技术领域
本发明属于地锦草提取物的应用，具体涉及地锦草提取物在制备诱导细胞自噬药物的应用。
背景技术
细胞自噬(autophagy)是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用。细胞自噬是细胞组分降解与再利用的重要机制。细胞在应对短暂的生存压力时，可通过降解自身非必需成分来提供营养和能量，从而维持其存活。正常生命过程所产生的损伤的蛋白和细胞器，也可以通过细胞自噬来清除。自噬主要有三种方式，即分子伴侣介导的自噬、微自噬和巨自噬，均通过两个泛素化途径实现。细胞自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样，是十分重要的生物学现象，参与生物的发育、生长等多种过程。自噬在机体的免疫、感染、炎症、肿瘤、心血管病、神经退行性病的发病中具有十分重要的作用。目前研究最热的三类疾病是肿瘤、神经退行性疾病和免疫性疾病。而利用天然药用植物的提取物诱导细胞自噬，可以做为相关临床治疗的备选方案之一。
地锦草为大戟科植物地锦(Euphorbia humifusa Willd.)的干燥全草，是一种中药材和维吾尔医常用药材，在夏、秋二季采收，除去杂质，晒干。地锦草能够清热解毒、利湿退黄、活血止血，主要用于治疗痢疾、泄泻、黄疸、咳血、吐血、尿血、便血、崩漏、乳汁不下、跌打肿痛及热毒疮疡等等疾病。现代研究证明其具有抗氧化、抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂、免疫调节等生物活性。地锦草中的多糖提取物是从传统中药地锦草中提取出来的有效成分之一。
多糖是以单糖为基本组成单位的复合多糖，是一类与蛋白质结合在一起的酸性多糖或酸性糖蛋白，具有多种多样的生物活性功能。随着对植物叶多糖生物活性的深入研究，其生物活性机理很明显，应用领域也会更加宽阔，多数植物多糖有着增强免疫和抗肿瘤的生物活性。我国叶类多糖资源丰富，尤其是来源于中草药的植物叶多糖应用历史悠久，具有巨大的开发前景，相关产品开发应由粗加工向提取、精制以及深加工转变，许多学者常常多角度、多学科地对植物叶多糖进行系统的研究，从而更好地发挥其对人类的有益作用。
目前市场上尚无以地锦草提取物为主要成分的诱导细胞自噬药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种地锦草提取物的新用途，即在制备诱导细胞自噬药物的应用。
为了实现上述目的，所采用的技术方案为：
地锦草提取物在制备诱导细胞自噬药物的应用。
进一步的，所述地锦草提取物为地锦草多糖提取物。
再进一步的，所述地锦草多糖提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)将包裹地锦草粉末的滤纸装入蒸馏器中，并加入石油醚，在70-80℃下加热回流22-26小时后，倒出石油醚，得地锦草混合物；所述地锦草粉末的质量与石油醚的体积比为1g:2-3ml；
(2)向地锦草混合物中加入甲醇，在70-80℃下加热回流11-13小时，得地锦草甲醇混合液；所述甲醇的用量与所述步骤(1)中石油醚的用量相同；
(3)过滤地锦草甲醇混合液，得地锦草湿品；将地锦草湿品晾干至无试剂气味，得地锦草干粉；
(4)将地锦草干粉和水按1g：25-35ml的料液比混合，再在35-45℃的温度下超声15-25分钟后，取上清液，得上清液1；将上清液1在2500-3500r/min下离心15-25分钟，收集上清液，得上清液2；
(5)将上清液2在45-55℃的温度下，冷凝回流浓缩后，冷却至室温，得浓缩液；所述浓缩液的体积与所述步骤(1)中地锦草粉末的质量比为2-2.5ml：1g；
(6)向浓缩液中加入体积分数为95％的乙醇，得混合溶液；将混合溶液在3-5℃下，静置11-13小时后，在2500-3500r/min下离心15-25分钟，收集沉淀物，得沉淀物；所述混合溶液中乙醇的体积分数为80％；
(7)向沉淀物中加入体积分数为80％的乙醇，在3-5℃下，静置11-13小时后，在2500-3500r/min下离心15-25分钟，收集沉淀物；重复此步骤3-4次，得醇沉沉淀物；
