技术领域
本发明涉及弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)抑制剂新的医学用途，更具体涉及中 性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂西维来司他在制备预防或/和治疗脑出血药物中的运用。
背景技术
脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)系指非外伤性的脑实质内出血，脑出血后除 了血肿本身的占位性损害外，尚有周围脑组织血液循环障碍、局部脑出血流量的下降、代谢 紊乱、炎症反应等，从而导致周围细胞的损伤和脑水肿，造成神经功能的缺损。
脑卒中是临床常见急症，多见于中老年患者，随着人口老龄化的日趋明显，本病的发病 率也日趋攀升，出血性脑卒中约占脑卒中患者的10％-20％。脑出血具有起病急，变化快，致 伤残率及病死率高的特点，严重影响患者的生存生活质量。另外，颅脑外伤致脑出血是临床 常见的急症，在平时，在工伤、交通事故引起的颅脑外伤十分常见，在战时，各种武器及恶 劣的战场环境均有可能导致颅内出血。在我国，每年脑外伤的发生率为千分之二，颅内血肿 是颅脑损伤中最多见而且最危险的继发病变，其发生率约占闭合性颅脑损伤的10％，但在重 型颅脑损伤中几乎有半数病人并发颅内血肿，常因诊断处理不及时而威胁病人生命。颅脑外 伤致脑出血和出血性脑卒中虽有一定的差异，但二者的治疗有很多相似之处。脑出血 (intracerebral hemorrhage，ICH)病情的恶化往往与ICH后继发的脑水肿、炎症反应、血 肿周围组织能量代谢紊乱及氧自由基的损伤有关。有学者也观察到炎症反应中白细胞释放的 弹性蛋白酶(NE)在ICH后脑损伤的过程中具有明显的作用。现代医学对出血性脑血管疾病 及外伤引起的颅内血肿治疗约10-40％可进行手术治疗，其他大多只能进行内科综合治疗。 其中，对于炎症反应而产生的炎症介质如细胞因子、自由基、弹性蛋白酶，会促使炎症继续， 从而进一步损伤脑组织、细胞和神经，其中弹性蛋白酶的增多，引起弹性蛋白、蛋白多糖和 胶原的降低导致组织、细胞和血管基底膜损伤。因此，如何控制弹性蛋白酶以防脑细胞、组 织进一步受损也是人们积极寻求的方法之一。经我们研究发现，弹性蛋白酶抑制剂在脑缺血 或脑出血时能抑制弹性蛋白酶的产生及其活性，具有保护脑组织、细胞的作用，可避免炎症 继续发展引起大脑损害。
人中性弹性蛋白酶(下文有时简称为弹性蛋白酶)是在感染或者炎性疾病情况下出现的嗜 中性白细胞颗粒大量释放的一种丝氨酸蛋白酶。弹性蛋白酶是一种水解蛋白的酶，所述水解 的蛋白例如为弹性蛋白、胶原蛋白、蛋白多糖、纤连蛋白等，这些蛋白构成例如肺、软骨、 血管壁、皮肤等的活体结缔组织间质。另外，已经阐明弹性蛋白酶也作用于其他蛋白质或细 胞。
在活体内，弹性蛋白酶保持活体动态平衡，同时其活性受控于内源性抑制蛋白质，例如 α1-蛋白酶抑制剂、α2-巨球蛋白、分泌的白细胞蛋白酶抑制剂等。但是，当由于炎症部位弹性 蛋白酶过度释放或者抑制剂水平降低引起弹性蛋白酶和内源性抑制剂之间失去平衡时，不能 控制弹性蛋白酶活性，因而导致组织损伤。
弹性蛋白酶(NE)可能参与的疾病有例如肺气肿、成人呼吸窘迫综合症(ARDS)、特发性间 质性肺炎(IIP)、囊性肺纤维化、慢性间质性肺炎、慢性支气管炎、慢性窦肺感染、弥散性全 细支气管炎、支气管扩张、哮喘、胰腺炎、肾炎、肝衰竭、慢性类风湿性关节炎、关节硬化、 骨关节炎、银屑病、牙周炎、动脉硬化、器官移植排斥反应、早产儿羊膜破裂、大疱皮肤病、 休克、脓毒症、全身性红斑狼疮(SLE)、节段性回肠炎、弥散性血管内凝血(DIC)、局部缺 血再灌注性组织损伤、角膜损伤等。
