相关专利申请的交互参考
本发明要求下面四个美国临时专利申请的权利：2003年9月22日提 交的60/504,901；2003年8月12日提交的60/494,714；2003年2月21日 提交的60/448,960；和2002年11月27日提交的60/429,842，这些美国临 时专利申请为了所有目的都被完整并入本文作为参考。
发明背景
编程性细胞死亡是对于所有后生动物的发育和组织稳态必需的高度保 守的细胞自杀程序。变为防止或者延迟正常细胞失识的编程性细胞死亡途 径在疾病的病理中和调节细胞周期中的异常一样重要。细胞分裂受到细胞 周期调节蛋白之间的复杂相互作用的控制，和细胞分裂一样，编程性细胞 死亡在正常环境中通过基因产物的相互作用而被类似调节，所述基因产物 防止或者诱导细胞死亡。
TNF-相关的编程性细胞死亡诱导性配体(TRAIL，也称作Apo2L)是 TNF细胞因子家族的成员。当结合到TNF受体超家族的两个成员DR4或 者DR5后，TRAIL通过编程性细胞死亡诱导细胞死亡。见，例如，Pan等 人，Science 277：815-8(1997)；Sheridan，等人，Science 277：818-213(1997)； Walczak等人，EMBO J.16：5386-974(1997)。在体外，已经证明TRAIL 杀死肿瘤细胞，但是对正常细胞相对无毒。
需要其它治疗癌症的疗法。本发明解决该问题及其他问题。
发明概述
本发明提供了在癌细胞中诱导编程性细胞死亡的方法。在一些实施方 案中，该方法包括将所述细胞与(i)抗DR4或者抗-DR5亲和剂激动剂；和 (ii)编程性细胞死亡诱导试剂接触。在一些实施方案中，该激动剂是抗 -DR-5-抗体。在一些实施方案中，抗-DR-5-抗体具有包含含有图24或者图 35中所示序列的重链可变区和如图25或图35中所示轻链可变区的抗体的 结合特异性。在一些实施方案中，抗-DR5抗体包含含有图24或者图35 中所示序列的重链可变区和图25或图35中所示的轻链可变区。在一些实 施方案中，抗-DR5抗体是抗体A(ATCC保藏号___)。在一些实施方案中， 所述激动剂是抗-DR4抗体。
在一些实施方案中，所述细胞与抗-DR4抗体激动剂和抗-DR5抗体激 动剂接触。
在一些实施方案中，激动剂是人源化抗体。在一些实施方案中，激动 剂是单链抗体。
在一些实施方案中，所述试剂防止或者减少BCL-2或者UbcH10的表 达。在一些实施方案中，所述试剂防止NFкB的活化。在一些实施方案中， 所述试剂防止IкB的降解。在一些实施方案中，所述试剂是蛋白酶体抑制 剂。在一些实施方案中，该蛋白酶体抑制剂选自PS-341、MG-262和 MG-132。
在一些实施方案中，所述试剂是编程性细胞死亡蛋白的抑制物 (Inhibitor of Apoptosis protein，IAP)的抑制剂。在一些实施方案中，抑制 剂是SMAC或者SMAC模拟物。
在一些实施方案中，所述试剂是多肽抑制剂，所述多肽选自plexin B1 (PLXNB1)、含有SET结构域的蛋白7(SET7)、促分裂原活化的蛋白激酶 激酶激酶5(MAP3K5)、STE20样激酶(JIK)、与MAP激酶相互作用的丝 氨酸/苏氨酸激酶1(MKNK1)、推定的内质网多次跨膜蛋白(RFT1)、I型5- 激酶γ(PIP5K1C)、促分裂原活化的蛋白激酶活化的蛋白激酶 2(MAPKAPK2)、促分裂原活化的蛋白激酶激酶5(MAP2K5)、依赖细胞周 期蛋白的激酶6(CDK6)、类活化素AII型受体-1(ACVRL1)、 Gardner-Rasheed猫肉瘤病毒(v-fgr)癌基因同系物(FGR)、推定的蛋白 FLJ21802(FLJ21802)、肌肉、骨骼受体酪氨酸激酶(MUSK)、20号染色体 可读框88(C20orf88)、苯并咪唑不抑制的芽殖(budding)1(酵母同系 物)(BUB1)、核糖体蛋白S6激酶的90kD多肽5(RPS6KA5)、v-yes-1 Yamaguchi肉瘤病毒相关癌基因同系物(LYN)、促分裂原活化的蛋白激酶 7(MAPK7)、和v-akt鼠胸腺瘤病毒癌基因同系物1(AKT1)。
在一些实施方案中，所述试剂是多肽活化剂，所述多肽选自信号识别 颗粒72kD(SRP72)、Caspase-8、Bid、B淋巴样酪氨酸激酶(BLK)、类似 于丙酮酸激酶的基因产物即M2同工酶(LOC148283)、糖原合酶激酶3α (GSK3A)、推定的蛋白FLJ32312(FLJ32312)、促分裂原活化的蛋白激酶 10(MAPK10)、TCF4：转录因子4、v-ablAbelson鼠白血病病毒癌基因同系 物2(arg，Abelson-相关基因)(ABL2)、v-ros禽UR2肉瘤病毒癌基因同系物 1(ROS1)和v-myc禽骨髓细胞瘤病病毒癌基因。
在一些实施方案中，癌细胞是结肠癌细胞或者胰腺癌细胞。
在一些实施方案中，所述试剂是PAK1的拮抗剂。在一些实施方案中， 所述试剂是多肽拮抗剂，该多肽选自UbcH10、nsurf、stk12、Ask1和JIK。 在一些实施方案中，所述试剂是siRNA分子。
本发明还提供了在需要诱导编程性细胞死亡的个体中诱导癌细胞编程 性细胞死亡的方法。在一些实施方案中，该方法包括对个体施用治疗有效 量的(i)抗-DR4或者抗-DR5亲和剂激动剂；和(ii)编程性细胞死亡诱导试 剂。
在一些实施方案中，所述激动剂和试剂被单独施用。在一些实施方案 中，所述激动剂和试剂作为混合物施用。在一些实施方案中，该激动剂是 抗-DR-5-抗体。在一些实施方案中，抗-DR-5-抗体具有包含含有图24或者 图35中所示序列的重链可变区和如图25或图35中所示轻链可变区的抗体 的结合特异性。在一些实施方案中，抗-DR5抗体包含含有图24或者图35 中所示序列的重链可变区和图25或图35中所示的轻链可变区。在一些实 施方案中，抗-DR5抗体是抗体A(ATCC保藏号＿)。在一些实施方案中， 所述激动剂是抗-DR4抗体。在一些实施方案中，所述细胞与抗-DR4抗体 激动剂和抗-DR5抗体激动剂接触。
在一些实施方案中，激动剂是人源化抗体。在一些实施方案中，激动 剂是单链抗体。
在一些实施方案中，所述试剂防止或者降低BCL-2或者UbcH10的表 达。在一些实施方案中，所述试剂防止NFкB的活化。在一些实施方案中， 所述试剂防止IкB的降解。在一些实施方案中，所述试剂是蛋白酶体抑制 剂。在一些实施方案中，该蛋白酶体抑制剂选自PS-341、MG-262和 MG-132。
在一些实施方案中，所述试剂是编程性细胞死亡蛋白的抑制物(IAP) 的抑制剂。在一些实施方案中，该抑制剂是SMAC或者SMAC模拟物。
在一些实施方案中，癌细胞是结肠癌细胞或者胰腺癌细胞。在一些实 施方案中，所述试剂是PAK1的拮抗剂。在一些实施方案中，所述试剂是 多肽拮抗剂，该多肽选自UbcH10、nsurf、stk12、Ask1和JIK。在一些 实施方案中，所述试剂是siRNA分子。
本发明还提供了含有治疗有效量的(i)抗-DR4或者抗-DR5抗体激动 剂；和(ii)编程性细胞死亡诱导试剂的生理组合物。在一些实施方案中，该 激动剂是抗-DR-5-抗体。在一些实施方案中，抗-DR-5-抗体具有包含含有 图24或者图35中所示序列的重链可变区和如图25或图35中所示轻链可 变区的抗体的结合特异性。在一些实施方案中，抗-DR5抗体包含含有图 24或者图35中所示序列的重链可变区和图25或图35中所示的轻链可变 区。在一些实施方案中，抗-DR5抗体是抗体A(ATCC保藏号＿)。在一些 实施方案中，所述激动剂是抗-DR4抗体。在一些实施方案中，所述细胞与 抗-DR4抗体激动剂和抗-DR5抗体激动剂接触。
在一些实施方案中，激动剂是人源化抗体。在一些实施方案中，激动 剂是单链抗体。在一些实施方案中，所述试剂防止或者降低BCL-2或者 UbcH10的表达。在一些实施方案中，所述试剂防止NFкB的活化。在一 些实施方案中，所述试剂防止IкB的降解。在一些实施方案中，所述试剂 是蛋白酶体抑制剂。在一些实施方案中，该蛋白酶体抑制剂选自PS-341、 MG-262和MG-132。
在一些实施方案中，所述试剂是编程性细胞死亡蛋白的抑制物(IAP) 的抑制剂。在一些实施方案中，该抑制剂是SMAC或者SMAC模拟物。
在一些实施方案中，所述试剂是PAK1的拮抗剂。在一些实施方案中， 所述试剂是多肽拮抗剂，该多肽选自UbcH10、nsurf、stk12、Ask1和JIK。 在一些实施方案中，所述试剂是siRNA分子。
本发明还提供了具有抗体结合特异性的亲和剂，所述抗体包含含有图 24或者图35中所示序列的重链可变区和如图25或图35中所示的轻链可 变区。在一些实施方案中，该亲和剂是包含含有图24或者图35中所示序 列的重链可变区和图25或图35中所示的轻链可变区的抗体。
本发明还提供了表达抗体的细胞，所述抗体包含含有图24或者图35 中所示序列的重链可变区和图25或图35中所示的轻链可变区。
本发明还提供了诱导癌细胞中编程性细胞死亡的方法，该方法包括将 所述细胞与具有抗体结合特异性的亲和剂接触，所述一种抗体包含含有图 24或者图35中所示序列的重链可变区和如图25或图35中所示的轻链可 变区。在一些实施方案中，所述激动剂是抗-DR5抗体。在一些实施方案中， 抗-DR-5-抗体具有包含含有图24或者图35中所示序列的重链可变区和如 图25或图35中所示轻链可变区的抗体的结合特异性。在一些实施方案中， 抗-DR5抗体包含含有图24或者图35中所示序列的重链可变区和图25或 图35中所示的轻链可变区。在一些实施方案中，抗-DR5抗体是抗体 A(ATCC保藏号＿)。
定义
“抗体”指含有免疫球蛋白基因构架区的多肽或者其片段，其能特异 结合和识别抗原。公认的免疫球蛋白基因包括к、λ、α、γ、δ、ε和 μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为к或λ。 重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，它们导致了对免疫球蛋白类别的定义， 分别是IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
天然存在的免疫球蛋白具有共同的核心结构，其中两条相同的轻链(约 24kD)和两条相同的重链(约55或者70kD)形成四聚体。每条链的氨基末端 部分已知为可变(V)区并且可以与每条链剩余的较保守恒定(C)区区别。轻 链的可变区内是通常所说的J区的C-末端部分。在重链的可变区内，除了 J区之外还有D区。免疫球蛋白中多数氨基酸序列变异被局限于V区中的 三个单独的位置，它们是通常所说的超变区或者互补决定区(CDRs)，超变 区或者互补决定区直接参与抗原结合。从氨基末端往前，这些区域分别指 定为CDR1、CDR3和CDR3。通过较保守的构架区(FRs)固定CDRs。从 氨基末端往前，这些构架区分别被指定为FR1、FR2、FR3、和FR4。Kabat 等人(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五 版，U.S.Department of Health and Human Services，U.S.Government Printing Office(1991))已经定义了CDR和FR区的位置和编号系统。
一种示例性免疫球蛋白(抗体)结构单位含有四聚体。每一四聚体由两 个相同的多肽链对组成，每对有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约 50-70kDa)。每条链的N-末端限定了约100到110或者更多氨基酸的可变 区，其主要负责抗原识别。术语“可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这 些轻链和重链。
抗体作为例如完整的免疫球蛋白或者作为通过多种肽酶消化产生的许 多良好表征的片段存在。从而，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键下面 的抗体产生F(ab)’2，其是Fab的二聚体，Fab自身是通过二硫键连接到 VH-CH1的轻链。可以在温和条件下还原F(ab)’2以断裂铰链区中的二硫键， 从而将F(ab)’2二聚体转化成Fab’单体。Fab’单体基本上是Fab，具有部 分铰链区(见FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul编者，第三版 1993))。尽管按照完整抗体的消化定义多种抗体片段，但是技术人员将理 解这些片段可以通过化学方法或者使用重组DNA方法从头合成。从而， 本文中，术语抗体还包括通过完整抗体的修饰、或者使用重组DNA方法(例 如，单链Fv)或者用噬菌体展示文库(见，例如，McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990))鉴定的抗体片段。
为了制备单克隆或者多克隆抗体，可以使用本领域中公知的任一种技 术(见，例如，Kohler & Milstein，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等人， Immunology Today 4：72(1983)；Cole等人，77-96页，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(1985))。“单克隆抗体”指从单个克隆得 到的抗体。产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)适于产生针对本发 明多肽的抗体。转基因小鼠或者其他生物诸如其他哺乳动物也可用于表达 人源化抗体。备选地，可用噬菌体展示技术鉴定特异结合所选抗原的抗体 和异聚体(heteromeric)Fab片段(见，例如，McCafferty等人，Nature 348： 552-554(1990)；Marks等人，Biotechnology 10：779-783(1992))。
“嵌合抗体”是一种这样的抗体分子，其中(a)恒定区或者其部分被 改变、替换或者交换从而抗原结合位点(可变区)连接到具有不同或者改变 的类别、效应功能和/或种类的恒定区，或者完全不同的分子，该分子赋予 该嵌合抗体新的性质，所述不同的分子为例如酶、毒素、激素、生长因子、 药物，等等；或者(b)可变区或者其部分被具有不同的或者改变的抗原特异 性的可变区改变、替换或者交换。
“人源化”抗体是保持非-人抗体的反应性而在人体中免疫原性较小的 抗体。可以例如，通过保留非-人CDR区并用将该抗体的剩余部分用人抗 体的对应物替换实现人源化。见，例如，Morrison等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92 (1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec. Immun.，28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.，31(3)：169-217(1994)。
当涉及蛋白质或者肽时，短语“特异(或者选择性)结合”到抗体或者 “特异(或者选择性)与...免疫反应”指结合反应，其可以确定蛋白质和其 他生物产品的异质群体中所述蛋白质的存在。从而，在所指定的免疫测定 条件下，该指定的抗体以背景的至少两倍结合特定蛋白质并且基本上不大 量结合样品中存在的其他蛋白质。这些条件下抗体的特异结合需要由于其 对特定蛋白质的特异性而选择的抗体。通过排除与例如来自其他物种的 DR5分子交叉反应的抗体实现该选择。可以用多种免疫测定形式选择与特 定蛋白质特异免疫反应的抗体。例如，通常用固相ELISA免疫测定法选择 与蛋白质特异免疫反应的抗体(关于可用于确定特异免疫反应性的免疫测 定形式和条件的描述，见例如，Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988))。通常，特异或者选择性反应将是背景信号或者噪声的至少 两倍，更通常是背景的10到100倍以上。
术语“肽模拟物”和“模拟物”指合成的化合物，其具有与天然的或 者非天然存在的多肽(例如，SMAC)基本上相同的结构和功能特征。肽类 似物通常用于制药工业作为非-肽药物，其具有类似于模板肽的性质。这些 类型的非肽化合物通常被称为“肽模拟物”或者“肽模仿物”(Fauchere，J. Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber和Freidinger TINS 392页(1985)；和 Evans等人，R Med.Chem.30：1229(1987)，它们被并入本文作为参考)。与 可用于治疗的肽在结构上类似的肽模拟物可用于产生等同的或者更强的治 疗或者预防效果。通常，肽模拟物与范例多肽(即，具有生物学或者药理学 活性的多肽)在结构(如目标多肽中发现的)上相似，但是一个或多个肽键任 选被选自例如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、 -COCH2-、-CH(OH)CH2-、和-CH2SO-的键替换。该模拟物可以完全由氨 基酸的合成、非天然类似物组成，或者是部分天然肽氨基酸和部分氨基酸 非天然类似物组成的嵌合分子。该模拟物还可以掺入任意量的天然氨基酸 保守置换，只要这些置换基本上不改变该模拟物的结构和/或活性。例如， 如果模拟物组合物能够实施目标多肽的至少一种结合或者酶活性，那么该 模拟物组合物在本发明的范围内。
“siRNA”指小干扰RNA，它们能够在细胞例如哺乳动物细胞(包括 人细胞)和在机体例如哺乳动物机体(包括人)中导致干扰并可以导致特定基 因的转录后沉默。RNA干扰的现象在Bass，Nature 411：428-29(2001)； Elbahir等人，Nature 411：494-98(2001)；和Fire等人，Nature 391：806-11 (1998)；和WO 01/75164中描述和讨论，其中WO 01/75164中还讨论了制 备干扰RNA的方法。基于本文中公开的序列和编码本文中公开的基因产 物的核酸，siRNA通常少于100个碱基对并且可以为，例如约30个碱基对 或者更短，并且可以通过本领域中公知的方法制备，所述方法包括使用互 补DNA链或者合成方法。siRNAs能够在细胞例如哺乳动物细胞(包括人细 胞)和在机体例如哺乳动物机体(包括人)中导致干扰并可以导致特定基因的 转录后沉默。本发明示例性siRNAs可以具有多达29碱基对、25碱基对、 22碱基对、21碱基对、20碱基对、15碱基对、10碱基对、5碱基对或 者它们附近或者之间的任一整数个碱基对。用于设计最佳的抑制性siRNA 的工具包括可以从DNAengine Inc.(Seattle，WA)和Ambion，Inc. (Austin，TX)得到的工具。
一种RNAi技术使用基因构建体，其中有义和反义序列以与供体和受 体剪接位点正确的剪接方向置于内含子序列侧翼的区域中。备选地，可以 用多种长度的间隔序列将该构建体中序列的自身互补区域分开。在基因构 建体转录物的加工期间，内含子序列被剪接除去，从而允许有义和反义序 列以及剪接连接序列结合而形成双链RNA。然后选择核糖核酸酶，结合并 切割双链RNA，由此引发级联事件，导致特异mRNA基因序列降解和沉 默特异基因。
“核酸”指单链或者双链形式的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸或者 它们的聚合物。该术语包括含有公知的核苷酸类似物或者修饰的主链残基 或者键的核酸，这些核酸是合成的、天然存在的、和非天然存在的，具有 与参比核酸相似的结合性质，并且以和参比核苷酸相似的方式被代谢。这 些类似物的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯、磷酰胺酯、甲基膦酸酯、 手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNAs)。
除非另外说明，特定核酸序列还暗含该序列的经保守修饰的变体(例 如，简并密码子替换)和互补序列，以及明确指出的序列。具体地，通过产 生这样的序列可以实现简并密码子替换，在所述序列中一个或多个所选(或 者所有的)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧次黄苷残基替换 (Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol. Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98 (1994))。术语“核酸”包括术语基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核 苷酸。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残 基的聚合物。该术语应用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸 残基是相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物，该术语还应用于天然存在 的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和 氨基酸模拟物，所述氨基酸类似物和氨基酸模拟物以类似于天然存在的氨 基酸的方式起作用。天然存在的氨基酸为被遗传密码编码的氨基酸以及被 后来修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨 酸。氨基酸类似物指具有和天然存在氨基酸相同的基本化学结构的化合物， 所述基本化学结构即连接至氢、羧基、氨基和R基团的α碳，该氨基酸类 似物为例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这 些类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或者经修饰的肽主链，但 是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与 氨基酸的通常化学结构不同的结构，但是以类似于天然存在的氨基酸的方 式起作用的化合物。
“经保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列。对于具体核酸序列， 经保守修饰的变体指这样的核酸，它们编码相同或者基本上相同的氨基酸 序列，或者当核酸不编码氨基酸序列时指基本相同的核酸序列。由于遗传 密码的简并性，许多功能上相同的核酸编码任一给定的蛋白质。例如，密 码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。从而，在丙氨酸被密码 子指定的每个位置，可以将该密码子改变成所述相应密码子的任一种而不 改变所编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其是一种经保守修饰的 变异。文中编码多肽的每种核酸序列也描述了该核酸的每种可能的沉默变 异。技术人员将认识到可以修饰核酸中的每个密码子(除了AUG和TGG 之外，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密 码子)以产生相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异都暗含在 每种所描述的序列中。
对于氨基酸序列，技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或者蛋白质序 列的分别替换、缺失或者加入改变、加入或者缺失了所编码序列中的单个 氨基酸或者少数氨基酸，当改变导致氨基酸被另一化学上相似的氨基酸替 换时，所编码的序列是“经保守修饰的变体”。提供功能上相似的氨基酸的 保守替换表是本领域中众所周知的。这些经保守修饰的变体包括并且不排 除本发明的多态性变体、种间同系物和等位基因。
下面的8组每组含有相互为保守置换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)精氨酸(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(见，例如，Creighton，Proteins (1984))。
通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列确定“序列同一性百分 数”，其中比较窗口中多核苷酸序列的部分与参比序列(例如，本发明的多 肽)相比可以包含加入或者缺失(即，缺口)，为了两个序列的最佳比对，该 参比序列不包含加入或者缺失。通过确定两个序列中存在相同的核酸碱基 或者氨基酸残基而产生匹配的位置的数目，将匹配位置数除以比较窗口中 位置总数并将所得结果乘以100得到序列同一性百分数。
在两个或者多个核酸或者多肽序列的上下文中，术语“相同的”或者 百分数“同一性”指具有相同序列的两个或多个序列或者子序列。如果使 用下面的序列比较算法之一或者通过手工比对和视觉检查在比较窗口中或 者所指定的区域中比较和比对两个序列以得到最大一致性时，这两个序列 的特定百分数的氨基酸残基或者核苷酸相同(即，在特定区域或者不特指时 在完整序列内，60％同一性，任选65％、70％、75％、80％、85％、90％、 或95％同一性)，那么这两个序列是“基本上相同的”。本发明提供了分别 与此处例示的多肽或多核苷酸(例如，图23-25中例示的CDRs)基本上相同 的多肽或者多核苷酸。任选地，该同一性在至少约50个核苷酸长度的区域 内，或者更优选地在100到500或1000或更多核苷酸长度的区域内存在。
对于序列比较，通常一条序列作为参比序列，将受试序列与参比序列 相比较。当使用序列比较算法时，将受试和参比序列输入计算机，随后指 定坐标，如果必要，还指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数， 或者备选地，可以使用指定参数。然后序列比较算法基于程序参数计算受 试序列相对于参比序列的百分数序列同一性。
