技术领域
本发明属制药领域，涉及载脂蛋白A-I在制药中的用途，具体涉及载脂蛋白 A-I的抗内毒素与抑制细胞因子释放的新用途。
背景技术
载脂蛋白A-I(简称Apo A-I)作为血浆高密度脂蛋白(HDL)的主要成分，其 抗动脉粥样硬化功能已为国内外研究所确认。有报道，在机体急性相反应(acute phase response，APR)时，如微生物和寄生虫感染性炎症；内毒素血症；急性胰 腺炎、心脑梗塞、烧伤等非感染性炎症引起组织坏死，血清C-反应蛋白 (C-reactive protein，CRP)和血清淀粉样蛋白(serum amyloid A，SAA)急 剧升高(Morley JJ et al：Ann.N.Y.Acad.Sci.1982：389：406)，SAA与血 浆HDL相互作用(Gabanan VG et al：J.Lipid Res.1989：30：39；Shephard EG et al：Biochem.J.1987：248：919；Goetzee GA et al：J.Biol.Chem. 1986：261：9644)，SAA取代Apo A-I成为HDL中的主要载脂蛋白。
90年代中后期，国外对非特异性免疫细胞，如中性粒细胞、巨噬细胞等的 功能有了新的认识，它们不仅仅被认为是炎症反应效应细胞，也可能作为体内细 胞因子(cytokines，如肿瘤坏死因子TNF-α，白细胞介素系列IL等)的重要来 源(Gabrilovich Etd：“Neutrolphils：New outlook for old cells”Imperial College Press England.1999)，细胞因子集中大量释放形成细胞因子风暴 (cytokines stom)会造成机体极大伤害，直至组织坏死，休克死亡。内毒素 (LPS)是G-菌细胞壁上的一种组分，本质是脂多糖，LPS在体内大量释放导致 机体发热、低血压、休克、弥漫性血管内凝血、多器官衰竭甚至死亡。其直接诱 因是LPS引发的细胞因子风暴(Breyer I et al：Medicina(B Aires) 1998：58(1)：61-4)。SARS患者死亡的重要诱因是肺功能衰竭，其重要原因是免 疫系统过度激活，细胞因子及弹性蛋白酶大量释放，至今临床上仍无直接对抗 LPS及抑制细胞因子释放的有效药物。
发明内容
本发明的目的是提供Apo A-I在制药中的新用途，具体涉及Apo A-I的抗内 毒素与抑制细胞因子释放的新用途。
本发明通过常规方法制备Apo A-I，并经动物实验和细胞实验证实Apo A-I 具有抗内毒素与抑制细胞因子释放的新用途。
本发明Apo A-I能保护机体免受内毒素和细胞因子大量释放而导致对机体的 严重损伤。为机体急性相反应时直接对抗内毒素和抑制细胞因子释放提供一条新 的特效治疗途径。
具体实施方式
实施例1制备及纯化Apo A-I
(1)常规超速离心法分离人血浆(HDL)
收集d 1.063-1.21g/cm3的HDL部分，收集d＞1.21的无脂蛋白血浆部分(LFF)。
(2)制备与纯化Apo A-I
浓缩后的HDL经乙醇/乙醚脱脂，收集蛋白部分(Apo HDL)，经Bio CAD Workstation POROS HQ阴离子交换柱分离，获纯化Apo A-I。经SDS-PAGE电泳 鉴定，仅有一条Apo A-I条带。
实施例2 Apo A-I的抗内毒素(LPS)功能实验
(1)整体动物实验Apo A-I保护小鼠免受LPS损伤实验
实验分四组，每组10只昆明种小鼠，尾静脉注射LPS，注射量为0.18ml/10g， LPS剂量为4mg/kg，Apo A-I剂量为49mg/kg，LFF剂量为49mg/kg，连续观察48 小时。结果表明，Apo A-I具有对抗LPS对小鼠的致死作用，LFF存在增强Apo A-I 的作用。预试验结果显示LFF无对抗LPS的毒性作用。
(2)Apo A-I抑制内毒素激活的小鼠腹腔巨噬细胞释放细胞因子对L929细 胞的杀伤作用(MTT法)
按常规方法取小鼠腹腔巨噬细胞，调节密度4×106/ml，细胞培养板预培养 24小时。实验分三组，n＝5，培养液中LPS浓度0.2μg，Apo A-I 0.2mg/ml，LFF 0.1mg/ml，L929细胞5×105/ml。共培养16小时，以常规MTT法测定L929存活 率。结果表明，Apo A-I能对抗LPS刺激巨噬细胞释放细胞因子对L929细胞的 杀伤作用，LFF存在能增强Apo A-I的作用。
(3)Apo A-I体外结合LPS实验
采用荧光酶标法，Apo A-I+LPS组，将Apo A-I包板，洗涤后用BSA封闭， 再洗涤，加入FITC-LPS，洗涤后用荧光分光光度仪测荧光结合量。Apo A-I+LFF +LPS组，BSA封闭后加入LFF，洗涤后加入FITC-LPS，再洗涤后用荧光分光光 度仪测荧光结合量。结果表明，Apo A-I能直接结合LPS，LFF存在能增强Apo A-I 的作用。
本发明实验所用L929细胞购自中科院上海细胞所，所述巨噬细胞按常规方 法取自昆明种小鼠腹腔，所用LPS购自Sigma公司。
表1是Apo A-I对抗LPS对小鼠的杀伤作用。