弹性蛋白酶抑制剂抑制弹性蛋白酶的活性及产生，目前，弹性蛋白酶抑制剂尤其是中性 粒细胞弹性蛋白酶抑制剂已在肺损伤、胰腺炎、肾炎、局部缺血再灌注性组织损伤的研究中 显示出组织保护作用。但弹性蛋白酶抑制剂尤其是中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂用于脑出血 引起的脑组织和脑细胞的损伤的治疗和预防的研究没有文献报道。本发明人经研究发现，中 性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂对脑出血具有保护作用，尤其对弹性蛋白酶引起的组织损伤具有 很好的保护效果。为此，完成本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预防和/或治疗脑出血的新方法，具体提供了弹性蛋白酶抑制 剂尤其是中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的新用途，即中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂在保护 脑出血药物中的运用。更具体是指西维来司他或其可药用盐或其药用衍生物，其药用盐优选 西维来司他钠，这里所说的西维来司他钠是四水合物形式。
所说的保护脑出血是指用于治疗和(或)预防脑出血，减少出血和出血后引发的继发性 脑组织和脑细胞的损伤。
本发明所说的运用是指西维来司他钠以注射剂的形式，优选冻干粉针和注射液。优选冻 干粉针，每单剂含西维来司他钠50-500mg、优选100-300mg。
西维来司他钠的日剂量范围为5-1500mg，优选10-1000mg，更优选10-500mg。
上述所说的注射剂还包括药用辅料，如赋形剂、增溶剂、助溶剂、PH调节剂、抗氧剂等。
赋形剂：乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、水解明胶、甘氨酸、谷氨酸、 右旋糖酐、氯化钠等其中一种或几种的混合物，0.01％～50％(w/v)。
助溶增溶剂：聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆、β-环糊精、HP-β-环糊精，甘油，0.001％～ 30％(w/v)。
pH调节剂：磷酸及磷酸盐(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠、磷酸氢二钾、磷酸钾)、 碳酸及碳酸盐(碳酸氢钠、碳酸钠)、柠檬酸及柠檬酸盐(柠檬酸二钠、柠檬酸钠)、盐酸、 氢氧化钠、氢氧化钾、甘氨酸、甘氨酸钠、去氧胆酸、去氧胆酸钠、氢氧化铵、醋酸及醋酸 钠，0.001％～30％(w/v)。
抗氧剂：亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、硫脲、维生素C，0.001％～ 20％(w/v)。
络合剂：EDTA-CaNa，EDTA-2Na，0.001％～20％(w/v)。
溶剂：水、乙醇、丙二醇、多元醇等一种或几种混合溶剂。
以上所述中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂还包括替法可近(tifacogin)、人α1-蛋白酶抑 制剂(human alpha-1-proteinase inhibitor)、AE-3763、depelestat、厄多司坦 (erdosteine)、elafin、ABT-491、SLAPI、TAPI、FK-706、ICI-200880、ZD-0982、ZD-8321、 BI-L-45XX、BI-RA-260、ONO-6818、DF-1283、GW-311616、ALP-242、eglin、氯德拉苯 (lodelaben)、SSR-69071、FR-134043、FR-901451、AAPbV、CE-0137、AN-090、NX-21909、 Ro-31-3537、米地司坦(midesteine)、L-658758、L-659286、L-680833、L-683845、orazipone、 FCE-28204、PBI-1101、MDL-100948A、MDL-104238、MDL-27324、SR-26831、SR-268794、LEX-001、 LEX-032、TEI-8362、SPAAT或其可药用的衍生物。
