长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710587131.8 (22)申请日 2017.07.18 (71)申请人 暨南大学 地址 510632 广东省广州市黄埔大道西601 号 (72)发明人 张冬梅 陈河如 叶文才 陈敏锋 李啸波 雷雪萍 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 苏运贞 刘瑜 (51)Int.Cl. A61K 38/05(2006.01) A61P 35/04(2006.01) (54)发明名称 长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物 中的应用 (57)摘要。

2、 本发明公开了一种长春碱类衍生物在制备 抑制肿瘤转移药物中的应用。 所述的长春碱类衍 生物包括长春碱类二肽及其生理上可接受的盐； 所述的长春碱类二肽为肼解长春碱类化合物与 N-苄氧羰基二肽缩合所得的化合物； 所述的肼解 长春碱类化合物为长春碱类化合物与水合肼反 应所得到的化合物； 所述的长春碱类化合物为长 春碱、 长春瑞滨、 长春氟宁或长春新碱。 该长春碱 类二肽及其生理上可接受的盐， 在体外可显著抑 制肿瘤细胞的侵袭、 迁移和水平运动能力， 在体 内显著抑制肿瘤的远端转移， 可应用于中晚期恶 性肿瘤病人伴随远端转移病人的治疗。 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 CN 107349415 。

3、A 2017.11.17 CN 107349415 A 1.一种长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用， 其特征在于： 所述的长春 碱类衍生物包括长春碱类二肽及其生理上可接受的盐。 2.根据权利要求1所述的长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用， 其特征 在于： 所述的长春碱类二肽为肼解长春碱类化合物与N-苄氧羰基二肽缩合得到的化合物。 3.根据权利要求2所述的长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用， 其特征 在于： 所述的肼解长春碱类化合物为长春碱类化合物与水合肼反应得到的化合物。 4.根据权利要求2或3所述的长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用， 其特 征在于： 。

4、所述的肼解长春碱类化合物为肼解长春碱、 肼解长春瑞滨、 肼解长春氟宁或肼解长 春新碱。 5.根据权利要求3所述的长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用， 其特征 在于： 所述的长春碱类化合物为长春碱、 长春瑞滨、 长春氟宁或长春新碱。 6.根据权利要求2所述的长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用， 其特征 在于： 所述的N-苄氧羰基二肽为N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸， 其结构式如式I所示： 7.根据权利要求1所述的长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用， 其特征 在于： 所述的长春碱类二肽为长春碱加二肽、 长春瑞滨加二肽、 长春氟宁加二肽和长春新碱 加二肽中的一种或以上， 其结。

5、构式如式IIV所示： 8.根据权利要求1所述的长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用， 其特征 在于： 所述肿瘤为乳腺癌、 肺癌、 肝癌、 胃癌、 宫颈癌、 卵巢癌、 食管癌、 大肠癌、 肝癌、 鼻咽癌、 脑癌或骨癌。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107349415 A 2 长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于医药领域， 特别涉及一种长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移药物中 的应用。 背景技术 0002 肿瘤转移是恶性肿瘤的重要特征， 也是引起大多数恶性肿瘤患者死亡的首要原 因。 因此， 抑制肿瘤转移对挽救恶性肿瘤患者的生命具有至关重要。

6、的临床意义， 已成为抗肿 瘤药物研发的策略之一。 0003 肿瘤细胞从原发病灶向远端组织的转移包括以下几种方式： (1)直接蔓延到邻近 部位， 侵蚀原发器官； (2)癌细胞随淋巴结引流， 由近及远转移至各级淋巴结， 发生远端转 移； (3)癌细胞直接进入血管， 随血流转移至远端组织， 如肺、 骨和脑等组织， 形成继发性肿 瘤病灶。 一方面， 肿瘤细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在 肿瘤转移中扮演着重要的角色， 可增强肿瘤细胞的运动、 迁移和侵袭能力， 从而促进肿瘤的 转移(Prieto-Garcia.E,et al.Med Onc。

7、ol.2017,34(7):122.)。 另一方面， 肿瘤血管也为肿 瘤细胞的转移提供必要的运输通道。 因此， 靶向肿瘤细胞抑制癌细胞EMT和靶向肿瘤血管是 两个重要的抑制肿瘤转移的治疗策略。 0004 目前， 靶向肿瘤细胞EMT的抑制剂主要集中在TGF- 通路， 如竞争性结合TGF- RI激 酶ATP位点的抑制剂SD-093和LY-580276(Subramanian.G,et al.Cancer Res.2004,64 (15):5200-11.)； TGF- /ALK5特异性抑制剂EW-7203(Park CY,et al.Cancer Sci.2011, 102(10):1889-96。

