技术领域
本发明涉及一种猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗及其 制备方法，属于兽药疫苗领域。
背景技术
猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actionobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的一种呼吸系统重要传染病。本病主要引 起猪的一种伴有胸膜炎的纤维素性、出血性、坏死性肺炎，多呈最急性 或急性病程而迅速死亡，发病率和死亡率均在50%以上，它可发生于任 何年龄的猪只，尤其是在集约化养猪场，一旦发生会造成重大经济损失。
猪胸膜肺炎放线杆菌又称为副溶血嗜血杆菌（H.parahaemolyties）， 该病原菌生长要求严格，为革兰氏阴性球杆菌，有荚膜。该病原菌血清 型众多，根据NAD依赖性，可以分为生物I型和生物II型，其中依赖 NAD的猪胸膜肺炎放线杆菌划为生物I型（BiovarI），不依赖NAD的 猪胸膜肺炎放线杆菌划为生物II型(BiovarII)，采用传统血清型方法，又 可细分为15个血清型；其中生物I型包括血清1-12型和15型，生物II 型包括血清13型和14型。猪胸膜肺炎病的病原血清型众多，给猪胸膜 肺炎病的预防与控制带来了困难。
猪链球菌（Streptococcussuis）是条件致病菌，广泛分布于自然界中， 在动物的呼吸道、肠道、生殖道等处常在，可引起猪脑膜炎、关节炎、 心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡，严重危害养猪业的发展。猪链球 菌为革兰氏阳性菌，可在外界环境中存活很长时间，特别是在粪便中及 被污染的环境和带菌猪是重要的传染源，超急性死亡的猪只不出现任何 症状。猪只不分品种、年龄和性别，一年四季都可以感染本病，哺乳和 断奶后仔猪发病死亡率高达80%以上，并有一定人畜共感染性。猪链球 菌至少分为5种类型：急性败血性、脑膜炎性、关节炎性、脓肿性和无 乳型。
由于猪胸膜肺炎病血清型和猪链球菌的类型众多，对两种疾病共感 染、同时发病的养殖场，没有有效的应对措施，常常带来巨大损失。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种新型猪传染性胸膜肺 炎、猪链球菌病二联多价灭活疫苗，包含至少一种已灭活的猪传染性 胸膜肺炎放线杆菌抗原和至少一种猪链球菌抗原，以预防和治疗猪胸 膜肺炎病和猪链球菌引起的疾病。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原是指含有至少一种猪传染性胸膜肺 炎放线杆菌抗原形式的任何组合物，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗 原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染的 免疫应答。猪传染性胸膜肺炎放线杆菌为包括本领域技术人员熟知的 临床分离的野毒株，包含目前已鉴定的1～15个血清型。优选地，所 述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原是完整的猪传染性胸膜肺炎放线杆 菌，优选为灭活形式，更优选，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原 是灭活的血清型为1型、5型和7型的混合抗原；最优选为灭活的猪 传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株，和灭活的猪传染性胸膜肺炎 放线杆菌血清5型YC株，和灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7 型YS株。
本发明的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原还可以包含以下组合物 的任一种抗原：如武汉科前动物生物制品有限责任公司的猪传染性胸 膜肺炎三价灭活疫苗（APP血清型1型、2型和7型）；中牧实业股 份有限公司成都药械厂的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗（APP血清 1型、2型和7型）。
正如本领域技术人员所知，不同的微生物野外分离株在基因序 列上有微小的变异，然而，当变异不影响其蛋白质合成、结构或者主 要作用功能区时，该微生物之他种野外分离株即使基因序列无法百分 之百相同，其基本的生理功能并不会有所改变。因此，目前国际上常 使用16SRibosomalRNA（16SrRNA）来进行细菌型的分辨，因此在 相似性的比较上可以用16SrRNA来进行比对而得到其同源性。所 以，在16SrRNA具有同源性的前提下，本发明所使用的猪传染性胸 膜肺炎放线杆菌抗原并不限定于本发明所使用的野外分离株。
16srRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列， 存在于所有细菌的染色体基因组中。16SrRNA具有高度的保守性和 特异性以及该基因序列足够长（包含约50个功能域）。
因此，本发明包括与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌三株菌株（LC株、 YC株和YS株）16SrRNA的同源性在80%上以上的菌株，更优选与 LC株或YC株或YS株16SrRNA同源性在至少90%以上，优选地至 少95%以上，更优选地至少95%～99%以上的猪传染性胸膜肺炎放线 杆菌菌株，即不改变猪传染性胸膜肺炎放线杆菌三株菌株（LC株、YC 株和YS株）16SrRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛 选或诱变本发明的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，获得与本发明猪传染 性胸膜肺炎放线杆菌16SrRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有 相同或相似免疫原性的抗原组合物。
