负载氧化铁纳米颗粒的Γ‑聚谷氨酸水凝胶的制备及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510127862.5 (22)申请日 2015.03.23 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104740656 A (43)申请公布日 2015.07.01 (73)专利权人 东华大学 地址 201620 上海市松江区人民北路2999 号 专利权人 上海市第十人民医院 (72)发明人 史向阳 朱建志 孙文杰 于智博 彭琛 (74)专利代理机构 上海申汇专利代理有限公司 31001 代理人 翁若莹 (51)Int.Cl. A61K 49/18(2006.01。

2、) A61K 49/12(2006.01) (56)对比文件 CN 103933584 A,2014.07.23, CN 102321256 A,2012.01.18, EP 1988108 A1,2008.11.05, 王敬等， . “-多聚谷氨酸水凝胶制备及生 物安全性评价” . 中国组织工程研究与临床康 复 .2008,第12卷(第1期),第56-60页. 审查员 郑召磊 (54)发明名称 负载氧化铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶 的制备及其应用 (57)摘要 本发明涉及负载氧化铁纳米颗粒的-聚谷 氨酸水凝胶的制备及其应用。 所述的制备方法包 括： (1)温和还原法合成PEI包覆的Fe3O4。

3、纳米颗 粒(PEI-Fe3O4)； (2)-聚谷氨酸的水溶液先经 EDC活化， 然后经过双乳化的方法反应形成W/O/W 的聚合物乳液； (3)将(1)中的PE-Fe3O4作为交联 剂加入到(2)中的聚合物溶液中发生交联反应， 除去有机溶剂和表面活性剂后， 即得到负载氧化 铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶。 本发明工艺 简单， 易于操作分离， 原料来源广泛， 成本低廉； 制备的-聚谷氨酸水凝胶粒径分布均匀， 弛豫 率较高， 造影效果显著， 具有良好的水溶性、 胶体 稳定性、 细胞相容性和血液相容性， 对生物体无 不良影响。 权利要求书1页 说明书7页 附图7页 CN 104740656 B 2017。

4、.10.24 CN 104740656 B 1.一种负载氧化铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶的制备方法， 其特征在于， 包括： 步骤1： 将铁盐溶解， 通入N2鼓吹搅拌， 将亚硫酸钠水溶液滴加到上述溶液中， 搅拌 10min-1h； 将超支化聚乙烯亚胺水溶液加入到上述溶液中， 搅拌混合均匀； 将氨水加入到上 述溶液， 在60-70下反应10min-1h， 在室温下继续反应1-3h， 反应结束后， 将反应液离心洗 涤， 即得PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒； 步骤2： 配制-聚谷氨酸的水溶液， 先加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐活化1-3h， 再加入碳酸氢钠继续反应0.5-1.5。

5、h； 然后将上述溶液逐滴加入到磺基琥珀酸 二辛酯钠的二氯甲烷溶液中， 搅拌3-8分钟， 形成W/O乳液； 然后将该W/O乳液逐滴加入到聚 乙烯醇的水溶液中， 搅拌5-15分钟， 形成W/O/W的聚合物乳液； 步骤3： 将步骤1制备的PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒逐滴加入到步骤2制备的W/O/W 的聚合物乳液中， 搅拌过夜， 蒸发除去有机溶剂， 然后离心洗涤， 即得到负载氧化铁纳米颗 粒的-聚谷氨酸水凝胶。 2.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶的制备方法， 其特征 在于， 所述的步骤1中的铁盐、 亚硫酸钠、 超支化聚乙烯亚胺和氨水的用量配比为2.6 g:0.4 g:1 g:。

6、4 mL， 氨水的浓度为25.0%-28.0%。 3.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶的制备方法， 其特征 在于， 所述的步骤1中的铁盐为FeCl36H2O。 4.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶的制备方法， 其特征 在于， 所述的步骤2中的-聚谷氨酸的水溶液的浓度为1 wt%。 5.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶的制备方法， 其特征 在于， 所述的步骤2中的-聚谷氨酸与碳酸氢钠的质量比为1:1.3。 6.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶的制备方法， 其特征 在于， 所述的步骤2中的磺基琥珀酸二辛酯钠的二。