8、.)， EW-719(Park CY,et al.Eur J Cancer.2011,47(17):2642-53.)和 EW-7197(Jin CH,et al.J Med Chem.2014,57(10):4213-38.)等。 然而， 这些抑制剂仅停留 在临床试验阶段， 临床上尚缺乏有效的EMT抑制剂类药物上市。 0005 靶向肿瘤血管的治疗药物主要包括两大类(McKeage MJ,et al.Cancer 2010,116 (8):1859-71.)。 一类是血管新生抑制剂(angiogenic inhibitors,AIs)， 主要为VEGF单克 隆抗体贝伐单抗(bevacizuma。

9、b)和VEGFR2酪氨酸激酶抑制剂Apatinib， Vandetanib等。 AIs 主要抑制肿瘤血管的新生过程， 虽然可促进肿瘤血管正常化， 减少肿瘤转移， 但它们对肿瘤 已形成的血管无显著影响， 因而仅能减缓肿瘤的进展， 不能有效杀伤已形成的肿瘤， 且对中 晚期肿瘤的疗效较差。 因此， AIs的临床应用范围受到明显的限制， 患者的受益程度较小。 另 一类是肿瘤血管破坏剂(vascular disrupting agents,VDAs)， 可选择性损伤肿瘤中心区 域已形成的血管， 诱导肿瘤中心大面积坏死， 从而发挥良好的抗肿瘤效果。 然而， 肿瘤边缘 区域的血管成熟度较高(周细胞覆盖率相对。

10、较高)， 该部分血管对VDAs不敏感， 因此， VDAs治 疗后在肿瘤边缘区域残留明显的生存圈(Tozer GM,et al.Nat Rev Cancer.2005,5(6): 423-35.； Tozer GM,et al.Cancer Res.2008,68(7):2301-11.； Nguyen L,et al.BMC cancer 2012,12:522.)。 残留的肿瘤生存圈， 一方面由于缺氧等因素导致肿瘤细胞EMT增强 (Fifis T,et al.Cancer Med.2013,2(5):595-610.)， 增加了治疗后肿瘤发生转移的风险； 另一方面， 生存圈也是VDAs治疗停。

11、药后迅速复发的重要原因。 综上所述， 寻找可同时抑制肿 说 明 书 1/7 页 3 CN 107349415 A 3 瘤细胞EMT和破坏肿瘤血管， 克服肿瘤生存圈的药物具有十分重要的治疗意义。 0006 从夹竹桃科植物长春花中分离得到的长春碱类化合物如长春碱、 长春新碱及其衍 生物长春瑞滨和长春氟宁等， 它们都属于双吲哚生物碱。 药理作用研究表明， 长春碱及其衍 生物属于细胞毒性药物， 主要抑制微管蛋白的聚合， 妨碍纺锤体微管的形成， 使细胞核分裂 被阻滞于中期。 长春碱及其衍生物具有广谱的抗肿瘤活性， 临床上主要用于治疗何杰金氏 病、 绒毛膜上皮癌， 对急性白血病、 乳腺癌、 卵巢癌、 睾丸。

12、癌、 头颈部癌、 口咽部癌、 单核细胞 白血病均有一定疗效(Wilson L,et al.Ann N Y Acad Sci.1975,253:213-31.)。 近年来， Angelo Vacca等人研究发现， 非毒剂量下长春碱可在细胞水平显著抑制血管的新生(Vacca A,et al.Blood 1999,94(12):4143-55.)； Giannoula Klement等人研究表明， 持续给予低 剂量的长春碱可抑制肿瘤血管的新生(Klement G,et al.J Clin Invest.2000,105(8): R15-24.)； James Moore等人证实长春新碱能够抑制肿瘤新。

13、生血管的生长(Moore J,et al.J Pediatr Surg.2001,36(8):1273-6.)； 另一方面， Anna Kruczynskia等人研究发现， 长春氟宁可抑制肿瘤血管生成， 同时破坏已生成的肿瘤血管， 对实验性恶性肿瘤转移也有 显著的抑制作用(Kruczynski A,et al.Eur J Cancer.2006,42(16):2821-32.)。 与许多临 床使用的化疗药物一样， 长春碱类药物在疾病治疗过程中也出现许多严重的副作用， 例如 骨髓抑制、 肌痛、 恶性呕吐等不良反应(Bonneterre J,et al.Ann Oncol.2001,12(12):。

