本发明涉及药物组合物和用途，特别是涉及包括二膦酸 (bisphosphonates)的药物组合物并涉及二膦酸的新型治疗用途。
二膦酸广泛用于抑制骨吸收得到增加的各种良性和恶性疾病中破 骨细胞的活性。因此，近来已经将二膦酸用于长期治疗患有多发性骨 髓瘤(MM)的患者。这些焦磷酸盐类似物不仅可以减少与骨骼相关的 疾病的发生、而且它们还可以对患者产生临床有益效果并改善存活率。 二膦酸能够预防体内的骨吸收；二膦酸的治疗功效已经在治疗骨的佩 吉特病、肿瘤诱发的血钙过多且更进一步说是骨转移瘤和多发性骨髓 瘤(MM)的过程中得到了证实(综述参见FleischH1997的二膦酸临床 研究(Bisphosphonates clinical.)-《骨疾病中的二膦酸》 (Bisphosphonates in Bone Disease)：从实验室到患者(From the Laboratory to the Patient)，编辑：The Parthenon Publishing Group，New York/London，68-163页)。二膦酸抑制骨吸收的机理仍然 难以理解且看起来可根据所研究的二膦酸的不同而改变。已经证实二 膦酸与骨的羟磷灰石晶体强力结合，从而减少了骨的更新和吸收、降 低了血液中羟脯氨酸或碱性磷酸酶的水平并且还抑制了破骨细胞的活 化和活性。
MM是一种浆细胞癌，其特征在于恶性浆细胞在骨髓内增殖和累积。 主要临床结果是与病理性骨折和骨痛相关的裂解性骨损害。这些损害 是由骨吸收过度所造成的，通常导致血钙过多。已经引入了二膦酸并 结合常规的化疗来对MM进行长期治疗。近来已经证实诸如氯膦酸盐和 氨羟二磷酸二钠这样的二膦酸可以减少诸如裂解性骨损害和病理性骨 折这样的与骨骼相关的情况的发生并可以缓解骨痛和改善患者的生命 质量。
目前已经令人意外地发现某些二膦酸对新近形成的毛细血管具有 栓塞作用，所述的毛细血管是在与肿瘤生长和侵害以及诸如炎症、类 风湿关节炎和骨关节炎这样的病理性情况相关的血管发生过程中形成 的。此外，已经发现某些二膦酸抑制了哺乳动物模型和组织培养实验 中生长因子诱发的血管发生和内皮细胞增殖。
因此，本发明提供了一种用于根据治疗需要治疗患者体内血管发 生的方法，该方法包括对患者给予有效量的二膦酸的步骤。
本发明进一步提供了二膦酸在制备用于治疗血管发生的药物中的 用途。
本发明进一步提供了二膦酸在治疗与哺乳动物体内疾病或病理情 况相关的血管发生中的用途。
形成新血管的血管发生是在诸如修复、排卵和胚胎发生这样的许 多生理过程中的主要情况。新血管形成也是诸如炎症、心肌缺血、类 风湿关节炎、骨关节炎和例如肿瘤生长、侵害或转移这样的肿瘤形成 这类许多病理情况的一个主要组成部分。许多固体肿瘤诱发从宿主血 管床上形成新的毛细血管以便提供营养和氧。因此，本发明一般用于 治疗疾病和医学情况，它们涉及包括如上所述在内的疾病或情况的建 立和发展过程中的血管发生。涉及血管发生疾病和情况的其它和更为 特殊的实例包括：视网膜病，例如糖尿病性视网膜病；银屑病；成血 管细胞瘤(haemangioblastoma)；血管瘤(haemangioma)；疼痛； 与年龄相关的黄斑变性；且特别是肿瘤疾病(固体肿瘤)，尤其是诸 如乳腺癌、结肠癌、肺癌(特别是小细胞肺癌)或前列腺癌。
本发明的用途和方法代表了对现存恶性疾病疗法的改进，其中将 二膦酸用于预防或抑制骨转移瘤或骨吸收过度的发展并且还用于诸如 类风湿关节炎和骨关节炎这样的炎症疾病疗法。已经发现二膦酸用于 栓塞新近形成的血管的用途可使适当的治疗期后例如固体肿瘤这样的 肿瘤和例如骨转移瘤这样的转移瘤得到抑制且甚至使例如固体肿瘤这 样的肿瘤和例如骨转移瘤这样的转移瘤的大小减小。已经使用血管造 影术观察到在二膦酸治疗后新近形成的血管消失而正常血管保持完 整。此外，已经观察到栓塞的血管在停止用二膦酸治疗后没有恢复。 还观察到在用二膦酸治疗后骨转移瘤、类风湿关节炎和骨关节炎患者 感到疼痛减轻。
尽管尚不了解二膦酸作为导致新近形成的血管栓塞的活性剂的作 用方式，但是看起来新近形成的血管(毛细血管)被阻断、部分或完 全被消除或另外血管发生被逆转，从而在例如使用血管造影术观察例 如炎症部位这样的肿瘤或疾病部位时使新近形成的血管(毛细血管) 部分或完全消失。就本说明书的目的而言，术语“血管发生的栓塞性 治疗”或“栓塞作用”指的是这些观察到的现象。
因此，在本发明的另一个方面中，提供了：
-一种用于根据治疗需要对患者体内的血管发生进行栓塞性治疗 的方法，该方法包括对患者给予有效量的二膦酸的步骤；
-二膦酸在制备用于对血管发生进行栓塞性治疗的药物中的用 途；和
-二膦酸作为血管发生抑制剂的用途。