7、氯甲烷溶液的浓度为2.5 wt%。 7.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶的制备方法， 其特征 在于， 所述的步骤2中的聚乙烯醇的水溶液的浓度为2 wt%。 8.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶的制备方法， 其特征 在于， 所述的步骤2中的-聚谷氨酸水溶液、 磺基琥珀酸二辛酯钠的二氯甲烷溶液和聚乙 烯醇的水溶液的体积比为1:2:15。 9.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶的制备方法， 其特征 在于， 所述的步骤3中所用的PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒和步骤2中所用的-聚谷氨酸 的质量比为3:1。 10.一种MR成像造影剂， 其特征。

8、在于， 含有权利要求1-9中任一项所述的方法制备的负 载氧化铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104740656 B 2 负载氧化铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶的制备及其应用 技术领域 0001 本发明属于磁共振造影剂的制备领域， 特别涉及一种负载氧化铁纳米颗粒的- 聚谷氨酸纳米水凝胶的制备方法。 背景技术 0002 纳米水凝胶是由亲水性或两亲性的高分子链通过物理或者化学交联的方式组成 的三维网状结构的水凝胶颗粒， 它是一种纳米尺度的软体材料。 纳米水凝胶具有许多优良 的特性， 如良好的胶体稳定性、 细胞相容性、 高负载能力、 易于多功能化、 易进入肿瘤组。

9、织 等， 促进了其在诸多领域的应用。 天然多聚氨基酸(如-聚谷氨酸)具有良好的细胞相容性 和生物可降解性 ， 同时价廉易得 ， 广泛用于合成纳米水凝胶。 -聚谷氨酸 (- Polyglutamic Acid， -PGA)是自然界中微生物发酵产生的水溶性多聚氨基酸， 其结构为 谷氨酸单元通过 -氨基和-羧基形成肽键的高分子聚合物， 其结构如式所示。 -聚谷氨 酸具有优良的水溶性、 超强的吸附性和生物可降解性， 是一种优良的环保型高分子材料， 已 广泛用于生物医学领域。 0003 0004 磁共振成像(MRI)技术是七十年代发展起来的一种先进医学成像诊断技术， 已广 泛用于人体多种疾病的检测和早期。

10、诊断。 MRI具有较高的分辨率， 较高的空间和断层成像能 力， 没有放射引起的电离损害， 同时可获得解剖及生理信息， 具有其他医学成像无可比拟的 优点。 MRI在疾病监测领域发挥越来越重要的作用。 但MRI的弱点是其敏感性较低， 而且不同 器官或肿瘤组织的弛豫时间相互 重叠使MRI诊断困难。 近年来， 通过注射MRI成像造影剂的 方法可以有效解决MRI敏感性较低的问题， 显著提高成像的对比度和清晰度。 因此选择合适 的MRI成像造影剂就显得尤为重要。 0005 磁性四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4)近年来在生物医学领域有着越来越广泛的应用， 尤其是在MRI成像造影剂方面的应用更是受到了普遍的关注。

11、。 Fe3O4纳米颗粒具有独特的磁 学性质以及较高的信号强度、 较低的使用剂量、 良好的细胞相容性和较低的制造成本等特 点。 本课题组之前采用还原法制备超顺磁性氧化铁纳米颗粒的结果表明， 通过还原法制备 的四氧化三铁纳米颗粒尺寸较小， 粒径均匀， 并且表现出极高的r2弛豫率， 且其表面存在大 量的氨基活性基团， 可作为纳米水凝胶合成的交联剂(沈明武， 李静超， 胡勇， 孙文杰， 史向 阳。 一种叶酸修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法。 中国发明专利， 申请号： 201410182821.1， 申请日期： 2014-4-30)。 本发明以还原法合成的PEI-Fe3O4为交联剂合成 -聚谷氨酸。

12、纳米水凝胶， 构建了负载Fe3O4纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶用作MRI成像造 说 明 书 1/7 页 3 CN 104740656 B 3 影剂， 其表面丰富的羧基可以进一步修饰功能化试剂， 为本发明的进一步深入研究开发提 供了很大的空间。 0006 检索国内外文献发现， 尚没有发现关于以还原法合成的PEI-Fe3O4为交联剂制备 -聚谷氨酸水凝胶作为MR成像造影剂研究的相关报道。 发明内容 0007 本发明所要解决的技术问题是提供一种-聚谷氨酸纳米水凝胶的制备及其在MR 造影剂方面的应用， 该方法工艺简单， 易于操作分离， 原料来源广泛； 制备的-聚谷氨酸纳 米水凝胶能稳定地分散于水溶液中，。