14、 1683-91.18.； Spiller M,et al.Pediatr Blood Cancer.2005,45(3):344-6.)， 极大限制 了其在临床上的应用。 降低该类药物毒副作用的有效途径之一是对药物进行结构修饰， 使 之成为前体药物， 利用病灶组织与正常组织之间分子生物学上的差异， 选择性作用于病灶 靶细胞的基因、 酶、 信号传导因子等， 从而达到靶向治疗的目的。 近年来大量研究表明， 成纤 维细胞激活蛋白酶(Fibroblast-activation protein alpha,FAP )特异性表达于伤愈组 织和90以上的肿瘤组织激活的成纤维细胞与周细胞表面(Ramirez。

15、-Montagut T,et al.Oncogene 2004,23(32):5435-46.)。 0007 研究表明， 长春碱类化合物经肼解及加二肽衍生化形成FAP 酶激活式前药后， 在 体内外均有良好的抗肿瘤、 血管新生抑制和血管破坏活性， 如申请中国发明专利(CN 201310138241.8； CN201310738860.0)和PCT专利(PCT/CN2014/000192)。 但是长春碱类衍生 物在抑制肿瘤转移方面的应用和研究尚未见报道。 发明内容 0008 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足， 提供一种长春碱类衍生物在 制备抑制肿瘤转移药物中的应用。 0009 本发明的。

16、目的通过下述技术方案实现： 一种长春碱类衍生物在制备抑制肿瘤转移 药物中的应用， 所述的长春碱类衍生物包括长春碱类二肽及其生理上可接受的盐。 0010 所述的长春碱类二肽为肼解长春碱类化合物与N-苄氧羰基二肽缩合得到的化合 物(即长春碱类二肽为长春碱类化合物与水合肼反应形成的肼解长春碱类化合物， 再与N- 苄氧羰基二肽缩合所得的化合物)； 优选为长春碱加二肽(BX-CCJ)、 长春瑞滨加二肽(BX- CCRB)、 长春氟宁加二肽(BX-CCFN)和长春新碱加二肽(BX-CCXJ)中的一种或以上， 其结构式 如式IIV所示： 说 明 书 2/7 页 4 CN 107349415 A 4 0011。

17、 0012 0013 其中， Z-GP表示苄氧羰基甘氨酰脯氨酰基。 0014 所述的长春碱类衍生物的合成路线如下： 0015 0016 所述的肼解长春碱类化合物为长春碱类化合物与水合肼反应得到的化合物； 优选 为肼解长春碱(JJ-CCJ)、 肼解长春瑞滨(JJ-CCRB)、 肼解长春氟宁(JJ-CCFN)或肼解长春新 碱(JJ-CCXJ)。 0017 所述的长春碱类化合物优选为长春碱(CCJ)、 长春瑞滨(CCRB)、 长春氟宁(CCFN)或 长春新碱(CCXJ)。 0018 所述的N-苄氧羰基二肽优选为N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸(Z-GP-OH)； 所述的N-苄 氧羰基甘氨酰脯氨酸的结构式如式。

18、I所示： 0019 0020 所述肿瘤包括但不限于乳腺癌、 肺癌、 肝癌、 胃癌、 宫颈癌、 卵巢癌、 食管癌、 大肠 癌、 肝癌、 鼻咽癌、 脑癌、 骨癌等恶性肿瘤； 优选为乳腺癌。 说 明 书 3/7 页 5 CN 107349415 A 5 0021 所述的肿瘤转移包括肿瘤转移的各个阶段， 包括肿瘤转移早期、 中期和晚期。 0022 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： 本发明肼解长春碱类化合物、 长 春碱类二肽及其生理上可接受的盐， 在体外可显著抑制肿瘤细胞的侵袭、 迁移和水平运动 能力， 在体内显著抑制肿瘤的远端转移， 其药效优于长春碱类化合物， 可应用于中晚期恶性 肿瘤病人伴。

19、随远端转移病人的治疗。 附图说明 0023 图1是长春碱类衍生物对TGF- 1诱导的人乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力的抑制 作用对比图(*P0.001vs空白对照组， #P0.001vs TGF- 1组，#P0.01vs TGF- 1组)。 0024 图2是长春碱类衍生物对TGF- 1诱导的人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的抑制 作用对比图(*P0.001vs空白对照组, #P0.001vs TGF- 1组，#P0.01vs TGF- 1组)。 0025 图3是长春碱类衍生物对TGF- 1诱导的人乳腺癌细胞MDA-MB-231水平运动能力的 抑制作用对比图(*P0.001vs空。