此外，正如下文的实施例中所述，已经发现某些二膦酸可抑制哺 乳动物模型中生长因子诱发的血管发生并且还可抑制组织培养模型中 内皮细胞的增殖。看起来这种对血管发生的抑制作用并不依赖于激活 的巨噬细胞的缺失，而相反，二膦酸看起来在内皮细胞活化和/或内皮 细胞增殖的水平上起作用。因此，还可以将二膦酸有利地用于通过抑 制血管发生出现或发展来预防或预防性治疗涉及血管发生的疾病和医 学情况，包括如上述确定的疾病和医学情况。
因此，在本发明的另一个方面中，提供了：
-一种用于根据治疗需要预防或预防性治疗患者体内血管发生的 方法，该方法包括对患者给予有效量的二膦酸的步骤；
-二膦酸在制备用于预防或预防性治疗血管发生的药物中的用 途；和
-二膦酸作为血管发生预防剂的用途。
特别地，本发明提供了一种如上述直接定义的并不依赖于或涉及 活化的巨噬细胞缺失的方法和用途。
因此，在本说明书中术语“疗法”或“治疗”指的是防或预防性 治疗以及治愈或改善疾病的疗法，包括对处于感染疾病或怀疑已经感 染疾病的危害中的患者以及患病或已经诊断为患有疾病或医学情况的 患者进行治疗。
本发明中使用的二膦酸一般是那些可以产生如上所述的栓塞或血 管发生抑制作用的二膦酸。
因此，用于本发明的合适的二膦酸例如可以包括下列化合物或其 药物上可接受的盐或其任意的水合物：3-氨基-1-羟基丙烷-1，1-二膦 酸(帕米膦酸(pamidronic acid))，例如氨羟二磷酸二钠(APD)； 3-(N，N-二甲氨基)-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸，例如二甲基-APD；4-氨 基-1-羟基丁烷-1，1-二膦酸(阿仑膦酸(alendronic acid))，例 如阿仑特罗；1-羟基-亚乙基-二膦酸，例如羟乙二膦酸；1-羟基-3-(甲 基戊基氨基)-亚丙基-二膦酸，ibandronicacid，例如ibandronate； 6-氨基-1-羟基己烷-二膦酸，例如氨基-己基-BP；3-(N-甲基-N-正戊 基氨基)-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸，例如甲基-戊基-APD (＝BM21.0955)；1-羟基-2-(咪唑-1-基)乙烷-1，1-二膦酸，如 zoledronic acid；1-羟基-2-(3-吡啶基)乙烷-1，1-二膦酸(利塞膦 酸(risedronic acid))，例如利塞膦酸盐，包括其N-甲基吡啶鎓 盐，例如诸如NE-10244或NE-10446这样的碘化N-甲基吡啶鎓；1-(4- 氯代苯硫基)甲烷-1，1-二膦酸(替鲁膦酸(tiludronic acid))，例 如替鲁膦酸盐；3-[N-(2-苯硫基乙基)-N-甲氨基]-1-羟基丙烷-1，1-二 膦酸；1-羟基-3-(吡咯烷-1-基)丙烷-1，1-二膦酸，例如EB1053(Leo)； 1-(N-苯基氨基硫代羰基)甲烷-1，1-二膦酸，例如FR78844 (Fujisawa)；5-苯甲酰基-3，4-二氢-2H-吡唑-3，3-二膦酸四乙酯， 例如U-81581(Upjohn)；1-羟基-2-(咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)乙烷 -1，1-二膦酸，例如YM529；和1，1-二氯甲烷-1，1-二膦酸(氯膦酸 (clodronic acid))，例如氯膦酸盐。
药物上可接受的盐优选与碱形成的盐，通常是来源于元素周期表 中Ia、Ib、IIa和IIb族的金属盐，包括例如钾且特别是钠盐这样的 碱金属盐或碱土金属盐、优选钙盐和镁盐且还有与氨形成的铵盐或有 机胺类。
特别优选的药物上可接受的盐是那些二磷酸酸性氢中的一个、两 个、三个或四个、特别是一个或两个被药物上可接受的阳离子取代的 盐，所述的药物上可接受的阳离子特别是钠、钾或铵，首选钠。
极为优选的一组药物上可接受的盐的特征在于每个膦酸基上带有 一个酸性氢和一个药物上可接受的阳离子、特别是钠。
众所周知上述所有的二磷酸衍生物来源于文献。所述文献中包括 其制备方法(例如参见EP-A-513760第13-48页)。例如，如美国专 利3,962,432中所述制备了3-氨基-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸且如美国 专利4,639,338和4,711,880所述制备了其二钠盐；且如美国专利 4,939,130中所述制备了1-羟基-2-(咪唑-1-基)乙烷-1，1-二膦酸。