13、 粒径分布均匀， 弛豫率高、 造影效果显著， 具有良好的 医用前景。 0008 为了解决上述技术问题， 本发明提供了一种负载氧化铁纳米颗粒的-聚谷氨酸 水凝胶的制备方法， 其特征在于， 包括： 0009 步骤1： 将铁盐(III)溶解， 通入N2鼓吹搅拌， 将亚硫酸钠(Na2SO3)水溶液滴加到上 述溶液中， 搅拌10min-1h； 将超支化聚乙烯亚胺(PEI)水溶液加入到上述溶液中， 搅拌混合 均匀； 将氨水(NH3.H2O)加入到上述溶液， 在60-70下反应10min-1h， 在室温下继续反应1- 3h， 反应结束后， 将反应液离心洗涤， 即得PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒(PEI-Fe。

14、3O4)； 0010 步骤2： 配制-聚谷氨酸的水溶液， 先加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 盐酸盐(EDC)活化1-3h， 再加入碳酸氢钠(NaHCO3)继续反应0.5-1.5h； 然后将上述溶液逐滴 加入到磺基琥珀酸二辛酯钠(AOT)的二氯甲烷(DCM)溶液中， 搅拌3-8分钟， 形成W/O乳液； 然 后将该W/O乳液逐滴加入到聚乙烯醇(PVA)的水溶液中， 搅拌5-15分钟， 形成W/O/W的聚合物 乳液； 0011 步骤3： 将步骤1制备的PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒逐滴加入到步骤2制备的W/ O/W的聚合物乳液中， 搅拌过夜， 蒸发除去有机溶剂， 然后离心洗涤， 即得。

15、到负载氧化铁纳米 颗粒的-聚谷氨酸水凝胶。 0012 优选地， 所述的步骤1中的铁盐、 亚硫酸钠、 超支化聚乙烯亚胺和氨水的用量配比 为2.6g 0.4g 1g 4mL， 氨水的浓度为25.0-28.0。 0013 优选地， 所述的步骤1中的铁盐为FeCl36H2O。 0014 优选地， 所述的步骤2中的-聚谷氨酸的水溶液的浓度为1wt。 0015 优选地， 所述的步骤2中的-聚谷氨酸与碳酸氢钠(NaHCO3)的质量比为1 1.3。 0016 优选地， 所述的步骤2中的AOT的二氯甲烷(DCM)溶液的浓度为2.5wt。 0017 优选地， 所述的步骤2中的聚乙烯醇(PVA)的水溶液的浓度为2w。

16、t。 0018 优选地， 所述的步骤2中的-聚谷氨酸水溶液、 AOT的二氯甲烷(DCM)溶液和聚乙 烯醇(PVA)的水溶液的体积比为1 2 15。 0019 优选地， 所述的步骤3中所用的PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒和步骤2中所用的 -聚谷氨酸的质量比为3 1。 0020 本发明还提供了一种MR成像造影剂， 其特征在于， 含有上述方法制备的负载氧化 铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶。 0021 本发明所制备的负载氧化铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶是由-聚谷氨酸与 PEI-Fe3O4的静电相互作用和化学作用交联而成。 本发明先利用还原法合成PEI包裹的Fe3O4 说 明 书 2/7 页 4 CN 1。

17、04740656 B 4 磁性纳米颗粒， 然后将其加入到经EDC活化和双乳化的-聚谷氨酸溶液中， 发生交联反应 形成负载Fe3O4纳米颗粒的-聚谷氨酸纳米水凝胶。 本发明操作简单， 易于分离， 原料来源 广泛。 制备的-聚谷氨酸水凝胶粒径分布均匀， 弛豫率较高、 造影效果显著， 具有良好的水 溶性、 胶体稳定性、 细胞相容性和血液相容性， 对生物体无不良影响， 易于被肿瘤细胞吞噬。 肿瘤成像结果显示， 本发明制备的负载Fe3O4纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶具有显著的造 影效果， 在磁共振成像造影剂领域有潜在的应用价值。 0022 本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、 X射线衍射分析。

