭味。但是，根据本发明构成的制剂中没有产生这种异常气 味，因此显示了本发明的改进之处。
【表13】
上面表13结果可以证实，当乙酰半胱氨酸作为抗氧化剂被与通常使用的各种缓冲 剂一起被用于制剂以考察所造成的稳定性时，观察到包含除柠檬酸钠以外的缓冲剂的制剂 自初始阶段外观变化(变色)或单个杂质增加至少0.2％并且总体杂质增加至少1.0％。
因此，证实在制备含培美曲塞注射用液体制剂时，只有当乙酰半胱氨酸作为抗氧 化剂并且柠檬酸钠作为缓冲剂被一起使用时，才可以实现制剂的最佳稳定性。
实验实施例2：加速稳定性测试(40℃/70％，4个月稳定性评价)
所进行的加速稳定性测试的结果如表14所示。
【表14】
上面表14结果可以证实，只使用注射用水作为载体没有任何抗氧化剂制备的对照 实施例1的制剂，在加速条件下从第2个月开始变黄，并且在加速条件下第4个月显示0.2％ 或更高的单个杂质并且1.0％或更高的总体杂质，并且因此在稳定性方面不适合。但是，实 施例11中制备的制剂(其使用乙酰半胱氨酸作为抗氧化剂并且柠檬酸钠作为缓冲剂两者制 备)，显示0.2％或更少的单个杂质和1.0％或更少的总体杂质，因此在加速条件下6个月稳 定性测试期间显示了优异的稳定性。
相反，只使用乙酰半胱氨酸作为抗氧化剂制备的制剂(对照实施例12)在加速条件 下从第4个月开始变黄或显示0.2％或更高的单个杂质，因此在稳定性方面不适合。
此外，从加速条件下第四个月开始，对照实施例14中制备的只包含L-半胱氨酸的 制剂，满足关于杂质的验收标准但产生类似于臭鸡蛋气味的异常气味。但是，根据本发明制 备的制剂，即实施例11中制备的那些，没有产生这种异常气味。