本发明的一个特殊的实施方案由二磷酸衍生物的应用来代表，所 述的二磷酸衍生物选自3-氨基-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸、3-(N，N-二 甲氨基)-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸、4-氨基-1-羟基丁烷-1，1-二膦酸、 6-氨基-1-羟基己烷-1，1-二膦酸、3-(N-甲基-N-正戊基氨基)-1-羟基 丙烷-1，1-二膦酸、1-羟基-2-(咪唑-1-基)乙烷-1，1-二膦酸、1-羟基 -2-(3-吡啶基)乙烷-1，1-二膦酸及其N-甲基吡啶鎓盐、1-(4-氯代苯 硫基)甲烷-1，1-二膦酸、3-[N-(2-苯硫基乙基)-N-甲氨基]-1-羟基丙 烷-1，1-二膦酸、1-羟基-3-(吡咯烷-1-基)丙烷-1，1-二膦酸、1-(N- 苯基氨基硫代羰基)甲烷-1，1-二膦酸、5-苯甲酰基-3，4-二氢-2H-吡唑 -3，3-二膦酸四乙酯、1-羟基-2-(咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)乙烷-1，1- 二膦酸或其药物上可接受的盐及其任意的水合物。
本发明的一个优选的实施方案由二磷酸衍生物的应用来代表，所 述的二磷酸衍生物选自3-氨基-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸、3-(N，N-二 甲氨基)-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸、4-氨基-1-羟基丁烷-1，1-二膦酸、 6-氨基-1-羟基己烷-1，1-二膦酸、3-(N-甲基-N-正戊基氨基)-1-羟基 丙烷-1，1-二膦酸、1-羟基-2-(咪唑-1-基)乙烷-1，1-二膦酸、1-羟基 -2-(3-吡啶基)乙烷-1，1-二膦酸、3-[N-(2-苯硫基乙基)-N-甲氨基 ]-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸、1-羟基-3-(吡咯烷-1-基)丙烷-1，1-二膦 酸、1-羟基-2-(咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)乙烷-1，1-二膦酸或其药物 上可接受的盐及其任意的水合物。
本发明的一个极为优选的实施方案由膦酸衍生物的应用来代表， 所述的膦酸衍生物选自帕米膦酸、阿仑膦酸、3-(N-甲基-N-正戊基氨 基)-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸、1-羟基-2-(咪唑-1-基)乙烷-1，1-二膦 酸、利塞膦酸和替鲁膦酸或其药物上可接受的盐及其任意的水合物。
本发明的一个特别优选的实施方案由二膦酸衍生物的应用来代 表，所述的二膦酸衍生物选自1-羟基-2-(咪唑-1-基)乙烷-1，1-二膦 酸和3-氨基-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸或其药物上可接受的盐及其任 意的水合物。
此外，本发明涉及3-氨基-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸或其药物上可 接受的盐及其任意的水合物、例如氨羟二磷酸二钠或pamidronate的 用途。
此外，本发明涉及1-羟基-2-(咪唑-1-基)乙烷-1，1-二膦酸或其药 物上可接受的盐及其任意的水合物、例如zoledronic acid的用途。
已经发现在本发明的动物模型中，zoledronic acid(1-羟基 -2-(咪唑-1-基)乙烷-1，1-二磷酸)与其抑制血管内皮细胞生长因子 (VEGF)诱发的血管发生相比优选抑制碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)诱发的血管发生，正如下文实施例中所述。
因此，在本发明特别优选的实施方案中，提供了一种如上所述的 方法或用途：
-其中二膦酸是zoledronic acid或其药物上可接受的盐及其任 意的水合物且其中所述的血管发生包括bFGF诱发的血管发生；或
-其中二膦酸是zoledronic acid或其药物上可接受的盐及其任 意的水合物并将所述的二膦酸与VEGF抑制剂联用。
可以使用异构体或异构体混合物形式的二膦酸(下文称作本发明 的活性剂)，如果合适，一般作为旋光异构体使用它们，诸如对映体 或非对映异构体或几何异构体，一般为顺式-反式异构体。可以获得纯 对映体和/或外消旋物形式的旋光异构体。
还可以使用水合物形式的本发明活性剂或包括用于其结晶的其它 溶剂。
优选使用药物组合物形式的本发明活性剂(二膦酸)，所述的药 物组合物可以含有治疗有效量的活性组分和适合于给药的无机或有机 的固体或液体的药物上可接受的载体或混有它们。
例如，该药物组合物可以是：诸如口服、直肠、气溶胶吸入或鼻 部给药的肠内用组合物；诸如静脉内或皮下给药的非肠道用组合物； 或经皮给药用组合物(例如被动或离子渗透用组合物)。
优选所述的药物组合物适合于口服或非肠道(尤其是静脉内、动 脉内或经皮)给药。将动脉内和口服给药、首要和最重要的动脉内给 药看作是特别重要的。优选二膦酸活性组分是非肠道剂型、最优选动 脉内剂型。