18、(XRD)、 傅里叶转换 红外光谱分析(FTIR)、 热重分析(TGA)、 扫描电子显微镜(SEM)、 透射电子显微镜(TEM)、 电感 耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)和磁共振(MR)分析等手段表征制备的负载Fe3O4纳 米颗粒的-聚谷氨酸纳米水凝胶(-PGA/PEI-Fe3O4)。 然后利用刃天青还原法评价纳米水 凝胶的细胞毒性， 并用相差显微镜获取与材料共培养后的细胞的形貌； 随后评价肿瘤细胞 对该纳米水凝胶的吞噬能力。 最后进行体外细胞、 裸鼠体内肿瘤模型的MR成像实验， 考察 -PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶的体内外MR成像效果。 此外， 通过组织分布实验研究-PG。

19、A/ PEI-Fe3O4纳米水凝胶在生物体内的代谢情况。 0023 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 0024 (1)本发明采用还原法合成的Fe3O4-PEI作为交联剂制备-PGA/PEI-Fe3O4纳米水 凝胶用于MR成像造影剂， 该方法工艺简单， 易于操作分离， 原料来源广泛价廉生物可降解， 具有良好的发展前景。 0025 (2)本发明制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶粒径分布均匀， 具有良好的水溶 性、 胶体稳定性、 细胞相容性和血液相容性， 弛豫率高， 造影效果显著， 该水凝胶表面拥有大 量的活性基团可用于进一步的修饰和深入开发， 在磁共振成像诊断领域有潜在的应用价 值。

20、。 附图说明 0026 图1为本发明实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶水溶液的粒径分布图 (a)及其在不同储存时间的水动力学直径变化(b)； 0027 图2为本发明实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶和和裸露的Fe3O4纳米 颗粒(共沉淀法)的X射线衍射分析(XRD)图片； 0028 图3为本发明实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶、 -PGA和PEI-Fe3O4纳 米颗粒的傅立叶变换红外光谱分析(FTIR)图片； 0029 图4为本发明实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶、 裸露的Fe3O4纳米颗粒 (共沉淀法)和PEI-Fe。

21、3O4纳米颗粒的的热重分析(TGA)图片； 0030 图5为本发明实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶的透射电子显微镜 (TEM， 左图)和扫描电子显微镜(SEM， 右图)图片； 0031 图6为本发明实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶的T2驰豫时间倒数随Fe 浓度变化的关系曲线； 0032 图7为HeLa细胞经本发明实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶处理24小时 后的刃天青还原分析图(Fe浓度为0.01、 0.02、 0.04、 0.08、 0.1、 0.2mM)； 0033 图8为本发明实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶。

22、的对HeLa细胞处理24小 说 明 书 3/7 页 5 CN 104740656 B 5 时后(Fe浓度为0.01、 0.02、 0.04、 0.08、 0.1、 0.2mM)的细胞相差形貌图片。 0034 图9为本发明实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶的HeLa细胞吞噬量随Fe 浓度的变化关系(Fe浓度为0.01、 0.02、 0.04、 0.08、 0.1、 0.2mM)； 0035 图10为本发明实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶对细胞处理后的细胞 MR成像图片(a)和体外细胞MR成像信噪比随Fe浓度变化的关系图(b)； 0036 图11为注射本发明实。

23、施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶(200 L， Fe 51.04mM)后在不同时间点下体内Hela肿瘤模型的MR成像图片(a)及其信噪比图片(b)； 0037 图12本发明实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶(200 L， Fe51.04mM) 组织分别在荷兰裸鼠(a)和正常白鼠(b)体内代谢的组织分布图片； 具体实施方式 0038 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所。

24、附权利要求书所限定 的范围。 0039 实施例1 0040 将2.6g六水合氯化铁(FeCl36H2O)倒入三口烧瓶中， 加入40ml超纯水溶解， 通入 N2鼓吹搅拌； 将15ml 26.67g/L亚硫酸钠(Na2SO3)水溶液缓慢滴加到上述溶液中， 搅拌 30min； 将10ml100g/L超支化聚乙烯亚胺(PEI， Mw25kDa)水溶液加入到上述溶液中， 搅拌 混合均匀； 将4ml浓度为25.0-28.0的氨水(NH3.H2O)加入到上述溶液， 在60-70下反应 0.5h， 在室温下继续反应2h。 反应结束后， 将反应液在6000rpm离心并用超纯水洗涤3次， 即 得PEI 包裹的四氧。

