技术领域
本发明属医药和基因工程技术领域，具体涉及一种新的抗HSV-2多表位DNA疫苗及应 用
背景技术
单纯疱疹病毒(HSV)感染是人类比较常见的感染性疾病.。HSV-1主要引起唇疱疹、龈 口炎、脑炎、角膜结膜炎等非生殖器感染，而HSV-2引起生殖器感染。大多数生殖器疱疹 由HSV-2引起，可呈慢性复发过程，目前尚未有根治的良药。该病在全球的流行情况十分 明显，已占性病的10％左右，由HSV-2感染造成的公共卫生问题促使人们研制可预防和控 制感染的疫苗。有研究表明，DNA疫苗与常规的灭活苗、减毒苗、亚单位疫苗相比，DNA 疫苗不仅可诱导产生特异性免疫球蛋白，且可同时激发机体的细胞免疫反应(尤其是CTL 免疫)，对病毒感染性疾病等依赖细胞免疫清除病原的疾病预防更为有效。DNA疫苗另一 个突出优点是免疫原的单一性。只有编码所需抗原的基因被导入细胞得到表达，载体本身 没有免疫原性。而重组活载体疫苗除目的基因的表达外，其本身还具有庞大而复杂的免疫 原蛋白。DNA疫苗不仅可用于预防，而且可用于治疗。
本发明从HSV入侵和繁殖的机理及整个生命周期过程角度出发，将HSV-2糖蛋白D、B、 C基因(gD免疫原性较强、gB和gC与相应的受体结合能稳定病毒在细胞表面的吸附)和即刻 早期蛋白ICP27基因(该基因能启动病毒DNA进入细胞后转录和表达)作为靶基因串连起来 插入到pCDNA3.1，首次构建了HSV-2新型多表位DNA疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种能有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗及其制备方法。
本发明的技术路线为，首先培养扩增HSV-2病毒，并抽提其基因组DNA，同时用生物 信息学方法根据糖蛋白的免疫原性分析，选取所需的抗原表位，设计相应引物，然后用PCR 方法分段扩增所需的目的基因，最后把六段基因连接起来先克隆到pGEM-T载体上，再酶 切装入pcDNA3.1，得到抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗(HV-pcDNA3.1质粒)。
本发明提出的有效抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗，其组成如下：将HSV-2病毒胞膜 糖蛋白的强免疫原gD、gB、gC和参与病毒复制的即刻早期蛋白ICP27的主要抗原表位区 域，以主要保护性抗原gD为中心，选定6段抗原基因加间隔序列AAY串连到真核表达载 体pcDNA3.1，得到HV-pcDNA3.1质粒；其中6段抗原基因为ICP27上第377～459氨基酸 的一段抗原肽，gD上第1～77、第146～179、第223～306氨基酸的三段抗原肽，gB上第 529～606氨基酸的一段抗原肽和gC上第247～282氨基酸的一段抗原肽。
本发明提出的抗HSV-2感染的多表位DNA疫苗的制备方法，具体步骤如下：
1.设计引物：根据靶抗原免疫原性分析，以人HSV-2全病毒基因组DNA为(SEQ ID NO.7) 模板，设计6对引物(含酶切位点)，分别用于扩增三种包膜糖蛋白gD，gB和gC的主要 免疫优势区段和ICP27片段，引物序列见表1所列：
表1.DNA疫苗引物序列表 表位名 引物序列 ICP27 ICP27-F：5’CAG GAATTCGAAATGGACCCTATCATCGGAACG 3’(EcoRI) ICP27-R：5’CTA CTCTTCAGGCAGCCGTCTCGCCGGCCCCAAC 3’(EarI) gD2 PgD2-F：5’CAG CTCTTCTGCCTACAGCGAGGATAACCTGGGATT 3’(EarI) PgD2-R：5’GTC CTCTTCGCGTTGTGTGATCTCCGTCCAGTC 3’(EarI) gD3 PgD3-F：5’CCA CTCTTCAACGCTTTATCCCCGAAAACCA 3’(EarI) PgD3-R：5’CTA CTCTTCTGGCAGCGTGCGGCGCGACGTCCT 3’(EarI) gB4 PgB4-F：5’TAC CTCTTCTGCCTACCAGAACCACGAGCTGACTC 3’(EarI) PgB4-R：5’CTA CTCTTCTAAGCGGCCTGGTCTTCGTACCGAAAG 3’ (EarI) gC5 PgC5-F：5’TAG CTCTTCGCTTACGAGGGCCAGCCGTTTAAGG 3’(EarI) PgC5-R：5’GCA CTCTTCTGGCAGCGTGTATCTGGGCCGGATCG 3’(EarI) gD6 PgD6-F：5’CCA CTCTTCAGCCTACGCCAAATACGCCTTAGCAG 3’(EarI) PgD6-R：5’CGA GGTACCAATCATCACTCCGATGGGGCATGTAGGA 3’ (KpnI)