如果合适，特定的给药方式和剂量可以由主管医师根据患者的特 殊情况、尤其是年龄、体重、生活方式、运动程度、激素状态(例如 绝经后)和骨无机密度来选择。然而，最优选将二膦酸经动脉内给药 入产生新近形成的血管的动脉。
因此，在本发明特别优选的实施方案中，提供了：
一种用于根据治疗需要对患者体内血管发生进行栓塞性治疗的方 法，该方法包括对患者给予有效量的二膦酸的步骤；
二膦酸在制备用于对血管发生进行动脉内栓塞治疗的药剂中的用 途；
二膦酸在治疗与哺乳动物体内疾病或病理情况相关的血管发生或 使其逆转的动脉内用途；和
二膦酸作为血管发生逆转剂的动脉内用途。
本发明活性剂的剂量可以取决于各种因素，诸如活性组分作用的 功效和期限、给药方式、温血物种和/或温血动物性别、年龄、体重和 个体的情况。
剂量通常要求对体重约为75kg的温血动物给予 0.002-3.40mg/kg、尤其是0.01-2.40mg/kg的单剂量二膦酸活性组分。 如果需要，还可以分几次给予该剂量，可以按照相等的部分剂量给药。
“mg/kg”指的是所治疗的每kg体重哺乳动物、包括人所用的mg 药物。
可以重复给予作为单剂量(优选)或分几次部分剂量给药的上述 剂量，例如每天一次、每周一次、每月一次、每3个月一次、每6个 月一次或一年一次。换句话说，可以按照从连续每日疗法到间歇周期 疗法范围内的方案给予所述的药物组合物。
优选按照与传统上使用二磷酸衍生物治疗疾病中所用相同等级的 剂量给予二膦酸，所述的疾病诸如佩吉特病、肿瘤诱发的血钙过多或 骨质疏松。换句话说，优选按照可同样有效治疗佩吉特病、肿瘤诱发 的血钙过多或骨质疏松的剂量给予二磷酸衍生物，即按照同样有效抑 制骨吸收的剂量给予它们。
单剂量单位剂型的制剂优选含有约1％-约90％的活性组分，而 非单剂量剂型的制剂优选含有约0.1％-约20％的活性组分。诸如胶 囊剂、片剂或锭剂这样的单剂量单位剂型例如含有约1mg-约500mg 的活性组分。
用于肠内和非肠道给药的药物制剂例如是那些诸如锭剂、片剂或 胶囊剂以及安瓿这样的剂型。按照本身公知的方式制备它们，例如通 过常规的混合、成粒、成型、溶解或冻干步骤制备它们。例如，可以 通过将活性组分与固体载体混合、如果合适使所得混合物成粒且如果 需要或必要在添加合适的佐剂后将该混合物或颗粒加工成片剂或锭剂 芯来获得用于口服给药的药物组合物。
合适的载体尤其是：填充剂，诸如糖类，例如乳糖、蔗糖、甘露 糖醇或山梨醇；纤维素制剂和/或磷酸钙，例如磷酸三钙或磷酸氢钙； 以及粘合剂，诸如例如使用玉米、小麦、稻米或马铃薯淀粉制成的淀 粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素和/或聚乙烯吡咯烷酮；和如果需要， 崩解剂，诸如上述淀粉、以及羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼 脂或藻酸或其盐，诸如藻酸钠。佐剂尤其是流动调节剂和润滑剂，例 如硅酸、滑石、硬脂酸或其盐，诸如硬脂酸镁或硬脂酸钙；和/或聚乙 二醇。将锭剂芯制成可以耐胃液的合适的包衣层，特别是使用可以含 有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛的浓 糖溶液或溶于合适的有机溶剂或溶剂混合物的涂层溶液或诸如邻苯二 甲酸乙酰基纤维素或邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素这样的合适纤维素 制剂，从而产生耐胃液的包衣层。例如，为了确定或表明不同剂量活 性组分的目的，可以将着色剂或色素添加到片剂或锭剂的包衣层中。
其它可口服给药的药物制剂是由明胶制成的干填充胶囊和由明胶 和诸如甘油或山梨醇这样的增塑剂制成的密封软胶囊。干填充胶囊可 以含有颗粒形式的活性组分，所述的颗粒例如混有诸如乳糖这样的填 充剂、诸如淀粉这样的粘合剂和/或诸如滑石或硬脂酸镁这样的助流剂 且如果合适可以混有稳定剂。在软胶囊中，优选将活性组分溶于或悬 浮于诸如脂肪油、石蜡油或液体聚乙二醇这样合适的液体中，还能够 向其中添加稳定剂。
非肠道制剂尤其是以诸如通过静脉内、肌内、腹膜内、鼻内、经皮、 皮下或优选动脉内这样的各种方式有效的可注射液体。这类液体优选 是可以在使用前由冻干制剂制备的等渗水溶液或混悬液，所述的冻干 制剂含有单独的活性组分或与药物上可接受的载体混合的活性组分。 可以将该药物组合物灭菌和/或该药物组合物例如含有防腐剂、稳定 剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。
经皮施用的合适制剂包括有效量的活性组分与载体。有利的载体 包括可吸收的药理上可接受的溶剂以便有助于通过宿主皮肤。经皮装 置以绷带形式为特征，绷带包括表褙层、含有化合物且可以含有载体 的储存层、可以包括在延长时间期限内以受控和预定速率输送宿主皮 肤中的活性组分的速率控制屏障和使所述装置与皮肤固定的部件。