25、化三铁纳米颗粒PEI-Fe3O4。 将20mg-聚谷氨酸(-PGA， Mw1000kDa) 溶解于2.4ml超纯水配制-聚谷氨酸的水溶液， 先加入0.6ml50g/L EDC溶液活化2h； 将 26mg碳酸氢钠(NaHCO3)加入到上述溶液中继续反应1h； 然后将上述溶液逐滴加入到6ml 33.5g/LAOT的二氯甲烷(DCM)溶液中， 搅拌5分钟， 形成W/O乳液； 然后将该W/O乳液逐滴加入 到44.1ml 20.4g/L聚乙烯醇(PVA， 醇解度88， Mw20-30kDa)的水溶液中， 搅拌10分钟， 形 成W/O/W的聚合物乳液。 取5ml 1.34g/L PEI-Fe3O4逐滴加入。

26、到上述W/O/W的聚合物乳液中， 搅拌过夜， 蒸发除去有机溶剂， 然后5000rpm离心并用超纯水洗涤3次以除去表面活性剂， 即 得到负载氧化铁纳米颗粒的-聚谷氨酸水凝胶(-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶)。 0041 实施例2 0042 取实施例1中制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶， 将其用超纯水稀释100倍后， 用 于测表面电势和水动力直径。 Zeta电势测定结果表明-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶的表面 电势为-6.550.42mV， 从而有效避免了PEI-Fe3O4表面氨基产生的细胞毒性， 也证明了- PGA和PEI-Fe3O4的成功交联。 其水动力学直径为23。

27、9.43.8nm， 粒径分布均一， 且水动力直 径能长时间保持几乎不变(如图1)， 从而说明-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶(实施例1)具有 良好的胶体稳定性。 接着本发明通过测定XRD(如图2)和FTIR(如图3)， 本发明制备的- PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶的XRD图谱(参见附图2)表明： 所制备的水凝胶的衍射峰在位点 220、 311、 400、 422、 511和440处与四氧化三铁纳米颗粒的衍射峰位点非常吻合。 衍射峰峰型 尖锐， 说明反应制得了晶型良好的四氧化三铁纳米晶体。 本发明制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳 说 明 书 4/7 页 6 CN 1047406。

28、56 B 6 米水凝胶的FTIR图谱(参见附图3)表明： 在598cm-1、 1630cm-1、 1737cm-1、 2925cm-1三处， 吸收 峰强度明显增加。 这说明PEI-Fe3O4很好的交联了-PGA， 形成纳米水凝胶， 表明了PEI- Fe3O4和-PGA成功交联。 然后本发明对-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶进行了TGA(如图4)分 析， 结果表明水凝胶中的四氧化三铁含量为38， -PGA的含量为50。 之后通过透射电子 显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)观察实施例1中制备-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶的 形貌(如图5)。 结果表明所形成的 -PGA/PEI。

29、-Fe3O4纳米水凝胶的形貌呈球形或准球形， 尺 寸均匀， 凝胶直径大小约为130nm， 没有明显的团聚现象， 在溶液中分散良好而且不发生聚 集。 0043 实施例3 0044 通过ICP-AES测试法测定实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶中Fe元素的 含量。 分别配制Fe元素浓度为0.0125、 0.025、 0.05、 0.1、 0.2mM的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝 胶水溶液2mL， 通过磁共振成像分析仪测定材料在不同Fe浓度下的T2弛豫效应(如图6)。 0045 Fe3O4纳米材料可以用作核磁共振成像的阴性造影剂， 随着Fe浓度的增加， MRI信号 强度逐渐。

30、减弱。 弛豫率(r2)反映Fe3O4纳米材料作为MRI造影剂的成像效率， 为单位摩尔浓度 铁的横向弛豫时间， 可通过不同浓度下的弛豫时间(T2)的倒数拟合计算得到。 0046 通过本发明制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶T2弛豫时间倒数与Fe浓度的线性 拟合图， 可以看出这种-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加(在 0.01250.2mM浓度范围内)， 具有良好的线性关系。 随着Fe浓度的增高， 其MR信号强度明显 减弱。 不同浓度样品的磁共振成像可以看出纳米颗粒具有良好的体外成像效果。 通过计算 得出-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶的r2值为1。