20、白对照组， #P0.001vs TGF- 1组，#P0.01vs TGF- 1 组)。 0026 图4是长春碱类衍生物对TGF- 1诱导的人乳腺癌细胞MDA-MB-231上皮间质转化相 关蛋白表达的影响结果图(*P0.001vs空白对照组,#P0.001vs TGF- 1组， #P0.01vs TGF- 1组)； 其中， 图A为上皮细胞钙粘蛋白、 图B为N-钙粘蛋白， 图C为波形蛋白。 0027 图5是长春碱类衍生物对MDA-MB-231乳腺癌裸鼠原位移植瘤肺转移的抑制作用对 比图(n8,meanSEM,#P0.001vs空白对照组； #P0.01vs空白对照组)； 其中， 图A为H&E 染色。

21、检测裸鼠肺组织转移灶数目， 图B为H&E染色检测裸鼠肺组织转移灶面积， 图C为利用免 疫组化的方法对给药前后小鼠肺组织上皮标志物(上皮细胞钙粘蛋白)和间质标志物(N-钙 粘蛋白、 纤粘蛋白)的检测结果， 图D为采用免疫印迹的方法检测长春碱类衍生物作用前后 小鼠肿瘤组织中上皮标志物(上皮细胞钙粘蛋白)和间质标志物(N-钙粘蛋白、 波形蛋白)的 变化。 0028 图6是长春碱类衍生物对裸鼠乳腺癌MDA-MB-231肺转移的抑制作用对比图(n8, meanSEM,#P0.001vs空白对照组； #P0.01vs空白对照组)； 其中， 图A为H&E染色检测裸 鼠肺组织转移灶数目； 图B为H&E染色检测。

22、裸鼠肺组织转移灶面积； 图C为利用免疫组化的方 法对给药前后小鼠肺组织上皮标志物(上皮细胞钙粘蛋白)和间质标志物(N-钙粘蛋白、 纤 粘蛋白)的检测结果， 图D为采用免疫印迹的方法检测长春碱类衍生物对小鼠肺组织中上皮 标志物(上皮细胞钙粘蛋白)和间质标志物(N-钙粘蛋白、 波形蛋白)的作用。 具体实施方式 0029 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限于此。 0030 本发明实施例中涉及的长春碱类化合物依次为长春碱(CCJ)、 长春瑞滨(CCRB)、 长 春氟宁(CCFN)和长春新碱(CCXJ)， 它们经肼解后所得的肼解长春碱类化合物； 肼解长春碱 类化合物为： 。

23、肼解长春碱(JJ-CCJ)、 肼解长春瑞滨(JJ-CCRB)、 肼解长春氟宁(JJ-CCFN)和肼 解长春新碱(JJ-CCXJ)； 0031 本发明实施例中涉及的长春碱类二肽为为长春碱类化合物与水合肼反应形成的 肼解长春碱类化合物， 再与N-苄氧羰基二肽(N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸(Z-GP-OH)缩合所 说 明 书 4/7 页 6 CN 107349415 A 6 得的化合物； 长春碱类二肽为长春碱二肽(BX-CCJ)、 长春瑞滨二肽(BX-CCRB)、 长春氟宁二 肽(BX-CCFN)及长春新碱二肽(BX-CCXJ)； 0032 所述化合物的结构及命名如下所示： 0033 0034 实施例1。

24、长春碱类衍生物对TGF- 1诱导的人乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力的抑 制作用 0035 实验方法： 将处于对数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞(购买于American type culture collection， ATCC)消化， 离心， 计数， 以2104/mL分别接种于铺有Matrigel 基质胶(BD公司)的Transwell小室， 重悬细胞于无血清培养基中。 每孔100 L， 设置空白对照 组、 TGF- 1组(TGF- 1 2ng/mL)组和加药组， 加药组为BX-CCJ， BX-CCRB， BX-CCFN， BX-CCXJ， CCJ， CCRB， CCFN。

25、， CCXJ(6.25nM)与TGF- 1(2ng/mL)共同处理， 下室加入700 L含10新生牛 血清的1640培养液。 培养48小时后， 吸去培养液， 用PBS缓冲液清洗一次， 4多聚甲醛室温 固定30分钟， 用吉姆萨染料着色30分钟， 用棉棒将小室上层膜上的细胞擦去， PBS清洗一次， 显微镜观察并计算细胞数目。 说 明 书 5/7 页 7 CN 107349415 A 7 0036 实验结果： 与空白对照组相比， TGF- 1组显著增加了人乳腺癌细胞MDA-MB-231的 侵袭作用； 与因子组对比， 长春碱类衍生物明显抑制了人乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭作 用， 其药效优于长。