下列实施例解释了上文所述的本发明且相关的实施例5涉及附图：
附图1是用氨羟二磷酸二钠治疗前(a)和治疗后(b)乳腺癌患 者左侧支气管动脉的血管造影片。
附图2是用氨羟二磷酸二钠治疗前(a)和治疗后(b)相同乳腺 癌患者右侧支气管动脉的血管造影片。
附图3是用氨羟二磷酸二钠治疗前(a)和治疗后(b)骨关节炎 患者右膝关节的血管造影片。
在下列实施例中，将术语“活性组分”理解为本发明使用的上述 二磷酸衍生物中的任意一种。
实施例 实施例1：含有包衣颗粒形式的例如氨羟二磷酸二钠五水合物这样的 活性组分作为活性组分的胶囊剂： 芯颗粒：
活性组分(粉碎) 197.3mg
微晶纤维素 52.7mg
(AvicelPH105)
250.0mg +内包衣层：
纤维素HP-M603 10.0mg
聚乙二醇 2.0mg
滑石 8.0mg
270.0mg +耐胃液的外包衣层：
EudragitL30D(固体) 90.0mg
柠檬酸三乙酯 21.0mg
AntifoamAF 2.0mg
水
滑石 7.0mg
390.0mg
将氨羟二磷酸二钠与AvicelPH105的混合物用水润湿并捏合、挤 压且制成球状。然后在流化床中依次用由纤维素HP-M603、聚乙二醇 (PEG)8000和滑石组成的内包衣层和由EudragitL30D、柠檬酸三乙 酯和AntifoamAF组成的耐胃液的水包衣层给干燥的颗粒包衣。用滑 石将包衣的颗粒制成粉末并通过例如Hfliger和Karg的商品胶囊填 充机将其填入胶囊(胶囊大小为0号)。 实施例2：例如含有1-羟基-2-(咪唑-1-基)乙烷-1，1-二膦酸作为活性 组分的整体粘合经皮系统： 组成：
聚异丁烯(PIB)300 5.0g
(OppanolB1，BASF)
PIB35000 3.0g
(OppanolB10，BASF)
PIB1200000 9.0g
(OppanolB100，BASF)
氢化烃树脂 43.0g
(Escorez5320，Exxon)
1-十二烷基氮杂环庚-2酮 20.0g
(Azone，NelsonRes.，Irvine
CA)
活性组分 20.0g
总计 100.0g
制备：
通过在辊式齿轮床上滚动将上述成分彼此溶于150g特殊沸点的石 油级分100-125中。通过使用300mm医用刀片的涂铺器将该溶液施用 在聚酯薄膜(Hostaphan，Kalle)上，得到约75g/m2的包裹层。在干 燥(60℃下15分钟)后，将硅氧烷处理的聚酯薄膜(75mm 厚，Laufenberg)用作剥离薄膜。使用穿孔工具给成品系统穿出所需形 式的5-30cm2大小的孔。将完整的系统独立地密封在铝纸囊剂中。
实施例3：装有1.0mg干燥的冻干1-羟基-2-(咪唑-1-基)乙烷 -1，1-二膦酸(混合的其钠盐)的小瓶。在用1ml水稀释后，获得了静 脉输注用的溶液(浓度为1mg/ml)。 组成： 活性组分(游离的二磷酸) 1.0mg
甘露糖醇 46.0mg
柠檬酸三乙酯×2H2O 约3.0mg
水 1ml
注射用水 1ml
在1ml水中用柠檬酸三乙酯将所述的活性组分滴定至pH为6.0。 然后加入甘露糖醇并将该溶液冻干和将冻干物装入小瓶。
实施例4：装有例如溶于水的氨羟二磷酸二钠五水合物这样的活性 组分的安瓿。该溶液(浓度为3mg/ml)是稀释后静脉输注用的溶液。 组成： 活性组分(Δ5.0mg无水活性组分) 19.73mg
甘露糖醇 250mg
注射用水 5ml
实施例5患者的治疗
通过动脉内方式用二膦酸输注液经产生癌、转移瘤或骨关节炎部 位的动脉治疗患有癌症和相关转移瘤的许多患者和1位患有骨关节炎 的患者。在输注二膦酸前后使用标准血管造影技术检查癌、转移瘤或 骨关节炎部位。在所有情况中，观察到了对疾病区域中新近形成的毛 细血管和其它血管的明显的栓塞作用。治疗方案在下面具体描述。
i)患者ID： 1676
性别： 女性
年龄： 68岁零6个月
诊断： 乳腺癌、多发性肺转移瘤
治疗蒂： 双侧支气管动脉
将总计75mg的氨羟二磷酸二钠(Aredia)输注入双侧支气管动 脉以便消除其肿瘤血管扩张(tumour blushes)。附图1和2表示治 疗前(a)和治疗后(b)的左侧(附图1)和右侧(附图2)肺区域的 血管造影片。
ii)患者ID： 2022
性别： 女性
年龄： 57岁零1个月
诊断： 乳腺癌、骨转移瘤、多发性肺
转移瘤
治疗蒂 1.双侧最上部的肋间动脉到第
12肋间动脉
2.双侧支气管动脉
3.胸廓内的外侧动脉
4.胸廓外侧动脉前根
将总计75mg的氨羟二磷酸二钠(Aredia)、100mg依托泊苷、 10mgBLM和500mgimpras-liprodol用于消除沿这些蒂排列的肿瘤血管 扩张(tumourblushes)。(对骨转移瘤而言仅使用氨羟二磷酸二钠)。