31、71.1mM-1s-1(参见附图6)。 因此， 本发明所制备 的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶可以作为MR分子影像学诊断中的优良T2信号衰减造影剂。 0047 实施例4 0048 刃天青还原实验和相差显微镜测试结果： 0049 通过刃天青荧光比色法测定HeLa细胞的活力来评价本发明制备的-PGA/PEI- Fe3O4纳米水凝胶的细胞相容性。 配制不同浓度的实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水 凝胶水溶液。 收集对数生长期HeLa细胞， 按照10000细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板 上， 加入DMEM培养基， 细胞培养板置于CO2浓度为5和温度为37的环境中培养24小时。

32、。 弃 掉培养基后， 每孔更换180 L DMEM培养基， 并分别添加20 L不同浓度的-PGA/PEI-Fe3O4纳 米水凝胶(最终Fe元素浓度为0.01、 0.02、 0.04、 0.06、 0.08、 0.1、 0.2mM)和纯 PBS(对照组)， 每种浓度设定5个平行样。 将细胞培养板继续放置在5CO2， 37继续孵育24h。 倒掉原有培 养基并用无菌PBS清洗3遍， 每孔加入20 L刃天青溶液(1mg/mL)， 避光环境下37恒温培养 4h。 按顺序每孔吸取上层培养液100 L于黑色96孔板中， 在多功能荧光酶标仪上检测各孔在 激发波长 530nm， 发射波长 590nm处的荧光值，。

33、 荧光值的大小可以反映活细胞的数量 (如图7)。 结果显示， 与PBS对照组相比， -PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶在试验浓度范围内对 HeLa细胞没有明显细胞毒性， 细胞存活率均在100以上， 说明-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝 胶具有非常好的细胞相容性， 可以安全地应用于生物体内MRI成像。 同时， 本发明通过相差 显微镜观察法进一步验证了-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶对细胞形貌的影响。 如图8所示， 不同Fe浓度-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶(Fe浓度为0.01、 0.02、 0.04、 0.06、 0.08、 0.1、 0.02mM)在37下与细胞共培养24。

34、小时后， 细胞形貌与PBS处理的细胞没有明显的变化， 进 说 明 书 5/7 页 7 CN 104740656 B 7 一步说明了-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶具有良好的细胞相容性。 0050 实施例5 0051 一种理想的造影剂纳米材料应该易于被肿瘤细胞吞噬， 才能更好的应用于肿瘤的 MRI成像， 因此本发明对-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶被肿瘤细胞的吞噬情况进行了评价。 0052 配制不同浓度的实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶水溶液， 将HeLa细胞 接种在96孔细胞培养板上(接种密度为每孔50万)， 加180 L DMEM培养基， 细胞培养板置于 CO。

35、2浓度为5和温度为37的环境中培养24小时。 分别加入所配制的不同浓度的-PGA/ PEI-Fe3O4纳米水凝胶水溶液(Fe元素终浓度为0.01、 0.02、 0.04、 0.06、 0.08、 0.1、 0.2mM)， 在 5CO2， 37条件下共培养6小时， 以PBS培养作为空白对照组。 PBS清洗细胞3遍之后， 用王 水(盐酸/硝酸； 体积比3 1)消化， 然后利用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)测 量细胞吞噬的Fe浓度。 附图9结果显示， 经-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶(0.2mM)处理的细胞 的吞噬量非常高， 达到10.8pg/cell。 这一结果说明-PG。

36、A/PEI-Fe3O4纳米水凝胶易于被肿 瘤细胞所吞噬， 从而获得理想的造影效果。 0053 实施例6 0054 在体内实验之前， 本发明评价了本发明制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶的细 胞MRI成像效果， 配制不同浓度的实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶水溶液， 将 HeLa细胞接种在96孔细胞培养板上(接种密度为每孔50万)， 加具体什么培养基， 多少体积， 什么条件下培养12h， 分别加入所配制的不同浓度的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶水溶液 (Fe元素终浓度为0.025、 0.05、 0.1、 0.2mM)， 在5CO2， 37下共培养6小时， 并。

37、且以PBS处理 的细胞作为对照组， 在培养结束后细胞用PBS清洗5次， 再胰酶消化、 离心、 过滤， 最后分散在 1mL PBS(含0.5琼脂糖)中， 用核磁共振成像仪测各细胞样品的T2弛豫效应(如图10)。 在 图10a中， 随着Fe浓度的增加， -PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶处理后的细胞表现出MR信号衰 减的趋势， 说明随着Fe浓度的增加， 细胞对纳米水凝胶的吞噬量也增加。 图10b是细胞经过 不同浓度的纳米水凝胶处理后的MR成像信噪比值， 从图中明显看出， 随着Fe浓度的增加， 细 胞的MRI信噪比均逐渐减少。 这些结果说明制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶具有很好的 。