26、春碱类化合物(见图1)。 0037 实施例2长春碱类衍生物对TGF- 1诱导的人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的抑 制作用 0038 实验方法： 取对数生长期的MDA-MB-231细胞， PBS清洗离心， 重悬细胞于无血清培 养基中。 将2104个/mL的细胞接种于Transwell小室， 每孔100 L， 设置空白对照组、 TGF- 1 (TGF- 1 2ng/mL)组和加药组， 加药组为BX-CCJ， BX-CCRB， BX-CCFN， BX-CCXJ， CCJ， CCRB， CCFN， CCXJ(6.25nM)与TGF- 1(2ng/mL)共同处理， 下室加入700 L含10新生。

27、牛血清的1640 培养液。 置37、 含5CO2的细胞培养箱中， 培养48h后， 弃去培养液， 用PBS清洗一次， 4多 聚甲醛室温固定30分钟， 用吉姆萨染料着色30分钟， 用棉棒将小室上层膜上的细胞擦去， PBS清洗一次， 显微镜观察并计算细胞数目。 0039 实验结果： 与空白对照组相比， TGF- 1组显著增加了人乳腺癌细胞MDA-MB-231的 迁移作用； 与因子组对比， 长春碱类衍生物明显抑制了人乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移作 用， 其药效优于长春碱类化合物(见图2)。 0040 实施例3长春碱类衍生物对TGF- 1诱导的人乳腺癌细胞MDA-MB-231水平运动能力 的抑制。

28、作用 0041 实验方法： 取对数生长期的MDA-MB-231细胞， PBS清洗， 消化。 将5105个/mL的细 胞接种于六孔板， 待细胞密度达90时， 用无血清培养基饥饿8h， 10 L移液器划十字交叉 痕， PBS冲洗， 拍照， 设置空白对照组、 TGF- 1(TGF- 12ng/mL)组和加药组， 加药组为BX-CCJ， BX-CCRB， BX-CCFN， BX-CCXJ， CCJ， CCRB， CCFN， CCXJ(6.25nM)与TGF- 1(2ng/mL)共同处理， 8h 后相同视野拍照。 结果使用Image Plus 5软件统计， 求平均值， 并计算迁移的细胞数目。 0042 。

29、实验结果： 与空白对照组相比， TGF- 1组显著增加了人乳腺癌细胞MDA-MB-231的 水平运动能力； 与TGF- 1组对比， 长春碱类衍生物明显抑制了人乳腺癌细胞MDA-MB-231的 水平运动能力， 其药效优于长春碱类化合物(见图3)。 0043 实施例4长春碱类衍生物对TGF- 1诱导的人乳腺癌细胞MDA-MB-231上皮间质转化 相关蛋白表达的影响 0044 实验方法： 取对数生长期的MDA-MB-231细胞， 设置空白对照组、 TGF- 1(TGF- 1 2ng/mL)组和加药组， 加药组用BX-CCJ， BX-CCRB， BX-CCFN， BX-CCXJ， CCJ， CCRB，。

30、 CCFN， CCXJ (6.25nM)处理48小时后， TGF- 1组和加药组同时加入TGF- 1(2ng/mL)， 作用1小时。 用RIPA 裂解液裂解细胞蛋白； 进行BCA蛋白定量； 取4050 g蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳， 根 据分子量大小的不同对蛋白进行分离； 将胶上的蛋白条带转移到PVDF膜上； 将蛋白条带置 于5的牛血清白蛋白(BSA)中进行封闭； 孵育一抗(购买于Cell Signaling Technology， CST)： 按照体积比1:1000稀释上皮细胞钙粘蛋白， 波形蛋白， N-钙粘蛋白， 4孵育过夜； 孵 育二抗(购买于Cell Signaling Te。