本文中，“比较窗口”包括任一数目的连续位置的片段，该数目可以选 自20到600，通常约50到约200，更通常约100到约150，其中序列与具 有相同数目的连续位置的参比序列经最佳比对后可以比较。用于比较的序 列比对方法是本领域众所周知的。可以例如，通过Smith和Waterman(1970) Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch (1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法，通过Pearson和 Lipman(1988)Proc Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性搜寻方法，通过 这些算法的计算机实现(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中)，或者通过手工比对和视觉检查(见，例如，Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))可以实施用于比 较的序列的最佳比对。
适于确定百分数序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是 BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别在Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402，和Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中描 述。实施BLAST分析的软件可以公开地通过国家生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information)得到。该算法包括首先通 过确定询问序列中长为W的短字来确定高得分序列对(HPSs)，所述短字当 与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或者满足某一正值阈值得分T。 将T称为邻近字得分阈值(Altschul等人，如前)。最初的邻近字采样作为 起始物以启动寻找含有其的更长HSPs。只要累积比对得分增加，字采样就 沿着每条序列的两个方向延伸。对于核酸序列，使用参数M(一对匹配残基 的奖励分值；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)。对于氨基酸序列， 用得分矩阵计算累积得分。当：累积比对得分从其最大实现值下降量X； 由于累积一个或多个负得分残基比对；或者达到任一序列的末尾时，累积 得分达到0或者以下。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和 速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用默认字长(W)11，期望值(E)为 10，M＝5，N＝-4，并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认 字长3，期望值(E)为10，并且BLOSUM62得分矩阵(见，Henikoff和 Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对(B)为50，期望值 (E)为10，M＝5，N＝-4，并比较两条链。
BLAST算法还实施两条序列之间相似性的统计分析(见，例如，Karlin 和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。BLAST算法 提供的相似性的一个量度是最小和概率(P(N))，其指出了两条核苷酸或者 氨基酸序列之间偶然发生的匹配的概率的指示。例如，如果受试核酸和参 比核酸的比较中最小和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约 0.001，那么认为核酸与参比序列是相似的。
两条核酸序列或者多肽基本上相同的一个指示是第一条核酸编码的多 肽与针对第二条核酸编码的多肽产生的抗体具有免疫交叉反应，如下述。 从而，例如，当两条多肽仅由于保守置换而不同时，其中的一条多肽与另 一条多肽通常基本上相同。两条核酸序列基本上相同的另一指示是两个分 子或者它们的互补序列在如下描述的严格条件下相互杂交。两条核酸序列 基本上相同的另一指示是可以用相同引物扩增该序列。
术语“亲和剂激动剂”指能够活化受体而诱导全部或者部分受体介导 的应答的亲和剂(即，特异结合靶分子的分子)。例如，DR4或DR5的激动 剂结合DR4或DR5并诱导DR4或DR5-介导的信号转导。在一些实施方 案中，DR4或者DR5亲和剂激动剂可以通过其当与Jurkat细胞接触时能 够结合DR4或DR5并诱导编程性细胞死亡的能力来鉴定。“抗体激动剂” 指其中亲和剂是抗体的情况。
术语“编程性细胞死亡诱导试剂”指当与细胞类型接触时能够诱导或 者促进至少一种细胞类型中编程性细胞死亡的化合物。示例性编程性细胞 死亡诱导试剂包括，例如，下面物质的激动剂或者模拟物：SMAC、Bax、 Bik、Bok、Bim、Bak、Bid、Noxa、Puma、Hrk、或Bad；BH3、p53、 TRAIL配体、Fadd、Myc、和Mekk1、信号识别颗粒72kD(SRP72)、 Caspase-8、Bid、B淋巴样酪氨酸激酶(BLK)、类似于丙酮酸激酶的基因产 物即M2同工酶(LOC148283)、糖原合酶激酶3α(GSK3A)、推定的蛋白 FLJ32312(FLJ32312)、促分裂原活化的蛋白激酶10(MAPK10)、TCF4：转 录因子4、v-abl Abelson鼠白血病病毒癌基因同系物2(arg，Abelson-相关基 因)(ABL2)、v-ros禽UR2肉瘤病毒癌基因同系物1(ROS1)和v-myc禽骨髓 细胞瘤病病毒癌基因，以及下面的物质或途径的拮抗剂或者抑制剂：26S 蛋白酶体抑制剂、c-flip、NFкB途径、IAP家族成员(例如，XIAP、cIAP1、 cIAP2、NAIP、MLIAP/Livin、survivin)、蛋白酶体途径成员(例如，E1、 E2和E3)；激酶PI3、Akt1、2和3、Rip、Nik；CD40；Bcl2家族成员(例 如，Bcl2、Bcl-x1、A1、Mc11)、泛素接合酶UbcH10、osteoprotegrin、plexin B1(PLXNB1)、含SET结构域的蛋白7(SET7)、促分裂原活化的蛋白激酶 激酶激酶5(MAP3K5)、STE20样激酶(JIK)、与MAP激酶相互作用的丝 氨酸/苏氨酸激酶1(MKNK1)、推定的内质网多次跨膜蛋白(RFT1)、I型5- 激酶γ(PIP5K1C)、促分裂原活化的蛋白激酶活化的蛋白激酶 2(MAPKAPK2)、促分裂原活化的蛋白激酶激酶5(MAP2K5)、依赖细胞周 期蛋白的激酶6(CDK6)、类活化素A II型受体-1(ACVRL1)、 Gardner-Rasheed猫肉瘤病毒(v-fgr)癌基因同系物(FGR)、推定的蛋白 FLJ21802(FLJ21802)、肌肉、骨骼受体酪氨酸激酶(MUSK)、20号染色体 可读框88(C20orf88)、苯并咪唑不抑制的芽殖1(酵母同系物)(BUB1)、核糖 体蛋白S6激酶的90kD多肽5(RPS6KA5)、v-yes-1 Yamaguchi肉瘤病毒相 关癌基因同系物(LYN)、促分裂原活化的蛋白激酶7(MAPK7)、和v-akt鼠 胸腺瘤病毒癌基因同系物1(AKT1)、PAK1(包括，例如，P21(CDKN1A)- 活化的激酶1、PAKA、P65-PAK、P68-PAK、α-PAK、MUK2、PAK1B(p21 活化的激酶1B)、P21/Cdc42/Rac1-活化的激酶1(酵母Ste20-相关的)、 Cdc42/Rac效应物激酶PAK-A、蛋白质激酶MUK2之一)、nsurf、stk12(包 括，例如，丝氨酸/苏氨酸激酶12、aurora-相关激酶2、aurora/IPL1样激 酶2、AIK2、ARK2、AIM-1和AIM1)、编程性细胞死亡信号调节激酶 1(Ask1)、TLK1(例如，登录号NM_012290)、NLK(例如，登录号 NM_016231)、GRAF(例如，登录号NM_015071)、GCK(例如，登录号 NM_000162)、ERK5(例如，登录号NM_002749)、FGR(例如，登录号 NM_005248)、ACVRL1(例如，登录号NM_000020)、MEKK5(例如，登 录号NM_002757)、PIP5K1C(例如，登录号XM_047620)、MAPKAPK2(例 如，登录号NM_004759)、RFT1(例如，登录号NM_052859)、MKNK1(例 如，登录号NM_003684)、PLXNB1(例如，登录号NM_002673)。其它示 例性编程性细胞死亡诱导试剂包括，例如，增强DR5和DR4表达和/或稳 定性的试剂、增强caspase活性或稳定性的试剂、和诱导或者增强DNA损 伤应答的试剂。上面的列表中激动剂或者模拟物包括基因产物自身，例如， p53是p53的激动剂。拮抗剂包括直接抑制活性的试剂和通过降低靶标分 子mRNA(例如siRNAs)或者蛋白质的表达或者稳定性间接抑制活性的试 剂。
“阻止或者降低蛋白质表达”的试剂指例如结合而部分或者完全阻断 刺激、降低、阻止、延迟表达的化合物。蛋白质的表达可以降低至少例如， 5％、10％、25％、50％、75％、90％、95％或100％。
“NFкB的活化”指诱导NFкB的核定位、NFкB对DNA的结合 或者NFкB对DNA的结合导致的转录。
“防止IкB的降解”指通过蛋白酶体降解IкB，从而释放NFкB进 入细胞核。
“蛋白酶体抑制剂”指抑制蛋白酶体-泛素途径，从而防止IкB的降 解和IкB的配偶体NFкB的随后核定位的试剂。蛋白酶体包括，例如， 26S蛋白酶体复合体。
“编程性细胞死亡蛋白的抑制物(IAP)”指抑制caspase活性的蛋白质 家族的多肽。几乎所有已知的IAP蛋白都具有特征序列基序的两倍或者三 倍重复，该特征序列基序为杆状病毒抑制性重复子(BIR；～70个残基； survivin是最近发现的一种人IAP，其含有一个BIR区域)。该BIR区域 含有许多保守残基，共有序列为：R-X(20-23)-G-X(11)-C-X(2)-C-X (16)-H-X(6)-C。示例性IAPs包括，例如，X染色体连锁的编程性细胞死 亡蛋白的抑制物(XIAP；Genbank登录号U32974)、细胞IAP蛋白质 (c-IAP-1/HIAP-2/hMIHB和c-IAP-2/HIAP-1/hMIHC；Liston等人，Nature 379：349-353(1996)；Rothe等人，Cell 83：1243-1252(1995))；神经元编程 性细胞死亡蛋白的抑制物(NIAP；Roy等人，Cell 80：167-178(1995))；和 survivin(Ambrosini等人，Nature Med.3：917-921(1997))。见，例如，美 国专利申请号2002/0132786和2002/0009757以及美国专利号6,187,557。
“SMAC”指线粒体多肽，应答编程性细胞死亡刺激时该多肽与细胞 色素c一起从线粒体释放。SMAC通过结合并中和IAPs促进caspase活化。 见，例如，Du等人，Cell 102：33-42(2000)；Verhagen等人，Cell 102：43-53 (2000)。
本文中所用的“调节剂”指抑制或者增强基因产物的表达活性的分子。 “拮抗剂”或者“抑制剂”是例如抑制基因产物表达或者结合而部分或者 完全阻断刺激、降低、阻止或者延迟活化、失活、脱敏、或者下调基因产 物的活性或者结合或下调该基因产物结合的受体的化合物。“激动剂”或者 “活化剂”是例如，诱导或者激活基因产物的表达或者结合、刺激、增强、 打开、活化、促进、增强活性、敏化或者上调基因产物的活性或者结合或 者上调基因产物所结合的受体的化合物。激动剂或者拮抗剂可以包括例如， 抗体、有机小分子(例如，小于1500道尔顿)、基因产物自身的经遗传修饰 形式等等。拮抗剂包括例如siRNA分子，其用于降低编码基因产物的转录 物的表达。
附图简述
图1显示了Jurkat细胞中TRAIL诱导的编程性细胞死亡。
图2显示了DR5功能抗体的特异性。
图3显示了三种不同的DR5抗体激动剂对Jurkat细胞的作用。
图4图解了经处理的Jurkat细胞中Caspase-3活性。
图5图解了DR4/DR5功能抗体对结肠和黑素瘤癌细胞系的作用。
图6图解了DR4/DR5功能抗体对乳腺癌细胞系的作用。
图7图解了正常和肿瘤细胞中对DR5抗体激动剂的剂量应答。
图8图解了关于Caspase-3激活的DR5抗体激动剂“A”。
图9图解了DR5抗体激动剂对Colo 205肿瘤体积的影响。
图10图解了COLO205皮下模型中抗-DR5剂量应答。
图11图解了DR5单克隆抗体在体内的杀肿瘤活性。
图12图解了Caspase活化和编程性细胞死亡的途径。
图13图解了在SMAC模拟物存在下A2058细胞中抗-DR4或者抗 -DR5诱导的编程性细胞死亡。
图14图解了SMAC模拟物对正常的和肿瘤细胞的影响。
图15图解了SMAC模拟物的Pk和PD研究。
图16图解了NFкB途径和其与蛋白酶体的关系。
图17阐明蛋白酶体抑制剂MG132增强DR5抗体诱导的编程性细胞 死亡。
图18图解了多种蛋白酶体抑制剂。
图19图解了蛋白酶体抑制剂对A2058的作用。
图20图解了蛋白酶体抑制剂对肝癌细胞系的作用。
图21图解了蛋白酶体抑制剂对正常乳腺细胞的作用。
图22图解了小鼠-人嵌合DR5抗体的表达。
图23图解了抗体A的重链和轻链可变区的核苷酸序列。
图24图解了抗体A的重链可变区。
图25图解了抗体A的轻链可变区。
图26图解了在基于细胞的鉴定法中通过导入siRNA敲除特定基因表 达以鉴定介导TRAIL-诱导的编程性细胞死亡的基因产物的筛选方法学。
图27也图解了在基于细胞的鉴定法中通过导入siRNA敲除特定基因 表达以鉴定介导TRAIL-诱导的编程性细胞死亡的基因产物的筛选方法 学。
图28提供了在上述siRNA筛选中鉴定的采样。“比例”指加入TRAIL 后与不存在TRAIL相比，存活细胞(即，非-编程性细胞死亡)的比例。低 比例(低于50)表明基因产物干扰编程性细胞死亡。较高比例(大于50)表明 基因产物利于编程性细胞死亡。
图29阐明了Gsk3α和Gsk3β的siRNA数据。图的上部表明siRNA 对Gsk3α或Gsk3β特异。图的下部柱状图图解了存在或者缺乏TRAIL 时导入siRNA后Caspase的活性。
图30图解了TRAIL-诱导的编程性细胞死亡的调节网络。尤其值得注 意的是，myc是促进编程性细胞死亡的(pro-apoptotic)。因此，抑制myc 就抑制了TRAIL-诱导的编程性细胞死亡和myc协同活化的TRAIL的活 性或者抗-DR4或抗-DR5诱导的编程性细胞死亡。
图31显示了siUbeH10对常规细胞毒性抗癌剂杀伤肿瘤细胞的加和效 应。该图还表明用siUbcH10预处理肿瘤细胞显著增加了抗-DR5抗体诱导 的编程性细胞死亡。
图32显示了用siUbcH10下调UbcH10使得肿瘤细胞对TRAIL/DR5- 介导的细胞杀伤敏感。
图33图解了联合使用26S蛋白酶体抑制剂MG-132、MG-262或 Lactacystin(LC)使HCT116细胞或者其Bax-对TRAIL配体敏感。
图34图解了蛋白酶体抑制剂MG-262对多种线粒体编程性细胞死亡 途径蛋白质表达的影响。
图35图解了抗体A的重链和轻链可变区的备选序列。
发明详述
I.介绍
本发明阐明了令人惊奇的结果，即与编程性细胞死亡诱导试剂一起施 用的抗-DR4或抗-DR5抗体激动剂以协同方式诱导癌细胞中的编程性细胞 死亡。从而，对这些组分中一种组分有抗性的癌细胞当与抗-DR4或抗-DR5 激动剂抗体和第二编程性细胞死亡诱导试剂接触时可能被杀死。此外，对 于当与上面所列的组分之一接触时将经历编程性细胞死亡的那些细胞，与 抗-DR4或者抗-DR5激动剂抗体和编程性细胞死亡诱导蛋白接触将导致更 快诱导编程性细胞死亡。
本发明还提供了高潜能DR5激动剂抗体和它们用于诱导癌细胞中编 程性细胞死亡的用途。
II.抗-DR4或DR5抗体
1.介绍
根据本发明的方法，可以使用任一种抗-DR4或者抗-DR5抗体激动剂。 DR4(也称作死亡受体4)和DR5(也称作死亡受体5)是配体TRAIL的两种 受体。见，例如，Pan等人，Science 277：815-8(1997)；Sheridan，等人，Science 277：818-213(1997)；Walczak等人，EMBO J.16：5386-974(1997)。以前 已经在例如，PCT WO01/83560(抗体TRA-8；ATCC PTA-1428)和PCT WO 02/079377中描述了抗-DR5抗体。此外，本文中描述了抗-DR5抗体 激动剂。在图23-25中提供了代表性抗-DR5抗体激动剂的重链和轻链的可 变区。在一些实施方案中，抗-DR5抗体与该代表性抗体竞争结合DR5。 在一些实施方案中，DR5抗体激动剂具有与图24、25或者两者中所示例 的CDRs基本上相似的CDRs。
根据本发明的方法，可以使用任一类型的抗体激动剂。通常，所用的 抗体是单克隆抗体。通过本领域中公知的任一方法可以产生单克隆抗体(例 如，使用杂交瘤、重组表达和/或噬菌体展示)。
本发明的抗体在施用前不需要交联或者其他处理。然而，在一些实施 方案中，本发明的抗体被交联。交联(例如，使用异-或同-双功能化学交联 剂)是本领域中众所周知的。备选地，可以施用稳定的多价Fabs(例如，三 聚体或者四聚体，等等)。见，例如，PCT WO 99/27964。
代表性抗-DR5抗体包括具有包含图24和图25中所示的轻链和重链 可变区序列的抗体特异性的那些抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗体 A(ATCC保藏号.＿＿＿)。
在许多实施方案中，本发明的抗-DR5抗体不结合其他多肽。在一些 实施方案中，抗-DR5抗体不结合TNF受体家族中的任何其他受体(例如， TNFR2、TNFR3、OX40、CD40、FAS、DcR3、CD27、CD30、CD137、 DR4、DcR1、DcR2、RANK、OPG、DR3、TR2、NGFR、TNFR1、和TAC1)。 在一些实施方案中，抗-DR5抗体不结合DR4、DTR1、DTR2或者OPG。
本发明的抗-DR4或者抗-DR5抗体可以非常有效。例如，在一些实施 方案中，在标准皮下肿瘤消除测定中，本发明的抗体以1mg/kg体重或者 更小的浓度(在一些实施方案中，0.50mg/kg、0.05mg/kg、或者0.01mg/kg 或者更小)施用于动物，每周3次持续两周时，可以使肿瘤大小减小50％， 当该剂量使用10次时，肿瘤完全消除。
在一些情况下，本发明的抗-DR4或者抗-DR5抗体经设计而缺少或者 具有减小的抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。例如，在一些实施方案中，本发 明的抗体含有IgG-1、IgG-2、IgG-2A、IgG3或IgG-4Fc区。
许多不同的合成分子支架可用于展示图24和25中所示的可变轻链和 可变重链序列。描述使用纤连蛋白III型结构域(FN3)作为特异分子支架以 在其上展示包括CDRS的肽的一个公开是Koide，A.等人，J.Mol.Biol 284： 1141-1151(1988)。其他支架备选物包括，例如，“微体”(minibodies)(Pessi，A. 等人，Nature 362：367-369(1993))、坛达米斯(McConnell，S.J.和Hoess，R. H.J.Mol.Biol.250：460-470(1995))、和″camelized″VH结构域(Davies J. 和Riechmann，L.BiolTechnology 13：475-479(1995))。不基于免疫球蛋白样 折叠结构的其他支架在Nygren，P.A.和Uhlen，M.Curr.Opin.Struct.Biol. 7：463-469(1997)中综述。美国专利号6,153,380描述了额外的支架。术语 “亲和剂”包括含有如上面描述的合成分子支架的分子，该分子显示出对 DR4或DR5的结合特异性，其包括对本文中所描述抗体特异性的结合结 构域。
2.人源化抗体
在一些实施方案中，根据本发明使用的抗体是嵌合(例如，小鼠/人)抗 体，其由来自非人抗-DR4或者抗-DR5抗体激动剂的区域与人抗体的区域 一起组成。例如，嵌合的H链可以含有连接到至少一部分人重链恒定区的 非人抗体的重链可变区(例如，图24或者图35中所示的序列)的抗原结合 区。该人源化或者嵌合重链可以与嵌合L链组合，该嵌合L链含有连接到 至少一部分人轻链恒定区的非人抗体的轻链可变区(例如，图25或者图35 中所示的序列)的抗原结合区。
本发明的嵌合抗体可以是单价、二价、或者多价免疫球蛋白。例如， 单价嵌合抗体是通过如上面提到的嵌合H链与嵌合L链通过二硫桥形成的 二聚体(HL)。二价嵌合抗体是通过两个HL二聚体通过至少一个二硫桥形 成的四聚体(H2L2)。多价嵌合抗体是基于链的聚集。
在图22-24中提供了代表性抗-DR5抗体激动剂可变区的核苷酸和氨基 酸序列。通过本领域中众所周知的方法可以鉴定、分离和克隆本发明抗体 的DNA序列并将其转移到原核或者真核细胞中进行表达。这些方法通常 在Sambrook等人，如前，以及CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel等人，编者1989)中描述。适于表达 抗体和人源化抗体的表达载体和细胞尤其是本领域中众所周知的。下面的 参考文献是适于表达重组免疫球蛋白的代表性方法和载体，所述参考文献 可用以实施本发明：Weidle等人，Gene，51：21-29(1987)；Dorai等人，J. Immunol.，13(12)：4232-4241(1987)；De Waele等人，Eur.J.Biochem.，176： 287-295(1988)；Colcher等人，Cancer Res.，49：1738-1745(1989)；Wood等 人，J.Immunol.，145(a)：3011-3016(1990)；Bulens等人，Eur.J Biochem.，195： 235-242(1991)；Beggington等人，Biol.Technology，10：169(1992)；King等 人，Biochem.J.，281：317-323(1992)；Page等人，Biol.Technology，2：64 (1991)；King等人，Biochem.J.，290：723-729(1993)；Chaudary等人， Nature，339：394-397(1989)；Jones等人，Nature，321：522-525(1986)； Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Benhar等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，91：12051-12055(1994)；Singer等人，J.Immunol.，150： 2844-2857(1993)；Cooto等人，Hybridoma，13(3)：215-219(1994)；Queen 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：10029-10033(1989)；Caron等人， CancerRes.，32：6761-6767(1992)；Cotoma等人，J.Immunol.Meth.，152： 89-109(1992)。此外，通过商业途径可得到适于表达重组抗体的载体。
能够表达功能免疫球蛋白的宿主细胞包括，例如，哺乳动物细胞，如 中国仓鼠细胞(CHO)细胞；COS细胞；骨髓瘤细胞，如NSO和SP2/O细 胞；细菌，如大肠杆菌(Escherichia coli)；酵母细胞，如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)；和其他宿主细胞。
3.单链抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体是单链抗体。可用于产生单链Fv 和抗体的技术的实例包括在美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等 人，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 90：7995-7999(1993)；和Skerra等人，Science 240：1038-1040 (1988)中描述的那些技术。
4.人抗体
在一些实施方案中，根据本发明使用人抗体。可通过本领域中公知的 多种方法制备人抗体，这些方法包括通过使用噬菌体展示方法，使用来源 于人免疫球蛋白序列的抗体文库。见，例如，Lonberg和Huszar，Int.Rev. Immunol.13：65-93(1995)；美国专利号4,444,887和4,716,111；和PCT公 开号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、和WO 91/10741，这些文献都被完整并入本文 作为参考。
在一些实施方案中，使用噬菌体展示产生本发明的抗体。例如，在噬 菌体颗粒的表面上展示功能抗体结构域，该噬菌体颗粒携带编码所述结构 域的多核苷酸序列。这种噬菌体可用于展示从所有组成成分或者组合抗体 文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。用DR4或者DR5，例如，使 用经标记的DR4或者DR5可以选择或者鉴定表达结合DR4或者DR5的 抗原结合结构域的噬菌体。用于这些方法中的噬菌体通常是丝状噬菌体， 其包含从噬菌体表达的fd和M13结合结构域，Fab、Fv或者二硫键稳定 的Fv抗体结构域重组地融合到噬菌体基因III或者基因VIII蛋白。可用 于制备本发明的抗体的噬菌体展示方法的实例包括在Brinkman等人， J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24：952-958 (1994)；Persic等人，Gene 187：9-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开 WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236； WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409； 5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908； 5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中公开的方法，这些 文献都被完整并入本文作为参考。