(8)将醇沉沉淀物依次用体积分数为95％的乙醇、无水乙醇离心洗涤，得洗涤后的沉淀物；所述离心洗涤的转速为2500-3500r/min，时间为8-12分钟；
(9)向洗涤后的沉淀物依次加入丙酮、乙醚进行脱水后，晒干，得所述地锦草多糖提取物。
再进一步的，所述地锦草多糖提取物的制备方法中：
所述步骤(1)中，采用水浴法加热；
所述步骤(2)中，采用水浴法加热；
所述步骤(4)中，超声处理的频率为100HZ。
再进一步的，所述地锦草多糖提取物的制备方法中：
所述步骤(1)中，加热温度为75℃，加热时间为24小时；
所述步骤(2)中，加热温度为75℃，加热时间为12小时；
所述步骤(4)中，地锦草干粉和水按1g：30ml的料液比混合；所述超声处理的时间为20分钟，温度为40℃；
所述步骤(5)中，浓缩的温度为50℃；
所述步骤(6)中，所述离心的转速为3000r/min，时间为20分钟；
所述步骤(7)中，所述离心的转速为3000r/min，时间为20分钟；
所述步骤(8)中，所述离心的转速为3000r/min，时间为10分钟。
再进一步的，所述地锦草多糖提取物的制备方法中：
所述步骤(4)中，所述离心的转速为3000r/min，时间为20分钟；
所述步骤(5)中，所述浓缩液的体积与所述步骤(1)中地锦草粉末的质量比为2ml：1g；
所述步骤(6)中，所述静置时间为12小时，温度为4℃；
所述步骤(7)中，所述静置时间为12小时，温度为4℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过LC3蛋白标记法检测地锦草诱导小鼠肾上腺上皮细胞的实验，研究发现地锦草多糖提取物可引起细胞发生自噬现象，表明地锦草提取物可用于诱导细胞自噬，从而提供一种地锦草提取物的新用途，即在制备诱导细胞自噬药物的应用。
附图说明
图1为试验方法(1)中0mg/ml地锦草多糖提取物培养液诱导细胞自噬的激光共聚焦图；即阴性对照的激光共聚焦图；
图2为试验方法(1)中阳性对照的激光共聚焦图；
图3为试验方法(1)中0.08mg/ml地锦草多糖提取物培养液诱导细胞自噬的激光共聚焦图；
图4为试验方法(1)中0.16mg/ml地锦草多糖提取物培养液诱导细胞自噬的激光共聚焦图；
图5为试验方法(1)中0.20mg/ml地锦草多糖提取物培养液诱导细胞自噬的激光共聚焦图；
图6为试验方法(2)中地锦草多糖提取物处理后自噬蛋白GFP-LC3表达的Western Blotting图。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明地锦草提取物在制备诱导细胞自噬药物的应用，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的地锦草提取物在制备诱导细胞自噬药物的应用，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。
在详细阐述本发明地锦草提取物在制备诱导细胞自噬药物的应用之前，有必要对本发明中提及的原料和方法等做进一步说明，以达到更好的效果。
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件进行。实施例中所用原料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明的地锦草提取物，在制备成药物制剂时可加入药物可接受的载体，可接受的载体选自以下载体的一种或几种：防腐剂、表面活性剂、填充剂、润湿剂、分散剂、矫味剂等，常用的载体如：水、甘露糖醇、右旋糖苷、山梨醇、甘露醇、木糖醇、氯化钠、纤维素及纤维素衍生物、亚硫酸钠、藻酸盐、明胶、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、聚乙二醇、β-环糊精、淀粉、薄荷香精、尼泊金乙酯、苯甲酸钠、山梨酸等。
本发明的地锦草提取物的药物制剂，是通过将地锦草原料经过提取或其他方式加工，制成药物活性物质，随后，以该活性物质为原料，需要时加入药物可接受的载体，按照制剂学的常规技术制成药物制剂。
在了解了上述原料和方法等之后，下面将对本发明地锦草提取物在制备诱导细胞自噬药物的应用做进一步的详细介绍：
一实施例
实施例1.