在这些中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂中优选西维来司他钠或其可药用的衍生物，通常使 用西维来司他钠的四水合物形式。
西维来司他钠(sivelestat sodium)的分子式为C20H21N2O7Na.4H2O，是由日本公司开发的 一种中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，已在日本上市用于治疗急性肺损伤。
西维来司他钠是一个小分子多形核粒细胞(neutrophilic polymorphonuchear leukocytes，PMN)NE(弹性蛋白酶)抑制剂，能可逆性且竞争性地抑制NE。临床研究证实， 西维来司他钠通过抑制中性粒细胞释放的弹性蛋白酶，改善伴有全身性炎症反应综合症 (SIRS)的急性肺损伤(ALI)患者的呼吸功能。其主要机制可能是：直接抑制NE的合成和 释放，减少活化的中性粒细胞介导的肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤；降低肺血管内皮细 胞的通透性，减少血栓调节素的释放，降低肺动脉压和肺的通透性；抑制人单核细胞的致炎 症因子如IL-β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF-α)的产生等。国外已有报道西维来司他钠能 够改善脑缺血/再灌注引起的脑水肿、脑损伤及炎症反应。
本发明主要按下述方案实现：
本发明主要从神经生化、神经病理学和行为学三个方面，观察和研究西维来司他钠对胶 原酶所诱导的大鼠脑出血模型的保护作用。
本发明选用通过胶原酶诱导产生的大鼠脑内出血模型为研究对象，以目前临床治疗脑出 血常用药尼立苏(尼莫地平)为对比参照，研究了西维来司他钠对脑出血的保护作用。通过 对比观察给药后ICH大鼠行为学变化、病理学、脑含水量改变，证明了西维来司他钠对脑出 血具有保护作用。
本发明选用的鼠脑出血模型是胶原酶诱导模型，此模型是目前国内外最为常用的脑出血 模型之一。该模型中采用的胶原酶(collagenase)是一种金属蛋白酶，可降解间质和基底膜 胶原，将其注入脑内后，能降解血管壁的胶原，从而造成出血。此模型在某些方面的病理如 脑水肿、组织学和行为学等与临床很接近，而且该模注入脑内的液体量较少，几乎没有药液 本身的压迫占位效应。
本发明采用尾壳(状)核内胶原酶注射制作的大鼠模型。尾壳核是鼠脑内最大的核团， 易于定位，而且尾壳核属基底神经节，是人类高血压脑出血最好发部位。在脑内立体定向注 射0.5U胶原酶后模型组动物尾壳核均形成典型血肿，同时出现神经缺损体征，相当好的模拟 了同部位脑出血的临床体征。该模型造模成功率高(本发明用于造模的大鼠脑出血发生率为 100％)，重复性好，是较为理想的研究模型。
结论：
西维来司他钠(150mg/kg)能促进胶原酶引起的ICH大鼠行为学改变的恢复进程；减轻脑 水肿的发生并呈剂量依赖性；减少脑组织NE的活性和NO的含量，同时西维来司他钠能减轻 ICH大鼠出血侧脑细胞的病理损伤。表明西维来司他钠对胶原酶所引起的大鼠ICH具有保护 作用。
试验结果证明，西维来司他钠能有效的降低大鼠脑出血后神经功能评分，能够显著减轻脑 含水量的增加，能够明显减轻病理改变，降低脑组织的NE的活性和NO的含量，对脑出血有 显著的保护作用。对大鼠脑出血的保护作用与尼莫地平相当。
本发明另外的动物试验结果也表明西维来司他钠(150mg/kg)能降低胶原酶所引起的ICH 大鼠出血侧脑BBB通透性的增加程度；可以阻止胶原酶所引起的ICH大鼠出血侧脑内SOD含 量的降低和MDA含量的升高；能降低胶原酶所引起的ICH大鼠出血侧脑内TNF-α表达和MPO 含量的增加。表明西维来司他钠可能通过保护ICH后大鼠BBB、提高组织清除自由基的能力 以及抗多形核粒细胞的聚集、释放炎症介质等机制实现对胶原酶引起的大鼠ICH具有保护作 用。
