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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711078962.9 (22)申请日 2017.11.06 (71)申请人 首都医科大学附属北京朝阳医院 地址 100020 北京市朝阳区工人体育场南 路8号 (72)发明人 邢念增 杨飞亚 陈东 孟令全 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 白艳 (51)Int.Cl. A61K 31/352(2006.01) A61K 31/12(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/04(2006.01)。
2、 (54)发明名称 槲皮素和姜黄素联合用药在制备治疗前列 腺癌产品中的应用 (57)摘要 本发明公开了槲皮素和姜黄素联合用药在 制备治疗前列腺癌产品中的应用。 本发明提供了 提供了槲皮素和姜黄素在制备治疗人或动物前 列腺癌产品中的应用。 本发明还提供了槲皮素和 姜黄素在制备抑制前列腺癌细胞迁移和/或侵袭 产品中的应用。 本发明将槲皮素和姜黄素低剂量 联合用药抗前列腺癌,药物协同作用,药效显著 提升,表现出更低的药物毒性,更佳的抑癌效果。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 107595834 A 2018.01.19 CN 107595834 A 1.槲皮素和姜黄素在制备治疗人或动物前。
3、列腺癌产品中的应用。 2.槲皮素和姜黄素在制备抑制前列腺癌细胞迁移和/或侵袭产品中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所述抑制前列腺癌细胞迁移为抑制前列腺 癌细胞横向迁移和/或纵向迁移。 4.根据权利要求1-3中任一所述的应用， 其特征在于： 所述前列腺癌细胞来源于人或动 物； 或所述前列腺癌细胞为PC-3细胞或LNCaP细胞。 5.一种产品， 其活性成分为槲皮素和姜黄素。 6.根据权利要求5所述的产品， 其特征在于： 所述槲皮素和所述姜黄素的摩尔浓度比为1:1； 或， 所述产品具有如下1)-3)中至少一种功能： 1)治疗人或动物前列腺癌； 2)抑制前列腺癌细胞迁移； 3)。
4、抑制前列腺癌细胞侵袭。 7.根据权利要求5或6所述的产品， 其特征在于： 所述前列腺癌细胞为PC-3细胞或LNCaP 细胞。 8.一种抑制前列腺癌细胞迁移和/或侵袭的方法， 包括如下步骤： 将槲皮素和姜黄素添 加在含有前列腺癌细胞的培养体系中， 得到药物作用体系， 培养， 实现抑制前列腺癌细胞迁 移和/或侵袭。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于： 所述槲皮素和所述姜黄素的摩尔浓度比为 1:1； 或所述槲皮素在所述药物作用体系中的浓度为30 mol/L； 所述姜黄素在所述药物作用体系中的浓度为30 mol/L。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107595834 A 2 槲皮。
5、素和姜黄素联合用药在制备治疗前列腺癌产品中的应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 尤其涉及一种槲皮素和姜黄素联合用药在制备治疗前 列腺癌产品中的应用。 背景技术 0002 近年来， 随着人们生活水平的提高、 饮食结构的改变及人口结构的老龄化， 我国的 前列腺癌发病率呈上升趋势， 并且发病年龄也日趋年轻化， 成为威胁男性健康的主要因素。 0003 由于前列腺癌症状隐蔽， 临床确诊时半数以上已经突破前列腺包膜或发生骨转移 而失去了手术根治的机会， 因此非手术疗法在前列腺癌治疗中处于非常重要的地位。 目前 常用的雄激素阻断疗法总有效率为70-80， 虽然疗效肯定， 但治疗18-24个月。
6、后， 大多数患 者失去对激素治疗的敏感性， 转化为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer， CRPC)， 而CRPC患者的中位生存期只有1-2年。 因此， CRPC的治疗是目前比 较棘手的难题， 也是研究的热点之一。 CRPC化疗治疗时， 由于单一用药存在药效低、 毒副作 用大等明显的缺点， 而寻求新的化疗药物难度高， 因此对现有药物的联合应用成为研究的 热点。 联合用药是治疗恶性肿瘤的基本策略， 其理论基础是： 在提高治疗效果的同时， 降低 各药物的用量和血药浓度， 减少各自潜在的毒副作用发生。 研究证明槲皮素和姜黄素均可 通过多条信号通。