A制备地锦草多糖提取物：
(1)称取地锦草粉末50g，用滤纸包裹装入索氏蒸馏器中，加入100ml石油醚，在水浴锅中，70℃下加热回流26小时，以脱去地锦草中的脂质；再将烧瓶中的石油醚倒出，得地锦草混合物。
(2)向地锦草混合物中加入100ml甲醇，在水浴锅中，70℃下加热回流13小时，以脱去其中的色素，得地锦草甲醇混合液。
(3)过滤地锦草甲醇混合液，得地锦草湿品；将地锦草湿品取出，晾干至无试剂气味，得地锦草干粉。
(4)将步骤(3)得到的地锦草干粉和水按1g：25ml的料液比在圆底烧瓶中混合，再在35℃的温度下，于100HZ的频率下超声提取25分钟后，取上清液，得上清液1；将上清液1装入离心管，在2500r/min的转速下离心25分钟，收集上清液，得上清液2。
(5)将上清液2倒入圆底烧瓶中，在45℃的温度下，冷凝回流浓缩至100ml后，于大烧杯中冷却至室温，得浓缩液。
(6)向浓缩液中加入体积分数为95％的乙醇，至混合后的溶液中乙醇的体积分数为80％，得混合溶液；将混合溶液在3℃下，醇沉静置13小时后，在2500r/min下离心25分钟，弃去上清液，收集沉淀物，得沉淀物。
(7)向沉淀物中加入体积分数为80％的乙醇，在3℃下，醇沉静置13小时后，在2500r/min的转速下离心25分钟，收集沉淀物；重复此步骤3次，得醇沉沉淀物。
(8)将醇沉沉淀物依次用体积分数为95％的乙醇、无水乙醇离心洗涤，得洗涤后的沉淀物；即向醇沉沉淀物中加入体积分数为95％的乙醇，混合均匀，在2500r/min的转速下离心12分钟，弃去上清液，收集沉淀物；再向收集的沉淀物中加入无水乙醇，混合均匀，在2500r/min的转速下离心12分钟，弃去上清液，收集沉淀物，得洗涤后的沉淀物。
(9)向洗涤后的沉淀物依次加入丙酮、乙醚进行脱水后，晒干，得所述地锦草多糖提取物。
B制备诱导细胞自噬药物
称取上述制备的地锦草多糖提取物200mg，加入1000ml的水中，加热溶解后，装入瓶中密封，消毒，制成0.2mg/ml的诱导细胞自噬药物。
本发明实施例所述的地锦草提取物在制备诱导细胞自噬药物的应用，提供了一种地锦草提取物的新用途，即在制备诱导细胞自噬药物的应用，并且以地锦草多糖为提取物，制备成0.2mg/ml的诱导细胞自噬药物。
实施例2.