5.产生激动剂抗体
通过产生抗-DR4或者抗-DR5抗体，然后试验每种抗体引发DR4或 DR5介导的事件，例如，诱导癌细胞中编程性细胞死亡的能力来鉴定激动 剂抗体。本领域中公知的多种测定法可用于检测对编程性细胞死亡的诱导。
在一种测定法中，将DOHH-2或者Jurkat细胞与候选抗体激动剂接 触，然后监视随着抗体浓度改变的生存力。随着抗体浓度的增加细胞生存 力减小(例如，由编程性细胞死亡的增加导致)表明该抗体是激动剂。通过 加入Alamar blue可以测定细胞生存力，Alamar blue在活细胞而不是死亡 细胞的存在下发荧光。如实施例中所描述的，通过筛选针对DR4或DR5 产生的杂交瘤，然后筛选杂交瘤上清液诱导DOHH-2或Jurkat细胞中编 程性细胞死亡的能力来鉴定激动剂抗体。例如，不经历DR4或者DR5-介 导的TRAIL诱导的编程性细胞死亡的细胞系将不应答候选抗-DR4或抗 -DR5激动剂引起的编程性细胞死亡。
III.编程性细胞死亡诱导试剂
本发明提供了抗-DR4或抗-DR5亲和剂激动剂与第二编程性细胞死亡 诱导试剂的协同效应。编程性细胞死亡诱导试剂包括诱导细胞中编程性细 胞死亡的任一试剂。在一些实施方案中，该编程性细胞死亡诱导试剂优选 在癌细胞而不是非癌细胞中诱导编程性细胞死亡。通常，编程性细胞死亡 诱导试剂是编程性细胞死亡的激动剂或者活化剂或者编程性细胞死亡的抑 制剂的拮抗剂。
代表性编程性细胞死亡诱导试剂包括，例如，下面物质的激动剂或者 模拟物：SMAC、Bax、Bik、Bok、Bim、Bak、Bid、Noxa、Puma、Hrk、 或Bad；BH3、p53、TRAIL配体、Fadd、Myc、和Mekk1、信号识别颗 粒72kD(SRP72)、Caspase-8、Bid、B淋巴样酪氨酸激酶(BLK)、类似于 丙酮酸激酶的基因产物即M2同工酶(LOC148283)、糖原合酶激酶3α (GSK3A)、推定的蛋白FLJ32312(FLJ32312)、促分裂原活化的蛋白激酶 10(MAPK10)、TCF4：转录因子4、v-abl Abelson鼠白血病病毒癌基因同系 物2(arg，Abelson-相关基因)(ABL2)、v-ros禽UR2肉瘤病毒癌基因同系物 1(ROS1)和v-myc禽骨髓细胞瘤病病毒癌基因，以及下面的物质或途径的 拮抗剂或者抑制剂：26S蛋白酶体抑制剂、c-flip、NFкB途径、IAP家族 成员(例如，XIAP、cIAPI、cIAP2、NAIP、MLIAP/Livin、survivin)、蛋 白酶体途径成员(例如，E1、E2和E3)；激酶PI3、Akt1、2和3、Rip、 Nik；CD40；Bcl2家族成员(例如，Bcl2、Bcl-x1、A1、Mc11)、泛素接合酶 UbcH10、osteoprotegrin、plexin B1(PLXNB1)、含SET结构域的蛋白 7(SET7)、促分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶5(MAP3K5)、STE20样激酶 (JIK)、与MAP激酶相互作用的丝氨酸/苏氨酸激酶1(MKNK1)、推定的内 质网多次跨膜蛋白(RFT1)、I型5-激酶γ(PIP5K1C)、促分裂原活化的蛋 白激酶活化的蛋白激酶2(MAPKAPK2)、促分裂原活化的蛋白激酶激酶 5(MAP2K5)、依赖细胞周期蛋白的激酶6(CDK6)、类活化素AII型受体 -1(ACVRL1)、Gardner-Rasheed猫肉瘤病毒(v-fgr)癌基因同系物(FGR)、 推定的蛋白FLJ21802(FLJ21802)、肌肉、骨骼受体酪氨酸激酶(MUSK)、 20号染色体可读框88(C20orf88)、苯并咪唑不抑制的芽殖1(酵母同系 物)(BUB1)、核糖体蛋白S6激酶的90kD多肽5(RPS6KA5)、v-yes-1 Yamaguchi肉瘤病毒相关癌基因同系物(LYN)、促分裂原活化的蛋白激酶 7(MAPK7)、和v-akt鼠胸腺瘤病毒癌基因同系物1(AKT1)、PAK1(包括， 例如，P21(CDKN1A)-活化的激酶1、PAKA、P65-PAK、P68-PAK、α-PAK、 MUK2、PAK1B(p21活化的激酶1B)、P21/Cdc42/Rac1-活化的激酶1(酵 母Ste20-相关的)、Cdc42/Rac效应物激酶PAK-A、蛋白质激酶MUK2之 一)、nsurf、stk12(包括，例如，丝氨酸/苏氨酸激酶12、aurora-相关激酶 2、aurora/IPL1样激酶2、AIK2、ARK2、AIM-1和AIM1)、编程性细胞 死亡信号调节激酶1(Ask1)、TLK1(例如，登录号NM_012290)、NLK(例 如，登录号NM_016231)、GRAF(例如，登录号NM_015071)、GCK(例 如，登录号NM_000162)、ERK5(例如，登录号NM_002749)、FGR(例 如，登录号NM_005248)、ACVRL1(例如，登录号NM_000020)、MEKK5 (例如，登录号NM_002757)、PIP5K1C(例如，登录号XM_047620)、 MAPKAPK2(例如，登录号NM_004759)、RFT1(例如，登录号NM_ 052859)、MKNK1(例如，登录号NM_003684)、PLXNB1(例如，登录号 NM_002673)。其它代表性编程性细胞死亡诱导试剂包括，例如，增强DR5 和DR4表达和/或稳定性的试剂、增强caspase活性或稳定性的试剂、和诱 导或者增强DNA损伤应答的试剂。上面的列表中激动剂或者模拟物包括 基因产物自身(例如，p53是p53的激动剂)。拮抗剂包括直接抑制活性的试 剂和通过降低靶标分子mRNA(例如siRNAs)或者蛋白质的表达或者稳定 性间接抑制活性的试剂。
通过靶向这些基因产物而可鉴定的编程性细胞死亡诱导试剂包括具有 多种化学性质的化合物。例如，这些基因产物的调节剂可以用如下物质的 文库筛选：多肽、β-转角模拟物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、类固醇、 芳香族化合物、杂环化合物、苯二氮类、寡聚N-取代的甘氨酸、寡聚氨 基甲酸酯、多肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、它们的衍生物、结 构类似物或者组合。
在一些实施方案中，编程性细胞死亡诱导试剂是多核苷酸。例如，该 编程性细胞死亡诱导试剂可以是靶向基因的抑制TRAIL-诱导的编程性细 胞死亡(例如，UbcH10或者图27的第一部分中所列的分子)的siRNA。在 一些实施方案中，编程性细胞死亡诱导试剂是小分子化合物(例如，分子量 小于1500道尔顿，在某些情况中，小于1000道尔顿的分子)。例如，编程 性细胞死亡诱导试剂可以是抑制基因产物的表达或者活性的小分子化合 物，其中所述基因产物抑制TRAIL-诱导的编程性细胞死亡(例如，UbcH10 或者图27的第一部分中所列的分子)。编程性细胞死亡诱导试剂还可以是 增强基因产物的表达或者活性的化合物，所述基因产物促进TRAIL-诱导 的编程性细胞死亡(例如，UbcH10或者图27的底部所列的分子)。筛选基 因及其所编码多肽的调节剂(包括所有小分子调节剂)的方法以及制备已知 基因的siRNA或者其他抑制性多核苷酸的方法是本领域中众所周知的。见， 例如，美国专利号6,573,099和6,506,559；Principles and Practice of HighThroughput Screening，K.Murray(编者)，CRC Press(2003)；High Throughput Screening：Methods and Protocols，W.Janzen(编者)，Humana Press(2002)；PCT公开WO 95/35503、WO 95/30642、和WO 91/18980； Schultz等人，BioorgMed Chem Lett 8：2409-2414，1998；和Weller等人， Mol Divers.3：61-70，1997。可以用于筛选这些基因和其产物的调节剂的其 他方法在例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，第三版(2000)；和Ausubel等人， Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York (1999)中公开。
在一些实施方案中，将编程性细胞死亡诱导试剂缀合到抗-DR4和抗 -DR5抗体激动剂。在其他实施方案中，未将编程性细胞死亡诱导试剂缀合 到抗-DR4和抗-DR5抗体激动剂。
在一些实施方案中，编程性细胞死亡诱导试剂不是TNF-α、TNF-β、 AIM I、AIM II、Fas配体或者VEGI。
1.SMAC
在一些实施方案中，编程性细胞死亡诱导试剂是SMAC/Diablo或者 SMAC模拟物或者激动剂。SMAC/Diablo通过结合编程性细胞死亡蛋白的 抑制物(IAPs)而促进caspase活性。见，例如，Du等人，Cell 102：33-42 (2000)；Verhagen等人，Cell 102：43-53，2000；美国专利申请号 2002/0110851。本发明包括施用或者在细胞中表达SMAC。也可以表达或 者施用SMAC片段，如SMAC的N-末端肽(例如，N-末端四肽或者七肽 (Guo等人，Blood 99(9)：3419-3426(2002)；Srinivasula等人，J.Biol.Chem. 275：36152-36157(2000))。也见，美国专利申请2002/0132786。
此外，根据本发明还可以使用SMAC模拟化合物。这些化合物可以具 有有用的药学性质并且与抗-DR4或者抗-DR5抗体一起施用同样更有效。 代表性SMAC模拟物包括例如这样的肽，所述肽包括结合IAP的BIR结 构域内的表面沟的四肽，所述四肽包括式X1X2X3X4的四肽，其中X1是A、 X2是V、T或者I，X3是P或者A，X4是F、Y、I或V，或者为PCT WO 02/26775中描述的其他SMAC肽、激动剂或者肽模拟物。其他代表性 SMAC模拟物包括LBP672。见，例如，图15和实施例54。
2.26S蛋白酶体抑制剂
在一些实施方案中，编程性细胞死亡诱导试剂是26S蛋白酶体抑制剂。 蛋白酶体抑制剂是抑制蛋白酶体-泛素途径，从而防止IкB降解和IкB的 配偶体NFкB的随后核定位的试剂。该蛋白酶体具有两种功能组分：20S 核心催化亚单位和19S调节亚单位。20S和19S亚单位形成26S复合体， 加入泛素后，该复合体降解被靶定而将被降解的蛋白质。代表性蛋白酶体 抑制剂包括，例如，PS-341(NSC号681239，也称作bortezomib)和其类似 物(见，例如，Adams，Cur.Opin.Chein Biol.6：493-500(2002))。PS341和 根据本发明方法可以使用的其他蛋白酶体抑制剂在美国专利号5,780,454 中描述，该专利被并入作为参考。
其它代表性蛋白酶体抑制剂包括，例如，lactacystin、PS-273(NSC号 681226)、PS-293(NSC号681227)、PS-296(NSC号681228)、PS-303(NSC 号681229)、PS-305(NSC号681231)、PS-313(NSC号681234)、PS-321(NSC 号681236)、PS-334(NSC号681237)、PS-364(NSC号681242)、PS-325(NSC 号683086)、PS-352(NSC号683094)、PS-383(NSC号683098)，YU101 (ac-hFLFL-环氧化物)(见，例如Elofsson，等人，Chem.Biol.6：811-822 (1999))、MG262、MG132、MG115、PSI(蛋白酶体抑制剂N-苄氧基羰基 -Ile-Glu(O-叔丁基)-Ala-leucinal)。用于鉴定蛋白酶体抑制剂的鉴定法可通 过商业途径从例如，Discoverx(Fremont，CA)得到。
尽管26S蛋白酶体抑制剂与DR4或者DR5激动剂(例如，本发明的抗 -DR4或者抗-DR5抗体)的组合可以是多种超增殖性失调的有效疗法，但是 该组合对于在Bax或者线粒体编程性细胞死亡途径的其他组分(例如， Bcl-x1或者Bcl-2)中有缺陷的癌细胞尤其有效。例如，结肠癌患者通常具 有Bax缺陷的肿瘤细胞。因此，与DR4或DR-5拮抗剂组合的蛋白酶体抑 制剂对于治疗与Bax或者其他线粒体编程性细胞死亡缺陷有关的结肠癌尤 其有效。
在一些实施方案中，蛋白酶体抑制剂是式I化合物或者其盐，
其中R1是未经取代或者经取代的芳基；芳烷基羰基，其中芳基部分未 经取代或者经取代；未经取代或者经取代的杂环基；或者杂环烷基羰基， 其中杂环基部分未经取代或者经取代；
R2是未经取代或者经取代的芳基或者未经取代或者经取代的杂芳基；
R3是氢、未经取代或者经取代的芳基或者烷基，其未经取代或者被未 经取代或者经取代的环烷基、未经取代或者经取代的芳基、或者含有至少 一个氮原子的未经取代或者经取代的杂芳基取代。
R4是式IA的部分，
其中A1和A2是羟基或者经取代的羟基，或者A1和A2一起与所结 合的硼原子和两个结合的氧原子形成式IA*的环，
其中W是亚烷基、经取代的亚烷基、未经取代的或者经取代的环亚烷 基、未经取代的或者经取代的二环亚烷基或者未经取代的或者经取代的三 环亚烷基；
R5是未经取代的或者经取代的烷基、未经取代的或者经取代的芳基、 未经取代的或者经取代的杂环基，或者未经取代的或者经取代的环烷基。
在式I的上下文中，所用的一般术语具有下面的意义：
芳基优选具有不超过20个碳原子，特别不超过12个碳原子的环系统， 优选为单-、二-或者三环，并且未经取代或者经取代，优选在每种情况中 为未经取代或者经取代的苯基或者(特别1-或2-)萘基，一种或多种取代基 优选独立地选自脂族基团；游离的、醚化或者酯化的羟基；游离或者酯化 的羧基；甲酰基；烷酰基；未经取代的、单取代或二取代的氨基；巯基； 硫代；烷硫基、氨甲酰基；N-烷基-氨甲酰基；N，N-二-烷基-氨甲酰基；苯 基；萘基；杂环基，特别是吡啶基；氰基和硝基，更优选地选自烷基，例 如，甲基、乙基或丙基；烷氧基，例如，甲氧基或乙氧基；二-取代的氨基， 例如，二甲氨基；卤素，例如，氯或溴；卤代烷基，例如，三氟甲基；和 苯基、(特别是1-或2-)-萘基，和杂环基，特别如下定义，特别是吡啶基， 例如，3-、4-、或特别是2-吡啶基，所述吡啶基每一个都是未经取代的或 者经一个或多个，特别高达3个取代基取代，所述取代基特别独立地选自 刚提到的其他芳基取代基。芳基R1更优选地为联苯基，特别是2-、4-或优 选地3-联苯基；吡啶基苯基，特别是4-、3-或最特别地2-吡啶基-(2-、4- 或优选3-)苯基，或者低级烷基-苯基，特别是丙基-苯基，如2-、4-或特别 是3-异丙基苯基。芳基烷基羰基R1(未经取代或者优选经取代的芳基)优选 为芳基-低级烷基羰基，其芳基如上定义，更优选地为苯基-低级烷氧基-苯 基-低级烷基羰基，特别是2-、4-或优选3-苄氧基-苯基-乙酰基或者-丙酰基； 吡啶基-低级烷氧基苯基-低级烷羰基，特别是2-，4-或者优选3-(吡啶-2-， -4-或者优选-3-)-乙酰基或者-丙酰基，或者苯基-低级烷基羰基，特别是苯 基-2-或者优选地2-苯基-丙酰基或者苯乙酰基，其中苯基未经取代或者被多 达三个取代基取代，所述取代基独立地选自低级烷氧基，特别是甲氧基， 卤素，特别是氟或氯，或者卤代低级烷基，如三氟甲基。未经取代或者经 取代的芳基R2或者(独立地)R3优选为单-、二-、或三取代的苯基，特别被 多达4个取代基取代，所述取代基独立地选自关于芳基所提到的取代基， 特别选自羟基、低级烷氧基(最优选的)，优选甲氧基、卤素，优选氯或氟， 和卤代低级烷基，优选三氟甲基，特别是苯基，其被多达三个低级烷氧基， 优选甲氧基取代基取代，或者对于R3未经取代的苯基，或者进一步未经取 代的或者经取代的萘基，特别1-或2-萘基，其未经取代或者被多达四个取 代基取代，所述取代基独立地选自关于芳基所提到的取代基，特别选自羟 基、低级烷氧基(最优选的)，优选甲氧基、卤素，优选氯或氟，和卤代低 级烷基，优选三氟甲基。
未经取代的杂环基优选为杂环基，其在结合环中是不饱和的、饱和的 或者部分饱和的，并且优选为单环或者更广义上为二环或者三环的环；具 有3到24个，更优选4到16个环原子；其中至少在结合式I的分子基团 的环中，相应芳基的一或多个，优选1到4个，特别是1到2个碳原子被 杂原子取代，该杂原子选自氮、氧和硫，结合环优选具有4到12，特别是 5到7个环原子；杂芳基未经取代或者被一个或多个，特别1到3个取代 基取代，所述取代基独立地选自上面定义为经取代芳基的取代基的取代基； 并且尤其为这样的杂芳基，其选自咪唑基、噻吩基、呋喃基、四氢呋喃基、 吡喃基、thianthrenyl、异苯并呋喃基、苯并呋喃基、色烯基、2H-吡咯基、 吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑烷基、苯并咪唑基、吡唑基、 吡唑烷基、pyranyol、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、吡啶基、 吡嗪基、嘧啶基、哌啶基、哌嗪基、哒嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、indolizinyl、 异氮茚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、三唑基、四唑基、嘌呤基、4H- 喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、 八氢异喹啉基、苯并呋喃基、苯并苯硫基、2，3-二氮杂萘基、萘啶基、喹喔 啉基、喹唑啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶 基、吖啶基、白啶基、菲咯啉基、furazanyl、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪 基、异色满基和苯并二氢吡喃基，这些基团的每一个都未经取代或者被一 个或多个基取代，所述基选自低级烷基、特别是甲基或者叔丁基、低级烷 氧基，特别是甲氧基，和卤素，特别是溴或氯；吡啶基，特别是2-或3-吡 啶基，或者尤其优选吲哚基，在更宽的方面，低级烷基-吡啶基、嘧啶基或 者低级烷基嘧啶基、卤代低级烷基吡啶基、低级烷氧基-吡啶基、二低级烷 基-吡啶基，或者卤代吡啶基。杂环基未经取代或者经一个或多个，优选多 达3个取代基取代，该取代基独立地选自上面关于芳基所提到的取代基(其 中作为杂环基的取代基的杂环基不携带除了吡啶基或者吲哚基之外的杂环 取代基)和选自如上定义的芳基，特别是苯基，特别所提到的优选的那些基 团。优选未经取代的杂环基。
在杂环烷基羰基R1中，杂环基部分优选为经取代或者特别如上提到的 未经取代的杂环基；优选经取代或者优选未经取代的杂环基-低级烷基，特 别被末端取代或者优选未经取代的杂环基，杂环基如上描述；优选吡啶基- 低级烷基羰基，如-乙酰基或-丙酰基。
作为R1，优选未经取代的或者经取代的芳基或者经取代的芳基-低级 烷基羰基。
杂芳基R2是如上提到的未经取代的或者经取代的杂芳基，特别是吲哚 基，其未经取代或者被一个或多个，特别多达3个取代基取代，所述取代 基独立地选自上面关于经取代的芳基所提到的，特别选自羟基、低级烷氧 基(最优选的)，优选甲氧基，卤素，特别是氟或氯，或者卤代低级烷基， 如三氟甲基。
R2优选为经取代的芳基。
脂肪族基团优选具有多达12个碳原子，优选多达7个碳原子，最优选 多达4个碳原子，并且是脂肪族烃基，如未经取代的或者经取代的炔基、 链烯基或者优选烷基，最优选低级烷基，特别是甲基、乙基、正丙基、异 丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或者叔丁基。
烷基可以是分枝的或者线性的，优选具有多达12个碳原子，更优选为 低级烷基。烷基R3优选为低级烷基，特别是异丁基。
前缀“低级”表示基团具有最多并且包括7个，优选最多并且包括4 个碳原子。
低级烷基优选为正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、 正戊基、异戊基、新戊基、正己基或正庚基，优选地异丁基、仲丁基、叔 丁基、异丙基、乙基或甲基、最优选地异丙基、乙基或甲基。
醚化的羟基为，例如，烷氧基，特别是低级烷氧基，如乙氧基或甲氧 基、芳氧基，特别是苯氧基，芳基-低级烷氧基，特别是苯基-低级烷氧基、 杂环氧基，特别是吡啶氧基，或者杂环基-低级烷氧基，特别是吡啶基-低 级烷氧基(优选具有上面给出的意义的芳基和杂环基)。
经酯化的羟基优选为通过有机羧酸，如链烷酸置换的羟基，例如，低 级链烷氧基。
经酯化的烷氧基为例如，烷氧羰基，特别是低级烷氧羰基，如甲氧羰 基。
单-或二-取代的氨基优选为N-烷氨基或者N，N-二烷氨基，特别是N- 低级烷氨基或者低级N，N-二-低级烷氨基，如N-甲氨基或者N，N-二甲氨基。
卤素为氟、氯、溴或碘，优选氟、氯或溴。
未经取代的或者经取代的环烷基优选具有多达12，更优选3到8个环 羰基原子并且优选被一或多个，特别多达3个取代基取代，所述取代基独 立地选自上面关于经取代的芳基所提到的那些取代基，或者优选地未经取 代。优选环戊基、环己基或者环庚基。
在用未经取代的或者经取代的环烷基取代的烷基R3中，烷基优选如上 面定义，更优选为低级烷基，特别是异丙基，并且(优选末端)被如上面定 义的环烷基取代。
在用未经取代或者经取代的芳基取代的烷基R3中，烷基优选如上一段 落中定义，芳基如上面定义并且被一个或多个，特别多达3个取代基取代， 所述取代基独立地选自关于经取代的芳基所提到的那些取代基，或者未经 取代；特别地，芳基为被一个或多个，特别是多达三个取代基取代的苯基， 所述取代基独立地选自卤素，特别是氟，羟基或者低级烷氧基，特别是甲 氧基，或者所述芳基是未经取代基的苯基。
在用未经取代的或者经取代的杂环基取代的烷基R3中，烷基优选如关 于用环烷基取代的烷基R3所定义的，杂环基如上面定义并且被一个或多 个，特别多达3个取代基取代，所述取代基独立地选自上面关于经取代的 杂环基所提及的取代基，或者杂环基未被取代。
如果A1和A2每一个都是经取代的羟基，那么经取代的羟基优选为烷 氧基，特别是低级烷氧基、芳氧基，该芳氧基特别具有如上面定义的未经 取代的或者经取代的芳基，或者环烷氧基，其具有如上面定义的未经取代 的或者经取代的环烷基。
如果A1和A2一起与结合的硼原子和氧原子形成环或者上述式IA*， 那么W优选携带两个氧原子，这两个氧原子结合到两个不同的碳原子上的 硼原子，这两个不同的碳原子是空间上邻近或者靠近的碳原子，特别在邻 位(“1，2-”)或者在“1，3”-位(相互间)。
亚烷基优选为未分枝的C2-C12-，优选C2-C7亚烷基部分，例如，亚乙 基，或者亚丙基，在更宽的方面，为亚丁基、亚戊基或者亚己基，该亚烷 基通过如上描述的两个不同的碳原子，优选在邻位或者“1，3”-位结合。 不结合到与硼原子结合的氧原子的碳原子中一个或者多个，特别是一个可 以被杂原子置换，该杂原子选自O、S或者优选N(分别携带所需数目的H原子)，例如，在1，5-(3-氮杂-戊二烯)中。
经取代的亚烷基优选为如上面定义的未分枝的低级亚烷基部分，其被 一个或多个，特别是多达三个取代基取代或者未经取代，所述取代基优选 独立地选自低级烷基，如甲基或乙基，例如，在1-甲基亚乙基、1，2-二甲 基亚乙基、羟基中，例如，在2-羟基-亚丙基，或者羟基-低级烷基，如羟 甲基中，例如，在1-羟甲基-亚乙基中。
未经取代的或者经取代的环亚烷基优选为C3-C12-，更优选C3-C8-环亚 烷基，其通过关于W描述的两个不同的碳原子，优选在邻位或者“1，3” -位结合，如环亚己基或者环亚戊基，其中不结合到与硼原子结合的氧原子 的碳原子中一个或者多个，特别是一个可以被杂原子置换，该杂原子选自 O、S或者N(分别携带所需数目的H原子)，例如在亚四氢呋喃基或者亚四 氢吡喃基中，并且所述碳原子可以不被取代或者被一个或多个，特别是多 达三个取代基取代，所述取代基独立地选自低级烷基，如甲基或乙基，羟 基，羟基-低级烷基，如甲氧基，或者单-或寡糖基，该单-或寡糖基通过氧 原子连结(“寡糖基”优选含有多达5个糖基部分)。
未经取代的或者经取代的二环亚烷基优选为C5-C12-二环亚烷基，其通 过关于W所描述的两个不同的碳原子结合，这两个碳原子优选在邻位或者 “1，3”-位，其中不结合到与硼原子结合的氧原子的碳原子中一个或者多个， 特别是一个可以被杂原子置换，该杂原子选自O、S或者N(分别携带所需 数目的H原子)，并且所述碳原子可以不被取代或者被一个或多个，特别 是多达三个取代基取代，所述取代基独立地选自低级烷基，如甲基或乙基， 羟基和羟基-低级烷基，如甲氧基。优选亚蒎烷(2，3-(2，6，6-三甲基-二环[3.1.1] 庚烷))。
未经取代的或者经取代的三环亚烷基优选为C8-C12-三环亚烷基，其通 过关于W所描述的两种不同的碳原子结合，所述碳原子优选在邻位或者 “1，3”-位，其中不结合到与硼原子结合的氧原子的碳原子中一个或者多个， 特别是一个可以被杂原子置换，该杂原子选自O、S或者N(分别携带所需 数目的H原子)，并且所述碳原子可以是未经取代的或者被被一个或多个， 特别是多达三个取代基取代，所述取代基独立地选自低级烷基，如甲基或 乙基，羟基和羟基-低级烷基，如甲氧基。
最优选地，R4为-B(OH)2或者2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环 [6.1.1.02，6]癸-4-基，特别是(1S，2S，6S，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环 [6.1.1.02，6]癸-4-基。
