技术领域
本发明属分析化学领域，具体涉及一种中药陆英颗粒有效成分及含量的测定 方法。
背景技术
中成药陆英，其陆英颗粒剂型，已上市多年，主要有效成分是小分多肽，棕 黄色或棕褐色颗粒，味甜、微苦。广泛用于临床内科，具有疏肝健脾，活血化瘀， 消肿止痛的作用。
已知技术对中药陆英颗粒中有效成分多肽的含量测定一般用考马斯亮蓝法， 这种方法存在诸多不足，如：准确度较差，灵敏度较低，干扰多等。迄今，尚未 见有可靠的方法用于中药陆英颗粒中有效成分多肽的鉴定和含量测定的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便而准确的测定中药陆英颗粒有效成分多肽及 含量的方法。
本发明的技术方案通过下述步骤实现：
(1)取待测样品，进行样品预处理：研细，精密称定，超声处理，放冷， 稀释，离心，取上清液进样；
(2)以HPLC/MS法对中药陆英颗粒的有效成分多肽进行初步鉴定，
采用HPLC/MS法对多肽进行鉴定，通过HPLC-MS检测得到欲测定组分的分子 离子峰，从而推算出物质的分子量，当分子量大于200时，出现的峰即为小分子 多肽；
(3)用高效液相色谱法测定中药陆英颗粒的有效成分多肽的含量，
采用液相色谱-紫外检测器测定中药陆英颗粒的有效成分多肽及对照品缩宫 素的峰面积，用校正方程换算成中药陆英颗粒的有效成分多肽的含量。
采用通用型或者细径型的液相色谱柱为固定相，其填料为十八烷基键合相硅 胶、辛烷基键合相硅胶或者氰基键合相硅胶，填料粒径3~10μm。
流动相由0.1~0.2％的三氟乙酸水溶液和0.1~0.2％的三氟乙酸乙腈溶液组 成。
本发明测定样品中中药陆英颗粒的有效成分含量的方法简便、准确、可靠， 多肽对照品缩宫素(九肽)线性范围0.01~0.5mg/mL，最小检出量40ng，线性 相关系数r＝0.99991，相对标准偏差(RSD)小于2％，加样回收率97~102％。本 方法能排除其他物质对有效成分多肽的干扰，准确地用于中药陆英颗粒的有效成 分多肽鉴定及含量测定。
附图说明
图1为典型的中药陆英颗粒有效成分多肽HPLC-UV色谱图，
其中，(A)为空白色谱图；(B)为对照品缩宫素(九肽)色谱图；(C)为中药 陆英颗粒样品色谱图。
具体实施方式
实施例1中药陆英颗粒有效成分多肽的鉴定
色谱条件：
Agilent 1100型高效液相色谱/质谱仪(包括G1322A Vacuum Degasser在线 脱气，G1312A Bin Pump高压双泵，G1313A ALS Autosampler自动进样器，G1316A Thermostatted Column Compartment柱温箱，G1315B Diode Array and Multiple Wavelength Detector，DAD二极管阵列检测器，G1946D(SL)Qudarpole LC/MSD 四极杆质谱仪，G2710AA single instrument ChemStation for liquid chromatography(LC)systesm色谱工作站)，Agilent Zorbak，Eclipse C18(150 ×2.1mm I.D.，5μm)；流动相：A：0.1％三氟乙酸水，B：0.1％三氟乙酸乙腈，0到 120分钟A∶B由95∶5变到70∶30；流速：0.5ml·min-1；检测波长：220nm； 柱温：25℃；进样5μl。
质谱条件：
离子化方式：API-ES；碎裂电压：70ev；检测方式：正离子全扫描100到 2000检测；干燥气流：液N2，流速10.0L/min，温度为350℃；雾化压力：50psig； 毛细管电压：4000V。
对照品溶液的制备：精密称取对照品缩宫素(九肽)适量，加水制成每1ml 含0.25mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取中药陆英颗粒装量差异项下的内容物适量，研细，取 2.5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加水适量，超声处理(功率250W，频率40kHz) 30分钟，放冷，加水稀释至刻度，静置10分钟，取出1ml离心10分钟(每分 钟转速4000转)，取上清液，作为供试品溶液。
测定法：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μl进样，进行高效液相色 谱-质谱分析。
色谱峰的定位：在以上条件下，陆英颗粒中多肽类成分(共15个)的保留 时间分别为8.5min、12.1min、21.5min、22.6min、26.7min、40.7min、42.2min、 46.0min、50.2min、56.1min、58.7min、61.6min、65.8min、69.9min、75.0min； 相对保留时间(相对于缩宫素保留时间为75.7min)为0.11、0.16、0.28、0.30、 0.35、0.53、0.56、0.61、0.66、0.74、0.77、0.81、0.87、0.92、0.98；分 子量分别为717.3、906.2、737.1、423.1、924.0、702.1、875.9、890.5、633.0、 975.1、675.1、675.1、318.2、365.6、736.4；相对保留时间(相对于最后一个 多肽保留时间为75.0min)分别为0.11、0.16、0.29、0.30、0.36、0.53、0.56、 0.61、0.67、0.75、0.78、0.82、0.88、0.93、1。