A制备地锦草多糖提取物：
(1)称取地锦草粉末50g，用滤纸包裹装入索氏蒸馏器中，加入150ml石油醚，在水浴锅中，80℃下加热回流22小时，以脱去地锦草中的脂质；再将烧瓶中的石油醚倒出，得地锦草混合物。
(2)向地锦草混合物中加入150ml甲醇，在水浴锅中，80℃下加热回流11小时，以脱去其中的色素，得地锦草甲醇混合液。
(3)过滤地锦草甲醇混合液，得地锦草湿品；将地锦草湿品取出，晾干至无试剂气味，得地锦草干粉。
(4)将步骤(3)得到的地锦草干粉和水按1g：35ml的料液比在圆底烧瓶中混合，再在45℃的温度下，于100HZ的频率下超声提取15分钟后，取上清液，得上清液1；将上清液1装入离心管，在3500r/min的转速下离心15分钟，收集上清液，得上清液2。
(5)将上清液2倒入圆底烧瓶中，在55℃的温度下，冷凝回流浓缩至125ml后，于大烧杯中冷却至室温，得浓缩液。
(6)向浓缩液中加入体积分数为95％的乙醇，至混合后的溶液中乙醇的体积分数为80％，得混合溶液；将混合溶液在5℃下，醇沉静置11小时后，在3500r/min下离心15分钟，弃去上清液，收集沉淀物，得沉淀物。
(7)向沉淀物中加入体积分数为80％的乙醇，在5℃下，醇沉静置11小时后，在3500r/min的转速下离心15分钟，收集沉淀物；重复此步骤4次，得醇沉沉淀物。
(8)将醇沉沉淀物依次用体积分数为95％的乙醇、无水乙醇离心洗涤，得洗涤后的沉淀物；即向醇沉沉淀物中加入体积分数为95％的乙醇，混合均匀，在3500r/min的转速下离心8分钟，弃去上清液，收集沉淀物；再向收集的沉淀物中加入无水乙醇，混合均匀，在3500r/min的转速下离心8分钟，弃去上清液，收集沉淀物，得洗涤后的沉淀物。
(9)向洗涤后的沉淀物依次加入丙酮、乙醚进行脱水后，晒干，得所述地锦草多糖提取物。
B制备诱导细胞自噬药物
称取上述制备的地锦草多糖提取物100mg，加入1000ml的水中，加热溶解后，装入瓶中密封，消毒，制成0.1mg/ml的诱导细胞自噬药物。
本发明实施例所述的地锦草提取物在制备诱导细胞自噬药物的应用，提供了一种地锦草提取物的新用途，即在制备诱导细胞自噬药物的应用，并且以地锦草多糖为提取物，制备成0.1mg/ml的诱导细胞自噬药物。
实施例3.
A制备地锦草多糖提取物：
(1)称取地锦草粉末50g，用滤纸包裹装入索氏蒸馏器中，加入125ml石油醚，在水浴锅中，75℃下加热回流24小时，以脱去地锦草中的脂质；再将烧瓶中的石油醚倒出，得地锦草混合物。
(2)向地锦草混合物中加入125ml甲醇，在水浴锅中，75℃下加热回流12小时，以脱去其中的色素，得地锦草甲醇混合液。
(3)过滤地锦草甲醇混合液，得地锦草湿品；将地锦草湿品取出，晾干至无试剂气味，得地锦草干粉。
(4)将步骤(3)得到的地锦草干粉和水按1g：30ml的料液比在圆底烧瓶中混合，再在40℃的温度下，于100HZ的频率下超声提取20分钟后，取上清液，得上清液1；将上清液1装入离心管，在3000r/min的转速下离心20分钟，收集上清液，得上清液2。
(5)将上清液2倒入圆底烧瓶中，在50℃的温度下，冷凝回流浓缩至100ml后，于大烧杯中冷却至室温，得浓缩液。
(6)向浓缩液中加入体积分数为95％的乙醇，至混合后的溶液中乙醇的体积分数为80％，得混合溶液；将混合溶液在4℃下，醇沉静置11小时后，在3000r/min下离心20分钟，弃去上清液，收集沉淀物，得沉淀物。
(7)向沉淀物中加入体积分数为80％的乙醇，在4℃下，醇沉静置12小时后，在3000r/min的转速下离心20分钟，收集沉淀物；重复此步骤3次，得醇沉沉淀物。
(8)将醇沉沉淀物依次用体积分数为95％的乙醇、无水乙醇离心洗涤，得洗涤后的沉淀物；即向醇沉沉淀物中加入体积分数为95％的乙醇，混合均匀，在3000r/min的转速下离心10分钟，弃去上清液，收集沉淀物；再向收集的沉淀物中加入无水乙醇，混合均匀，在3000r/min的转速下离心10分钟，弃去上清液，收集沉淀物，得洗涤后的沉淀物。
(9)向洗涤后的沉淀物依次加入丙酮、乙醚进行脱水后，晒干，得所述地锦草多糖提取物。
B制备诱导细胞自噬药物
称取上述制备的地锦草多糖提取物300mg，加入1000ml的水中，加热溶解后，装入瓶中密封，消毒，制成0.3mg/ml的诱导细胞自噬药物。
本发明实施例所述的地锦草提取物在制备诱导细胞自噬药物的应用，提供了一种地锦草提取物的新用途，即在制备诱导细胞自噬药物的应用，并且以地锦草多糖为提取物，制备成0.3mg/ml的诱导细胞自噬药物。
实施例4.