猪链球菌抗原是指含有至少一种猪链球菌抗原形式的任何组合物， 所述猪链球菌抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪链球菌感染的免 疫应答。猪链球菌为包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株， 包含目前已鉴定的1～9个起致病作用的血清型。优选地，所述猪链 球菌抗原是完整的猪链球菌，优选为灭活形式，更优选，所述猪链球 菌抗原是灭活的血清型为2型和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种的混 合抗原；最优选为灭活的猪链球菌血清2型SC株，和灭活的猪链球 菌C群马链球菌兽疫亚种。
本发明的猪链球菌抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原：如 武汉科前动物生物制品有限责任公司的猪链球菌病灭活疫苗（马链球 菌兽疫亚种+猪链球菌2型+猪链球菌7型）；上海海利生物技术股份 有限公司的猪链球菌病灭活疫苗（马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2 型）；广东永顺生物制药有限公司的猪链球菌2型灭活疫苗；山东滨 州华宏生物制品有限责任公司的猪链球菌病灭活疫苗（马链球菌兽疫 亚种+猪链球菌2型）。
还包括在16SrRNA具有同源性的前提下，本发明所使用的猪链 球菌抗原并不限定于本发明所使用的野外分离株。本发明还包括与猪 链球菌两株菌株（SC株和马链球菌兽疫亚种）16SrRNA的同源性在 80%上以上的菌株，更优选与SC株或马链球菌兽疫亚种16SrRNA同 源性在至少90%以上，优选地至少95%以上，更优选地至少95%～99% 以上的猪链球菌菌株，即不改变猪链球菌两株菌株（SC株和马链球菌 兽疫亚种）16SrRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛 选或诱变本发明的猪链球菌，获得与本发明猪链球菌16SrRNA高度 同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似免疫原性的抗原组合物。
发明人通过长期的研究和大量的试验，发现目前猪传染性胸膜肺炎、 猪链球菌病缺少合适治疗措施，特别是缺少合适的二联疫苗的原因在 于，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的血清型众多，和猪链球菌亚型和/或亚 种众多，制备针对猪传染性胸膜肺炎或猪链球菌病的单苗中多价抗原之 间就会相互干扰，从而影响其疫苗的总体免疫效果。但发明人在长期的 研究和大量的试验中，意外地发现了将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的至 少三种血清型，和猪链球菌至少两种亚型或亚型联用时，会减少抗原之 间的相互影响；特别是当使用猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的三种血清型 1、5、7型时，会显著地减少抗原之间的影响，在减少抗原用量的同时， 获得良好的免疫原性，可以用于同时预防和治疗猪传染性胸膜肺炎和猪 链球菌病。
更出乎意料地，发明人还获得了3株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和 1株猪链球菌，与保藏号ATCC35246的猪链球菌配合使用，可以将抗原 之间的相互干扰将至最低，而获得一种具有良好的免疫原性的猪传染性 胸膜肺炎、猪链球菌病二联灭活疫苗
基于上述发现，本发明的第一方面为提供猪传染性胸膜肺炎、猪链 球菌病二联灭活疫苗，其含有猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型的抗原 和猪链球菌亚型或亚种的抗原。
优选地，本发明所述的二联灭活疫苗为含有至少三种猪传染性胸膜 肺炎放线杆菌血清型的抗原和至少两种猪链球菌亚型或亚种的抗原。 更优选地，本发明所述的二联灭活疫苗中，含有猪传染性胸膜肺炎放 线杆菌血清1型、血清5型和血清7型的抗原；以及猪链球菌2型的 抗原。
优选地，本发明所述的二联灭活疫苗，含有猪传染性胸膜肺炎放 线杆菌血清1型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪链球 菌2型（R群）SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种的抗原。
优选地，本发明所述的二联灭活疫苗，所述二联灭活疫苗中抗原 比例为：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株：血清5型YC 株：血清7型YS株:猪链球菌2型SC株:猪链球菌C群马链球菌兽 疫亚种=2:2:2:1:1。
优选地，本发明所述的二联灭活疫苗，据权利要求4所述的二联 灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗中抗原的含量为：灭活前 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型、血清5型、血清7型活菌数各自 均不少于5.0×107CFU／mL，猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种活菌数 各自均不少于5×109CFU／mL；或上述抗原总体积为所述疫苗总体积的 75%～90%。