7、路促进肿瘤细胞凋亡， 是两种广阔临床应用前景的新型抗癌药物。 0004 槲皮素是一种植物来源的类黄酮， 广泛分布于蔬菜、 水果、 干果、 饮料及中草药中， 具有抗癌、 抗氧化、 抗炎、 扩张血管、 抗变态反应等多种生物活性。 自1971年美国国家癌症研 究所首次发现槲皮素对白血病的抑制作用后， 国内外学者对其抗癌作用进行了广泛深入的 研究。 首先， 槲皮素可通过多种途径发挥癌化学预防作用。 例如， 槲皮素可以抑制杂环胺、 黄 曲霉素等前致癌物转化为致癌物； 增强谷胱甘肽-S-转移酶、 超氧化物歧化酶等的活性， 促 进致癌物质在肝脏的解毒代谢和排出； 有效捕获和清除氧自由基， 防止或减轻氧自由基。
8、诱 发细胞癌变的可能等。 除了具有癌化学预防作用， 槲皮素能对癌细胞产生细胞毒作用。 研究 证实槲皮素可抑制前列腺癌、 结肠癌、 乳腺癌、 肝癌等多种肿瘤细胞的生长。 基于其抗癌作 用， 槲皮素在美国已经作为非处方药用于治疗晚期前列腺癌。 0005 姜黄素是一种从姜科植物姜黄等的根茎中提取得到的黄色色素。 为酸性多酚类物 质， 主链为不饱和脂族及芳香族基团。 姜黄素很早就作为一种天然色素被用到食品工业中。 它对还原剂稳定， 着色力强， 不易褪色， 但对光、 热和铁离子敏感。 主要用于罐头、 肠类制品、 酱卤制品的染色， 也用作酸碱指示剂。 姜黄素也有重要的经济价值和广泛的药理作用， 如降 血脂。
9、、 抗氧化、 抗发炎、 抗动脉粥样硬化等。 此外， 抗癌是姜黄素的主要药理活性之一， 其抑 制肿瘤的作用已在许多动物实验中得到反复证实， 其具体抗癌机制已成为近期研究热点。 0006 目前还没有关于槲皮素和姜黄素联合应用的相关报道。 发明内容 0007 本发明一个目的是提供槲皮素和姜黄素的用途。 说 明 书 1/4 页 3 CN 107595834 A 3 0008 本发明提供了槲皮素和姜黄素在制备治疗人或动物前列腺癌产品中的应用。 0009 本发明还提供了槲皮素和姜黄素在制备抑制前列腺癌细胞迁移和/或侵袭产品中 的应用。 0010 上述应用中， 所述抑制前列腺癌细胞迁移为抑制前列腺癌细胞横向。
10、迁移和/或纵 向迁移。 0011 所述槲皮素和所述姜黄素的摩尔浓度比为1:1； 0012 上述应用中， 所述前列腺癌细胞来源于人或动物； 0013 或所述前列腺癌细胞为PC-3细胞或LNCaP细胞。 0014 本发明另一个目的是提供一种产品。 0015 本发明提供的产品， 其活性成分为槲皮素和姜黄素。 0016 所述槲皮素和所述姜黄素的摩尔浓度为1:1； 0017 上述产品具有如下1)-3)中至少一种功能： 0018 1)治疗人或动物前列腺癌； 0019 2)抑制前列腺癌细胞迁移； 0020 3)抑制前列腺癌细胞侵袭。 0021 上述产品中， 所述前列腺癌细胞为PC-3细胞或LNCaP细胞。 。
11、0022 本发明第3个目的是提供一种抑制前列腺癌细胞迁移和/或侵袭的方法。 0023 本发明提供的方法， 包括如下步骤： 将槲皮素和姜黄素添加在含有前列腺癌细胞 的培养体系中， 得到药物作用体系， 培养， 实现抑制前列腺癌细胞迁移和/或侵袭。 0024 上述方法中， 所述槲皮素和所述姜黄素的摩尔浓度比为1:1； 0025 或， 所述槲皮素在所述药物作用体系中的浓度为30 mol/L； 0026 所述姜黄素在所述药物作用体系中的浓度为30 mol/L。 0027 本发明将槲皮素和姜黄素低剂量联合用药抗前列腺癌,与槲皮素、 姜黄素单药治 疗比较， 药物协同作用,药效显著提升,表现出更低的药物毒性,。
12、更佳的抑癌效果。 附图说明 0028 图1为划痕实验实验结果。 0029 图2为划痕实验实验结果分析。 0030 图3为Transwell迁移实验结果。 0031 图4为Transwell迁移实验结果分析。 0032 图5为Transwell侵袭实验结果。 0033 图6为Transwell侵袭实验结果分析。 具体实施方式 0034 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0035 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0036 实施例1、 槲皮素和姜黄素联用对前列腺癌细胞用药 0037 一、 槲皮素和姜黄素联用对前列腺癌细胞用药 003。
13、8 下面的前列腺癌细胞为PC-3细胞或LNCaP细胞： 说 明 书 2/4 页 4 CN 107595834 A 4 0039 PC-3细胞(以下也称为PC3细胞)， 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心， 目录号TCHu158； 0040 LNCaP细胞， 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心， 目录号TCHu173。 0041 将前列腺癌细胞分为如下几组分别用药： 0042 槲皮素治疗组： 前列腺癌细胞在含有槲皮素的培养基中培养24h， 得到槲皮素单独 治疗后前列腺癌细胞。 0043 含有槲皮素的培养基为槲皮素加入1640培养基， 得到含有槲皮素的培养基， 且槲 皮素在培养基中的浓。