iii)患者ID： 1441
性别： 女性
年龄： 63岁零11个月
诊断： 乳腺癌、多发性骨转移瘤、多
发性肝转移瘤
治疗蒂： 1.双侧闭孔肌动脉
2.双侧L4/5至L1腰动脉
3.右侧肝的6、7、8胚下
(subergemenal)肝动脉
将总计45mg的氨羟二磷酸二钠(Aredia)、10mgADM(对肝)、 10mgBLM和500mgimpras-liprodol乳剂用于消除沿这些蒂排列的肿瘤 血管扩张(tumour blushes)。(对骨转移瘤而言将45mg氨羟二磷酸 二钠用于其上而就肝转移瘤而言还使用10mgADM和 500mgimpras-liprodol)。
iv)患者ID： 1840
性别： 男性
年龄： 43岁零11个月
诊断： 舌癌、colateralvibo、隔膜转
移瘤
治疗蒂： 1.第7、8、9、10肋间动脉
2.左侧腹股沟隔
3.左侧较上部肋间动脉
4.左侧肩胛下动脉
将总计60mg的氨羟二磷酸二钠(Aredia)输注入上述动脉以便 消除其沿这些蒂排列的肿瘤血管扩张(tumour blushes)。
v)患者ID： 1835
性别： 女性
年龄： 34岁零8个月
诊断： 乳腺癌、多发性肺转移瘤、多
发性骨转移瘤、多发性肝转移
瘤
治疗蒂： 左侧回肠腰、回肠骶、骶骨外
侧动脉
右侧回肠腰、深部回肠
orumgles动脉
双侧L4、左侧L3、双侧L2胸
廓动脉；右侧胸廓肋间动脉；
支气管、右侧肝动脉
将总计90mg的氨羟二磷酸二钠(Aredia)、100mg依托泊苷、 10mgADM、6.0CE的OK-432和500mgimpras-liprodol乳剂用于消除沿 这些蒂排列的肿瘤血管扩张(tumourblushes)。
vi)患者ID： 2013
性别： 女性
年龄： 73岁零7个月
诊断： 右侧膝关节骨关节炎(解释为
局部缺血性生血管骨疾病)
治疗蒂： 1.右侧膝降动脉
2.右侧sular动脉
将总计30mg的氨羟二磷酸二钠(Aredia)用于消除其沿这些蒂 排列的生血管扩张(blushes)。治疗前(a)和治疗后(b)的右侧膝 关节区域的血管造影片如附图3中所示。
vii)患者ID： 2026
性别： 女性
年龄： 49岁
诊断： 乳腺癌、胸柱、骨转移瘤
治疗蒂： 1.双侧最上部肋间动脉
2.双侧1-4腰动脉
3.骶骨中动脉
将总计30mg的氨羟二磷酸二钠(Aredia)输注入肿瘤血管扩张 (tumour blushes)以便消除它们。
viii)患者ID： 1985
性别： 女性
年龄： 49岁零8个月
诊断： BCT后乳腺癌、多发性骨转移
瘤
治疗蒂： 1.双侧最上部肋间至第12肋
间动脉
2.双侧腰动脉(L1-L4)
3.骶骨中动脉
将总计90mg的氨羟二磷酸二钠(Aredia)用于消除沿这些蒂排 列的肿瘤血管扩张(tumour blushes)。
ix)患者ID： 1063
性别： 男性
年龄： 80岁零10个月
诊断： 肺癌、扁平细胞癌
治疗蒂： 1.右侧最上部肋间动脉
2.双侧支气管动脉的普通动脉
仅将总计45mg的氨羟二磷酸二钠(Aredia)输注入肿瘤以便消 除饲养蒂的肿瘤血管扩张(tumour blushes)。
实施例6 zoledrinic acid对由小鼠体内皮下植入物输注的生长 因子诱发的血管发生的作用
方法
动物
使用称重为17-20g的雌性小鼠(Tiflbm：MAG)。通过耳部标记 区分它们并在正常条件下分组(6只动物/笼)且每日进行观察。在每 次实验中每个治疗组使用6只小鼠。将全部实验至少进行两次。
室的制备
使用由全氟-烷氧基-特氟隆(Teflon-PFA，21mm×8mm直径，550μl 体积)制成并穿有80个固定间隔的0.8mm孔的多孔组织。将两端用相 同物质制成的可除去的帽密封。将4-6个室插入硅管(12mm直径)。 然后用硅橡胶密封所述管的两端并在24小时后通过高压灭菌给含有 所述室的管灭菌(121℃，15分钟)。
生长因子
在无菌条件下填充该室(总体积0.5ml)，而在硅管内仍然含有包 含20U/ml的肝素(NovoNordiskA/S，2880Bagsvaerd，Denmark)的0.8 ％w/v琼脂(BBLNr.11849，BectonDickinson，Meylan，France)并含 有或不含生长因子(人VEGF2μg/ml或人bFGF0.3μg/ml)。在填充步 骤前将该琼脂溶液维持在42℃下。
室的移植
通过吸入3％的含氧异氟醚(Forene，AbbottAG， Cham，Switzerland)诱发小鼠麻醉。在无菌条件下通过动物背部上的 小切口植入所述室。用止血钳(Autoclip9mm，ClayAdams)封闭皮肤切 口。
室的去除