A制备地锦草多糖提取物：
(1)称取地锦草粉末50g，用滤纸包裹装入索氏蒸馏器中，加入100ml石油醚，在水浴锅中，75℃下加热回流24小时，以脱去地锦草中的脂质；再将烧瓶中的石油醚倒出，得地锦草混合物。
(2)向地锦草混合物中加入100ml甲醇，在水浴锅中，75℃下加热回流12小时，以脱去其中的色素，得地锦草甲醇混合液。
(3)过滤地锦草甲醇混合液，得地锦草湿品；将地锦草湿品取出，晾干至无试剂气味，得地锦草干粉。
(4)将步骤(3)得到的地锦草干粉和水按1g：30ml的料液比在圆底烧瓶中混合，再在40℃的温度下，于100HZ的频率下超声提取20分钟后，取上清液，得上清液1；将上清液1装入离心管，在3000r/min的转速下离心20分钟，收集上清液，得上清液2。
(5)将上清液2倒入圆底烧瓶中，在50℃的温度下，冷凝回流浓缩至100ml后，于大烧杯中冷却至室温，得浓缩液。
(6)向浓缩液中加入体积分数为95％的乙醇，至混合后的溶液中乙醇的体积分数为80％，得混合溶液；将混合溶液在4℃下，醇沉静置12小时后，在3000r/min下离心20分钟，弃去上清液，收集沉淀物，得沉淀物。
(7)向沉淀物中加入体积分数为80％的乙醇，在4℃下，醇沉静置12小时后，在3000r/min的转速下离心20分钟，收集沉淀物；重复此步骤3次，得醇沉沉淀物。
(8)将醇沉沉淀物依次用体积分数为95％的乙醇、无水乙醇离心洗涤，得洗涤后的沉淀物；即向醇沉沉淀物中加入体积分数为95％的乙醇，混合均匀，在3000r/min的转速下离心10分钟，弃去上清液，收集沉淀物；再向收集的沉淀物中加入无水乙醇，混合均匀，在3000r/min的转速下离心10分钟，弃去上清液，收集沉淀物，得洗涤后的沉淀物。
(9)向洗涤后的沉淀物依次加入丙酮、乙醚进行脱水后，晒干，得所述地锦草多糖提取物。
B制备诱导细胞自噬药物
称取上述制备的地锦草多糖提取物200mg，加入到100ml的甘油中，搅拌均匀并加热溶解后，得到诱导细胞自噬药物。
本发明实施例所述的地锦草提取物在制备诱导细胞自噬药物的应用，提供了一种地锦草提取物的新用途，即在制备诱导细胞自噬药物的应用，并且以地锦草多糖为提取物，制备诱导细胞自噬药物。
实施例5.