其次，目前在用于预防和治疗猪传染性胸膜肺炎或猪链球菌病的疫 苗中，所用的佐剂为油性疫苗，这也是因为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 的血清型众多，和猪链球菌亚型和/或亚种众多，在使用水性佐剂时，多 价抗原之间就会相互干扰，从而影响其疫苗的总体免疫效果；而发明人 通过大量实验，意外地发现在本发明的上述二联灭活疫苗中，加入水性 佐剂并不会降低疫苗的免疫原性。
因此，本发明的第二方面在于提供含上述抗原的二联灭活疫苗水性 佐剂；即本发明所述的二联灭活疫苗，还含有佐剂；更优选地，所述 佐剂为水性佐剂；最优选地，所述水性佐剂选自MontanideGELPR 聚合物及其同系物的一种或几种。
此外，本发明的疫苗还可以含有防腐剂、免疫增强剂等公知的疫 苗佐剂；优选地，本发明所述的二联灭活疫苗，还含有疫苗总量0.01% 的硫柳汞。
本发明的第三方面为提供上述发现中的猪传染性胸膜肺炎放线杆 菌和猪链球菌，其具有超强毒力及免疫原性，在疫苗制备过程中可使用 较少的抗原量达到较好的免疫效果，从而降低生产及使用成本，具体为：
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株，由普莱柯生物工程 股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心（简称CCTCC） 进行保藏，保藏日期：2011年12月9日，保藏号为：CCTCCM2011458， 地址为中国武汉·武汉大学；猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型 YC株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型 培养物中心进行保藏，保藏日期：2011年12月9日，保藏号为：CCTCC M2011459；猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株，由普莱柯 生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保 藏，保藏日期：2011年12月9日，保藏号为：CCTCCM2011460。
猪链球菌2型SC株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴 定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期：2011年10月12 日，保藏号为：CCTCCM2011351。
本发明的第三方面为提供了上述猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病二 联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1）分别繁殖培养猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌；
2）灭活并以一定比例混合；
3）加入佐剂和/或防腐剂；和/或免疫提高剂，既得猪传染性胸膜肺炎、 猪链球菌病二联灭活疫苗的成品。
优选地，本发明的二联灭活疫苗的制备方法，进一步包括以下步 骤：
1.根据权利要求13所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述步骤为：
⑴分别将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、血清5型YC 株、血清7型YS株、猪链球菌2型（R群）SC株和猪链球菌C群马 链球菌兽疫亚种菌种繁殖培养，得到猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清 1型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪链球菌2型（R群） SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种菌液；
⑵分别将步骤⑴培养得到的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC 株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪链球菌2型（R群）SC株 和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种菌液中按各自总量加入0.2%的甲醛 溶液，放置37℃灭活24h，期间搅拌3～5次，根据计数结果浓缩菌液；
⑶将上述已灭活、浓缩的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、 血清5型YC株、血清7型YS株、猪链球菌2型（R群）SC株和猪 链球菌C群马链球菌兽疫亚种菌液，按2：2:2:1:1比例混合，并加入 疫苗总量0.01%的硫柳汞，然后和佐剂进行乳化，佐剂含量为10%～ 25%；成品猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病二联灭活疫苗抗原含量为 灭活前猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型、血清5型、血清7型活 菌数均不少于5.0×107CFU／mL，猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种 活菌数均不少于5×109CFU／mL。
由上可见，本发明的二联灭活疫苗可以用于预防和治疗猪传染 性胸膜肺炎、猪链球菌病。
技术效果
本发明的至少有以下优点：
1.本发明第一次解决了同时预防和治疗猪传染性胸膜肺炎、猪链 球菌病的难题，克服了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌类型众多 引起相互配合的困难，提供了能够具有良好免疫原性的抗原组合物；