在未经取代或者经取代的烷基R5中，烷基可以是分枝的或者线性的， 优选具有多达12个碳原子，并且更优选为低级烷基。烷基R5优选为低级 烷基，特别是异丙基。可以存在一个或多个，特别多达2个取代基，所述 取代基可以独立地选自未经取代的或者经取代的芳基(特别是苯基或者羟 苯基)、未经取代的或者经取代的杂环基(特别是咪唑基或吲哚基)、未经取 代的或者经取代的环烷基，这些基团每一个都如上面定义；羟基(优选的)、 烷氧基(优选的)、氨甲酰基、巯基、低级烷硫基例如甲硫基、苯基、羟苯 基、吲哚基、咪唑基、氨基、三-低级烷氨基例如三甲氨基、低级烷酰氨基 例如乙酰氨基、胍基、N-低级烷基胍基例如N-甲基胍基，或者完成含有 R5的氨基酸的任何其他取代基。优选地，R5可以是甲基、异丙基、异丁基、 仲丁基、巯甲基、2-甲硫基-乙基、苯甲基、羟苯甲基、吲哚-3-基甲基、羟 甲基、1-羟乙基、2-羟乙基、氨甲酰甲基、2-氨甲酰乙基、4-氨丁基、3-胍 基丙基、5-咪唑基甲基、羧基甲基或2-羧基乙基。
式I化合物中存在的不对称碳原子可以以(R)、(S)或(R，S)构型存在， 优选以(R)或(S)构型，最优选以下面的式I*中指出的构型存在。在双键或 者环上的取代基可以以顺式-(＝Z-)或者反式(＝E-)形式存在。从而化合物可 以作为异构体的混合物或者优选作为纯的异构体存在。
式I的化合物中的盐形成基团是具有碱性或者酸性性质的基团。具有 至少一个碱性基团或者至少一个碱性基例如氨基、不形成肽键或者吡啶基 的仲氨基的化合物可以与酸形成酸加成盐，所述的酸为例如无机酸，如盐 酸、硫酸或者磷酸，或者与适宜的有机羧酸或者磺酸，例如，脂肪族单- 或二-羧酸，如三氟乙酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、 羟基马来酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸或者草酸，或者氨基酸，如精氨酸 或者赖氨酸、芳香族羧酸，如苯甲酸、2-苯氧基-苯甲酸、2-乙酰氧基-苯甲 酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、芳香族-脂肪酸羧酸，如扁桃酸或肉桂酸，杂 芳香族羧酸，如烟酸或者异烟酸、脂肪族磺酸，如甲磺酸、乙磺酸或者2- 羟基乙磺酸，或者芳香族磺酸，例如，苯磺酸、对-甲苯磺酸或者萘-2-磺酸。 当存在几个碱性基团时，可以形成单-或多-酸加成盐。
具有酸性基团，例如，游离的硼酸基团(-B(OH)2，即，在式IA*中， A1和A2每个都是羟基)或羧基的式I化合物可以形成金属盐或者铵盐，如 碱金属或者碱土金属盐，例如，钠、钾、镁或者钙盐，或者与氨或者适宜 的有机胺，如叔单胺，例如，三乙胺或者三-(2-羟乙基)-胺，或者杂环碱， 例如，N-乙基-哌啶或者N，N’-二甲基哌嗪形成铵盐。盐的混合物是可能的。
具有酸性或者碱性基团的式I化合物可以形成内盐。
代表性式I化合物包括这样的化合物或者其盐，其中
R1为经取代的芳基-低级烷羰基或者未经取代的或者经取代的芳基，
R2为经取代的芳基或者未经取代的或者经取代的杂环基，
R3为低级烷基，未经取代的或者经取代的芳基或者低级烷基，其被未 经取代的或者经取代的芳基取代，
R4是上面给出的式IA的部分，其中A1和A2是羟基、低级烷氧基、 具有未经取代的或者经取代的芳基的芳氧基或者具有未经取代的或者经取 代的环烷基的环烷氧基，或者其中A1和A2一起与结合的硼原子和两个结 合氧原子形成上面给出的式IA*的环，其中W是未经取代的或者经取代的 低级亚烷基，其通过两个不同的碳原子结合，这两个碳原子是空间上邻近 或者邻位的，特别是邻位的或者彼此在“1，3”-位，并且
R5为低级烷基。
代表性式I化合物包括这样的化合物或者其盐，其中
R1是苯氧基苯基-低级烷羰基；苯基-低级烷氧基苯基-低级烷羰基；吡 啶氧基苯基-低级烷羰基；苯基-低级烷羰基，其被低级烷氧基，特别是甲 氧基、卤素，特别是氟或氯，或者卤代低级烷基，特别是三氟甲基取代； 或者优选地未经取代或者经取代的苯基或萘基，其中在这两种情况下，取 代基(如果存在)独立地为一种或多种，特别是一到三种取代基，所述取代 基选自低级烷基、羟基、低级烷氧基、低级烷酰氧基、羧基、低级烷氧基 羰基、甲酰基、低级烷酰基、氨基、N-低级烷氨基、N，N-二-低级烷氨基、 巯基、硫代、低级烷硫基、氨甲酰基、N-低级烷基-氨甲酰基；N，N-二-低 级烷基-氨甲酰基、苯基、萘基、吡啶基、氰基和硝基，更优选低级烷氧基， 特别是甲氧基或乙氧基；
R2是被一个或多个，特别是一到三个部分取代的苯基，所述部分独立 地选自羟基、低级烷氧基，特别是甲氧基，卤素，特别是氟或氯，和卤代 低级烷基，特别是三氟甲基；
R3是低级烷基，特别是异丁基、苯基或被一个或多个，特别是多达三 个取代基取代的苯基，所述取代基独立地选自羟基、低级烷氧基，特别是 甲氧基，卤素，特别是氟或氯，和卤代低级烷基，特别是三氟甲基；
R4是-B(OH)2(特别优选)或者2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环 [6.1.1.02，6]癸-4-基，特别是(1S，2S，6S，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环 [6.1.1.02，6]癸-4-基；
R5是低级烷基，特别是异丙基。
代表性式I化合物包括这样的化合物及其盐，其中
R1是苯氧基苯基乙酰基、苄氧基苯基乙酰基、吡啶氧基苯基乙酰基、 联苯基、吡啶基苯基、低级烷基苯基或者经取代的苯基丙酰基氧基，其中 苯基取代基多达三个取代基，这些取代基独立地选自甲氧基、氟、氯和三 氟甲基；
R2是用多达单个甲氧基取代基取代的苯基，特别是2，3，4-三甲氧基苯 基或者3，4，5-三甲氧基苯基；
R3是异丁基或者苯基，其未被取代或者被多达三个部分取代，所述部 分独立地选自羟基、氟和甲氧基；
R4是(1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4- 基，或者特别是-B(OH)2；且
R5是异丙基。
式I的代表性化合物包括这样的化合物和其盐，其中
R1是联苯基、低级烷基-苯基、苯基-低级烷基-羰基、苯氧基-苯基-低 级烷基-羰基、苯基-低级烷氧基-苯基-低级烷基-羰基或者吡啶基-苯基；
R2是被1到3个低级烷氧基取代的苯基或者为苯基-低级烷氧基-苯基；
R3是低级烷基或者苯基-低级烷基；
R4是4，4，5，5-四甲基-[1，3，3]二噁硼-2-基；(1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基 -3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基或者-B(OH)2；且
R5是低级烷基。
其他代表性式I化合物或者其盐包括这样的化合物，其中其立体化学 在式I*中描绘
其中所示的构型代表绝对构型并且其中R1、R2、R3、R4和R5具有关 于式I化合物所定义的含义，特别上文中描述的优选的含义。
其他代表性式I化合物或者其盐包括这样的化合物，其中其立体化学 在式I**中描绘
其中所示的构型代表绝对构型并且其中R1、R2、R3、R4和R5具有关 于式I化合物所定义的含义，特别上文中描述的优选的含义。
其他代表性式I化合物或者其盐(包括非对映异构体的混合物)包括这 样的化合物，其中其立体化学在式I***中描绘
其中所示的构型代表绝对构型并且其中R1、R2、R3、R4和R5具有关 于式I化合物所定义的含义，特别上文中描述的优选的含义。
最特别优选的是实施例中描绘的式I化合物，或者其可药用盐。
按照公知的方法制备式I化合物或者其盐。这些方法优选包括
a)将式II的二肽类似物，
其中R3、R4和R5具有式I中给出的含义，与式III的氨基酸，
或者其反应性衍生物反应，其中R1和R2具有式I中的含义，如果必要， 除了参与反应的基团之外，式II和/或III的化合物中存在的官能团被容易 除去的保护基团保护，并且除去存在的任一保护基团，或者
b)对于产生式I化合物，其中R1为芳基烷基羰基或者杂环基烷基羰基， 并且其他部分R2到R5具有式I中给出的含义，将式IV的氨基化合物
其中R2、R3、R4和R5具有式I中给出的含义，与式V的碳酸，
或者其反应性衍生物反应，其中R1为芳基烷基羰基或者杂环基烷基羰基，
如果必要，除了参与反应的基团之外，式IV和/或v的化合物中存在 的官能团被容易除去的保护基团保护，并且除去存在的任一保护基团。
并且，如果希望，可以将通过方法a)或者b)得到的式I化合物转化成 式I的另一种化合物，将所得的式I的游离化合物转化成盐，将式I化合 物的所得盐转化成另一种盐或者其游离形式，和/或将式I的异构化合物的 混合物分开成各自异构体。
使用具有适宜构象的离析物可以制备式I化合物的不同可能的立体异 构体。例如，通过下面的方法可以制备式I*的化合物或者其盐：
a)将式II*的二肽类似物，
其中R3、R4和R5具有式I中给出的含义，与式III*的氨基酸，
或者其反应性衍生物反应，其中R1和R2具有式I中的含义，
如果必要，除了参与反应的基团之外，式II*和/或III*的化合物中存 在的官能团被容易除去的保护基团保护，并且除去存在的任一保护基团， 或者
b)对于产生式I*化合物，其中R1为芳基烷基羰基或者杂环基烷基羰 基，并且其他部分R2到R5具有式I中给出的含义，将式IV*的氨基化合 物
其中R2、R3、R4和R5具有式I中给出的含义，与式V的碳酸，
或者其反应性衍生物反应，其中R1为芳基烷基羰基或者杂环基烷基羰基， 如果必要，除了参与反应的基团之外，式IV*和/或V的化合物中存在的官 能团被容易除去的保护基团保护，并且除去存在的任一保护基团。并且， 如果希望，可以将通过方法a)或者b)得到的式I*化合物转化成式I*的另一 种化合物，将所得的式I*的游离化合物转化成盐，将式I*化合物的所得盐 转化成另一种盐或者其游离形式。
式I的终产物可以含有取代基，所述取代基还可用作起始材料中的保 护基以制备式I的其他终产物，例如，对于R4不同于-B(OH)2的情况。从 而，在本文的范围内，除非上下文另外指出，不是式I的特定目的终产物 的成分的、容易除去的基团被指定为“保护基”。
通过这些保护基保护官能团、保护基团自身、和它们的断裂反应在例 如标准参考文献，如J.F.W.McOmie，″Protective Groups in Organic Chemistry″，Plenum Press，London和New York 1973，T.W.Greene和P.G. M.Wuts，″Protective Groups in Organic Synthesis″，第三版，Wiley，New York 1999，″The Peptides″；卷3(编者：E.Gross和J. Meienhofer)，Academic Press，London和New York 1981，″Methoden der organischen Chemie″(有机化学方法)，Houben Weyl，第四版，卷15/I，Georg Thieme Verlag，Stuttgart 1974，H.-D.Jakubke 和 H.Jescheit，″Aminosauren，Peptide，Proteine″(氨基酸、肽和蛋白质)，Verlag Chemie，Weinheim，Deerfield Beach，和Basel 1982，以及 JochenLehmann，″Chemie der Kohlenhydrate：Monosaccharide und Derivate″(糖化学：单糖和衍生物)，Georg Thieme Verlag，Stuttgart 1974中 描述。
保护基的特征是它们可以例如通过溶剂分解、还原、光分解或者备选 地在生理条件下(例如，通过酶切割)容易地(即，没有发生不希望的副反应) 除去。
优选用酸，例如，氯化氢，在适宜的溶剂，例如，低级烷醇，如甲醇， 或者低级链烷，如己烷，或者它们的混合物，0到50℃的温度下，例如， 在室温下除去-B(OH)2-基团的保护基团(为了得到其中R4是-B(OH)2)的式I 化合物。
至少可以用两种方法合成式I的蛋白酶体抑制剂。在方法“a”中，通 过下面的方法实施反应：将式II和III的化合物溶于适宜的溶剂，例如， N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、二氯甲烷， 或者这些溶剂的两种或多种的混合物，并加入适宜的碱，例如，三乙胺、 二异丙基乙胺(DIEA)或者N-甲基吗啉和适宜的偶联剂，该偶联剂原位形成 式III碳酸的优选反应性衍生物，该偶联剂为例如二环己基碳二亚胺/1-羟 基苯并三唑(DCC/HOBT)；O-(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)-N，N，N’，N’-四甲 基四氟硼酸铀(TPTU)；O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基四氟硼酸铀 (TBTU)；或者1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(EDC)。关于其 他可能的偶联剂的综述，见例如，Klauser；Bodansky，Synthesis 1972，453-463。优选将反应混合物在约-20到50℃，特别约0℃到室温的温 度下搅拌以产生式I的化合物。优选在惰性气体，例如，氮气或氩气中实 施反应。
在方法“b”中，优选在类似于关于a)所描述的条件下实施反应。
可以以自身已知的方式制备具有盐-形成基团的式I化合物的盐。从而， 通过用酸或者用适宜的阴离子交换试剂处理可以得到式I化合物的酸加成 盐。
例如通过用适宜的碱性试剂，例如，用碱金属碳酸盐、碳酸氢盐，或 者氢氧化物，通常碳酸钾或者氢氧化钠处理可以将盐转化成游离的化合物。
通过适宜的分离方法可以以本身已知的方式将立体异构体混合物例如 非对映异构体的混合物分离成它们的相应异构体。例如，通过分级结晶、 层析、溶剂分配和类似的方法可以将非对映异构体混合物分离成它们各自 的非对映异构体。该分离可以在起始化合物之一的水平上或者在式I化合 物本身中进行。通过形成对映异构体盐，例如通过用对映异构体-纯的手性 酸形成盐，或者通过层析，例如，通过HPLC，使用具有手性配体的层析 底物可以分离对映异构体。
根据标准方法，例如，使用异丁基-硼酸(i-BuB(OH)2，在水/甲醇/己烷 混合物中酸特别是氢卤酸存在下，优选在0到50℃的温度，例如，室温下， 可以将其中R4不为-B(OH)2的式I化合物转化成其中R4为-B(OH)2的式 I化合物。
在方法a)和b)中，除非在本方法的描述中另外说明，为了转化或者合 成中间物或者起始材料，可以从中选择用于所述反应的溶剂，包括例如水； 酯，通常的低级烷基-低级链烷酸酯，例如，乙酸二乙酯；醚，通常为脂肪 族醚，例如二乙醚，或者环醚，例如，四氢呋喃；液态芳烃，通常为苯或 者甲苯；醇类，通常为甲醇、乙醇或者1-或2-丙醇；腈，通常为乙腈；卤 代烃，通常为二氯甲烷；酰胺，通常为二甲基甲酰胺；碱，通常为杂环氮 碱，例如，吡啶；羧酸，通常为链烷羧酸，例如，乙酸；羧酸酐，通常为 低级链烷酸酸酐，例如乙酸酐；环状、线性或者分枝的烃，通常为环己烷、 己烷，或者异戊烷，或者这些溶剂的混合物，例如，水性溶剂。这些溶剂 混合物可用于例如，通过层析或者分配的处理中。
新的起始材料和/或中间物，以及它们的制备方法同样是本发明的主 题。在优选实施方案中，使用这些起始材料并选择反应条件以允许生产优 选的化合物。
式II-V的起始材料或者它们的前体是公知的，可以根据公知的方法制 备，或者是通过商业途径可得到的；具体地，使用与实施例中描述的方法 相同或者类似的方法可以制备式II-V的起始材料或者它们的前体。
例如，通过下面的反应可以得到式II的化合物，其中取代基如上面对 式I所定义的：
首先，式VI的氨基酸的硼酸类似物或者其酸加成盐，特别是与三氟 乙酸形成的盐
其包含例如式VI*中指出的构型
其中R3具有上面对式I的化合物所给出的含义，R4具有不同于上面 对式I所提到的-B(OH)2的含义，特别是为(1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5- 二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基，
与式VII的氨基酸缩合，
其中式VII的氨基酸含有例如在式VII*中指出的构型，
或者与式VII的氨基酸的反应性衍生物缩合，其中R5具有上面对于式I的 化合物所给出的含义，Pr1为受保护的氨基，优选叔丁氧基羰基氨基，反应 条件为类似于对反应a)所描述的那些反应条件(也是缩合条件，也优选原位 形成活性碳酸衍生物)，从而产生N-保护形式的式II化合物，然后例如， 使用上面提到的标准教科书中描述的条件将所述式II化合物N-去保护，对 于叔-丁氧基羰基氨基，例如，使用适宜的溶剂例如二噁烷和/或二氯甲烷 中的氢氯酸，得到式II的化合物，其可直接用于方法a)中。
式VI的硼酸是公知的，通过商业途径可得到的和/或可以根据公知的 方法合成的。例如，式VI化合物，其中R3为低级烷基，特别是异丁基， R4为对式VI的化合物所描述的，优选(1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二 噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基的化合物可以通过下面的方法制备：通过将 式VIII的化合物：
其中R4具有上面描述的含义，在适宜的溶剂例如二氯甲烷中与正低级 烷基锂，特别是正丁基锂反应，随后与氯化锌反应，产生式IX的化合物，
其中R4具有上面式VI所给出的含义。然后将该化合物与LiN(SiCH3)2反应，然后将所得的化合物在三氟乙酸的存在下反应，得到式X的盐，
其中R4具有式VI下所给出的含义，其是式VI的化合物并且可以直 接用于与上述式VII的化合物反应。
式III的化合物是公知的、通过商业途径可得到的和/或根据标准方法 可以得到的。
例如，通过下面的方法可以制备这样的式III化合物，其中R1是芳基， 特别是联苯基，可将式XI的化合物
其中式XI的化合物包含例如式XI*中所指出的构型
其中，R2具有为式I的化合物所给出的含义，该化合物是公知的、通 过商业途径可得到的或者根据标准方法可以得到的，
与式XII的化合物反应，
R1-X (XII)
其中R1是芳基，X是卤素，特别为溴，该反应在适宜的溶剂例如二甲 基甲酰胺中，在碱，特别是碱金属碳酸盐，例如，碳酸钾的存在下，50℃ 到100℃，例如，90℃温度下，优选在惰性气体，例如，氮气或者氩气中 进行。该反应直接产生了式III的相应化合物。
式VII的氨基酸衍生物是公知的、通过商业途径可得到的或者根据标 准方法可以得到的。它们优选以氨基受保护的形式使用，例如，使用叔- 丁氧基羰基氨基代替游离的氨基。
式IV的化合物可以例如通过将含有方法a)中定义的式II*中指出的构 型的式II化合物与式XIII的N-受保护的氨基酸或者其反应性衍生物反应，
其中式III的N-受保护的氨基酸含有例如式XIII*中指出的构型，
其中R2如式I中定义，Pr2是受保护的氨基，特别是叔丁氧基羰基氨 基，反应条件为如方法a)中描述的优选的缩合反应条件。所得化合物为式 IV化合物，其中N-末端氨基以受保护的形式存在，然后除去N-末端保护 基团，例如，对于叔丁氧基羰基氨基，使用于二噁烷中的氯化氢。
在其他实施方案中，编程性细胞死亡诱导试剂是来自2，4-二氨基-3-羟 基羧酸家族化合物的蛋白酶体抑制剂。见，PCT WO 00/64863。例如，在 一些实施方案中，该蛋白酶体抑制剂是式XIV的2，4-二氨基-3-羟基羧酸，
其中
A和B独立地代表键或者未经取代的或者经取代的氨酰基部分；
R1代表氢、氨基保护基，或者式R5Y-的基团，其中
R5代表氢或者未经取代或者经取代的烷基、链烯基、链炔基、芳基、 芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环基或者杂环基烷基；
Y代表-CO-、-NH-CO-、-NH-CS-、-SO2-、-O-CO-、或者-O-CS-；
R2代表天然氨基酸的侧链；烷基、芳基烷基、杂芳基烷基或者环烷基 烷基；或者三甲硅烷基甲基、2-噻吩基甲基或者苯乙烯基甲基；
R3代表卤素、烷基、烷氧基或者羟基烷氧基；
R4代表2(R)-羟基茚满-1(S)-基；(S)-2-羟基-1-苯乙基；或者2-羟基-苯 甲基，其在4位未经取代或者被甲氧基取代；其中2，4-二氨基-3-羟基羧酸 为游离形式，为其可药用盐或者在药物组合物中。
未经取代的或者经取代的烷基优选为1到5个碳原子，优选1到4个 碳原子的烷基，例如，甲基、乙基、异丙基或者叔丁基；其特别为1或者 4个碳原子。取代基为例如苯氧基、羟基或者未受保护或者受保护的氨基。
未经取代的或者经取代的芳基烷基为例如，总共7到10个碳原子的苯 基烷基，如苯甲基或者2-苯基乙基。该芳基烷基未被取代或者在芳基或者 烷基部分被例如羟基取代，如在苯甲基-CH(OH)-或者苯基-CH(CH2OH)- 中，或者被烷基、氨基或者烷基氨基取代；或者例如在亚烷基部分中为1 到4个碳原子的萘基烷基，特别是萘基甲基。
氨基保护基团优选为苄氧基羰基、环烷基烷氧基羰基，特别是环己基 甲氧基羰基，或者叔丁氧基羰基。未经取代的或者经取代的杂芳基烷基优 选为吡啶基烷基，特别是2-吡啶基甲基和4-吡啶基甲基。
芳基、杂芳基以及芳基烷基和杂芳基烷基的芳基部分可以是单环或者 多环的，如吡啶基、萘基、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)或者苯并咪唑基。芳 基烷基或者杂芳基烷基的亚烷基部分可以被例如羟基取代。
杂环基以及杂环基烷基的杂环基部分可以是饱和的杂环基团，其具有 选自氮、氧和硫的一个或多个杂原子。杂环基以及杂环基烷基的杂环基部 分优选具有5或6个环组成原子，优选多达3个杂原子。
环烷基烷基优选为环己基烷基；其优选在亚烷基部分有1到4个碳原 子。
卤素为氟、氯、溴或碘，优选氯或溴。
烷基和烷氧基优选为1到4个碳原子，特别1或2个碳原子，更特别 为甲基或者甲氧基。
羟基烷氧基优选为2到4个碳原子的ω-羟基烷氧基，特别是2-羟基乙 氧基。
盐为例如酸加成盐如盐酸盐。
式I的化合物具有几个手性中心并且因此可以以多种立体异构体存 在。除非另外说明，本发明提供了所有立体异构体以及外消旋混合物。通 过常规技术，例如层析，可以拆分或者分离异构体。如从式I看来，2位 中碳原子的构型为R，在3和4位碳原子的构型为S。
R1优选为氢、吡啶基烷氧基羰基、萘基烷氧基羰基、萘基烷基羰基、 苯甲基-CH(OH)-羰基、苯氧基甲基羰基、苯基烷基羰基或者氨基保护基团， 如叔丁氧基羰基、环烷基烷氧基羰基，特别是环己基甲氧基羰基，或者苄 氧基羰基，其未经取代或者被烷基或者氨基取代；R1特别为萘基甲氧基羰 基、萘基甲基羰基、吡啶基甲氧基羰基、苯基丙酰基、氨基苯基丙酰基、 叔丁氧基羰基、氨基苄氧基羰基、烷基苄氧基羰基、二烷基苄氧基羰基或 者苄氧基羰基，甚至更优选地苄氧基羰基。
当A是未经取代的或者经取代的氨酰基部分时，其优选为未经取代的 或者经取代的α-氨酰基部分，如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、 缬氨酸、叔丁基甘氨酸、叔亮氨酸或者组氨酸。A优选为天然α-氨基酸、 优选蛋白质的正常组成部分的氨基酸、或者叔亮氨酸的受保护的或者未受 保护的部分。其优选具有L-构型。A特别为甘氨酸、L-缬氨酸、L-叔-亮氨 酸或者键，甚至更优选L-叔亮氨酸。
R2优选为天然氨基酸，优选α-氨基酸，优选蛋白质的正常组成部分 的氨基酸的侧链。R2为例如，异丙基、氨基羰基甲基、甲基、1-甲基丙基、 苄基、4-羟基苄基或者异丁基，优选苄基。
当B是未取代或者取代的氨酰基部分时，其优选为未受取代或者受取 代的α-氨酰基部分，如苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸或 天冬酰胺。B优选为天然α-氨基酸，优选蛋白质的正常组成部分的氨基酸 的未受取代或者受取代的部分。具有另一羧基基团的α-氨基酸，例如，谷 氨酸，优选经C1-C3醇，特别是甲醇酯化。所述α-氨基酸优选具有L-构 型。B特别为L-缬氨酸、L-谷氨酸甲基酯或者键，甚至更优选L-缬氨酸。
R3优选为卤素、甲基或者甲氧基，特别是甲氧基。
R4优选为如上定义的未受取代的或者受取代的2(R)-羟基茚满-1(S)-基 或者2-羟基苄基，特别是2-羟基-4-甲氧基-苄基。
Y优选为-CO-或者-O-CO-，特别是-O-CO-。
R5优选为未经取代的或者经取代的烷基、芳基烷基或者杂芳基烷基， 特别是烷基；当R5是未受取代的或者受取代的杂芳基烷基时，它优选为吡 啶基烷基，特别是2-吡啶基甲基；当R5是未受取代的或者受取代的芳基烷 基时，它优选为苄基-CH(OH)-；当R5是受取代的烷基时，它优选为苯氧 基甲基。
在一些实施方案中，蛋白酶体抑制剂是2-氨基-3-羟基-4-叔-亮氨酰-氨 基-5-苯基-戊酸酰胺衍生物。见，例如，PCT 01/89282。
例如，在一些实施方案中，本发明的蛋白酶体抑制剂涉及式XV的化 合物或者其盐
其中n为0或1；
R1和R2相互独立地为脂肪族基团，或者芳族、芳族-脂肪族、环脂肪 族、环脂肪族-脂肪族、杂环或者杂环-脂肪族基团，每种基团不超过20个 碳原子；
R3为氢、噁-烷基、脂肪族基团或者式-(Y)m-R6的多达20个碳原子 的基团，其中Y为烷基，m为0或者1，R6为未经取代的或者经取代的单 环基团，其具有5个或6个环原子，含有选自氮、氧和硫的多达3个杂原 子，其中所述单环基团可以与苯并环稠合；
R4和R5独立地选自氢；脂肪族基团；游离的、醚化或者酯化羟基； 游离的或者酯化的羧基；甲酰基；烷醇；未经取代的、单-或者二-取代的 氨基；巯基、硫代、烷硫基、氨甲酰基、N-烷基-氨甲酰基、N，N-二烷基- 氨甲酰基；氰基和硝基；其中含碳基R4和R5具有多达12个碳原子，条件 是如果n为1，R1为苄基或者叔丁基，R2为苄基或者4-甲氧基-苄基，R3为异丙基并且X为氧，那么R4和R5不都是氢，并且如果n为0或1，R2为4-甲氧基-苄基，R3为氢并且X为氧，那么R4不为甲氧基；
X为氮、氧或者硫。
在2-氨基-3-羟基-4-叔-亮氨酰-氨基-5-苯基-戊酸酰胺衍生物的上下文 内，此前和此后所用的通用术语优选具有下面的含义：n为0或者1，优选 0。