植入5天后，麻醉(3％异氟醚)动物并使用超剂量的戊巴比妥处 死动物(210mg/kg腹膜内给药，Vetanarcol，Veterinaria AG，Zürich，Switzerland)。然后将室从动物体内取出，谨慎取出已 经在各植入物周围形成的血管化多孔组织、称重并通过血红蛋白浓度 的比色测定来对总血量进行定量。
生血管反应的定量
在添加2ml蒸馏水后，以24000rpm将组织样品匀化1分钟 (UltraTurraxT25)。然后以7000rpm将该样品离心1小时。通过 0.45μmGHP注射滤器(AcrodiscGF，Gelman Sciences，AnnArbor， Michigan，USA)过滤上清液以避免脂肪的污染。通过使用Drabkin试 剂盒(Sigma血红蛋白#525，SigmachemicalCo.Ltd.，Poole， Dorset，England)在540nm处的分光光度分析来测定滤液中存在的血 红蛋白的量。将滤液的等分部分(100μl)加入到1ml的Drabkin’s溶 液中并在室温下将该混合物培养15分钟。540nm处的吸收度 (Uvikon810P)与血红蛋白的浓度成正比。然后应用预先使用从供体 小鼠体内不同体积的全血样品中获得的校正曲线将血红蛋白测定值转 换成血液体积测定值(μl)。
药物治疗
在植入所述室前1天开始给予Zoledronic acid并在植入后5天 最后一次剂量后24小时取出所述室。将动物分组以便于实验期限。通 过在旋转位置上给予注射而经皮下给予1、10和100μg/kg/天(剂量 体积25ml/kg)剂量的Zoledronic acid。首先将该化合物溶于蒸馏水 且然后用含有甘露糖醇的蒸馏水稀释(终浓度：5％甘露糖醇)。对照 组动物仅接受载体。将各实验至少进行两次且然后收集数据以便于最 终的评价。
计算和统计学
如下计算各动物体内生血管反应的抑制百分比(组织重量或总血 液量的增加)：
(A-B)/(C-D)×100
A＝来自药物治疗的带有含生长因子的室的小鼠组织的重量(或血 液体积)。
B＝来自药物治疗的带有不含生长因子的室的小鼠组织的平均重 量(或血液体积)。
C＝来自载体治疗的带有含生长因子的室的小鼠组织的平均重量 (或血液体积)。
D＝来自药载体治疗的带有不含生长因子的室的小鼠组织的平均 背景重量(或血液体积)。
使用Mann-Whitney秩和检验(SigmaStar2.0软 件，JandelScientific，Germany)在各组之间(化合物治疗的与未治 疗的动物)对组织重量和血液体积的绝对值进行统计学比较。将显著 性水平设定在p＜0.05。
结果
正如通过重量和血液含量测定的，Zoledronic acid以剂量依赖性 方式抑制了由bFGF诱发的生血管反应，IC50近似值分别为2.5和 3.1μg/kg。在最高测试剂量下(100μg/kg/天)，对VEGF-诱发的血液 含量而非重量增加方面存在显著抑制作用。
这些研究证实Zoledronic acid在显示出对几种疾病动物模型中 骨更新的治疗作用的剂量范围内抑制了bFGF而非VEGF诱发的血管发 生。在较高剂量下还观察到了对VEGF反应的部分抑制作用。因此，看 起来Zoledronic acid对bFGF介导的反应的抑制作用具有一定的选择 性。
实施例7 Zoledronate对体外细胞增殖和迁移的作用
方法
测试化合物和溶液
使用zoledronate的水合二钠盐进行本报告中所述的研究。用PBS 制备zoledronate(10mM)和EDTA(5mM)的储备溶液。然后将储备溶 液稀释入针对各细胞系的最佳培养基中。
细胞和细胞培养条件
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)获自PromoCell (BioConceptAG，Allschwil，Switzerland)。用于本研究的人肿瘤细 胞系A431(上皮癌)获自美国典型培养物保藏中心 (ATCC，Rockville，MD，USA)。按照供应商的建议在体外培养所有的细 胞系。
内皮细胞增殖试验
作为zoledronate抑制对VEGF功能性反应的能力的试验，使用基 于BrdU结合的内皮细胞增殖试验 (BiotrakCellProliferationElisaSystemV.2，Amersham，England)。 为了测试该反应的特异性，还测试了zoledronate和EDTA(作为 zoledronate离子螯合作用的对照)对bFGF-和血清-诱发的HUVEC增 殖的作用。以5×103个细胞/孔的密度将分会合HUVEC接种入包被了 1.5％明胶的96孔平板且然后在37℃和5％CO2下的生长培养基(内皮 细胞生长培养基(Endothelial cell Grouth medium，) PromoCellNr.C-22110，BioConcept AG，Allschwil，Switzerland)中 培养。24小时后，在有或没有测试化合物存在的情况下用含有人VEGF165(10ng/ml)、bFGF(0.5ng/ml)或5％FCS的基础培养基(内皮细胞 生长培养基PromoCellNr.C-22110，BioConcept AG，Allschwil， Switzerland)取代生长培养基。作为对照，还包括不含生长因子的孔。 在24小时培养后，加入BrdU标记溶液并在固定、阻断和添加过氧化 物酶标记的抗-BrdU抗体前24小时将细胞进一步进行培养。然后使用 3，3’5，5’-四甲联苯胺底物检测结合的抗体，所述的底物形成着色反应 产物，可通过分光光度法在450nm处对该产物进行定量。