14、度为30 mol/L。 0044 姜黄素治疗组： 前列腺癌细胞在含有姜黄素的培养基中培养24h， 得到姜黄素单独 治疗后前列腺癌细胞。 0045 含有姜黄素的培养基为槲皮素加入1640培养基， 得到含有姜黄素的培养基， 且姜 黄素在培养基中的浓度为30 mol/L。 0046 槲皮素和姜黄素联合治疗组： 前列腺癌细胞在含有姜黄素的培养基中培养24h， 得 到槲皮素和姜黄素联合治疗后前列腺癌细胞。 0047 含有槲皮素和姜黄素的培养基为槲皮素和姜黄素加入1640培养基， 得到含有槲皮 素和姜黄素的培养基， 且槲皮素在培养基中的浓度为30 mol/L， 姜黄素在培养基中的浓度 为30 mol/L。。
15、 0048 对照组： 前列腺癌细胞在1640培养基中培养24h， 得到对照组细胞。 0049 二、 划痕实验检测 0050 1、 先用marker笔在6孔板背后， 用直尺比着， 均匀地划横线， 大约每隔0.5到1cm一 道， 横穿过孔。 每孔至少穿过5条线。 0051 2、 在孔中分别加入约5X105个上述一中各组治疗后细胞和对照组细胞， 过夜铺满。 0052 3、 第二天用枪头比着直尺， 尽量垂直于背后的横线划痕， 枪头要垂直， 不要倾斜。 0053 4、 用PBS洗细胞3次， 去除划下的细胞， 加入无血清培养基。 0054 5、 放入37、 5CO2培养箱培养。 按24小时取样， 拍照。 。
16、0055 结果如图1(其中PC3细胞或LNCaP细胞各组中左边为处理前， 右边为各个组处理 后)和图2， 与槲皮素治疗组和姜黄素治疗组作用相比， 槲皮素和姜黄素联合治疗对抑制前 列腺癌细胞横向迁移作用明显增强。 0056 三、 Transwell迁移及侵袭实验 0057 可拍照显微镜， Transwell小室， 孔径8 m， Transwell迁移实验的细胞培养板24孔 板。 细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套， BD公司的Matrigel， 无血清DMEM， (1 胎牛血清)DMEM和1640培养基， DMEM完全培养基， 1640完全培养基(也可加到20血清)， 无 菌PB。
17、S， 棉签， 胰酶， 4多聚甲醛固定液， 结晶紫染液(0.1(g/ml)PBS结晶紫) 0058 1、 基质胶铺板 0059 用BD公司的Matrigel 1： 8稀释， 包被Transwell小室底部膜的上室面， 置37 30min使Matrigel聚合成凝胶。 使用前进行基底膜水化。 0060 2、 制备细胞悬液 0061 1)将上述各治疗组处理24h的细胞， 撤血清饥饿12h。 2)消化细胞： 将上述撤血清饥 饿后的细胞加入胰酶消化3min， 终止消化后离心弃去培养液， 用PBS洗2遍， 用含BSA的1640 说 明 书 3/4 页 5 CN 107595834 A 5 培养基重悬， 调。
18、整细胞密度至5105/ml， 得到细胞悬液。 0062 3、 接种细胞 0063 将上述细胞悬液100 l加入Transwell小室， 常规培养24h。 0064 孔板下室一般加入600 l含20FBS的培养基， 0065 直接计数法，“贴壁” 细胞计数， 这里所谓的 “贴壁” 是指细胞穿过膜后， 可以附着在 膜的下室侧而不会掉到下室里面去， 通过给细胞染色， 可在镜下计数细胞。 0066 取出Transwell小室， 弃去孔中培养液， 用无钙的PBS洗2遍， 甲醇固定30分钟， 将小 室适当风干。 0.1结晶紫染色20min， 用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞， 用PBS洗3遍。 400倍 显微镜下随即五个视野观察细胞， 记数。 0067 结果如图3-6所示， 可以看出， 与槲皮素治疗组和姜黄素治疗组作用相比， 槲皮素 和姜黄素联合治疗组对抑制前列腺癌细胞纵向迁移作用和侵袭作用明显增强。 说 明 书 4/4 页 6 CN 107595834 A 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 7 CN 107595834 A 7 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 8 CN 107595834 A 8 图5 图6 说 明 书 附 图 3/3 页 9 CN 107595834 A 9 。