表2是Apo A-I对抗LPS刺激巨噬细胞释放细胞因子对L929细胞的杀伤作 用。
表3是Apo A-I体外结合LPS试验结果。
表1 实验组 小鼠死亡率 小鼠平均存活时间(h) 1.LPS 2.LPS+Apo A-I 3.LPS+Apo A-I+LFF 90％ 70％ 40％ 6.8±6.17 12.0±8.69* 16.8±9.48**
*P＜0.05**P＜0.01
表2 实验组 L929细胞死亡率(％) 1.LPS 2.LPS+Apo A-I 3.LPS+Apo A-I+LFF 4.32±3.71 -5.35±2.07* -8.98±4.81**
*P＜0.05**P＜0.01
其中，数据负值表示细胞不但没有死亡，而且还有增长。
表3
组别(n＝4) Apo A-I+LPS Apo A-I+LFF+LPS
荧光强度 24.35±3.7 64.47±8.06*
*P＜0.01
实施例3 Apo A-I对中性粒细胞功能的调节作用实验
(1)Apo A-I对激活中性粒细胞粘附功能抑制作用
采用体外细胞培养法，常规由肝素抗凝兔血分离中性粒细胞，以fMLP激活， 同时与不同浓度的Apo A-I共培养，调节细胞密度至2×106/ml，接种至纤维结 合蛋白包被的细胞培养板，37℃培养30min，以PBS洗涤，结晶紫染色，酶标仪 测定光吸收度。结果表明，Apo A-I具有抑制fMLP激活的中性粒细胞粘附于纤 维结合蛋白的作用，其抑制作用随Apo A-I浓度增加而增强。
(2)Apo A-I抑制激活中性粒细胞释放细胞因子(TNF-α等)对L929细胞 杀伤作用实验(MTT法)
采用体外细胞培养法，常规由肝素抗凝兔血分离中性粒细胞，以fMLP激活， 同时与不同浓度的Apo A-I共培养，调节细胞密度至2×106/ml，37℃培养30min， 离心，弃上清液，调细胞密度至2×106/ml，加至L929细胞共培养12h，MTT法 测定L929细胞存活率。结果表明，Apo A-I具有抑制激活的中性粒细胞释放细 胞因子如TNF-α杀伤L929细胞的作用。
(3)Apo A-I抑制激活中性粒细胞释放超氧阴离子作用(NBT法)
采用体外细胞培养法，常规由肝素抗凝兔血分离中性粒细胞，以fMLP激活， 同时与不同浓度的Apo A-I共培养，调节细胞密度至2×106/ml，37℃培养30min， NBT染色，酶标仪测定光吸收度。结果表明，Apo A-I具有抑制激活的中性粒细 胞产生超氧阴离子的功能，其抑制功能随着Apo A-I浓度增加而增强。
(4)Apo A-I对中性粒细胞脱粒功能抑制作用
采用体外细胞培养法，常规由肝素抗凝兔血分离中性粒细胞，以fMLP激活， 同时与不同浓度的Apo A-I共培养，调节细胞密度至2×106/ml，37℃培养30min， 离心收集上清液，分别测定上清液中的弹性蛋白酶及髓过氧化物酶活性。结果表 明，Apo A-I具有抑制激活的中性粒细胞脱颗粒的作用，其抑制作用随着Apo A-I 浓度增加而增强。
本发明实验所用fMLP、纤维结合蛋白购自Sigma公司
表4是Apo A-I抑制激活中性粒细胞粘附到纤维结合蛋白的结果。
表5是Apo A-I抑制激活的中性粒细胞释放细胞因子杀伤L929细胞的作用。
表6是Apo A-I抑制激活的中性粒细胞产生超氧阴离子作用的结果。
表7是Apo A-I抑制激活的中性粒细胞释放弹性蛋白酶的结果。
表8是Apo A-I抑制激活的中性粒细胞释放髓过氧化物酶的结果。
表4
中性粒细胞粘附率
ApoA-I(μg/ml) 0 2.5 5 10
1、中性粒细胞 17.3±0.7％ 17.1±0.2％ 17.3±0.0％ 17.3±0.0％
2、中性粒细胞+fMLP 24.1±1.6％** 22.2±2.1％**，Δ 15.7±0.3％ΔΔ 10.6±1.0％**，ΔΔ
与1组比较：**P＜0.01，n＝3；与2/0组比：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01
表5
n＝3
与1组比较：**P＜0.01，与2/0组比较：ΔP＜0.05，
表6
A570nm
ApoA-I(μg/ml) 0 2.5 5 10
1、中性粒细胞 0.16±0.0
2、中性粒细胞+fMLP 0.20±0.0** 0.15±0.0ΔΔ 0.13±0.0**，ΔΔ 0.12±0.0**，ΔΔ
n＝3
与1组比较：**P＜0.01，与2/0组比：ΔΔP＜0.01，
表7
弹性蛋白酶产物(μM)
ApoA-I(μg/ml) 0 2.5
1、中性粒细胞 29.6±1.4
2、中性粒细胞+fMLP 42.2±0.7** 21.5±0.5％**，ΔΔ
n＝3，与1组比较：**P＜0.01，与2/0组比：ΔΔP＜0.01
表8 Apo A-I抑制激活中性粒细胞释放髓过氧化酶(MPO)的作用
释放MPO占细胞总MPO活性％
ApoA-I(μg/ml) 0 2.5 5 10
1、中性粒细胞 50.4±0.5％
2、中性粒细胞+fMLP 93.0±1.0％** 58.7±0.9％*’ΔΔ 50.8±0.3％ΔΔ 46.1±0.6％*’ΔΔ
n＝3
与1组比较：*P＜0.05，**P＜0.01与2/0组比：ΔΔP＜0.01