2.本发明发现了3株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和1株猪链球菌， 几种抗原配合使用，可以将抗原之间的相互干扰将至最低，而获得一种 具有良好的免疫原性的猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病二联灭活疫苗；
3.本发明使用了灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1、5、7型与 猪链球菌作为抗原，其具有超强毒力及免疫原性，在疫苗制备过程中 可使用较少的抗原量达到较好的免疫效果，从而降低生产及使用成 本，适宜大规模生产及养殖场中的应用；
4.本发明在疫苗的制备中，使用了中空纤维超滤器浓缩、生理盐 水悬浮的配苗菌液大大减少了毒素，优化工艺的同时，提高了疫苗的 安全性。
5.本发明首先在猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗使用 了水性佐剂，减少了使用油性佐剂免疫猪只而发生的应激反应，不仅 符合当今猪用疫苗水性佐剂发展趋势，减少了配苗过程中繁琐的程 序，并降低了人力物力的需求。代表了当今猪用疫苗新的发展趋势， 具有推广潜力。
6.本发明的猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗，在与单 苗相同生产成本及销售价格的水平上，达到一针两防的效果，可代替 单苗使用，从而大大降低了免疫成本，具有商业上的成功潜力。
具体实施方式
本发明实施例中的具体实验方法可参见《中华人民共和国兽药典 （二〇一〇年版）》及附录。其他未注明的试剂或原料均可由本领域 技术人员根据现有技术获得。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点 将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明 的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发 明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或 替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗的制备
1.菌种
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株，由普莱柯生物工程 股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏 日期：2011年12月9日，保藏号为：CCTCCM2011458。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT株，公开于中国专利CN 102391975A，保藏号为：CCTCCNOM2011410。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株，由普莱柯生物工程股份 有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期： 2011年12月9日，保藏号为：CCTCCM2011459。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株，由普莱柯生物工程股份 有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期： 2011年12月9日，保藏号为：CCTCCM2011460。
猪链球菌2型SC株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定， 已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期：2011年10月12日，保 藏号为：CCTCCM2011351。
猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种，来自美国菌种保藏中心，保藏号 ATCC35246。
为获得免疫性强的菌种，各菌种经敏感猪体复壮鉴定合格后冻干保 存并包藏。
2.猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗的制备
2.1.生产用种子的制备
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、2型XT株、5型 YC株、7型YS株冻干菌种，分别划线接种于TSA/NAD（含5%小牛血 清）平板上，置37℃培养16～24小时，选取符合要求的菌落，接种于 TSB/NAD（含5%小牛血清）液体培养基中，37℃培养12～16小时，作 为一级种子；猪链球菌2型SC株、C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246 株冻干菌种，分别划线接种于Clumbia羊血平板上，置37℃培养18～24 小时作为一级种子。
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、2型XT株、5型 YC株、7型YS株取一级种子的培养物，按0.1%的量加入TSB/NAD（含 5%小牛血清）液体培养基中，37℃培养12～16小时，经检验纯粹后作 为二级种子；猪链球菌2型SC株、C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246 株分别选取符合要求的菌落，接种于含有15ml/L犊牛血清的改良马丁肉 汤培养基中，37℃静置培养12～16小时，经羊血平板纯粹检验合格后 作为二级种子。