附图说明
图1
西维来司他钠对大鼠脑出血后4h、8h、12h、24h神经病学评分的影响
*p＜0.05VS模型；△p＜0.05VS西维来司他钠-1；**p＜0.01VS模型；△△p＜0.01VS西 维来司他钠-1
图2
西维来司他钠对大鼠脑出血后4h、8h、12h、24h脑含水量的影响 *p＜0.05VS模型；**p＜0.01VS模型；△p＜0.05VS sham；△△p＜0.001VS sham
具体实施方式
实施例1西维来司他钠对大鼠脑出血保护作用
材料和方法
实验材料：
实验动物：
Wistar大鼠，雌雄各半，体重180-250g，由重庆医科大学实验动物中心提供。术前 12h禁食，自由饮水。
主要试剂和药品：
胶原酶VII型 美国Sigma公司
水合氯醛 苏州正兴化工厂
西维来司他钠 重庆医药工业研究院有限责任公司
尼莫地平(尼立苏) 山东泰安制药厂
主要仪器：
立体定位仪 西北光学仪器厂
微量注射器 上海保西玻璃仪器厂
恒温干燥箱 重庆实验仪器厂
电子分析天平 Sartorius，德国
显微镜H-2 日本欧林巴斯公司(OLYMPUS)
实验方法：
1、实验动物分组：
动物随机分成五个组即：假手术(sham)24h组；ICH+生理盐水组(模型)；ICH+西维来 司他钠(150mg/kg)组，称为高剂量组(h)；ICH+西维来司他钠(75mg/kg)组，称为低剂量组 (1)；ICH+尼莫地平(50μg/100g)组。后四个组又分为4h，8h，12h，24h四个时间点亚组。生 理盐水、西维来司他钠和尼莫地平于ICH造模前30min经大鼠尾静脉给药，每日一次。缓慢 注射，药液总量控制在1ml/200g体重；生理盐水也按1ml/200g体重给予。每组Wistar大 鼠7只。
2、大鼠ICH模型的建立：
本文参照Rosenberg等报道的方法。具体操作步骤如下：实验鼠经水合氯醛(350mg/kg) 腹腔麻醉后，仰卧位固定于立体定位仪上，并按照包新民等报道的定位方法使上门齿钩平面 比耳间线平面低2.4mm，这样大鼠前囟和后囟在同一平面。用碘酒局部消毒，头皮正中切口， 剪开骨膜，暴露前囟，于前囟后1mm，中线向左旁开3mm处用五号针头钻一直径大约为1mm 的小孔，深达硬脑膜。用固定于立体定位仪上的微量注射器沿钻孔进针，进针深度为5.8mm(即 尾状核位置)，缓慢注射胶原酶VII0.5U(用生理盐水配制成1U/μl)。注射时间为3min，注射完 后留针5min再退针，然后缝合皮肤，回笼饲养。假手术组只插针，不注射药物，其余操作一 样。
统计学处理：各组测定值用均数±标准差( x±SD)表示，用SPSS统计软件作单因素方 差分析(one-way ANOVA)，显著性水平p＜0.05。
3、观察指标：
(1)、西维来司他钠对ICH大鼠神经病学评分的影响
动物苏醒后，各组均按照Bederson等的神经缺损分级评分标准(稍加改进)立即进行神 经功能缺失评分。标准如下：(见表1)
表1ICH大鼠模型神经病学评分标准 分级 症状 评分 0 I II III IV 无任何症状或仅有同侧眼裂缩小 提尾时对侧肢体屈曲内收 抗侧方推力减弱并伴有I级症状 爬行时向对侧划圈并伴有II级症状 意识丧失不能行走 0 1 2 3 4
3分及以上动物入选本实验，术后动物分笼饲养，正常进食进水。室温控制在20-25℃， 以后于造模后4h、8h、12h、24h进行评分。
结果：假手术组各时间点神经功能缺损评分均为0分；模型组动物麻醉清醒后立即评分 均为3分或4分，一方面说明ICH大鼠造模成功，另一方面说明ICH造成了极为明显的大鼠 神经功能缺损。同时我们观察到随着时间的推移，各组ICH大鼠神经功能评分逐渐下降，而 给药组评分的下降快于模型组。在ICH后12h、24h大剂量西维来司他钠给药组与模型组、小 剂量西维来司他钠组相应时点的神经缺损评分比有显著性差异(p＜0.05)，而与相应时点的尼 莫地平组神经缺损评分比没有显著性。在ICH后12h、24h时点，尼莫地平组与模型组、小剂 量西维来司他钠相应时点的神经缺损评分比有显著性差异(p＜0.05)。虽然小剂量西维来司他 钠组也在一定程度上降低了相应时点的神经缺损评分，但是与模型组相应时点的神经缺损评 分比并没有显著性差异。上述观察提示西维来司他钠150mg/kg静脉给药能够改善ICH后神 经缺损评分，其作用相似于50μg/100g的尼莫地平产生的作用。(见表2，图1)