2.抗原靶基因的分段克隆回收：取HSV病毒裂解液，用Taqplus高保真DNA聚合酶 分别对6段选定的抗原基因进行PCR扩增。这6段抗原基因分别为：ICP27上第377～459 氨基酸的一段抗原肽(SEQ ID NO.1)，gD上第1～77(SEQ ID NO.2)、第146～179(SEQ ID NO.3)、第223～306(SEQ ID NO.4)氨基酸的三段抗原肽，gB上第529～606(SEQ ID NO.5) 氨基酸的一段抗原肽和gC上第247～282(SEQ ID NO.6)氨基酸的一段抗原肽；
取PCR扩增产物，用琼脂糖凝胶电泳观察是否有目的基因条带，把得到的目的基因 片段割胶回收、定量；
3.将六段PCR产物的酶切和连接：将纯化得到的各段HSV抗原片段分别用EarI酶切 成粘性末端，然后用T4 ligase把它们按照下述顺序连接(见图1所示)：
ICP27上的377～459，gD上的146～179，gD上的223～306，gB上的529～606，gC 上的247～282；gD上的1～77，得到完整的抗原表位，用于连接的间隔序列为AAY；
4.将串联后的目的基因构建质粒：将上述得到的完整抗原表位和真核表达载体 pcDNA3.1同时双酶切，然后连接起来，构成所需的DNA疫苗：HV-pcDNA3.1。
由本发明制备获得的DNA疫苗，经过对小鼠免疫试验，结果表明该疫苗能有效引起小 鼠特异性的体液免疫和细胞免疫应答。然后进行免疫小鼠毒性攻击试验：测定其戚率指标， 表明该疫苗免疫的有效性，而且具有特异性高、杀伤力强的优点。
附图说明
图1为多表位DNA复合疫苗抗原示意图。
图2为克隆抗原片断的路线图示。
具体实施方式
下面进一步描述本发明的实施方式。
1.引物设计：参照【图1】设计6对引物，以人HSV-2全病毒基因组DNA为模板，设 计引物(含酶切位点)分别扩增三种包膜糖蛋白gD，gB和gC的主要免疫优势区段和ICP27 片段。引物序列参见【表1】：
2.抗原靶基因的分段克隆回收：取2ul HSV病毒裂解液，用Taqplus高保真DNA聚 合酶分别对6段选定的抗原基因进行PCR扩增。条件如下：
50μl PCR扩增反应体系：ddH2O 9.5μl
10×Buffer 5.0μl
4×dNTP(10mM) 1.0μl
Primer F(10μM) 1.0μl
Primer R(10μM) 1.0μl
Template 2.0μl
Taqplus(5U/μl) 0.5μl
PCR扩增反应条件：
取2μl PCR扩增产物，2.0％琼脂糖凝胶电泳观察是否有目的基因条带。把得到的目的基 因片段割胶回收、定量。
3.六段PCR产物的酶切和连接：纯化得到的各段HSV抗原片段分别用Ear I酶切成粘 性末端，然后用T4 ligase把它们按照顺序先后联接。参照【图1】
Ear I酶切条件：
2ul Buffer；
1ul EarI；
10ul纯化的PCR片段；
7.5ul ddH2O；
反应Mix于37℃保温3h。
T4 ligase顺序连接各段酶切产物，4℃连接过夜，连接分别如下：
(1)2ul 10×T4 ligase buffer
1ul T4 ligase
8.5ul ICP1+8.5ul D2
(2)2ul 10×T4 ligase buffer
1ul T4 ligase
8.5ul D3+8.5ul B4
(3)2ul 10×T4 ligase buffer
1ul T4 ligase
8.5ul C5+8.5ul D6
把3段联接产物用1.5％琼脂糖电泳观察结果。切下3段连接片段，(1)号联接产物中 目的条带为377bp(A)，(2)号联接产物中目的条带为503bp(B)，(3)号联接产物中目的条 带为376bp(II)。回收这些目的片段。
用T4 ligase联接回收的A和B片段，4℃连接过夜，Mix如下：
2ul 10×T4 ligase buffer
1ul T4 ligase
8.5ul A+8.5ul B
把A和B的连接产物用1.5％琼脂糖电泳观察结果。切下600～1000bp条带对应的位 置，回收DNA，进行用PCR扩增。
50μl PCR扩增反应体系：ddH2O 39.5μl
10×Buffer 5.0μl
4×dNTP(10mM) 1.0μl