采用商售的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基、猪链球菌培养 基。
2.2.菌液的培养
在猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基（商售TSB）中，加入 0.01%～0.05%NAD、5%～10%的血清，将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 血清1型LC株、2型XT株、5型YC株、7型YS株菌液分别按0.1% 的量加进培养基中分别培养，混匀后置37℃培养16～18小时，当菌液 的浓度OD600达到2.5以上、DO值开始上升、PH值降低到6.5以下时 停止培养。
在猪链球菌培养基（商售改良马丁肉汤）中，加入1.5%的L犊牛 血清、0.1%～5%的葡萄糖，将猪链球菌2型SC株、C群马链球菌兽疫 亚种ATCC35246株菌液分别按5%的量加进培养基中培养，混匀后置 37℃培养16～18小时，当菌液浓度OD600达到2.5以上、DO值开始上 升、PH值降低到6.0以下时停止培养。
2.3.灭活
向上述六种培养好的菌液中，按总量的0.2%（V/V）分别加入甲 醛溶液，放置于37℃灭活24h，期间搅拌3～5次。
2.4.检验
取已经灭活的4种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌液分别取5mL接种 于100mL含0.01%～0.05%NAD、5%～10%的血清的猪传染性胸膜肺炎 放线杆菌TSB培养基中，37℃培养24小时，再移植于上述100mL培养 基中37℃培养24小时；取灭活的3种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌液 0.5mL划线接种于TSA/NAD平板培养基，37℃培养24小时。两种方法 培养后，均无菌生长。
取已经灭活的2种猪链球菌菌液分别5mL接种于100mL加入1.5% 的L犊牛血清、0.1%～5%的葡萄糖改良马丁肉汤培养基，37℃培养24 小时，再移植于上述100mL培养基中37℃培养24小时；取已经灭活的 2种猪链球菌菌液0.5mL划线接种于羊血琼脂平板培养基，37℃培养24 小时。两种方法培养后，均无菌生长。
取上述六种已灭活的菌液分别静脉注射18～22g的Balb/C小鼠5只， 每只0.2mL，三天内5/5健活，方为灭活彻底。
3.猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗的配制
3.1.疫苗具体成分配比
现有的6种抗原成分（猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、 2型XT株、5型YC株、7型YS株、猪链球菌2型SC株和C群马链 球菌兽疫亚种ATCC35246株）可按照不同的搭配方式制成以下45种猪 传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗。抗原总含量体积百分比在 75%～90%，MontanideGELPR佐剂占10%～25%，此处我们选择抗原 总含量最优体积百分比90％，MontanideGELPR佐剂最优体积百分比 10%。猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、2型XT株、5型YC 株和7型YS株各占总体积20％，猪链球菌2型SC株和C群马链球菌 兽疫亚种ATCC35246株各占总体积10％，MontanideGELPR佐剂占总 体积10％，抗原成分不足90%部分以PBS补足。
本次配苗使用的抗原灭活前活菌数分别为猪传染性胸膜肺炎放线 杆菌血清1型LC株5.0×109CFU/ml、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2 型XT株3.0×109CFU/ml、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株 2.0×109CFU/ml、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株 3.7×109CFU/ml、猪链球菌2型SC株7.0×109CFU/ml和C群马链球菌兽 疫亚种ATCC35246株8.0×109CFU/ml。配苗时疫苗中所含灭活前猪传 染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、血清2型XT株、血清5型YC 株、血清7型YS株活菌数均调整为5.0×107CFU／mL，猪链球菌2型 SC株和马链球菌兽疫亚种ATCC35246株活菌数均调整为5×109CFU／ mL。
表1疫苗具体成分配比
3.2.疫苗配制过程
具体如下：将菌液用中空纤维超滤器浓缩，滤去上清，并用生理盐 水重悬稀释，参照菌落计数结果，调整菌液浓度为猪传染性胸膜肺炎放 线杆菌血清1型LC株、2型XT株、5型YC株、7型YS株各5.0×107CFU/ml 和猪链球菌2型SC株、C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株各 5.0×109CFU/ml。每种疫苗各制备100ml（疫苗45制备111ml），其中 MontanideGELPR取10ml，各疫苗中抗原含量按照以上表格中比例配 制，疫苗1～疫苗44均需加入PBS调整抗原总体积至90ml，疫苗45中 含有6种抗原成分，根据各抗原比例共制备约110ml疫苗（LC株 20ml+XT株20ml+YC株20ml+YS株20ml+SC株10ml+C群马链球菌 兽医亚种10ml+MontanideGELPR11ml）。各疫苗成分按配苗比例加入 后，低速搅拌乳化，在终止搅拌前加入疫苗总量的0.01%的硫柳汞。每 种配方疫苗制备3批。
4.安全性试验
4.1.对小白鼠的安全性
取制备的疫苗分别接种18～22g的Balb/C小鼠5只，每只皮下注 射0.2ml，观察14d，无局部反应且全部健活。