31、chnology， CST)； 用ECL显色液A和B显出蛋白条带， 并用 Quantity One软件进行灰度分析。 0045 实验结果： 与空白对照组相比， TGF- 1组上皮细胞钙粘蛋白表达下降； N-钙粘蛋白 和波形蛋白的表达升高。 与TGF- 1组相比， 给药组上皮细胞钙粘蛋白的表达增高； N-钙粘蛋 白和波形蛋白的表达下降； 表明长春碱类衍生物作用后， 可显著抑制TGF- 1诱导的上皮标 说 明 书 6/7 页 8 CN 107349415 A 8 志物上皮细胞钙粘蛋白表达降低， 同时抑制间质标志物N-钙粘蛋白和波形蛋白表达升高， 长春碱类衍生物抑制上皮间质转化相关蛋白的作用优于长春。

32、碱类化合物(见图4)。 0046 实施例5长春碱类衍生物对MDA-MB-231乳腺癌裸鼠原位移植瘤肺转移的抑制作用 0047 实验方法： 将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞消化， 用预冷PBS稀释的Matrigel 基质胶(体积比1:1稀释)重悬， 调整细胞密度为1107个/mL后， 按0.15mL/只接种于6周龄 雌性BALB/C nu/nu裸鼠(购买于广东省医学实验动物中心)左侧乳腺脂肪垫内。 待瘤块长至 100mm3200mm3大小， 将裸鼠随机分为9组， 每组10只， 分别为生理盐水， BX-CCJ， BX-CCRB， BX-CCFN， BX-CCXJ， CCJ， CCRB， 。

33、CCFN， CCXJ组， 尾静脉注射给药， 给药剂量为2 mol/kg。 隔天给 药1次， 连续给药10次后结束实验， 裸鼠经心脏采血后， 剥取肿瘤组织和肺组织。 裸鼠肺组织 采用苏木精-伊红染色， 分析转移灶的大小和数目。 肺组织用ABC法免疫组化染色。 以上皮细 胞钙粘蛋白作为上皮细胞标志性蛋白， N-钙粘蛋白和纤粘蛋白作为间质细胞标志物， 分析 它们在空白对照组和给药组小鼠肺组织的表达情况。 裸鼠肿瘤组织取一半匀浆、 裂解组织 蛋白， 用western blotting的方法分别检测裸鼠肿瘤组织中上皮细胞钙粘蛋白， N-钙粘蛋 白和波形蛋白的表达情况。 0048 实验结果： 长春碱类衍生。

34、物显著抑制了裸鼠乳腺癌上皮间质转化作用， 进而抑制 了裸鼠MDA-MB-231乳腺癌裸鼠原位移植瘤的肺转移； 其药效优于长春碱类化合物(见图5)。 0049 实施例6长春碱类衍生物对裸鼠MDA-MB-231乳腺癌转移的抑制作用 0050 实验方法： 将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞消化， 重悬于无血清的DMEM空白 培养基内， 调整细胞密度为1107个/mL后， 按0.1mL/只尾静脉注射到6周龄雌性BALB/C nu/nu裸鼠。 两周后， 将裸鼠随机分为9组， 每组10只， 分别为生理盐水， BX-CCJ， BX-CCRB， BX- CCFN， BX-CCXJ， CCJ， CCRB。

35、， CCFN， CCXJ组， 给药剂量为2 mol/kg。 隔天尾静脉给药1次， 连续给 药10次后结束实验， 裸鼠经心脏采血后， 剥取肺组织， 裸鼠肺组织采用苏木精-伊红染色， 分 析转移灶的大小和数目。 用ABC法免疫组化染色。 以上皮细胞钙粘蛋白作为上皮细胞标志性 蛋白， N-钙粘蛋白和纤粘蛋白作为间质细胞标志物， 分析它们在空白对照组和给药组小鼠 肺组织的表达情况。 取一半裸鼠肺组织匀浆、 裂解组织蛋白， 用western blotting的方法检 测裸鼠肺组织中上皮细胞钙粘蛋白， N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达情况(见图6)。 0051 实验结果： 长春碱类衍生物显著抑制了裸鼠乳腺癌上。

36、皮间质转化作用， 进而抑制 了裸鼠乳腺癌MDA-MB-231的肺转移， 其药效优于长春碱类化合物。 0052 上述实验结果揭示了本发明所述长春碱类衍生物在体内外可显著地抑制乳腺癌 的转移， 可应用于乳腺癌转移早期和晚期的治疗。 0053 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 7/7 页 9 CN 107349415 A 9 图1 图2 说 明 书 附 图 1/4 页 10 CN 107349415 A 10 图3 图4 说 明 书 附 图 2/4 页 11 CN 107349415 A 11 图5 说 明 书 附 图 3/4 页 12 CN 107349415 A 12 图6 说 明 书 附 图 4/4 页 13 CN 107349415 A 13 。