脂肪族基团具有多达12个碳原子，优选多达7个碳原子，最优选多达 4个碳原子，并且为未经取代或者经取代的脂肪族烃基，也就是说未经取 代的或者经取代的炔基、链烯基或者优选烷基，一种或多种取代基优选独 立地选自游离的、醚化的或者酯化羟基；游离的或者酯化羧基、甲酰基、 烷醇；未经取代的、单-或者二-取代的氨基、胍基、巯基、硫代、烷硫基、 氨甲酰基、N-烷基-氨甲酰基、N，N-二烷基-氨甲酰基；氰基和硝基。
脂肪族基团R1优选为低级烷基，如特别是叔丁基。
脂肪族基团R3优选为未经取代的低级烷基或者被羟基、羧基、氨基、 氨甲酰基、胍基、巯基或者烷硫基取代的低级烷基，最优选为丙氨酸、亮 氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷 氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸的侧链，特别是缬氨酸的侧 链。
脂肪族基团R4优选为甲氧基。
芳香族基团R1或R2具有不超过20个碳原子，特别不超过12个碳原 子，并且为未经取代的或者经取代的，优选在每种情况中为未经取代的或 者经取代的苯基或萘基，特别是1-萘基，一种或多种取代基优选独立地选 自脂肪族基团；游离、醚化的或者酯化的羟基；游离的或者经酯化的羧基； 甲酰基；烷醇；未经取代的、单-或者二-取代的氨基；巯基、硫代、烷硫 基、氨甲酰基、N-烷基-氨甲酰基、N，N-二烷基-氨甲酰基；氰基和硝基， 更优选地选自烷基，例如，甲基、乙基或丙基；烷氧基，例如，甲氧基或 乙氧基；二-取代的氨基，例如，二甲基氨基；卤素，例如氯或溴；和卤代 烷基，例如，三氟甲基。
在具有不超过20个碳原子的芳香族-脂肪族基团R1或R2中，芳香族 部分为如上定义并且脂肪族部分优选为低级烷基，如特别是C1-C2烷基， 其优选被关于芳香族基团所定义的取代或者优选未被取代。芳香族-脂肪族 基团R1优选为苄基或者萘-1-基甲基。芳香族-脂肪族基团R2优选为苄基， 其在苯部分被1-5个，优选1-3个甲氧基取代；或者苄基，其在苯部分， 优选在4位被二甲基-氨基取代；或者为萘-1-基甲基。最优选地，芳香族- 脂肪族基团R2为2，3，4-或3，4，5-三甲氧基-苄基。
环脂肪族基团R1或R2具有多达20个，特别多达10个碳原子，为单- 或多环的，并且优选为关于芳香族基团所定义的被取代或者优选未受取代， 例如，是这种环烷基，特别是这种5-或6-元环烷基，如优选环己基。
在具有不超过20个碳原子的环脂肪族-脂肪族基团R1或R2中，环脂 肪族部分如上面定义并且脂肪族部分优选为低级烷基，如特别为C1-C2烷 基，其优选为关于芳香族基团所定义的被取代或者优选未受取代，例如， 环己基-甲基。
杂环基R1或R2含有多达20个碳原子，通常多达12个碳原子，并且 为关于芳香族基团所定义的被取代或者未受取代并且优选为饱和的或者不 饱和单环基，其具有5到6个环成员和1到3个杂原子，所述杂原子选自 氮、氧和硫，R1或R2为例如噻吩基或者吡啶基，或者二-或三-环基团，其 中例如，苯基团稠合到所提及的单环基团，特别是例如，吲哚基，如5-吲 哚基，或者醌醇基(chinolyl)，如8-醌醇基。
在具有不超过20个碳原子的杂环-脂肪族基团R1或R2中，杂环部分 如上定义并且脂肪族部分优选为低级烷基，如特别是C1-C2烷基，其优选 为关于芳香族基团所定义的被取代或者优选未受取代。杂环-脂肪族基团 R1或R2为例如吲哚基-甲基，特别是5-吲哚基-甲基，或者醌醇基-甲基， 特别是8-醌醇基-甲基。
噁-烷基R3是式-G(O-CH2-CH2)t-R7的原子团，其中G和R7为烷基， 优选低级烷基，t为1到3，优选2，并且噁-烷基R3特别为2-(1，4-二噁- 己基)-乙基。
在具有多达20个碳原子的式-(Y)m-R6的基团中，Y为烷基，优选低级 烷基，m为0或1，基团R6为饱和的或者不饱和的单环基团，其具有5或 6环成员和多达3个杂原子，这些杂原子选自氮、氧和硫，并且备选地R6含有稠合苯环，这种基团优选为关于芳香族基团所定义的被取代或者优选 未受取代。
原子团R6优选通过环碳原子结合到Y并且为例如未受取代的或者受 取代的成员，其选自环戊基、环己基、环戊二烯基、苯基、吡咯烷基、吡 唑烷基、咪唑烷基、四氢呋喃基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吡咯基、吡 唑基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、茚 基、萘基、吲哚基和醌醇基。
最优选地，式-(Y)m-R6的基团为哌啶基，尤其4-哌啶基；哌嗪-乙基， 特别是哌嗪-1-基乙基；吗啉基-乙基，特别是吗啉-4-基乙基；吡啶-甲基， 如2-、3-或4-吡啶基-甲基，或者苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或组氨酸的侧 链。
X优选为氧(-O-)。
烷基优选为低级烷基。
前缀“低级”表示具有最多并且包括7，优选最多并且包括4个碳原 子的基团。
低级烷基为，例如，正丙基、异丁基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔 丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基或正庚基，优选地异丁基、仲丁 基、叔丁基、异丁基、乙基或甲基、最优选地异丁基、乙基或甲基。
醚化的羟基为例如烷氧基，特别是低级烷氧基，如乙氧基或者甲氧基。 酯化的羟基优选为通过有机羧酸如链烷酸，或者无机酸如氢卤酸酯化的羟 基，例如为低级烷酰氧基或者特别是卤素，如碘或者特别是氟、氯或者溴。
酯化的羧基为例如烷氧羰基，特别是低级烷氧羰基，如甲氧基羰基。
链烷醇为例如，烷基羰基，特别是低级烷基羰基，如乙酰基。
单-或二-取代的氨基为，例如，N-烷基氨基或者N，N-二烷基氨基，特 别是N-低级烷基氨基或者低级N，N-二-低级烷基氨基，如N-甲基氨基或者 N，N-二甲基氨基。
卤素为氟、氯、溴或碘，优选氟、氯或溴。
如上所示的式XV的结构指出绝对构型。
式XV的化合物中盐-形成基团是具有碱性或者酸性性质的基团。具有 至少一个碱基或者至少一个碱性基团，例如游离的氨基、吡嗪基或者吡啶 基的化合物可以形成酸加成盐，形成酸加成盐所用的酸为无机酸，如氢氯 酸、硫酸或磷酸，或者适宜的有机羧酸或者磺酸，例如脂肪族单-或二-羧 酸，如三氟乙酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、羟基 马来酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸或者草酸，或者氨基酸，如精氨酸或者 赖氨酸、芳香族羧酸，如苯甲酸、2-苯氧基-苯甲酸、2-乙酰氧基-苯甲酸、 水杨酸、4-氨基水杨酸、芳香族-脂肪酸羧酸，如扁桃酸或肉桂酸，杂芳香 族羧酸，如烟酸或者异烟酸，脂肪族磺酸，如甲磺酸、乙磺酸或者2-羟基 乙磺酸，或者芳香族磺酸，例如，苯磺酸、对-甲苯磺酸或者萘-2-磺酸。当 存在几个碱性基团时，可以形成单-或多-酸加成盐。
具有酸性基团，例如在基团Rio具有游离羧基的式XV的化合物可以 形成金属盐或者铵盐，如碱金属或者碱土金属盐，例如，钠、钾、镁或者 钙盐，或者与氨或者适宜的有机胺，如叔单胺，例如，三乙胺或者三-(2- 羟乙基)-胺，或者杂环碱，例如，N-乙基-哌啶或者N，N’-二甲基哌嗪形成 铵盐。
同时具有酸性和碱性基团的式XV化合物可以形成内盐。
为了分离和纯化的目的，以及对于用作中间物的化合物的情况，还可 能使用不可药用的盐。
然后，仅可药用、无毒盐用作治疗目的，并且因此这些盐是优选的。
由于游离形式的新化合物和它们的盐形式之间的密切关系，其中这些 盐包括可用作中间物，例如，用于该新化合物的纯化或者用于其鉴定的盐， 在适当和方便的时候，此前和此后任何谈及的游离化合物都应该理解为包 括相应的盐。
VII.施用和药物组合物
本发明的抗体和试剂可直接施用于哺乳动物受试者以治疗，例如，超 增殖性失调，包括癌症如，但不限于：癌、神经胶质瘤、间皮瘤、黑素瘤、 淋巴瘤、白血病、腺癌、乳癌、卵巢癌、宫颈癌、恶性胶质瘤、白血病、 淋巴瘤、前列腺癌、伯基特氏淋巴瘤、头脖癌、结肠癌、结肠直肠癌、非 小细胞肺癌、小细胞肺癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝胆管癌、胆囊癌、 小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、 宫颈癌、阴道癌、子宫癌、卵巢的癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、 胰腺内分泌癌、类癌瘤癌、骨癌、皮肤癌、成视网膜细胞瘤、多发性骨髓 瘤、何杰金氏淋巴瘤，和非何杰金氏淋巴瘤(关于其他癌，见CANCER： PRINCIPLES AND PRACTICE(DeVita，V.T.等人编著，1997))。
本发明组合物的施用是任一种用于将化学治疗化合物导入最终与所要 治疗的组织接触的途径。将抗体和试剂以任一种适宜的方式，任选与可药 用载体一起施用。施用这些抗体和试剂的适宜方法是可以得到的，且是本 领域技术人员众所周知的，并且，尽管可以用一种以上的途径施用特定组 合物，但是一种特定的途径通常可提供比另一途径更快和更有效的反应。
部分通过被施用的特定组合物，以及通过用于施用该组合物的特定方 法确定可药用载体。因此，有多种本发明的药物组合物适宜的制剂(见，例 如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，1985))。
可以将所述抗体和试剂单独或者与其他适宜的组分联合制备成气溶胶 制剂(即，它们可以被“喷雾”)以通过吸入施用。可以将气溶胶制剂置于 加压的可接受的推进剂，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等等中。
适于施用的制剂包括水性和非水性溶液、等渗无菌溶液，其可以含有 抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂等渗的溶质，适于施用的制剂还包 括水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定 剂和防腐剂。在本发明的实践中，例如，可以通过经口、局部、静脉内、 腹膜内、膀胱内或者鞘内施用组合物。任选地，该组合物经鼻施用。化合 物的制剂可以以单位剂量或者多剂量密闭容器，如安瓿或者小瓶中给出。 可以从无菌粉剂、粒剂和前面描述的片剂类型制备溶剂和悬浮剂。也可以 将调节剂作为所制备的食品或者药物的一部分施用。根据所希望的治疗或 者效果，本发明的化合物也可以与一种或多种其它的活性试剂(例如，化学 治疗剂)有效地联合使用。
在本发明上下文中，施用于患者的剂量应该足以随时间在受试者中实 现有益的应答。将通过所用的特定调节剂的功效和受试者的状况，以及体 重或者所要治疗的部位的表面积来确定剂量。通过伴随着在具体受试者中 施用特定化合物或者载体导致的不利副作用的存在、性质和程度确定剂量 的大小。通过单剂或者分开的剂量可以完成施用。
抗体激动剂和编程性细胞死亡诱导试剂可以一起在混合物中施用或者 每一种可以分开施用。抗体试剂和编程性细胞死亡诱导试剂可以，但是不 必同时施用。
VIII.编程性细胞死亡的抑制剂
如文中所描述，多种基因产物抑制(例如，图27第一部分中所列的分 子；和UbcH10)或者促进(例如，图27底部部分中所列的分子)TRAIL-诱 导的(和抗-DR4或抗-DR5诱导的)编程性细胞死亡。抑制TRAIL-诱导的编 程性细胞死亡的那些基因产物可以被抑制剂靶定以协同地增加TRAIL、抗 -DR4或抗-DR5抗体诱导的编程性细胞死亡。类似地，促进TRAIL-诱导 的编程性细胞死亡的那些基因产物可以被激活剂靶定以协同地增加 TRAIL、抗-DR4或抗-DR5抗体诱导的编程性细胞死亡。
备选地，当编程性细胞死亡为有害的情况下，抑制TRAIL-诱导的编 程性细胞死亡的基因产物的活化剂可以用于减小编程性细胞死亡。类似地， 当编程性细胞死亡为有害的情况下，促进TRAIL-诱导的编程性细胞死亡 的那些基因产物的抑制剂可用于减小编程性细胞死亡。一种该失调是血栓 性血小板减少性紫癜(TTP)(Kwaan，H.C.，Semin.Hemato.，24：71(1987)； Thompson等人，Blood，80：1890，(1992))。美国疾病控制中心(U.S.Centers for Disease Control)已经报导了不断增加的TTP-相关的死亡率(Torok等 人，Am.J.Hemato.50：84，1995)。
来自TTP患者(包括HIV+HIV-患者)的血浆诱导皮肤微血管来源但 不是大血管来源的人内皮细胞的编程性细胞死亡(Laurence等人， Blood，87：3245(1996))。从而认为TTP患者的血浆含有一种或多种直接或 间接诱导编程性细胞死亡的因子。如PCT申请WO 97/01633(这里引用作 为参考)中描述的，TRAIL存在于TTP患者的血清中，并且可以在诱导微 血管内皮细胞的编程性细胞死亡中起作用。
另一种血栓性微血管病是溶血性尿毒症综合征(HUS)(Moake，J. L.，Lancet，343：393(1994)；Melnyk等人，Arch.Intern.Med.155： 2077，(1995))。本发明的一个实施方案针对治疗通常称为“成年人HUS” 的病症(尽管其也可以侵袭儿童)。通常所说的儿童期/腹泻-相关的HUS的 失调与成年人HUS在病因上不同。
其他病症的特征是小血管的块凝。这些病症包括但不限于下面的：通 常认为在约5-10％儿科AIDS患者中看到的心脏问题与小血管块凝有关。 已经在多发性硬化症患者中报导了心脏中微血管系统的破坏。作为进一步 的实例，考虑了治疗系统性红斑狼疮(SLE)。
IX.预测使用抗-DR5激动剂的抗癌治疗功效
本发明人已经发现基因产物Myc的表达对于抗-DR5抗体诱导肿瘤细 胞的编程性细胞死亡的功效是必需但不充分的。因此，肿瘤细胞(例如，来 自生物活检)中Myc的表达提供了用于鉴定不可能应答DR5-靶定的疗法的 细胞(因此受试者)的标记。特别地，如果肿瘤细胞比野生型细胞表达更少 的Myc，那么DR-5靶定的治疗较不可能比其中Myc以野生型表达水平或 者更高水平的治疗更有效。从而，本发明提供了确定基于抗-DR5激动剂抗 体疗法功效的方法，该方法为通过从受试者得到肿瘤细胞样品并检测细胞 中Myc表达水平，其中低于Myc的野生型表达水平表明该疗法在杀死肿 瘤细胞中功效降低或者没有功效。
实施例
提供了下面的实施例以进一步阐明本发明，但不限制本发明的范围。 本发明的其他变通方案是本领域技术人员容易明白的并且为所附权利要求 书包括。
缩写：
abs.绝对的
i-BuB(OH)2异丁基硼酸
DIEA N-乙基二异丙基胺
DMF N，N-二甲基-甲酰胺
Equiv 当量
ES-MS 电喷雾质谱
EtOAc 乙酸乙酯
h 小时
HPLC 高效液相层析
MeOH 甲醇
min 分钟
m.p. 熔点
MPLC 中压液相层析
Rf 通过TLC在硅胶60F254(Merck，Darmstadt)上得到的前沿的 Rf比值
rt 室温
TBTU O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基四氟硼酸铀
TFA 三氟乙酸
TLC 薄层层析
tR 保留时间
如果不另外指出，以体积对体积(v/v)给出洗脱剂和其他溶剂混合物的 比值。
TLC的显色：
通过紫外照射不能检测的最终化合物或者中间物的TLC点通过使用 高锰酸钾染色溶液处理然后通过将板加热显色。
高锰酸钾染色溶液的组成：2.5g KMnO4(高锰酸钾)(Fluka，Buchs，瑞士) 溶于800ml H2O和200ml 1N H2SO4中。
分析性HPLC条件：
系统1
10分钟内线性梯度2-100％CH3CN(0.1％TFA)和H2O(0.1％TFA) +2分钟100％CH3CN(0.1％TFA)；在215nm检测，流速0.7mL/分钟， 25℃。柱：Nucleosil 120-3C18(125×3.0mm)。
系统2
7分钟内线性梯度20-100％CH3CN(0.1％TFA)和H2O(0.1％TFA) +2分钟100％CH3CN(0.1％TFA)；在215nm检测，流速1mL/分钟，30 ℃。柱：Nucleosil 100-3C18HD(125×4mm)。
系统3
7分钟内线性梯度20-100％CH3CN(0.1％TFA)和H2O(0.1％TFA) +2分钟100％CH3CN(0.1％TFA)；在215nm检测，流速1mL/分钟，30 ℃。柱：Nucleosil 100-3C8HD(125×4mm)。
合成方案1(实施例1和2)：
实施例1：(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酰氨 基]-3-甲基-N-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三 环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-丁酰胺
步骤A：在氩气下，将溶于二噁烷(5.7mL，22.77mMol，30当量)的HCl4N溶液加入{(S)-2-甲基-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二 噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯 (合成方案1中(A))(0.352g，0.759mMol)溶于纯CH2Cl2(5.5mL)的冷(0℃) 溶液中。让所得混合物升温到室温并搅拌10分钟。加入额外的4N HCl(1.9 mL，7.59mMol，10当量)。将反应混合物搅拌10分钟并浓缩得到粗盐酸 盐，其为黄色泡沫。
步骤B：氩气下，将纯DIEA(0.72mL，4.14mMol，5当量)逐滴(1.9mL/ 分钟)加入到所述粗盐酸盐(0.331g，0.828mMol)、(S)-2-(联苯-3-基氨 基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸(合成方案1中的(B))(0.518 g，0.994mMol，1.2当量)和TBTU(0.292g，0.910mMol，1.1当量)在纯 DMF(3.0mL)中的冷却(0℃)溶液。让所得混合物升温到室温，搅拌40分 钟并倒入到0℃水(45mL)上。通过真空过滤收集所得沉淀，将其在EtOAc中溶解并用H2O洗涤。将有机相干燥(Na2SO4)、过滤并浓缩。通过硅胶(25g) 柱层析(CH2Cl2/MeOH，90/10)纯化残渣得到标题化合物，其为黄色泡沫。
标题化合物：ES-MS：754.2[M+H]+；HPLC：单峰位于tR＝11.85分钟(系 统1)；Rf＝0.72(CH2Cl2/MeOH，90/10)。
如下制备起始材料：
(a)(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸(步骤B)
通过在氩气下将3-溴-联苯(1.47mL，8.54mMol，Aldrich 25，538-6)、 (S)-2-氨基-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸(3，4，5-OCH3-phe-OH) (3.27g，12.81mMol)、K2CO3(1.18g，8.54mMol)和CuI(163mg，0.854mMol) 在纯DMF(10.6mL)中的悬浮液在90℃加热24小时制备标题化合物。让所 得混合物冷却到室温，然后真空浓缩并通过MPLC(CH3CN/H2O/TFA)纯化 得到标题化合物。
标题化合物：ES-MS：408.2[M+H]+；HPLC：单峰位于tR＝8.86分钟(系 统1)。
(b)(S)-2-氨基-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸-(L-3，4，5-三甲氧基-苯 基)-丙氨酸)
根据文献的方法(E.M.Oltz，R.C.Bruening，M.J.Smith，K.Kustin和 K.Nakanishi，J.Am.Chem.1998，I10(18)，6162-6172)从通过商业途径可得 到的3，4，5-三甲氧基苯甲醛和N-乙酰基甘氨酸制备标题化合物。如文献(J.J. Nestor，Jr.，T.L.Ho，R.A.Simpson，B.L.Horner，G.H.Jones，G.I.McRae和 B.H.Vickery，J.Med.Chem.1982，25(7)，795-801；或O.D.Tyagi & P.M. Bollin Indian J.Chern.1992，851-854页)中描述的使用Alcalase(Novo Nordisk)通过酶催化的L-酯水解拆分外消旋N-乙酰基-3，4，5-三甲氧基-苯丙 氨酸甲酯。
标题化合物：[α]D20＝-18.9°(c＝1.025，H2O)；ES-MS：256.1[M+H]+； HPLC：单峰位于tR＝2.08分钟(系统2)。
(c){(S)-2-甲基-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二 噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯
如实施例1步骤B中描述的但使用(S)-3-甲基-1((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三 甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基铵三氟乙酸盐(合成方案1 中的(C))(关于制备，见Kettner，C.A.和Shenvi，A.B.J.Biol.Chem. 1984，259，15106-15114页和Matteson，D.S.和Sadhu，K.M.J.Ain.Chem. Soc.1981，103，5241-5242页)(2.395g，6.32mMol)、Boc-L-缬氨酸 (1.373g，6.32mMol)、TBTU(2.23g，6.95mMol，1.1当量)、DIEA(3.3 mL，18.95mMol，3.0当量)和DMF(24mL)制备标题化合物。
标题化合物：465.1[M+H]+；HPLC：单峰位于tR＝9.95分钟(系统1)。
实施例2：(R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)- 丙酰氨基]-3-甲基-丁酰氨基}-3-甲基-丁基硼酸
将i-BuB(OH)2加入(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基- 苯基)-丙酰氨基]-3-甲基-N-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5- 二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-丁酰胺、甲醇(4.3mL)、己烷(4.3 mL)和1N HCl(1.45mL)的混合物。将反应混合物在室温搅拌2小时并用甲 醇(8mL)和己烷(8mL)稀释。两层分离。将甲醇层用己烷洗涤两次，用 CH2Cl2稀释，H2O洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将残渣溶于CH2Cl2中并通过硅胶(20g)柱层析(CH2Cl2/MeOH，80/20)纯化得到标题化合物，其 是灰黄色泡沫。
标题化合物：ES-MS：618.2[M-H]-；Rf＝0.03(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
合成方案2(实施例3和4)：
实施例3：(S)-3-甲基-N-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5- 二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-2-[(S)-2-[2-(3-苯氧基-苯基)-乙酰 基氨基]-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酰氨基]-丁酰胺
通过重复实施例1中描述的2-步(去保护/偶联)方法但是使用(S)-2-叔- 丁氧基羰基氨基-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酸(合成方案2中(D))和(3-苯氧 基-苯基)-乙酸(合成方案2中(F))(Trans World Chemicals，Inc.； Rockville，MD，USA)分别作为每个偶联反应(步骤B，实施例1)中的配偶体 从{(S)-2-甲基-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼- 三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-丙基}-氨甲酸叔丁基酯(合成方案2 中(A))制备标题化合物。所得标题化合物为白色固体。
标题化合物：ES-MS：812.1[M+H]+；HPLC：单峰位于tR＝11.13分钟 (系统1)；Rf＝0.41(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
步骤3.1：(S)-2-氨基-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酸(L-2，3，4-三甲氧基- 苯基-丙氨酸)
如(S)-2-氨基-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸(实施例1)所描述的制备标 题化合物。
标题化合物：ES-MS：256.1[M+H]+；HPLC：tR＝2.54分钟(系统 2)；[α]D20＝-18.5°(c＝0.99，H2O)。
步骤3.2：(S)-2-叔-丁氧基羰基氨基-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酸