4.2.对仔猪的安全性
取制备的疫苗分别肌肉注射30日龄健康易感猪各5头，每头 4mL,14天内无局部反应且全部健活。
5.效力试验
每组疫苗各用18～22g的Balb/C小鼠,皮下接种0.1mL二联灭活 苗，免后28d分成6组,连同对照组每组各10只,分别用猪传染性胸膜 肺炎放线杆菌血清1型LC株腹腔注射5LD50（含菌量为4.0×105CFU）， 2型XT株腹腔注射5LD50（含菌量为4.0×105CFU），5型YC株进行 腹腔注射5LD50（含菌量为5.0×105CFU）；7型YS株进行腹腔注射5LD50 （含菌量为5.0×106CFU）；猪链球菌2型SC株皮下注射2LD50（含菌 量为1.0×102CFU），猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株 皮下注射5LD50（含菌量为4.0×102CFU）另外10只设为空白对照,观察 14d。
每组疫苗各用28～35日龄的健康易感猪30头，每头肌肉注射2mL, 含1个使用剂量，28d天后，将注射了每种疫苗的免疫试验猪随机分为6 组，分别用所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型LC株、2型XT株、5 型YC株、7型YS株、猪链球菌2型SC株和马链球菌兽疫亚种ATCC35246 株各自攻毒。对照猪30头，分6组，分别用所述猪传染性胸膜肺炎放线 杆菌血清1型LC株、2型XT株、5型YC株、7型YS株、猪链球菌2型SC株 和马链球菌兽疫亚种ATCC35246株各自攻毒。观察14天。效力检验结 果，见下表2。
表2疫苗效力检验结果
注：猪传染性胸膜肺炎发病标准：发病猪出现发热（体温40.5℃以 上，持续1～3日）、精神萎靡，聚堆、呼吸困难、腹泻、呕吐、被毛 粗乱等临床症状。对死猪和濒死猪剖检，可见猪只气管和支气管内充满 泡沫状血样粘性渗出物、肺充血、水肿，肺炎病灶变暗，变硬，质地脆 弱，纤维素性胸膜炎区呈现暗红色或发黑。
通过效力试验可知，疫苗43及疫苗45配方可对猪传染性胸膜肺 炎、猪链球菌两种病有效进行保护，通过配方可知疫苗43比疫苗45少 了一种抗原组分，却能达到疫苗45的全面免疫的效果，对这两种猪传 染性胸膜肺炎、猪链球菌病提供全面而有效的保护！
实施例2猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗对比试验
目前市售猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗主要由武汉科前和中牧成都 药械厂2家企业生产，猪链球菌疫苗主要由武汉科前，上海海利，广东 永顺和山东华宏4家企业生产。针对以上几家企业生产的疫苗，我们采 用本研究相同的制备方法制备了几种与市售产品相同血清型的二联灭 活疫苗，并对这几种二联灭活疫苗进行比较。随后将比较后获得最优二 联疫苗与市场销售的上述几家的产品进行一系列比较。其中市售相关猪 传染性胸膜肺炎疫苗及链球菌疫苗详细信息如下表3，表4：
表3.市售猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗
表4.市售猪链球菌疫苗
1.本发明的猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗的制备
按照上述表格所列举的市售猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗和猪链 球菌病灭活疫苗不同的血清型及搭配方式，我们对这几种组合方式按照 本研究制备方法对以上几种血清型进行了猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌 二联灭活疫苗制备，并对这几种组合方式下的猪传染性胸膜肺炎、猪链 球菌二联灭活疫苗进行保护效率的比较，以期得出最优组合。详细配方 如下所示：
1.1猪传染性胸膜肺炎（血清1型LC株＋血清2型XT株＋血清7型 YS株）、猪链球菌病（马链球菌兽疫亚种＋猪链球菌2型SC株） 二联灭活疫苗（V1）的制备
1.2猪传染性胸膜肺炎（血清1型LC株＋血清5型YC株＋血清7型 YS株）、猪链球菌病（马链球菌兽疫亚种＋猪链球菌2型SC株） 二联灭活疫苗（V2）的制备
注：以上配苗用菌液配苗前用中空纤维超滤器浓缩，滤去上清，并 用生理盐水重悬稀释，参照菌落计数结果，调整猪传染性胸膜肺炎放线 杆菌血清1型LC株、5型YC株、7型YS株菌液浓度各为5.0×107CFU/ml， 调整猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT株菌液浓度为 3.0×109CFU/ml，调整猪链球菌2型SC株和C群马链球菌兽疫亚种 ATCC35246株菌液浓度各为5.0×109CFU/ml，根据配苗具体成分配比标 准加入佐剂，低速搅拌乳化，在终止搅拌前加入疫苗总量的0.01%的硫 柳汞。
2.猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗动物试验比较
2.1仔猪对比试验
选35～40日龄断奶仔猪85头，分为4组，第1组25头，第2组 25头，第3组30头，第4组5头。第1组每头猪分别颈部肌肉注射疫 苗（V1）2ml，免疫后28d再次接种2ml；第2组每头猪分别颈部肌肉 注射疫苗（V2）2ml，免疫后28d再次接种2ml；第3组作为攻毒对照 组，第4组作为空白对照组。在首次免疫后42d，第1、2、3组各随机 挑选5头仔猪进行胸膜肺炎放线杆菌1型LC株攻毒，每头滴鼻菌液3ml， 活菌含量为1×108CFU/头；第1、2、3组各随机挑选5头仔猪进行胸膜 肺炎放线杆菌7型YS株攻毒，每头滴鼻菌液3ml，活菌含量为1×108CFU/ 头；第1、2、3组各随机挑选5头仔猪进行C群马链球菌兽疫亚种 ATCC35246株攻毒，每头滴鼻菌液3ml，活菌含量为1×108CFU/头；第 1、2、3组各随机挑选5头仔猪进行猪链球菌2型SC株攻毒，每头滴鼻 菌液3ml，活菌含量为1×108CFU/头；第1、3组各随机挑选5头仔猪进 行胸膜肺炎放线杆菌2型XT株攻毒，每头滴鼻菌液3ml，活菌含量为 1×109CFU/头；第2、3组各随机挑选5头仔猪进行胸膜肺炎放线杆菌5 型YC株攻毒，每头滴鼻菌液3ml，活菌含量为1×108CFU/头；