肿瘤细胞增殖试验
为了进一步测试zoledronate和EDTA的特异性，测试它们对人肿 瘤细胞系(A431，上皮癌)增殖的作用。以1.5×103个细胞/孔的密 度将细胞接种入96孔平板并培养过夜。然后添加顺序稀释的测试化合 物并将该平板培养3天，此后用3.3％v/v戊二醛固定所述细胞、将其 用水洗涤并用0.05％w/v亚甲蓝染色。洗涤后，用3％v/vHCl洗脱染 料并使用Dynatech7000分光光度计在665nm处测定光密度。通过使用 公式(OD检测值-OD起始值)/(OD对照值-OD起始值)×100的计 算机化系统测定与对照组相比接触化合物细胞的细胞生长降低百分 比。将IC50值定义为在培养期限结束时使与对照培养物相比(100％) 相比细胞数量减少50％的药物浓度。
内皮细胞迁移试验
作为zoledronate抑制对VEGF功能性反应的能力的试验，使用内 皮细胞迁移试验。给平板包被1.5％的明胶并安装环状防护物作为防 止细胞从孔中心生长的屏障。以1×105个细胞/孔的密度将分会合 HUVEC接种入外部区域且然后在37℃和5％CO2下的生长培养基(内皮 细胞生长培养基PromoCellNr.C-22110，BioConcept AG，Allschwil， Switzerland)中培养。24小时后，除去防护物在有或没有测试化合 物存在的情况下用含有人VEGF165(10ng/ml)或5％FCS的基础培养基 (内皮细胞生长培养基PromoCellNr.C-22110，BioConcept AG，Allschwil，Switzerland)取代生长培养基。为了抑制细胞增殖， 加入50μg/ml的5-氟尿嘧啶(Roche，Basel，Switzerland)。作为对 照，还包括不含生长因子的孔。在60-70小时培养后，固定细胞并用 Diff-Quik(DadeBehring AG.，Nr.130832，Düdingen，Switzerland) 染色。将24孔平板置于双目镜显微镜下并使用KS-400软件 (CarlZeissJena，Jena，Germany)和特别设计的macro(迁移.mcr) 对迁移的细胞数量进行计数。
统计学
通过一种方式方差分析、随后用Dunnett’s检验分析数据以评价 zoledronate或EDTA治疗组与对照组之间的显著性差异。将 Bonferroni检验用于在特定浓度下评价各对zoledronate和EDTA治 疗组之间的显著性差异。所有分析均使用Instat软件 (GraphPadInc.，SanDiego，USA)进行。
结果
Zoledronate以剂量依赖性方式抑制了血清诱发的HUVEC增殖，其 中IC50为4.1±0.6μM。它对由VEGF和bFGF诱发的增殖也具有相似的 作用，IC50分别为6.9±0.4μM和4.2±0.4μM。Zoledronate在较高浓度 下对增殖的抑制作用明显不同于对照组。对所有刺激物来说，在最高 测试浓度的zoledronate下(30μM)观察到了细胞形态的改变。
作为二膦酸螯合物的二价阳离子，将EDTA用作平行实验的对照组。 EDTA在30μM下抑制由FCS、VEGF和bFGF诱发的HUVEC增殖分别达 23.7％、55.6％和49.5％。对于所有刺激物来说，EDTA的作用低于 zoledronate的作用，它没有在测试浓度范围内达到血清诱发的增殖 的统计学显著性，而它在3μM和3μM以上EDTA浓度下使用VEGF和bFGF 刺激达到了。对于用血清或bFGF刺激来说，zoledronate的抑制作用 显著高于在3μM和3μM以上浓度下EDTA的抑制作用，而使用VEGF刺 激仅在30μM下具有显著性差异。
通过zoledronate抑制了人肿瘤细胞系A431的增殖，其中IC50为 1.35μM。EDTA在测试剂量范围内对A431增殖没有显著作用，尽管在 30μM下似乎有轻度抑制作用(8.8％)。
Zoledronate在达到10μM的浓度下刺激了基础培养基中以及含有 血清或VEGF的培养基中HUVEC的迁移。在30μM下迁移受到了完全抑 制且观察到了细胞形态的改变。EDTA对迁移没有一致的作用。
这些研究证实zoledronate抑制了由血清、VEGF和bFGF诱发的人 内皮细胞增殖。