A制备地锦草多糖提取物：
操作步骤与实施例4中制备地锦草多糖提取物的步骤相同。
B制备诱导细胞自噬药物
称取上述制备的地锦草多糖提取物10g，与40g的淀粉、3g的β-环糊精、0.5g的薄荷香精和0.2g的尼泊金乙酯混合均匀，制成散剂，得散剂型的诱导细胞自噬药物。
本发明实施例所述的地锦草提取物在制备诱导细胞自噬药物的应用，提供了一种地锦草提取物的新用途，即在制备诱导细胞自噬药物的应用，并且以地锦草多糖为提取物，制备成散剂型的诱导细胞自噬药物。
二实验测试
1、实验原理
LC3蛋白标记法检测地锦草诱导小鼠肾上腺上皮细胞NRK细胞自噬和凋亡作用。
作为细胞自噬信号通路中一个标志性蛋白，LC3具有I和II两种亚型。在无自噬作用发生的时候，LC3在胞质中以水溶性的LC3I亚型存在；在细胞发生自噬作用时，该蛋白会转化为水不溶性的LC3II亚型。通过检测细胞中LC3I含量的变化，可以判定细胞发生自噬作用的强弱。
在构建LC3过表达载体时，载体中自带的GFP基因可表达绿色荧光蛋白，当此载体进入细胞后，在载体携带的LC3蛋白表达的同时，绿色荧光蛋白也会在488nm激发光下可见绿色荧光。由于LC3I型蛋白为水溶性蛋白，在细胞中会以弥散状态存在；而LC3II型蛋白在水中以聚集态存在。因此，通过激光共聚焦观察细胞中绿色荧光的分布情况，即可了解LC3I型和LC3II蛋白在细胞中的存在情况，进一步可判定细胞是否发生自噬及发生程度。
2、实验步骤
(一)NRK细胞株体外培养
本试验所用细胞为大鼠肾小球上皮细胞(NRK-GFP-LC3细胞)，使用10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，Gibco)，1％双抗和1％谷氨酰胺的高糖培养基培养细胞，在37℃，5％CO2培养箱中进行细胞的孵育，当细胞生长至占培养皿底部80-90％时，使用0.25％胰酶-EDTA进行消化并传代。
(二)试验方法
取实施例(4)中制备的地锦草多糖提取物溶解于水中过0.22μm无菌滤膜，配制成4mg/ml母液，于-20℃保存。在其使用时，用培养基将其稀释成0.04、0.08、0.16mg/ml。
(1)将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，以5×105/孔密度种植于激光共聚焦专用培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养12-18小时后，移除原培养液，加入新鲜配置的不同浓度的地锦草多糖提取物培养液培养4小时，其浓度分别为：0、0.08、0.16、0.20mg/ml；在培养4小时后，在激光共聚焦下观察自噬小体的的分布情况。并且设置阳性对照(即饥饿对照组，加入杜氏磷酸缓冲液(DPBS)，其质量比例是1:1000)。(阴性对照即0mg/ml的地锦草多糖提取物进行培养)
(2)将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，以5×105/孔密度种植于激光共聚焦专用培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中12-18小时后，移除原培养液，加入新鲜配置的不同浓度的地锦草多糖提取物培养液培养4小时，其浓度选择分别为：0、0.08、0.16、0.20mg/ml。在培养4小时后终止培养，细胞终止培养后立即收集细胞总蛋白，然后用Western Blotting法检测P62、LC3I和LC3II蛋白表达量的变化。
3、实验结果
(1)激光共聚焦结果显示，随着多糖提取物浓度的升高，浓度在0-0.16mg/ml范围内，细胞中聚集的绿色荧光颗粒有明显的增多趋势，超过0.16mg/ml有下降趋势，不同浓度地锦草多糖提取物诱导细胞自噬的激光共聚焦图见图1-图5。
实验结果表明，地锦草多糖提取物可引起细胞发生自噬现象。
(2)Western Blot结果显示，LC3II型蛋白的表达量随着地锦草多糖提取物作用浓度的增高而有升高趋势(如图6所示)，P62对应于LC3II蛋白的表达量有所下降。说明地锦草多糖提取物能有效诱导NRK细胞自噬。
以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。