攻毒后连续观察10日，并于攻毒后第10日称重后扑杀，剖检。根据体 温、组织损伤和抗体水平等相关结果进行判定。试验结果如表5-表8。
表5.试验分组及处理
表6.攻毒后各组试验猪体温超40.5℃的天数比较
由上述体温产生情况表可看出，二联苗V2免疫后的猪只在攻毒后 只有2头试验猪出现体温升高，且只维持了1天的时间；二联苗V1免 疫后的猪只在攻毒后有5头试验猪出现体温升高，也只维持了1天的时 间，可见二联苗V1和V2免疫仔猪后攻毒所产生的保护效力都比较好， 且二联苗V2更优。
表7.攻毒后各组试验猪组织损伤及细菌检出率
由上述组织损伤及细菌检出率情况表可看出，二联苗V2免疫后的 试验猪只在攻毒后没有出现任何组织损伤，也没有检测出任何细菌；二 联苗V1免疫后的试验猪只在攻毒后有3头试验猪出现个别组织损伤， 同时个别猪只检测出细菌，可见二联苗V1和V2免疫仔猪后攻毒所产生 的保护效力二联苗V2更优。
表8.各组试验猪二免后14天抗体水平
注：“-”表示抗体为阴性
由上述各组试验猪二免后14天抗体水平情况表可看出，二联苗V2 免疫后的试验猪只二免后14天的抗体水平（包括APP-1型、APP-5型、 APP-7型、SS-2型和马链球菌兽疫亚种）多数为1:800，个别猪只抗体 水平达到1:1600；二联苗V1免疫后的试验猪只二免后14天的抗体水平 （包括APP-1型、APP-2型、APP-7型、SS-2型和马链球菌兽疫亚种） 多数为1:800，个别猪只抗体水平出现1:400，可见二联苗V1和V2免疫 仔猪后攻毒所产生的保护效力二联苗V2更优。
2.2怀孕母猪对比试验
选产前6周怀孕母猪12头，分为3组，每组4头。第1组每头猪分 别颈部肌肉注射疫苗（V1）2ml，产前2周再次接种2ml；第2组每头 猪分别颈部肌肉注射疫苗（V2）2ml，产前2周再次接种2ml；第3组 作为空白对照组。接种后观察母猪精神、采食状态、接种部位是否出现 红肿反应、产仔情况以及所产仔猪母源抗体持续情况。试验结果如表9- 表15。
表9.分组免疫及免疫后观察情况表
由上述各组怀孕母猪免疫后观察情况表可看出，二联苗V1和V2免 疫后的怀孕母猪在接种疫苗后精神和采食状况均正常，接种部位也没有 出现红肿现象，所产仔猪也100%健活，但是空白对照组所产仔猪出现 个别弱仔，并在出生后2天死亡，结果显示，二联苗V1和V2对怀孕母 猪均没有任何副作用，且均可产生有效的保护力，对所产仔猪而言意义 重大。
表10.怀孕母猪所产仔猪APP-1型菌母源抗体情况表
注：“-”表示抗体水平为阴性
表11.怀孕母猪所产仔猪APP-2型菌母源抗体情况表
注：“-”表示抗体水平为阴性
表12.怀孕母猪所产仔猪APP-5型菌母源抗体情况表
注：“-”表示抗体水平为阴性
表13.怀孕母猪所产仔猪APP-7型菌母源抗体情况表
注：“-”表示抗体水平为阴性
表14.怀孕母猪所产仔猪SS-2型菌母源抗体情况表
注：“-”表示抗体水平为阴性
表15.怀孕母猪所产仔猪马链球菌兽疫亚种母源抗体情况表
注：“-”表示抗体水平为阴性
本研究结果表明：二联苗V1和V2在免疫仔猪后均可以产生有效的 保护力，但从临床及剖检症状而言，二联苗V2略优于二联苗V1；二联 苗V1和V2在免疫怀孕母猪后对母猪均没有产生副反应，同时对所产的 仔猪均可以产生长时间有效的保护力。因此可以得出结论：应用本研究 方法所制备的猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗可以对仔猪及 怀孕母猪产生有效的保护力。
实施例3二联疫苗与单苗联合使用对比试验
结合实施例2试验结果，可知应用本研究方法所制备的猪传染性胸 膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗可以对仔猪及怀孕母猪产生有效的保护 力。本实施例选取最优组合猪传染性胸膜肺炎（血清1型LC株＋血清 5型YC株＋血清7型YS株）、猪链球菌（马链球菌兽疫亚种＋猪链球 菌2型SC株）二联灭活疫苗与市售单苗联合使用进行效果比对试验。
1.疫苗的制备及获取
1.1猪传染性胸膜肺炎（血清1型LC株＋血清5型YC株＋血清7型 YS株）、猪链球菌（马链球菌兽疫亚种＋猪链球菌2型SC株）二联灭 活疫苗
按照实施例2中V2的制备方法制备二联苗，见下表16。
1.2猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗购自武汉科前动物生物制品有限责 任公司，产品批号为111007；猪链球菌病灭活疫苗购自上海海利生物技 术股份有限公司，产品批号为20111022。
2.动物试验设计
2.1仔猪动物试验
选35～40日龄断奶仔猪85头，分为4组，第1组25头，第2组 25头，第3组30头，第4组5头。第1组每头仔猪分别颈部肌肉注射 疫苗（V2）2ml，免疫后28d再次接种2ml；第2组每头仔猪分别按照 猪链球菌病灭活疫苗20111022和猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗 111007使用说明书进行首免和二免；第3组作为攻毒对照组，第4组作 为空白对照组。二免后14d，第1、2、3组各随机挑选5头仔猪进行胸 膜肺炎放线杆菌1型LC株攻毒，每头滴鼻菌液3ml，活菌含量为 1×108CFU/头；第1、2、3组各随机挑选5头仔猪进行胸膜肺炎放线杆 菌7型YS株攻毒，每头滴鼻菌液3ml，活菌含量为1×108CFU/头；第1、 2、3组各随机挑选5头仔猪进行C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株 攻毒，每头滴鼻菌液3ml，活菌含量为1×108CFU/头；第1、2、3组各 随机挑选5头仔猪进行猪链球菌2型SC株攻毒，每头滴鼻菌液3ml， 活菌含量为1×108CFU/头；第2、3组各随机挑选5头仔猪进行胸膜肺炎 放线杆菌2型XT株攻毒，每头滴鼻菌液3ml，活菌含量为1×109CFU/ 头；第1、3组各随机挑选5头仔猪进行胸膜肺炎放线杆菌5型YC株攻 毒，每头滴鼻菌液3ml，活菌含量为1×108CFU/头；攻毒后连续观察10 日，并于攻毒后第10日称重后扑杀，剖检。根据体温、组织损伤和抗 体水平等相关结果进行判定。