38、细胞MR成像效果。 0055 实施例7 0056 在裸鼠体内构建HeLa皮下瘤模型， 通过尾静脉注射本发明实施例1制备的-PGA/ PEI-Fe3O4纳米水凝胶的PBS溶液(200 L， Fe51.04mM)来评价肿瘤部位MR成像效果(参见 附图11a)。 与注射前的对照组相比较， 在注射后2小时内， 注射-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶 的裸鼠肿瘤逐渐变暗， 在注射后4h时， 裸鼠的肿瘤部位变得最暗， 说明-PGA/PEI-Fe3O4纳 米水凝胶易被肿瘤细胞所吞噬， 具有明显的MRI肿瘤诊断效果。 在注射后6h， 实验组的裸鼠 肿瘤部位明暗程度逐渐开始恢复。 说明此时纳米材料随着血液流。

39、通从肿瘤部位逐渐代谢出 去(参见附图11a)。 图11b是相应注射时间的肿瘤MRI信噪比变化， 在注射后2h， 裸鼠肿瘤部 位信噪比有所降低， 在注射后4h， 裸鼠肿瘤部位信噪比达到最低， 在注射后6h， 裸鼠肿瘤部 位MRI信号值开始上升， 这与图11a的结果一致， 说明纳米材料逐渐从肿瘤部位代谢出去。 肿 瘤MR成像结果说明本发明制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶可以应用于体内肿瘤MR成像 诊断的造影剂。 0057 实施例8 说 明 书 6/7 页 8 CN 104740656 B 8 0058 以实施例7构建的HeLa肿瘤模型裸鼠(如图12a)和未构建HeLa肿瘤模型的白鼠(如。

40、 图12b)来研究本发明制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶在生物体内各组织的分布代谢情 况。 向裸鼠尾静脉注射本发明实施例1制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶的PBS溶液(200 L， Fe51.04mM)， 在2h、 4h、 6h时间点处死裸鼠； 向白鼠尾静脉注射本发明制备的-PGA/ PEI-Fe3O4纳米水凝胶(200 L， Fe51.04mM)， 饲养7d、 14d、 30d后处死白鼠。 老鼠处死后取 出各个器官并称重， 然后切成小片段， 并加入3mL王水浸泡2天， 用ICP-AES测定各个组织器 官中铁的含量， 并以空白老鼠作为参考对照。 如图12a所示， 在注射。

41、材料后， 肝、 脾和肺中铁 的含量较注射前均明显增加， 而在其他的器官， 比如： 心、 肾和肿瘤， 铁的聚集较少， 其结果 与裸鼠MR成像结果一致； 如图12b所示， 在注射材料7d之后， 白鼠体内的铁基本代谢干净， 说 明本发明制备的-PGA/PEI-Fe3O4纳米水凝胶能在白鼠体内正常的代谢清除。 0059 对比例1 0060 将Fe(II)和Fe(III)按照1 2的比例混合溶解于HCl溶液中， 将上述混合液逐滴滴 加到持续搅拌的2mol/L的NaOH溶液中， 80反应1小时后， 冷却至室温继续反应2小时。 反应 结束后， 磁分离洗涤三次， 5000rpm离心去除大颗粒， 即得到共沉淀法。

42、制备的裸露的Fe3O4纳 米颗粒。 说 明 书 7/7 页 9 CN 104740656 B 9 图1 图2 说 明 书 附 图 1/7 页 10 CN 104740656 B 10 图3 图4 说 明 书 附 图 2/7 页 11 CN 104740656 B 11 图5 图6 说 明 书 附 图 3/7 页 12 CN 104740656 B 12 图7 说 明 书 附 图 4/7 页 13 CN 104740656 B 13 图8 说 明 书 附 图 5/7 页 14 CN 104740656 B 14 图9 图10 说 明 书 附 图 6/7 页 15 CN 104740656 B 15 图11 图12 说 明 书 附 图 7/7 页 16 CN 104740656 B 16 。