Primer ICP-F(10μM) 1.0μl
Primer B4-R(10μM) 1.0μl
Template 2.0μl
Taqplus(5U/μl) 0.5μl
PCR扩增反应条件：
取100μl PCR扩增产物，2.0％琼脂糖凝胶电泳切下880bp条带(I)，回收目的片段， 再用EarI酶切片段I，条件同前。
T4 ligase连接片段I酶切产物和回收的片段II，4℃连接过夜，Mix如下：
2ul 10×T4 ligase buffer
1ul T4 ligase
8.5ul I+8.5ul II
连接产物用1.4％琼脂糖电泳，切下1100～1300bp条带(HV)，回收目的片段。 PCR检验回收的HV片段是否有6段基因的连接产物：
50μl PCR扩增反应体系：ddH2O 39.5μl
10×Buffer 5.0μl
4×dNTP(10mM) 1.0μl
Primer ICP-F(10μM) 1.0μl
Primer D6-R(10μM) 1.0μl
Template 1.0μl
Taqplus(5U/μl) 0.5μl
PCR扩增反应条件：
共有6段抗原肽表位，分别为ICP27上第377～459氨基酸的一段抗原肽，gD上第1～77、 第146～179、第223～306氨基酸的三段抗原肽，gB上第529～606氨基酸的一段抗原肽 和gC上第247～284氨基酸的一段抗原肽。其中不同类型糖蛋白之间用间隔序列(AAY)连 接起来，以提高免疫活性并防止N端被破坏，起保护作用。
4.HV连接片段的克隆测序：将上述回收的HV片段连接到pGEM-T载体中，16℃连接 过夜：
1ul Progema T4 ligase
1ul pGEMT-vector
5ul 2×Progema T4 ligase Buffer
3ul HV纯化液
HV-pGEMT-vector连接产物，转化到E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性转化子鉴定。 分别对阳性转化子和pcDNA3.1空载体用EcoRI和KpnI双酶切，EcoRI单切质粒，37℃保 温3h：
3.0ul Buffer H
2.0ul EcoRI
20.0ul质粒
5.0ul ddH2O
纯化得到的EcoRI酶切质粒再用KpnI酶切37℃，3h：
3.0ul Buffer 1
0.3ul 100×BSA
2.0ul KpnI
24.7ul质粒
对于HV-pGEMT-vector双酶切产物切胶1200bp条带；pcDNA3.1空质粒双酶切产物则切胶 约5.4kb的条带，分别对其回收定量。HV片段联入pcDNA3.1载体，16℃过夜：
1ul 10×T4 ligase buffer
1ul T4 ligase
1ul双切pcDNA3.1回收片段
3ul HV双切回收片段
HV，pcDNA3.1连接产物转化入DH5α感受态细胞，挑选阳性重组子，得HV- pcDNA3.1，并测序验证。
5.免疫小鼠：C57/BL6雌性6周龄小鼠10只，随机分为2组(空载体pcDNA3.1阴 性组和HV-pcDNA3.1+IL2-pcDNA3.1实验组)，每组5只。方法是初次免疫为10ug质粒 和1ug脂质体融合转染C57/BL6小鼠单个核细胞于皮下注射；14天后二次免疫为100ug质 粒和10ug脂质体混合后直接注射C57/BL6小鼠肌肉中；再过14天后加强免疫一次50ug 质粒和5ug脂质体混合后直接注射C57/BL6小鼠肌肉中。再过14天后检测。
6.通过以下方法进行HSV-2多表位DNA疫苗的免疫原性鉴定：
(1)特异性IgG抗体ELISA结果 血清稀释400倍时的OD值阴性组为0.113±0.035； 实验组为0.288±0.091，效价约为500。
(2)杀伤性T细胞毒分析结果 用LDH法测定CTL杀伤率(％)，当效靶比为50∶1时， 阴性组为8.301±2.906；实验组为47.913±15.086。
(3)细胞因子检测结果 ELISA测得血清中mIL2和mIFN-γ的含量(ng/L)，阴性组mIL2 为685.21±104.20，mIFN-γ为547.71±189.33；实验组mIL2为1421.16±220.98，mIFN- γ为1956.19±219.60。
(4)T细胞抗原特异性增殖反应测定结果 MTT法测得的小鼠脾T淋巴细胞刺激指数 (SI)，阴性组为0.709±0.035；实验组为2.751±0.259。
结论：HSV-2多表位DNA疫苗能有效引起小鼠特异性的体液免疫和细胞免疫应 答。
7.具体应用：