2.3怀孕母猪动物试验
选产前6周怀孕母猪12头，分为3组，每组4头。第1组每头怀孕 母猪分别颈部肌肉注射疫苗（V2）2ml，产前2周再次接种2ml；第2 组每头怀孕母猪分别按照猪链球菌病灭活疫苗20111022和猪传染性胸 膜肺炎三价灭活疫苗111007使用说明书进行首免和二免；；第3组作为 空白对照组。接种后观察母猪精神、采食状态、接种部位是否出现红肿 反应、产仔情况以及所产仔猪母源抗体持续情况。
3.动物试验结果
3.1仔猪动物试验结果
表17.攻毒后各组试验猪体温超40.5℃的天数比较
由上述体温产生情况表可看出，二联苗V2免疫后的猪只在攻毒后 只有1头试验猪出现体温升高，且只维持了1天的时间；猪链球菌病灭 活疫苗20111022和猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗111007联合免疫后 的猪只在攻毒后有6头试验猪出现体温升高，维持时间1～2天左右，可 见单独使用二联苗V2免疫仔猪后攻毒所产生的保护效力比联合使用猪 链球菌和猪传染性胸膜肺炎三价灭活单苗效果要好。
表18.攻毒后各组试验猪组织损伤及细菌检出率
由上述组织损伤及细菌检出率情况表可看出，二联苗V2免疫后的 试验猪只在攻毒后没有出现任何组织损伤，也没有检测出任何细菌；猪 链球菌病灭活疫苗20111022和猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗111007 联合免疫后的试验猪只在攻毒后个别出现组织损伤，同时检测出细菌， 可见单独使用二联苗V2免疫仔猪后攻毒所产生的保护效力比联合使用 猪链球菌和猪传染性胸膜肺炎三价灭活单苗效果要好。
表18.各组试验猪二免后14天抗体水平
注：“-”表示抗体为阴性
由上述各组试验猪二免后14天抗体水平情况表可看出，二联苗V2 免疫后的试验猪只二免后14天的抗体水平（包括APP-1型、APP-5型、 APP-7型、SS-2型和马链球菌兽疫亚种）多数为1:800；猪链球菌病灭 活疫苗20111022和猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗111007联合免疫后 的试验猪只二免后14天的抗体水平（包括APP-1型、APP-2型、APP-7 型、SS-2型和马链球菌兽疫亚种）多数为1:400，少数猪只抗体水平出 现1:800，可见单独使用二联苗V2免疫仔猪后攻毒所产生的保护效力比 联合使用猪链球菌和猪传染性胸膜肺炎三价灭活单苗效果要好。
3.2怀孕母猪动物试验结果
表19.分组免疫及免疫后观察情况表
由上述各组怀孕母猪免疫后观察情况表可看出，二联苗V2免疫后的 怀孕母猪在接种疫苗后精神和采食状况均正常，接种部位也没有出现红 肿现象，所产仔猪也100%健活；猪链球菌病灭活疫苗20111022和猪传 染性胸膜肺炎三价灭活疫苗111007联合免疫后的怀孕母猪在接种后所 产仔猪虽然100%健活，但出现精神萎靡、采食量下降现象，并且疫苗 注射部位出现细微红肿。分析原因可能是单苗联合使用要注射疫苗4次， 并且注射总体积也比使用二联苗要高出一倍，因此可能会带来相应的副 反应。结果显示，二联苗V2免疫对怀孕母猪没有任何副作用，且均可 产生有效的保护力，对所产仔猪而言意义重大；而单苗联合使用会给怀 孕母猪带来一些副反应，故使用二联苗要比单苗联合使用效果好，意义 大。
表20.怀孕母猪所产仔猪APP-1型菌母源抗体情况表
注：“-”表示抗体水平为阴性
表21.怀孕母猪所产仔猪APP-2型菌母源抗体情况表
注：“-”表示抗体水平为阴性
表22.怀孕母猪所产仔猪APP-5型菌母源抗体情况表
注：“-”表示抗体水平为阴性
表23.怀孕母猪所产仔猪APP-7型菌母源抗体情况表
注：“-”表示抗体水平为阴性
表24.怀孕母猪所产仔猪SS-2型菌母源抗体情况表
注：“-”表示抗体水平为阴性
表25.怀孕母猪所产仔猪马链球菌兽疫亚种母源抗体情况表
注：“-”表示抗体水平为阴性
本研究结果表明：二联苗V2在免疫怀孕母猪后不仅不会产生任何 副反应，而且会对怀孕母猪产生坚强保护力，怀孕母猪所产仔猪其母源 抗体水平不仅持续时间长，而且抗体水平很均一；猪链球菌病灭活疫苗 20111022和猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗111007联合免疫后对怀孕 母猪虽然也可以产生保护力，但在免疫后会对怀孕母猪产生一些副反 应，影响怀孕母猪生产状态，同时怀孕母猪所产仔猪抗体水平存在不均 匀、持续时间短的现象，因此二联苗使用要比单苗联合使用效果更优。
根据以上试验结果可以看出，用MontanideGELPR（包括同系列佐 剂）为佐剂制成的新型猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病二联灭活疫苗（LC 株+YC株+YS株+SC株+马链球菌兽疫亚种）不仅要使用方便，更为安 全，免疫效果较两种单苗联和使用要好，注射后不会引起仔猪及怀孕母 猪副反应，并能有效预防猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和链球菌引起的猪 传染性胸膜肺炎和猪链球菌病，具有很好的市场前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。