表2西维来司他钠对大鼠脑出血后4h、8h、12h、24h神经病学评分的影响
( x±SD，n＝7) 试验组 神经病学评分 4h 8h 12h 24h Sham 模型 西维来司他钠-h 西维来司他钠-1 尼莫地平 3.14±0.69 2.71±0.49 3.00±0.58 3.00±0.00 86±0.69 2.57±0.79 2.86±0.68 2.71±0.76 2.71±0.95 1.57±0.53*△ 2.43±0.79 1.71±0.76* 0.00 2.29±0.76 1.14±0.38**△△ 2.14±1.07 1.29±0.49**△
注：*p＜0.05VS模型；△p＜0.05VS西维来司他钠-1
**p＜0.01VS模型；△△p＜0.01VS西维来司他钠-1
(2)、脑含水量(BWC)测定：
观察西维来司他钠对大鼠脑出血后4h、8h、12h、24h脑含水量的影响，各组动物在预定 的时间点，经水合氯醛麻醉后，迅速断头取脑，将取出的脑组织放在已经用生理盐水湿润过 的滤纸上，以防止水分蒸发。去除软脑膜和血迹，以进针孔为中心，切取前半部分脑组织， 精密称重(精确到0.1mg)。取脑到称完重量时间控制在5min内。然后置于95℃恒温烘箱24h， 再称取干重。按Blliot公式计算脑含水量：
BWC＝(湿重-干重)/湿重×100％。
结果：分析表3可以发现，大鼠脑出血后其脑含水量在4h、8h、12h、24h时点与假手 术组比明显上升，并具有显著性差异(p＜0.05)，而且脑含水量随着时间的进程不断增加，并 在脑出血后24小时达到一个高峰。治疗组ICH大鼠脑含水量与模型组比，各个时点均不同程 度降低。其中，大剂量西维来司他钠给药组与模型组、小剂量西维来司他钠组在四个相应时 点比较其脑含水量降低程度差异有显著性(p＜0.05)，与尼莫地平组比在四个相应时点其脑含 水量降低程度虽然要大一些但还不具有显著性(p＞0.05)。尼莫地平组在四个相应时点其脑含 水量降低程度与模型组比也有显著性差异(p＜0.05)。小剂量西维来司他钠组虽然也能不同程 度降低ICH大鼠脑含水量，但与模型组比并无显著性差异(p＞0.05)。这些结果表明，西维来 司他钠150mg/kg给药能够降低ICH后大鼠脑水肿的严重程度，其治疗效果与50μg/100g的 尼莫地平的作用相似。(见表3，图2)
表3西维来司他钠对大鼠脑出血后4h、8h、12h、24h脑含水量的影响
(±SD，n＝6) 试验组 脑含水量 4h 8h 12h 24h Sham 模型 西维来司他钠-h 西维来司他钠-l 尼莫地平 78.60± 0.52△△ 77.74± 0.68* 78.33± 0.83△ 77.76± 0.74* 80.00± 0.53△△ 78.16± 0.52△** 79.85± 0.69△△ 78.38± 0.31△** 81.76± 0.61△△ 79.23± 0.19△△** 81.08± 0.74△△ 79.76± 0.70△△** 77.51±0.45 82.95± 0.84△△ 80.77± 0.72△△** 82.91± 0.63△△ 81.27± 0.67△△**
*p＜0.05VS模型；**p＜0.01VS模型；
△p＜0.05VS sham；△△p＜0.001VS sham；
(3)、组织病理学观察：
观察西维来司他钠对大鼠脑出血病理形态的影响。随机选取各组动物，于预定的时间点 以水合氯醛深度麻醉，迅速断头取脑，切取含血肿的脑组织片(约5mm)，立即放入10％甲醛 液中，固定24h后经乙醇梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片(5μm)，HE染色，封片。 光镜观察病变区及附近脑组织病理改变。