实施例2中药陆英颗粒有效成分多肽含量的测定
色谱条件：
美国Angilent HP-1100型高效液相色谱仪，包括在线脱气、四元泵、柱温 箱、紫外检测器、惠普色谱工作站及20μL手动进样系统；色谱柱：Agilent Zorbak， Eclipse C18(150×4.6mm I.D.，5μm)；柱温：25℃；流动相：A：0.1％三氟乙酸水 溶液，B：0.1％三氟乙酸乙腈，0到60分钟A∶B由95∶5变到70∶30；流速： 1.0mL/min；检测波长：220nm。典型色谱图见图1。
对照品溶液的制备：精密称取对照品缩宫素(九肽)适量，加水制成每1ml 含0.25mg的溶液，即得
供试品溶液的制备：取中药陆英颗粒装量差异项下的内容物适量，研细，取 2.5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加水适量，超声处理(功率250W，频率40kHz) 30分钟，放冷，加水稀释至刻度，静置10分钟，取出1ml离心10分钟(每分 钟转速4000转)，取上清液，作为供试品溶液。
测定法精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl进样，进行高效液相色 谱分析。根据样品中小分子多肽峰面积的和与多肽对照品缩宫素(九肽)峰面积 按下述校正方程式进行计算，即得样品中多肽类成分的百分含量。
P % = Ai × Cs × Vi As × W × 1000 × 100 % ]]>
式中：P％----样品中多肽类成分的百分含量
Ai----样品溶液中小分子多肽峰面积和
As----对照品溶液的峰面积
Cs----对照品溶液的浓度(mg/ml)
Vi---样品溶液的体积(ml)
多肽组分色谱峰的定位：在以上色谱条件下，陆英颗粒中多肽类成分(共15 个)的保留时间分别为4.4min、5.5min、10.5min、11.1min、12.9min、19.4min、 20.5min、22.1min、24.2min、28.3min、29.7min、30.2min、32.1min、34.1min、 36.5min；相对保留时间(相对于缩宫素保留时间为38.2min)分别为0.11、0.14、 0.27、0.29、0.34、0.51、0.54、0.58、0.63、0.74、0.78、0.79、0.84、0.90、 0.96；相对保留时间(相对于最后一个多肽保留时间为36.5min)分别为0.12、 0.16、0.29、0.31、0.36、0.55、0.58、0.62、0.68、0.80、0.84、0.85、0.90、 0.96、1。
专属性：利用高效液相色谱技术进行分离及含量测定，不同的组分应具有不 同的保留时间。用本方法对样品进行分析，结果表明多肽组分分离效果良好。空 白辅料和缩宫素都不干扰多肽的测定。
线性试验：配制多肽对照品缩宫素(九肽)溶液，使其浓度为0.01，0.05， 0.125，0.25，0.5mg/ml。以下按“样品制备”项处理。以峰面积(Y)，对缩宫 素浓度(C，mg/mL)进行线性回归，计算结果为Y＝11637.54C+32.82513 r＝0.99991，n＝5。
灵敏度：经测定，本方法对缩宫素的最低检测限为40ng(S/N＝3)，定量限为 130ng(S/N＝10)。
加样回收率试验：
精吸对照品适量，加入到已准确测定含量的样品溶液中，得到浓度为 0.125mg/ml缩宫素的加样样品，依上述方法进样5次，测定值代入标准曲线后 计算测定浓度和加样回收率，表1为加样回收率测定结果。
表1 样品 加样回收率(％) 平均回收率(％) RSD(％) 1 2 3 4 5 98.02 97.90 101.82 101.24 99.48 99.69 1.81
精密度试验：
天内精密度 精称对照品适量，分别配成0.01mg/ml、0.125mg/ml、0.5mg/ml 的溶液，按“样品制备”项处理。按上述色谱条件进行分析，一天内测定五次， 测得天内精密度，表2为HPLC法测量陆英颗粒天内精密度(n＝5)。
表2 理论浓度(mg/ml) 0.01 0.125 0.5 RSD(％) 1.10 1.27 1.84
天间精密度 精称对照品适量，分别配成0.01mg/ml、0.125mg/ml、 0.5mg/ml的溶液，按“样品制备”项处理。按上述色谱条件进行分析，连续测 定5天，测得天间精密度，表3为HPLC法测雷替曲塞含量天间精密度(n＝5)。
表3 理论浓度(mg/ml) 0.01 0.125 0.5 RSD(％) 1.23 2.00 2.32
重复性：同一样品溶液进样5次，计算峰面积的RSD，其结果为1.71％。