根据本领域中公知的方法(M.Bodanszky in Principles of Peptide Synthesis，Akad.-Verlag，1984)从(S)-2-氨基-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酸合 成标题化合物。
标题化合物：ES-MS：356.1[M+H]+；HPLC：tR＝5.35分钟(系统 1)；[α]D20＝-2.5°(c＝0.985，MeOH)。
实施例4：(R)-3-甲基-1-{(S)-3-甲基-2-[(S)-2-[2-(3-苯氧基-苯基)-乙酰基 氨基]-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酰氨基]-丁酰氨基}-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：676.0[M-H]-；Rf＝ 0.025(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例5：(S)-3-甲基-N-[(R)-3-甲基-1-(1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5- 二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-2-[(S)-2-(3-苯基-丙酰基-氨 基)-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酰氨基]-丁酰胺
通过重复实施例1中描述的2-步(去保护/偶联)方法但是使用(S)-2-(叔- 丁氧基羰基-氨基)-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酸和3-苯基-丙酸 (Fluka，Buchs，Switzerland)分别作为每个偶联反应(步骤B，实施例1)中的 配偶体从{(S)-2-甲基-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二 噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-丙基}-氨甲酸叔丁基酯制 备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：734.1[M+H]+；HPLC：单峰位于tR＝11.25分钟 (系统1)；Rf＝0.41(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例6：(R)-3-甲基-1-{(S)-3-甲基-2-[(S)-2-(3-苯基-丙酰氨 基)-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酰氨基]-丁酰氨基}-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：598.2[M-H]-；Rf＝0.025 (CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例7：(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(4-甲氧基-苯基)-丙酰氨基]-3- 甲基-N-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环 [6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-丁酰胺
如实施例1中描述的但是使用(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(4-甲氧基-苯 基)-丙酸制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：694.4[M+H]+；HPLC：单峰位于tR＝12.01分钟 (系统1)；Rf＝0.56(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
步骤7.1：(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(4-甲氧基-苯基)-丙酸
如关于(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸(实施例1) 所描述的但是使用O-甲基-L-酪氨酸(Bachem)制备标题化合物。通过 MPLC(CH3CN/H2O/TFA)纯化得到标题化合物；ES-MS：348.3[M+H]+； HPLC：单峰位于tR＝9.52分钟(系统1)。
实施例8：(R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(4-甲氧基-苯基)-丙酰 氨基]-3-甲基-丁酰氨基}-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：558.0[M-H]-；HPLC： tR＝6.47分钟(系统3)；Rf＝0.086(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例9：(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4-二甲氧基-苯基)-丙酰氨 基]-3-甲基-N-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三 环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-丁酰胺
如实施例1中描述的但是使用(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4-二甲氧基- 苯基)-丙酸制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：724.4[M+H]+；HPLC：tR＝11.75分钟时单峰(系 统1)；Rf＝0.41(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
步骤9.1：(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4-二甲氧基-苯基)-丙酸
如关于(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸(实施例1) 所描述的但是使用3-(3，4-二甲氧基苯基)-L-丙氨酸(Aldrich)制备标题化合 物。通过MPLC(CH3CN/H2O/TFA)纯化得到该标题化合物；ES-MS：378.2 [M+H]+；HPLC：tR＝9.10分钟下单峰(系统1)。
实施例10：(R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4-二甲氧基-苯基)- 丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰氨基-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：588.2[M-H]-；Rf＝ 0.090(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例11：(S)-2-[(S)-2-(3-异丙基-苯基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)- 丙酰基氨基]-3-甲基-N-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二 噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-丁酰胺
如实施例1中描述的但是使用(S)-2-(3-异丙基-苯基氨基)-3-(3，4，5-三甲 氧基-苯基)-丙酸制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：720.4[M+H]+；HPLC：tR＝11.85分钟时单峰(系 统1)；Rf＝0.43(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
步骤11.1：(S)-2-(3-异丙基-苯基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸
如关于(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸(实施例1) 所描述的但是使用1-溴-3-异丙基苯(Lancaster)制备标题化合物。通过 MPLC(CH3CN/H2O/TFA)纯化得到标题化合物；ES-MS：374.1[M+H]+； HPLC：tR＝8.95分钟下单峰(系统1)。
实施例12：(R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(3-异丙基-苯基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基- 苯基)-丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰氨基}-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：584.3[M-H]-；Rf＝ 0.13(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例13：(S)-3-甲基-N-[(R)-3-甲基-1-(1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5- 二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-2-[(S)-2-(3-吡啶-2-基-苯基氨 基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酰基氨基]-丁酰胺
如实施例1中描述的但是使用(S)-2-(3-吡啶-2-基-苯基氨基)-3-(3，4，5- 三甲氧基-苯基)-丙酸制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：755.3[M+H]+；HPLC：tR＝9.97分钟下单峰(系 统1)；Rf＝0.23(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
步骤13.1：2-(3-溴-苯基)-吡啶
根据文献方法：Zhang，Biliang，Breslow，Ronald，通过具有金属二吡啶 基连接基团的催化性环糊精二聚体酶模拟物实施酯水解.J.Am.Chem.Soc. (1997)，119(7)，1676-1681；M.Van der Sluis，V.Beverwijk，A.Termaten，F. Bickelhaupt，H.Kooijman，A.L.Spek，通过P：C双键的钯碳反应 (Carbopalladation)合成新的基于磷杂烯烃(Phosphaalkene)的二齿螯 合物配体Mes*P：CH(3-R-Ar)(R＝吡啶基，Carbaldimino)和形成三元钯 环(Palladacycles)Mes*(Me)P-CH(3-R-Ar)-PdCl.Organometallics (1999)，18(8)，1402-1407。
标题化合物：ES-MS：235.0[M+H]+；HPLC：tR＝6.64分钟时单峰(系 统1)；Rf＝0.17(己烷/Et2O，80/20)
步骤13.2：(S)-2-(3-吡啶-2-基-苯基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基- 苯基)-丙酸
如关于(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸(实施例1) 所描述的但是使用2-(3-溴-苯基)-吡啶制备标题化合物。通过 MPLC(CH3CN/H2O/TFA)纯化得到标题化合物；ES-MS：409.2[M+H]+； HPLC：tR＝6.64分钟时单峰(系统1)。
实施例14：(R)-3-甲基-1-{(S)-3-甲基-2-[(S)-2-(3-吡啶-2-基-苯基氨 基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酰基氨基]-丁酰氨基}-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：619.2[M-H]-；Rf＝ 0.044(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例15：(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酰 基氨基]-3-甲基-N-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼 -三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-丁酰胺
如实施例1中描述的但是使用(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(2，3，4-三甲氧基 -苯基)-丙酸制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：754.4[M+H]+；HPLC：tR＝12.08分钟时单峰(系 统1)；Rf＝0.66(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
步骤15.1：(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酸
如关于(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸(实施例1) 所描述的但是使用(S)-2-氨基-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酸制备标题化合 物。通过MPLC(CH3CN/H2O/TFA)纯化得到标题化合物；ES-MS：408.2 [M+H]+；HPLC：tR＝9.42分钟时单峰(系统1)。
实施例16：(R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(2，3，4-三甲氧基-苯 基)-丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰氨基}-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：618.3[M-H]-；Rf＝0.23 (CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例17：(S)-2-[(S)-3-(4-苄氧基-苯基)-2-(联苯-3-基氨基)-丙酰基氨 基]-3-甲基-N-[(R)-3-甲基-1-(1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环 [6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-丁酰胺
如实施例1中描述的但是使用(S)-3-(4-苄氧基-苯基)-2-(联苯-3-基氨 基)-丙酸制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：770.3[M+H]+；HPLC：tR＝12.45分钟时单峰(系 统1)；Rf＝0.74(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
步骤17.1：(S)-3-(4-苄氧基-苯基)-2-(联苯-3-基氨基)-丙酸
如关于(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸(实施例1) 所描述的但是使用(S)-2-氨基-3-(4-苄氧基-苯基)-丙酸(O-苄基-L-酪氨酸)制 备标题化合物。通过MPLC(CH3CN/H2OTFA)纯化得到标题化合物； ES-MS：424.3[M+H]+；HPLC：tR＝10.40分钟时单峰(系统1)。
实施例18：(R)-1-{(S)-2-[(S)-3-(4-苄氧基-苯基)-2-(联苯-3-基氨基)-丙酰 基氨基]-3-甲基-丁酰氨基}-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：633.9[M-H]-；Rf＝ 0.65(CH2Cl2/MeOH，90/10)。
实施例19：(R)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酰 基氨基]-3-甲基-N-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4- 硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-丁酰胺
如实施例1中描述的但是使用{(R)-2-甲基-1-[(R)-3-甲基 -1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁 基氨甲酰基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：754.1[M+H]+；HPLC：tR＝11.73分钟时单峰(系 统1)；Rf＝0.52(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
步骤19.1：{(R)-2-甲基-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基 -3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-丙基}-氨基甲酸叔 丁基酯
如关于{(S)-2-甲基-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二 噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基 酯(实施例1(c))所描述的但是使用Boc-D-缬氨酸(Fluka)制备标题化合 物。
标题化合物：ES-MS：465.4[M+H]+。
实施例20：(R)-1-{(R)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯 基)-丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰氨基}-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：618.2[M-H]-；Rf＝ 0.088(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例21：(S)-2-[(R)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酰 基氨基]-3-甲基-N-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4- 硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-丁酰胺
如实施例1中描述的但是使用(R)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基 -苯基)-丙酸制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：754.3[M+H]+；HPLC：tR＝11.71分钟时单峰 (系统1)；Rf＝0.67(CH2Cl2/MeOH，95/5)
步骤21.1：(R)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸
如关于(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸(实施例1) 所描述的但是使用(R)-2-氨基-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸 (3，4，5-OCH3-phe-OH制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：408.2[M+H]+；HPLC：tR＝9.10分钟时单峰(系 统1)。
对于(R)-2-氨基-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸的合成见实施例1。
酶拆分后，用本领域中公知的方案将剩余的D-氨基酸-甲基酯水解并 去乙酰化；[α]D20＝+19.7(c＝1.04，H2O)；ES-MS：256.2[M+H]+；tR＝2.11分 钟时单峰(系统2)。
实施例22：(R)-1-{(S)-2-[(R)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯 基)-丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰氨基}-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：618.2[M-H]-；Rf＝ 0.20(CH2Cl2/MeOH，90/10)。
实施例23：(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酰 基氨基]-3-甲基-N-[3-甲基-1-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二噁硼-2-基)-丁基]-丁 酰胺
如实施例1中描述的但是使用{(S)-2-甲基-1-[3-甲基-1-(4，4，5，5-四甲基 -[1，3，2]二噁硼-2-基)-丁基氨甲酰基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯制备标题化 合物。
所得标题化合物为粗产物；ES-MS：702.3[M+H]+；HPLC：tR＝10.31 分钟(系统1)。
步骤23.1：{(S)-2-甲基-1-[3-甲基-1-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二噁硼-2- 基)-丁基氨甲酰基-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯
类似于{(S)-2-甲基-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二 噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基 酯(实施例1(c))的合成制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：413.3[M+H]+。
实施例24：1-(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙 酰基氨基]-3-甲基-丁酰氨基}-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：618.2[M-H]-；Rf＝ 0.076(CH2Cl2/MeOH，95/5)；HPLC：在tR＝6.23分钟和6.36分钟处两个峰 (比例1∶1)(系统3)。
实施例25：(S)-2-{(S)-3-(3，4-二甲氧基-苯基)-2-[2-(3-苯氧基-苯)-乙酰 基氨基]-丙酰基氨基}-3-甲基-N-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基 -3，5-二噁-4硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-丁酰胺
通过重复实施例1中描述的2-步(去保护/偶联)方法但是使用 Boc-L-3，4-二甲氧基苯基丙氨酸(Synthetech)和(3-苯氧基-苯基)-乙酸 (Trans World Chemicals，Inc.；Rockville，MD，USA)分别作为每一偶联反应 (步骤B，实施例1)中的配偶体从{(S)-2-甲基-1-[(R)-3-甲基 -1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁 基氨甲酰基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯制备标题化合物。所得标题化合物为 泡沫；ES-MS：782.3[M+H]+；HPLC：tR＝11.76分钟时单峰(系统1)；Rf＝ 0.61(CH2Cl2/MeOH，90/10)。
实施例26：(R)-1-((S)-2-{(S)-3-(3，4-二甲氧基-苯基)-2-[2-(3-苯氧基-苯 基)-乙酰基氨基]-丙酰基氨基}-3-甲基-丁酰氨基)-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：646.2[M-H]-； HPLC：tR＝5.90分钟时单峰(系统3)；Rf＝0.12(CH2Cl2/MeOH，90/10)。
实施例27：(S)-3-甲基-N-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基 -3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-2-[(S)-2-[2-(3-苯氧基-苯基)- 乙酰基氨基]-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酰基氨基]-丁酰胺