结果：脑出血后大鼠脑组织出现明显的病理改变，第4、8、12小时的切片可见到明显的出 血灶，病灶周围组织疏松水肿，伴有少许炎症细胞浸润；第24小时的切片可见到病灶周围组 织仍然疏松水肿，炎症细胞浸润更为严重。
预先给予大剂量西维来司他钠治疗ICH大鼠能够明显减轻脑出血后组织水肿和炎症细胞 浸润；而预先给予小剂量西维来司他钠或尼立苏也能不同程度减轻上述病变。
(4)、对脑组织中NE的影响
各组大鼠经水合氯醛麻醉后，快速断头取脑，切取针孔周围脑组织，精密称重后，用生理盐 水作为匀浆介质，在冰浴环境中以玻璃匀浆器制成10％的组织匀浆。取上清液以双抗夹心 ELISA法测定NE活性。
结果：与假手术组相比，大鼠脑出血后脑组织NE活性明显增加(P＜0.01)；西维来司他 钠高、低剂量均能显著降低大鼠脑出血后脑组织的NE活性(p＜0.01)(见表4)。
表4西维来司他钠对ICH大鼠脑组织NE含量的影响 试验组 n(样本数) NE(ng/ml) sham 模型(24小时) 西维来司他钠-h 西维来司他钠-1 6 6 6 6 0.12±0.03△ 2.36±0.07 1.825±0.05△ 2.14±0.04△
注：△Pp＜0.01VS模型
(5)、对大脑组织中NO的影响
各组大鼠经水合氯醛麻醉后，快速断头取脑，切取针孔周围脑组织，精密称重后，用生理盐 水作为匀浆介质，在冰浴环境中以玻璃匀浆器制成10％的组织匀浆，取上清液以硝酸还原酶法 测定NO含量。
结果：与假手术组相比，大鼠脑出血后脑组织NO含量明显增加(p＜0.01)，西维来司他 钠高、低剂量均能降低大鼠脑出血后脑组织NO的含量(p＜0.01)(见表5)。
表5西维来司他钠对ICH大鼠脑组织NO含量的影响 试验组 n(样本数) NO(μmol/g pro) sham 模型 西维来司他钠-h 西维来司他钠-l 6 6 6 6 2.06±0.09△ 3.15±0.05 2.12±0.04△ 3.08±0.07△
注：△P p＜0.01VS模型
实施例2西维来司他钠冻干粉针
西维来司他钠 100g
甘露醇 300g
聚乙烯吡咯烷酮 100g
碳酸钠 适量
注射用水稀释至 51
制成1000瓶
制备工艺：
将碳酸钠配制成4％的溶液备用；西维来司他钠、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮混合后加入一 定量注射用水，充分搅拌至溶解后，用碳酸钠溶液调pH至6.5～8.5，然后用注射用水定容， 经初滤、除菌过滤后分装成5ml/瓶，冷冻干燥即得。
实施例3西维来司他钠注射液
西维来司他钠 100g
HP-β-环糊精 100g
EDTA-CaNa 1g
焦亚硫酸钠 1g
磷酸钠 适量
注射用水稀释至 5L
制成1000瓶
制备工艺
将磷酸钠配制成4％的溶液备用；将西维来司他钠、HP-β-环糊精、EDTA-CaNa、焦亚硫 酸钠混合后，加入一定量注射用水，充分搅拌使其溶解，然后用磷酸钠溶液调pH至6.5～8.5， 注射用水定容，经初滤、除菌过滤后分装即得。
使用方法：
对于脑出血患者，冻干粉针用生理盐水稀释，按0.2-0.5mg/kg/小时输注，可24小时 给药。
参考文献：
1、Rosenberg GA.Mun-bryce S.Wesley M，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats.Stroke，21(5)：801-807，1990
2、包新民，舒斯云。大鼠脑立体定位图谱。北京：人民卫生出版社，1991
3、Bederson，JB，Pitts LH，Nishimura MC，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evalution of the model and development of a neurologic examination.Stroke，1986；17(13)：472-476