根据一系列小鼠免疫指标的测定结果，表明该DNA疫苗构建设计是成功的。然后直接进 行HSV-2多表位DNA疫苗免疫小鼠病毒攻击实验，通过测定存活率指标，观察小鼠预防 HSV感染的动物试验效果，进一步反应了该疫苗的有效性。
临床应用：小鼠攻毒实验成功后，经临床I、II、III期实验，可作为抗HSV-2病毒的新 型DNA疫苗，用于预防和治疗感染HSV-2的疾病，如生殖器疱疹、宫颈癌、新生儿疱疹等 疾病。
序列表
SEQ ID NO.1：
DPIIGTAAAVLENLATRLRPFLQCYLKARGLCGLDDLCSRRRLSDIKDIASFVLVILARLANRVERGVSE
IDYTTVGVGAGET
SEQ ID NO.2：
AKYALADPSLKMADPNRFRGKNLPVLDQLTDPPGVKRVYHIQPSLEDPFQPPSIPITVYYAVLERACRS
VLLHAPSE
SEQ ID NO.3：
SEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQ
SEQ ID NO.4：
RFIPENQRTVALYSLKIAGWHGPKPPYTSTLLPPELSDTTNATQPELVPEDPEDSALLEDPAGTVSSQIPP
NWHIPSIQDVAPH
SEQ ID NO.5：
QNHELTLWNEARKLNPNAIASATVGRRVSARMLGDVMAVSTCVPVAPDNVIVQNSMRVSSRPGTCYS
RPLVSFRYEDQ
SEQ ID NO.6：
EGQPFKATCTAATYYPGNRAEFVWFEDGRRVFDPAQ
SEQ ID NO.7
ATGGACCCTATCATCGGAACGGCGGCCGCCGTGCTGGAAAACCTCGCCACGCGCCTGCGCCCCTT
TCTGCAGTGCTACCTGAAGGCCCGAGGCCTGTGCGGGCTGGACGACCTGTGCTCGCGGCGACGCC
TGTCGGACATTAAGGATATTGCCTCCTTTGTGTTGGTCATCCTGGCCCGCCTCGCCAACCGCGTCGA
GCGCGGCGTGTCGGAGATCGACTACACGACCGTGGGGGTTGGGGCCGGCGAGACGGCCGCTTAC
AGCGAGGATAACCTGGGATTCCTGATGCACGCCCCCGCCTTCGAGACCGCGGGTACGTACCTGCG
GCTAGTGAAGATAAACGACTGGACGGAGATCACACAACGCTTTATCCCCGAAAACCAGCGCACCG
TCGCCCTATACAGCTTAAA AATCGCCGGGTGGCACGGCCCCAAGCCCCCGTACACCAGCACCCTG
CTGCCGCCGGAGCTGTCCGACACCACCAACGCCACGCAACCCGAACTCGTTCCGGAAGACCCCG
AGGACTCGGCCCTCTTAGAGGATCCCGCCGGGACGGTGTCTTCGCAGATCCCCCCAAACTGGCAC
ATCCCGTCGATCCAGGACGTCGCGCCGCACGCTGCCTACCAGAACCACGAGCTGACTCTCTGGAA
CGAGGCCCGCAAGCTCAACCCCAACGCCATCGCCTCCGCCACCGTCGGCCGGCGGGTGAGCGCG
CGCATGCTCGGAGACGTCATGGCCGTCTCCACGTGCGTGCCCGTCGCCCCGGACAACGTGATCGT
GCAGAACTCGATGCGCGTCAGCTCGCGGCCGGGGACGTGCTACAGCCGCCCCCTGGTCAGCTTTC
GGTACGAAGACCAGGCCGCTTACGAGGGCCAGCCGTTTAAGGCGACGTGCACGGCCGCCACCTAC
TACCCGGGCAACCGCGCGGAGTTCGTCTGGTTCGAGGACGGTCGCCGGGTATTCGATCCGGCCCA
GGCTGCCTACGCCAAATACGCCTTAGCAGACCCCTCGCTTAAGATGGCCGATCCCAATCGATTTCG
CGGGAAGAACCTTCCGGTTTTGGACCAGCTGACCGACCCCCCCGGGGTGAAGCGTGTTTACCACA
TTCAGCCGAGCCTGGAGGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCATCCCGATCACTGTGTACTACGCAGTGC
TGGAACGTGCCTGCCGCAGCGTGCTCCTACATGCCCCATCGGAGTGATGA