通过重复实施例1中描述的2-步(去保护/偶联)方法但是使用(S)-2-叔- 丁氧基羰基氨基-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸和(3-苯氧基-苯基)-乙酸 (Trans World Chemicals，Inc.；Rockville，MD，USA)分别作为每一偶联反应 (步骤B，实施例1)中的配偶体从{(S)-2-甲基-1-[(R)-3-甲基 -1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)- 丁基氨甲酰基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯制备标题化合物。所得标题化合物 为黄色泡沫；ES-MS：812.4[M+H]+；HPLC：tR＝11.36分钟时单峰(系统1)； Rf＝0.53(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
步骤27.1：(S)-2-叔-丁氧基羰基氨基-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸
如关于(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酸(实施 例3)所描述的但是从(S)-2-氨基-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸开始合成标 题化合物。
标题化合物：ES-MS：356[M+H]+；HPLC：tR＝4.83分钟(系统2)；m. p.＝76-80C；[α]D20＝+13.4(c＝1.01，甲醇)。
实施例28：(R)-3-甲基-1-{(S)-3-甲基-2-[(S)-2-[2-(3-苯氧基-苯基)-乙酰 基氨基]-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酰基氨基]-丁酰氨基}-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：676.2[M-H]-；Rf＝0.14 (CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例29：(S)-2-{(S)-3-(4-苄氧基-苯基)-2-[2-(3-苄氧基-苯基)-乙酰基氨 基-丙酰基氨基}-3-甲基-N-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二 噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-丁酰胺
通过重复实施例1中描述的2-步(去保护/偶联)方法但是使用(S)-3-(4- 苄氧基-苯基)-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸和(3-苯氧基-苯基)-乙酸(Trans World Chemicals，Inc.；Rockville，MD，USA)分别作为每一偶联反应(步骤B， 实施例1)中的配偶体从{(S)-2-甲基-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9- 三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-丙基}-氨 基甲酸叔丁基酯制备标题化合物。所得标题化合物为浅褐色泡沫；ES-MS： 842.0[M+H]+；HPLC：tR＝12.19分钟时单峰(系统1)；Rf＝0.37 (CH2Cl2/MeOH，95/5)。
步骤29.1：(S)-3-(4-苄氧基-苯基)-2-叔丁氧基羰基氨基-丙酸
如关于(S)-2-叔-丁氧基羰基氨基-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酸(实施 例3)所描述的但是从O-苄基-L-酪氨酸(Fluka)开始合成标题化合物。
标题化合物：ES-MS：370.1[M-H]-；HPLC：tR＝9.23分钟(系统1)。
实施例30：(R)-1-((S)-2-{(S)-3-(4-苄氧基-苯基)-2-12-(3-苄氧基苯基)-乙 酰基氨基]-丙酰基氨基}-3-甲基-丁酰氨基)-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：705.8[M-H]-；Rf＝ 0.12(CH2C12/MeOH，95/5)。
实施例31：(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酰 基氨基]-4-甲基-戊酸[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4- 硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-酰胺
如实施例1中描述的但是使用{(S)-3-甲基-1-[(R)-3-甲基 -1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁 基氨甲酰基]-丁基}-氨基甲酸叔丁基酯制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：768.2[M+H]+；HPLC：tR＝11.79分钟时单峰(系 统1)；Rf＝0.72(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
步骤31.1：{(S)-3-甲基-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基 -3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-丁基}-氨基甲酸叔 丁基酯
如关于{(S)-2-甲基-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二 噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基 酯(实施例1(c))所描述的但是使用Boc-L-亮氨酸制备标题化合物。标题 化合物：ES-MS：479.2[M+H]+；HPLC：tR＝10.05分钟时单峰(系统1)。
实施例32：(R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯 基)-丙酰基氨基]-4-甲基-戊酰基氨基}-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：632.2[M-H]-；Rf＝ 0.15(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例33：(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4-二甲氧基-苯基)-丙酰基 氨基]-4-甲基-戊酸[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4- 硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-酰胺
如实施例1中描绘的但是使用{(S)-3-甲基-1-[(R)-3-甲基-1-((1 S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲 酰基]-丁基}-氨基甲酸叔丁基酯和(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4-二甲氧基-苯 基)-丙酸制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：738.3[M+H]+；HPLC：tR＝11.76分钟时单峰 (系统1)；Rf＝0.59(CH2Cl2/MeOH，95/5).
实施例34：(R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯 基)-丙酰基氨基]-4-甲基-戊酰基氨基)-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：602.2[M-H]-；Rf＝ 0.14(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例35：(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(4-甲氧基-苯基)-丙酰基氨 基]-4-甲基-戊酸[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼- 三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基]-酰胺
如实施例1中描述的但是使用{(S)-3-甲基-1-[(R)-3-甲基-1-((1 S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲 酰基]-丁基}-氨基甲酸叔丁基酯和(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(4-甲氧基-苯基)- 丙酸制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：708.3[M+H]+；HPLC：tR＝12.03分钟时单峰(系 统1)；Rf＝0.70(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例36：(R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(4-甲氧基-苯基)-丙酰 氨基]-4-甲基-戊酰基氨基}-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：572.1[M-H]-；Rf＝ 0.25(CH2Cl2/MeOH，90/10)。
实施例37：(S)-2-(联苯-3-基氨基)-N-{(S)-1-[(R)-3-甲基 -1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁 基氨甲酰基]-乙基}-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酰胺
如实施例1中描述的但是使用{(S)-1-[(R)-3-甲基 -1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁 基氨甲酰基]-乙基}-氨基甲酸叔丁基酯制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：726.3[M+H]+；HPLC：tR＝11.24分钟时单峰(系 统1)；Rf＝0.41(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
步骤37.1：{(S)-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二 噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-乙基}-氨基甲酸叔丁基酯
如关于{(S)-2-甲基-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二 噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基 酯(步骤1.1，实施例1)所描述的但是使用Boc-L-丙氨酸(Fluka)制备标题 化合物。
标题化合物：ES-MS：437.4[M+H]+；HPLC：tR＝10.91分钟时单峰 (系统1)
实施例38：(R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯 基)-丙酰基氨基]-丙酰基氨基}-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：590.0[M-H]-；Rf＝ 0.12(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例39：(S)-2-(联苯-3-基氨基)-N-{(S)-1-[(R)-3-甲基-1- ((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基 氨甲酰基)-乙基]-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酰胺
如实施例1中描述的但是使用{(S)-1-[(R)-3-甲基 -1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁 基氨甲酰基]-乙基}-氨基甲酸叔丁基酯和(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(2，3，4-三 甲氧基-苯基)-丙酸制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：726.3[M+H]+；HPLC：tR＝11.71分钟时单峰(系 统1)；Rf＝0.45(CH2C12/MeOH，95/5)。
实施例40：(R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(2，3，4-三甲氧基-苯 基)-丙酰基氨基]-丙酰基氨基}-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：590.0[M-H]-；Rf＝ 0.033(CH2Cl2/MeOH，95/5)
实施例41：(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(4-甲氧基-苯基)-N-{(S)-1-[(R)-3-甲 基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)- 丁基氨甲酰基]-乙基}-丙酰胺
如实施例1中描述的但是使用{(S)-1-[(R)-3-甲基-1-((1 S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨 甲酰基]-乙基}-氨基甲酸叔丁基酯和(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(4-甲氧基-苯 基)-丙酸制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：666.3[M+H]+；HPLC：tR＝11.63分钟时单峰 (系统1)；Rf＝0.46(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例42：(R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(4-甲氧基-苯基)-丙酰 基氨基]-丙酰基氨基}-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：530.3[M-H]-；Rf＝ 0.051(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例43：(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4-二甲氧基-苯 基)-N-{(S)-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环 [6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-乙基}-丙酰胺
如实施例1中描述的但是使用{(S)-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9， 9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-乙基}-氨 基甲酸叔丁基酯和(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4-二甲氧基-苯基)-丙酸制备 标题化合物。
标题化合物：ES-MS：696.3[M+H]+；HPLC：tR＝11.39分钟时单峰(系 统1)；Rf＝0.53(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例44：(R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4-二甲氧基-苯基) 丙酰基氨基]-丙酰基氨基)-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：560.2[M-H]-；Rf＝ 0.023(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例45：(S)-2-(3-异丙基-苯基氨基)-N-{(S)-1-[(R)-3-甲基 -1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基 氨甲酰基]-乙基}-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酰胺
如实施例1中描述的但是使用{(S)-1-[(R)-3-甲基 -1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁 基氨甲酰基]-乙基}-氨基甲酸叔丁基酯和(S)-2-(3-异丙基-苯基氨 基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酸制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：692.3[M+H]+；HPLC：tR＝11.49分钟时单峰(系 统1)；Rf＝0.24(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例46：(R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(3-异丙基-苯基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基- 苯基)-丙酰基氨基]-丙酰基氨基}-3-甲基-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：560.2[M-H]-；Rf＝0.22 (CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例47：(S)-N-{(S)-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5- 二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-乙基}-2-(3-苯基-丙酰基 氨基)-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酰胺
通过重复实施例1中描述的2-步(去保护/偶联)方法但是使用(S)-2-氨 基-3-(2，3，4-三甲氧基-苯基)-丙酸和3-苯基-丙酸(Fluka)分别作为每一偶联 反应(步骤B，实施例1)中的配偶体从{(S)-1-[(R)-3-甲基 -1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁 基氨甲酰基]-乙基}-氨基甲酸叔丁基酯制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：706.3[M+H]+；HPLC：tR＝10.81分钟时单峰(系 统1)；Rf＝0.32(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例48：(R)-3-甲基-1-{(S)-2-[(S)-2-(3-苯基-丙酰基氨基)-3-(2，3，4-三 甲氧基-苯基)-丙酰基氨基]-丙酰基氨基}-丁基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：570.3[M-H]-；Rf＝ 0.22(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例49：(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯基)-丙酰 基氨基]-3-甲基-N-[(R)-2-苯基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼 -三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-乙基]丁酰胺
如实施例1中描述的但是使用{(S)-2-甲基-1-[(R)-2-苯基 -1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-乙 基氨甲酰基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：788.0[M+H]+；HPLC：tR＝11.66分钟时单峰 (系统1)；Rf＝0.79(CH2Cl2/MeOH，95/5。
步骤49.1：{(S)-2-甲基-1-[(R)-2-苯基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基 -3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-乙基氨基甲酰]-丙基}-氨基甲酸叔丁 基酯
类似于{(S)-2-甲基-1-[(R)-3-甲基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5- 二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-丁基氨甲酰基]-丙基}-氨基甲酸叔丁 基酯(实施例1(c))的合成制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：499.1[M+H]+；HPLC：tR＝10.78分钟时单峰 (系统1)。
实施例50：(R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(3，4，5-三甲氧基-苯 基)-丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰氨基)-2-苯基-乙基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：652.2[M-H]-；Rf＝0.22 (CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例51：(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(4-甲氧基-苯基)-丙酰基氨 基]-3-甲基-N-[(R)-2-苯基-1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三 环[6.1.1.02，6]癸-4-基)-乙基]-丁酰胺
如实施例1中描述的但是使用{(S)-2-甲基-1-[(R)-2-苯基 -1-((1S，2S，6R，8S)-2，9，9-三甲基-3，5-二噁-4-硼-三环[6.1.1.02，6]癸-4-基)- 乙基氨甲酰基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯和(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(4-甲氧 基-苯基)-丙酸制备标题化合物。
标题化合物：ES-MS：727.9[M+H]+；HPLC：tR＝11.87分钟时单峰 (系统1)；Rf＝0.73(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例52：(R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(联苯-3-基氨基)-3-(4-甲氧基-苯基)-丙酰 基氨基]-3-甲基-丁酰氨基}-2-苯基-乙基硼酸
如实施例2中描述的制备标题化合物；ES-MS：591.8[M-H]-；Rf＝ 0.13(CH2Cl2/MeOH，95/5)。
实施例53：抑制20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样(chymotrypsin-like) 的活性
下面(表1)给出上面关于式I化合物所描述的试验确定的代表性IC50。
表1 实施例 IC50[μM] (一次或两次实验的结果) 实施例 IC50[μM] (一次或两次实验的结果) 1 0.0046/0.0024 28 0.0008 2 0.0028/0.0021 29 0.004 3 0.0017/0.0014 30 0.0059 4 0.0019/0.0015 31 0.0022 5 0.0013/0.0006 32 0.0037 6 0.0018/0.0019 33 0.0026 7 0.0029/0.0032 34 0.0013 8 0.0028/0.0045 35 0.0023 9 0.0017/0.0022 36 0.0023 10 0.0029/0.004 37 0.0013 11 0.0039 38 0.0017 12 0.0038 39 0.0019 13 0.0013 40 0.0022 14 0.0017 41 0.0012 15 0.0071 42 0.0019 16 0.0059 43 0.0018 17 0.0093 44 0.001 18 0.0015 45 0.0013 21 0.0015 46 0.0019 22 0.0017 47 0.0008 23 0.0021 48 0.0007 24 0.0021 50 0.0023 25 0.0008 51 0.0043 26 0.001 52 0.005 27 0.0003
实施例54：
作为我们为抗-DR5筛选所研发的测定法的一部分，我们克隆、表达 和纯化了Trail配体并将其用Jurkat细胞试验以确定我们用该配体是否能 杀死细胞。该测定法包括Alamar Blue-一种氧化还原染料，当活细胞还 原该染料时该染料发出荧光。当细胞通过编程性细胞死亡而杀死时，所产 生的环境是氧化性的，所以该染料不被还原并且检测不到荧光。如图1中 所阐明的，TRAIL在Jurkat细胞中诱导了编程性细胞死亡。
实施了抗体激动剂的筛选。用DR5受体免疫小鼠并将B细胞与骨髓 瘤融合。将所得杂交瘤排列到384孔板中并且生长数天后，向含有Jurkat 细胞的孔中加入20μl上清液和交联抗体。24小时后加入alamar blue染 料，24小时后用Acquest对平板读数。鉴定了含有阳性反应抗体的一些阳 性孔。
检验了阳性抗体的特异性。将在该测定法中给出阳性信号的三种杂交 瘤亚克隆、扩大并纯化。克隆、表达和纯化了21种TNF受体。将受体包 被在孔上并将所述三种抗体实施ELISA分析。结果表明这些抗体仅与DR5 反应，从而非常特异。见图2。
图3显示了剂量应答分析。所述3种抗体激动剂相对于Jurkat细胞杀 伤显示出不同的剂量应答。抗体A(ATCC保藏号＿＿＿)具有最大的潜能 并选中其用于进一步研究。Imgenex-257是没有功能活性的DR5特异抗体。
确定了Casμase 3活性。为了确定该抗体通过编程性细胞死亡杀死细 胞而不是同某种间接的或者非特异性机理杀伤细胞，我们进行了Caspase-3 活性测定。将抗体或者配体以多种浓度与细胞混合并从所处理的细胞产生 细胞提取物。向裂解物加入荧光底物，这可用于检验活性caspase3-编程 性细胞死亡的一种指示剂。该抗体以类似于配体的方式刺激编程性细胞死 亡。图4显示了结果。
确定了DR5抗体对结肠和黑素瘤细胞系的作用。图5显示了针对多种 贴壁肿瘤细胞系的剂量应答曲线。除了HCT 116bax/bax-细胞系之外，所 有细胞系都对DR5编程性细胞死亡诱导抗体敏感，HCT 116bax/bax-细胞 系不能执行编程性细胞死亡。
图6显示了对多种乳腺癌细胞系实施的相同实验。T47D和ZR-75-1 都抗DR5的杀肿瘤活性，而MCF-7和MDA-MB-231敏感。
图7表明肿瘤细胞对所述抗体的作用敏感，但是正常细胞、人肺成纤 维细胞(HLF)和人脐静脉上皮细胞(HUVEC)抗所述抗体，这一点通过它们 缺乏剂量应答而表明。
为了进一步证明正常细胞不被所述抗体杀死，将人肺成纤维细胞、人 乳腺上皮细胞和正常原代人肝细胞用DR5抗体处理后测量caspase3活性。 没有一种正常细胞显示出活性，而DOHH2滤泡性淋巴瘤和Jurkat细胞显 示出与编程性细胞死亡相关的Caspase活性。见图8。
此外，通过该抗体消灭了CaOV3-一种卵巢癌细胞系，而正常HLF 和HMEC完全不受DR5抗体的影响。
检测了所述抗体的体内效能。在第0天用5×106个colo 205(结肠肿瘤 细胞)皮下注射10只小鼠。在第11天开始用DR5抗体(400μg)治疗。用 400μg DR5注射两次后，5只被治疗的动物没有明显的肿瘤，而5只给予 PBS的小鼠都具有大肿瘤。从而，该抗体表现出在体内有效。
研究持续到第32天。未经治疗的小鼠有大肿瘤或者死亡。经治疗的小 鼠没有表现出疾病。该实验在第50天结束。所有未经治疗的小鼠都死亡。 经治疗的都没有在第50天表现出复发。图9显示了用图表示的Colo 205 效能研究。箭头指治疗天数。
前面的实验代表单剂量研究。为了确定所示抗体的潜能，我们实施了 大剂量应答研究。组大小扩大到每组8只小鼠并且如在前面的单剂量研究 中描述的给予50、200和400μg剂量。结果表明该抗体在低(例如，50μ g)剂量下是有效的。见图10。
还对一种新的肿瘤模型—黑素瘤细胞系A2058实施了更小的剂量应答 研究。该细胞系在体外对该抗体更具抗性。组大小为2只小鼠。经治疗的 小鼠(400μg)显示出体内杀肿瘤活性，而用20μg或者PBS处理的小鼠形 成了大肿瘤。见图11。
因为不同细胞系显示出对DR5抗体不同程度的敏感性，所以我们开发 了小分子协同剂，该协同剂使得抗性或者强(pertly)抗性细胞系对该抗体的 作用敏感。我们通过分析编程性细胞死亡途径，确定在哪里可以潜在地阻 断编程性细胞死亡，和哪种类型的小分子协同剂本质上可能是促进编程性 细胞死亡(pro-apoptotic)的来探讨该问题。
图12描绘了编程性细胞死亡的外在和内在途径。关键点是肿瘤细胞过 量表达编程性细胞死亡蛋白的抑制物(IAPs)和Bcl2，其阻断了关键的促进 编程性细胞死亡蛋白(cyto C和SMAC)从线粒体的释放。这些蛋白建立的 阻断可以通过加入SMAC克服。SMAC抑制IAPs。检验了称为LB 672 的SMAC模拟物可能的协同作用，其中该协同作用使肿瘤细胞对DR5激 动剂的作用敏感。
图13显示了该SMAC模拟物对A2058黑素瘤细胞的影响。前面我们 证明这些细胞对所述抗体部分敏感。该图表明用SMAC和DR5抗体处理 的细胞被完全消融，而672化合物自身几乎没有活性。
图14显示了剂量应答图，其表明不同浓度的SMAC对A2058黑素瘤 细胞的影响。再次，这些肿瘤细胞为部分抗性，但是对低水平的 SMAC(50-100nM)敏感。然而，更重要的是，HMEC和HLF细胞都不被 SMAC模拟物LB672敏化。
图15显示了SMAC的药物动力学性质。
另一协同剂策略用于试验蛋白酶体抑制剂用作DR4/DR5协同剂的用 途。如图16中所示，蛋白酶体抑制剂防止该蛋白酶体降解IкB。这又防 止释放NFкB。已知NFкB转移到核中并启动BCL2、IAPS和其他抗编 程性细胞死亡因子的转录。
我们首先试验了通过加入一种通过商业途径可得到的弱蛋白酶体抑制 剂MG132，蛋白酶体抑制剂是否将使肿瘤细胞对DR5敏感。图17表明在 相当高的浓度下，MG132使抗性SW480结肠细胞对所述抗体的作用敏感。
我们还得到了几种有效的蛋白酶体抑制剂。显示出最佳效果的化合物 是硼酸盐(boronates)。最大耐受剂量表明这些化合物相对有毒，从而在 体内毒性和杀肿瘤效能之间范围很窄。见图18。
所述蛋白酶体抑制剂使得A2058-LUC对DR5抗体敏感。见图19。该 蛋白酶体抑制剂还使得抗性肝癌细胞系HUH-7对抗体也敏感。见，图20。 然而，没有一种化合物对正常HMEC细胞有影响。此外，这些细胞对该 抗体的作用不敏感。见，图21。
从DR5小鼠抗体A克隆了可变区并将其插入SP20表达系统中。这些 载体编码人IgG1Fc。所得人嵌合体是80％人和20％小鼠。图22中显示 了重链可变区和轻链可变区的核酸序列。重链可变区的氨基酸序列在图24 或图35中显示，轻链可变区的氨基酸序列在图25或图35中显示。嵌合体 以20pg/细胞/天在SP2/0细胞中表达。所得人嵌合抗体与山羊抗-人Fc交 联并试验功能活性。该嵌合抗体具有等同于小鼠抗体的功能杀肿瘤活性。 见，图21。
实施例55：
将siRNA分子文库转染入细胞，将细胞与TRAIL接触，并对细胞筛 选与不存在TRAIL时相比改变的生存力。然后将具有改变生存力的细胞 用于鉴定转染到细胞的特定siRNA，从而确定被siRNA抑制的基因。见图 26和27。
图28阐明了相应于基于筛选而被选中的siRNAs的基因产物。那些用 siRNAs抑制导致低TRAIL(+/-)比值的基因产物是TRAIL-诱导的编程性 细胞死亡的抑制剂。
表1为图28中鉴定的基因产物提供的额外信息，包括Genbank登录 号。
表1
注解
TRAIL-诱导的编程性细胞死亡的活化剂 acc# 符号 未处理的 trail 比值 P分值
人plexin B1(PLXNB1)，mRNA” NM_002673 PLXNB1 73.85 5.96 0.081 6.27E-05
人含SET结构域的蛋白质7(SET7)，mRNA NM_030648 SET7 79.06 7.30 0.092 0.000266
人促分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶 NM_005923 MAP3K5 86.84 8.58 0.099 0.000585
5(MAP3K5)
人STE20样激酶(JIK) NM_016281 JIK 86.41 8.67 0.102 0.000727
与人MAP激酶相互作用的丝氨酸/苏氨酸激 NM_003684 MKNK1 76.61 8.13 0.105 0.000755
酶1(MKNK1)
人推定的内质网多次跨膜蛋白(RFT1) NM_052859 RFT1 77.39 7.99 0.105 0.000892
I型人磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶5-激酶γ XM_047620 PIP5K1C 83.06 8.88 0.107 0.001498
(PIP5K1C)
人促分裂原活化的蛋白激酶活化的蛋白激酶 NM_004759 MAPKAPK 77.71 8.44 0.113 0.002227
2(MAPKAPK2)，转录变体1 2
人促分裂原活化的蛋白激酶激酶5(MAP2K5) NM_002757 MAP2K5 94.661 1.24 0.119 0.00381
人依赖细胞周期蛋白的激酶6(CDK6)，mRNA NM_001259 CDK6 84.101 0.52 0.125 0.006206
人类活化素AII型受体-1(ACVRL1)，mRNA NM_000020 ACVRL1 84.641 0.40 0.128 0.006776
人Gardner-Rasheed猫肉瘤病毒(v-fgr)癌基因 NM_005248 FGR 106.43 13.45 0.129 0.007914
同系物(FGR)，mRNA
人推定的蛋白FLJ21802(FLJ21802)，mRNA NM_024644 FLJ21802 96.15 12.46 0.133 0.006866
人肌肉、骨骼受体酪氨酸激酶(MUSK)， NM_005592 MUSK 96.32 12.17 0.127 0.008166
mRNA’’’’’’
人20号染色体可读框88(C20orf88)，mRNA NM_080820 C20orf88 76.58 10.09 0.132 0.009842
人苯并咪唑不抑制的芽殖1(酵母同系 NM_004336 BUB1 75.76 9.65 0.133 0.009722
物)(BUB1)，mRNA’’’’’’
人核糖体蛋白S6激酶，90kD多肽 NM_004755 RPS6KA5 77.84 10.22 0.132 0.010693
5(RPS6KA5)，mRNA’’’’’’
人v-yes-1Yamaguchi肉瘤病毒相关癌基因同 NM_002350 LYN
系物(LYN)，mRNA’’’’’’
人促分裂原活化的蛋白激酶7(MAPK7)， NM_002749.1 MAPK7
mRNA
人v-akt鼠胸腺瘤病毒癌基因同系物 NM_005163 AKT
1(AKT1)，mRNA’’’’’’
人信号识别颗粒72kD(SRP72)，mRNA NM_006947 SRP72 77.23 71.11 0.946 0.00073
TRAIL-诱导的编程性细胞死亡的抑制剂
Caspase-8 NM_001228 CASP8 99.30 84.45 0.850 0.002444
Bid NM_001196 Bid 110.50 91.95 0.832 0.003027
DR4trail受体1 NM_003844 DR4 87.26 70.90 0.807 0.003725
人B淋巴样酪氨酸激酶(BLK)，mRNA NM_001715 BLK 98.04 77.87 0.801 0.004003
类似于丙酮酸激酶，M2同工酶(LOC148283) XM_086132 PKM2like 83.15 60.32 0.778 0.006752
人糖原合酶激酶3α(GSK3A)，mRNA NM_019884 GSK3A 104.20 76.91 0.740 0.008469
推定的蛋白质FLJ32312(FLJ32312) NM_144709 FLJ32312 88.32 65.01 0.751 0.010144
人促分裂原活化的蛋白激酶 NM_002753 MAPK10/J
10(MAPK10)，mRNA NK3
TCF4：转录因子4，LocusID：6926 NM_003199 TCF4
人v-abl Abelson鼠白血病病毒癌基因同系物 NM_005158 ABL2
2(arg，Abelson-相关基因)(ABL2)，转录物
人v-ros禽UR2肉瘤病毒癌基因1(ROS)， NM_002944 ROS1
mRNA*
v-myc禽骨髓细胞瘤病病毒癌基因同系物 NM_002467 MYC
实施例56：
鉴定了siRNA，它们特异抑制Gsk3α或者GSK3β的表达，从而允许 我们确定任一种基因产物对TRAIL-诱导的编程性细胞死亡的影响。如图 29中所阐明的，与对照相比，Gsk3α而不是Gsk3β的抑制降低了细胞中 Caspase活性。从而，Gsk3α是TRAIL-诱导的编程性细胞死亡的活化剂。 类似地，其他两种基因产物SRP72和FLJ32312也被鉴定为编程性细胞死 亡的活化剂。
在图30中提供了文中鉴定的多种组分间的关系。该图阐明了TRAIL- 诱导的编程性细胞死亡途径的多种组分的关系和效应(例如，编程性细胞死 亡活化剂或者抑制剂)。
实施例57：
将靶定384孔中排列的510种基因的siRNA文库转染Hela细胞。孵 育细胞48小时以允许靶标破坏，并用或者不用TRAIL处理。TRAIL处理 20小时后用alamar blue测量生存力。与通过对照siRNA所得60个值相 比，对每种siRNA确定敏感度比值。通过MTT测定法在对照孔中测量， 用TRAIL配体处理的Hela细胞导致生存力降低～40％。鉴定了显著抑制 或者增强细胞死亡的siRNA。分别见表2和3。
表2-抑制剂siRnAs 登录号 符号 SR p值 NM_006947 SRP72 0.94 8.5E-22 NM_001715 BLK 0.79 5.9E-16 XM_086132 PKM2- like 0.75 3.6E-14 NM_019884 GSK3A 0.73 3.6E-14 NM_144709 FLJ32312 0.72 1.8E-12 NM_002467 C-MYC 0.69 5.3E-11 NM_025133 FLJ12673 0.65 2.9E-09 NM_002944 ROS1 0.61 2.5E-08 NM_005158 ABL2 0.61 2.9E-08 NM_004705 DAP4 0.61 3.2E-08 NM_002753 JNK3 0.60 7.8E-08 NM_003199 TCF4 0.59 2.0E-07 NM_022575 VPS16 0.59 2.1E-07 NM_000858 GUK1 0.59 3.3E-07 NM_006257 PRKCQ 0.55 8.9E-06 NM_006252 PRKAA2 0.54 5.3E-05 AK_074085 FLJ00156 0.53 8.6E-05 NM_006254 PRKCD 0.53 1.0E-04 NM_001569 IRAK1 0.52 1.3E-04 NM_004422 DVL2 0.52 1.3E-04
表3-增强剂siRNAs 登录号 符号 SR p值 NM_012290 TLK1 0.15 3.7E-21 NM_016231 NLK 0.15 5.7E-22 NM_015071 GRAF 0.14 1.4E-21 NM_000162 GCK 0.14 2.5E-22 NM_005163 AKT1 0.14 1.1E-22 NM_002749 ERK5 0.14 6.8E-23 NM_002350 LYN 0.14 3.0E-24 NM_004755 RPS6KA5 0.13 5.6E-24 NM_004336 BUB1 0.13 8.2E-27 NM_005592 MUSK 0.12 3.2E-27 NM_024644 FLJ21802 0.12 9.5E-28 NM_005248 FGR 0.12 2.2E-28 NM_000020 ACVRL1 0.12 3.4E-28 NM_002757 MEKK5 0.11 1.4E-28 XM+047620 PIP5K1C 0.11 2.8E-33 NM_004759 MAPKAPK2 0.10 1.9E-18 NM_052859 RFT1 0.10 7.8E-35 NM_003684 MKNK1 0.10 9.3E-37 NM_016281 JIK 0.09 4.4E-37 NM_002673 PLXNB1 0.08 2.7E-38
通过生存力测定法确定在筛选中鉴定的几种siRNAs增强细胞死亡， 检测这些siRNAs通过DR5激动剂抗体增强对caspase的活化。用滴定法 测量产生最小量的caspase活化的DR5抗体，这通过荧光肽(DEVD-afc) 测量。将针对nsrna、nsurf、PAK1、stk12、Ask1和JIK转染入Hela细 胞然后用DR5抗体处理。对照siRNA(nsrna)几乎没有效果，而所鉴定的 siRNAs显著增强caspase活性。
还设计了几种(与筛选中的不同)针对PAK1的siRNA并测试存在或不 存在DR5抗体时这些siRNA对生存力的影响。这些siRNA包括：
siPAK1-0 AGAGCTGCTACAGCATCAA
siPAK1-1 GACAUCCAACAGCCAGAAA
siPAK1-2 GAGAAAGAGCGGCCAGAGA
hPAK1-6 UACCAGCACUAUGAUUGGA
siPAK1-7 UCUGUAUACACACGGUCUG
在24和48小时时，PAK1-1和PAK1-2强烈减小结肠癌细胞系HCT116 bax+/-的生存力(MTT测定法)。
HCT116bax-/-细胞的两份bax拷贝都被缺失，使得这些细胞对化学治 疗，包括对TRAIL1和DR5抗体的抗性非常强。然而，PAK1siRNAs仍 然有效降低生存力。在结肠癌DLD1细胞中也观察到这些相同的结果。
为了确定沉默或者抑制PAK1是否对正常细胞有毒，我们对原代卵巢 上皮细胞系IOSE80测试了PAK1siRNAs。结果表明针对PAK1的siRNAs 不降低正常细胞的生存力。从而，PAK1和其他基因产物。
此外，siPAK1不显著降低原代(“正常的”)上皮细胞系HMEC中的 生存力，而siPAK1在结肠癌细胞系HCT15中强烈增强DR5和DR4诱导 的生存力降低。
实施例58UbcH10拮抗剂和抗-DR5抗体的协同作用
该实施例描述了人泛素接合酶UbcH10(UBE2C)拮抗剂和抗-DR5抗 体在诱导肿瘤细胞中编程性细胞死亡的协同作用。UbcH10在细胞周期调 节中起基本作用。使用基因表达和免疫组织化学的全局分析，本发明人发 现UbcH10在多个解剖学部位，特别是乳腺、胃/食道、结肠(coloretum)、 肺和卵巢的癌中显著过量表达。数据表明UbcH10在肿瘤发展中起重要作 用。然后检查了抑制UbcH10在癌症治疗中的治疗潜力。
通过RNAi-介导的UbcH10表达沉默减少细胞生长
我们首先研究了具有高UbcH10水平的肿瘤细胞中基因沉默的序列， 我们对三种不同的和非重叠的小干扰RNA(siRNA)(UbcH10-495， UbcH10-378，UbcH10-412)设计了序列。首先在2种细胞系T3M4(源于胰 腺癌)和DLD-1(源于结肠癌)中试验了每种siRNAs。所有三种siRNA都靶 定UbcH10，但是不靶定对照siRNA，导致有效减少UbcH10蛋白，这与 它们抑制细胞生长的能力有关。这些数据强调了UbcH10siRNAs的特异性 并表明该结果不是由于“靶标外”效应。因为UbcH10-APC复合体控制细 胞周期蛋白B1降解，所以我们还在UbcH10沉默后通过蛋白质印迹分析 检查了细胞周期蛋白B1的水平。我们的结果揭示了用siUbcH10处理的细 胞中UbcH10蛋白的水平和细胞周期蛋白B1的水平之间的逆相关性。此 外，siUbcH10处理后的细胞周期分析表明M期的抑制(数据未显示)，这与 文献中的公开相一致。显微镜下，UbcH10的下调不诱导表明编程性细胞 死亡的细胞形态的任何改变，如细胞变圆、脱落、核浓缩或者产生编程性 细胞死亡小体。此外，siUbcH10处理不导致两种执行者caspases即 caspase-3和-7(14)的蛋白质水解加工，这是通过蛋白质印迹分析和荧光 caspase活性测定测量的。
UbcH10的下调对标准化学治疗药物具有加性效果：与多数正常组织 相比，UbcH10在人癌中高度过量表达。为了确定靶定性UbcH10的治疗 潜力，我们研究了几种公知的化学治疗剂和分子靶定试剂在UbcH10沉默 后的潜在肿瘤特异效果。关于这些研究，我们使用了微管稳定剂紫杉醇、 纺锤体抑制长春花碱、DNA烷化剂丝裂霉素c和能够引起DR5/TRAIL- 介导的编程性细胞死亡的功能性激动抗体，以覆盖具有不同作用机理的试 剂范围。将两种胰腺癌细胞系T3M4和Panc-1以及一种不依赖雄激素的前 列腺癌细胞系CRW-RV1用siUbcH10处理48小时后与长春花碱、紫杉醇、 丝裂霉素c和抗-DR5再孵育24小时。结果表明UbcH10沉默后用有丝分 裂毒物和DNA-损害药物共同处理在我们所试验的多种肿瘤细胞系中产生 了细胞生存力的加性减弱(图31)。用siUbcH10最初处理癌细胞48小时使 存活细胞的量减小50％以上，通过加入细胞毒性剂再处理24小时进一步 减少了存活细胞的量。对UbcH10沉默细胞的数目标准化后，IC90或IC50 浓度相同，表明加性效果。靶定UbcH10的所有三种独立的siRNAs都显 示出与TRAIL在T3M4和Panc-1细胞中相似的效果。数据是一式三份的 平均值并且在四次独立的实验中得到相似结果。
下调UbcH10使细胞对TRAIL/DR5-介导的细胞杀伤敏感：
将原代人成纤维细胞(BJ)、人乳腺上皮细胞(HMEC)、和T3M4细胞 依次用siUbcH10(siUbcH10-495)处理48小时，然后用激动剂抗-DR5抗体 (500ng/ml)再处理6小时。用荧光(FITC)标记的对照siRNAs确保包括BJ 和HMEC细胞的所有细胞系的相等转染功效。通过显微术分析细胞。结 果在图31和32中显示。如图中所阐明的，与仅用siRNA或者抗-DR5处 理相比，用UbcH10预处理T3M4和Panc-1细胞显著增加了抗-DR5抗体 诱导的编程性细胞死亡，而其对CWR-RV1细胞仅有可忽略不计的效果， CWR-RV1细胞是TRAIL-不敏感的(图31)。数据表明将癌细胞系，尤其是 T3M4用抗-DR5抗体处理后与UbcH10孵育显示出显著增强的编程性细胞 死亡。在原代人皮肤成纤维细胞(BJ)或者乳腺上皮细胞(HMEC)中没有观 察到该显著增强的编程性细胞死亡(图31和32)。该观察似乎反映了一种普 通现象，因为通过下调UbcH10没有使得其他TRAIL抗性肿瘤细胞系以 及正常细胞对TRAIL敏感。
实施例59抗-DR4或抗-DR5激动剂和蛋白酶体抑制剂针对Bax-缺陷 的肿瘤细胞的协同性
DNA修复系统(错配修复(MMR))中的缺陷导致遗传不稳定性，因为复 制错误未被纠正。这类遗传不稳定性是遗传性非-多发性息肉结肠癌 (HNPCC)和一部分偶发性结肠癌的恶性发展中的关键事件，并且在短重复 序列，如TGFβRII和BAX基因中所含的那些序列中突变率尤其高。从而， 这些肿瘤中的Bax丧失对编程性细胞死亡的天然和化学治疗剂诱导提供了 重要的生存益处。
图34阐明Bax的丧失赋予对TRAIL配体的抗性。然而，蛋白酶体抑 制恢复了对TRAIL的敏感性。通过基于肽酰的抑制剂MG-132或者MG262 或者天然化合物Lactacystin抑制蛋白酶体完全恢复了Bax缺陷细胞中对 TRAIL的敏感性。见图34。
蛋白酶体抑制剂阻止了线粒体编程性细胞死亡途径中的缺陷。根据细 胞类型，活性caspase-8可直接导致下游效应物caspase如caspase-3(也称 作I型细胞)的活化。在II型细胞(多数细胞包括HCT116)中，两种原型途 径—外在(死亡-受体)和内在(线粒体)通过促进编程性细胞死亡的bcl-2家族 成员Bid的caspase-8-介导的切割相联系，Bid促进细胞色素c和SMAC 的线粒体释放。细胞色素c一旦释放到胞浆中就与Apaf-1和原-caspase-9 结合形成“编程性细胞死亡体(apoptosome)”，其导致原-caspase-9的活化 和效应物caspase如caspase-3的随后活化。另一方面，胞质SMAC结合 IAP(编程性细胞死亡蛋白的抑制物)蛋白质家族的成员，从而防止caspase-3 和-9受到IAP抑制。
通过蛋白质印迹分析容易在TRAIL-处理的Bax+/-细胞中观察到这些 事件(SMAC和细胞色素-c释放未显示)。见，图34。同样，在用TRAIL(T) 处理的Bax-/-细胞中，caspase-8加工和Bid加工正常发生，然而，caspase-9 和完全caspase-3加工和成熟非正常发生(泳道2、3和4)。这是预料中的， 因为Bax丧失防止了Bid切割的下游事件，因为所得Bid的促进编程性细 胞死亡片段需要Bax用于这些事件。TRAIL(T)+MG-262(M)完全恢复了 线粒体途径，导致caspase-9和caspase-3加工和活化，导致细胞死亡。 MG-262(M)自身对该蛋白水解级联没有影响。这些数据和其他数据表明蛋 白酶体抑制可用于使含有线粒体编程性细胞死亡途径缺陷的肿瘤细胞对 TRAIL受体激动剂诱导的编程性细胞死亡再敏感化。
尽管为了更好地理解，通过阐明和实施例描述了前面的发明，但是本 领域普通技术人员根据本发明的教导将容易明白可以对本发明做出某些改 变和修改而不背离所附权利要求书的精神和范围。
该说明书中引用的所有出版物、数据库、Genbank序列、专利和专利 申请都被并入本文作为参考，就好像每一篇都被特别和单独地指出并入作 为参考一样。