技术领域
本发明涉及一种防治鸡大肠杆菌病的药物，具体地说是以中草药原料制成的制剂。
背景技术
鸡大肠杆菌是条件致病菌，当机体抵抗力下降后，某些血清型可导致机体发病，出现多种症状和病理变化，它是严重影响养鸡健康发展和食品安全的病原菌。随着养鸡集约化程度的日益提高，大肠杆菌病的发病率居高不下，发病率为11～69％，死亡率为3.8～72.9％。由于临床药物使用的不规范，大肠杆菌多重耐药性日益严重，有些菌株甚至对22种抗生素具有耐药性，造成抗菌药物临床治疗效果差、药物残留高、潜在生物危害严重等问题，因此，研究与开发新型高效抗菌制剂已成为热点。
大量试验已经证实，中兽医理论体系指导下研制的中药制剂具有高效、长效、低毒、低残留、低副作用和不易产生耐药性、消除耐药质粒等特点，已成为养鸡业健康发展和保障食品安全的首选防治药品。目前防治鸡大肠杆菌病的中药制剂有白头翁汤、郁金散等，这些中药制剂对鸡大肠杆菌具有一定的防治效果，但是在防治效果方面仍待进一步改善。为研制新型中药抗菌制剂，我们进行了抗菌中草药的筛选研究，在此基础上依据中兽医学理法方药要求，针对鸡大肠杆菌临床证候，科学组方，分别进行了组方、生产工艺、体外抗菌、大肠杆菌攻毒保护等试验。结果表明该制剂能很好的预防和治疗鸡大肠杆菌病。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种防治鸡大肠杆菌病的中药制剂及生产工艺，该中药制剂疗效显著，无毒副作用。
本发明的技术方案为：一种防治鸡大肠杆菌病的中草药口服液，其特征是，由下述重量份的中草药制成：生石膏28-32、千里光14-16、墨旱莲14-16、侧柏叶18-22、地锦草9-11和党参9-11。
优选配比(重量份)：生石膏30、千里光15、墨旱莲15、侧柏叶20、地锦草10和党参10。
生产工艺为：
(1)药物称量：按上述重量份称取各味中草药，生石膏4层纱布单包；
(2)第一次煎煮：生石膏与其余多味药分别加温水(40～50℃)浸泡0.5-1.5小时；生石膏先煎25-35分钟，再加其余中草药煮沸25-35分钟，过滤；
(3)第二次煎煮：滤渣再加入温水(40～50℃)浸泡0.5-1.5小时，煮沸40-80分钟，过滤，合并两次滤液；
(4)然后经浓缩、澄清、精滤、防腐、灌装，得到每毫升含生药1g的药液。
适用范围：家禽外感邪疫所致的恶寒发热、喜饮，排料便或黄绿色、黄白色、血色稀便。
使用方法：预防用量为，0.25～0.5ml/kg体重，饮水，2次/日，连用3～5日；治疗，1～1.5ml/kg体重，饮水，2次/日，连用5～7日。
本发明所选中草药的药性及药理分析如下：
生石膏：硫酸盐类矿物硬石膏族石膏。味辛、甘，微寒。归肺、胃经。具清热泻火，生津止渴之功效。主治外感热病，肺热喘促，胃热贪饮，壮热神昏，狂躁不安。现代医学研究证实生石膏具有退热，镇痉、消炎、解渴，降糖，补钙作用和硫酸多糖化作用，增强免疫力，促进凝血，利胆和利尿作用。内服经胃酸作用，一部分变成可溶性钙盐，至肠吸收入血后能增加血清内钙离子的浓度，可抑制体温调节中枢、减轻骨骼肌的兴奋性、减少血管通透性，故有解热、镇痉、消炎等作用。
千里光：为菊科植物千里光Senecioscandens Buch,-Ham.的地上部分。味苦，性寒，归肝肾经。具清热解毒、凉血消肿、清肝明目之功效。用于上呼吸道感染、扁桃体炎、眼结膜炎、痢疾、肠炎等。主要含毛莨黄素(flavoxanthin)、菊黄素(chrysanthema xanthin)、黄酮、鞣质、生物碱等。研究证实千里光有广谱抗生素作用，对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、甲型副伤寒杆菌、乙型副伤寒杆菌、志贺、鲍氏、宋氏痢疾杆菌均有较强的抑制作用。
墨旱莲：为菊科属植物鱧肠Herba Echiptae的全草。味甘、酸，性凉，归肾经，具有凉血止血、补益肝肾、清热解毒之功效。主要用于治疗吐血、衄血、尿血、便血、血崩、肠炎、痢疾等。全草挥发油、鞣质皂甙约含1.32％。旱莲草叶粉对狗半切断股动脉具有明显的止血效果。
侧柏叶：柏科植物侧柏Platycladus orientalis(L.)Franco的嫩枝叶。苦涩，寒。入心、肝、大肠经。具有凉血、止血，祛风湿，散肿毒之功效。主要用于治疗吐血、衄血、尿血、血痢、肠风、崩漏，风湿痹痛，细菌性痢疾，高血压，咳嗽，丹毒，痄腮，烫伤。枝叶含侧柏苦味素、侧柏酮、槲皮素、小香酮(fenchone)、挥发油。侧柏叶及所含黄酮类对小鼠具有镇咳祛痰作用；可使小鼠气管平滑肌松弛，可部分阻断乙酰胆碱对平滑肌的作用；本品可使实验动物安静闭目自由活动减少，与苯巴比妥具有协同作用；对金黄色葡萄球菌、卡他球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、白喉杆菌等均有抑制作用。
地锦草：为大戟科植物地锦Euphorbia humifusa Willd.或斑地锦Euphorbia maculata L.的干燥全草。味辛，性平。归肝、大肠经。具清热解毒，凉血止血之功效。用于痢疾，泄泻，咳血，尿血，便血，崩漏，疮疖痈肿。地锦草含没食子酸、没食子甲脂、槲皮甙、槲皮素、肌醇和鞣酸等.没食子酸为其主要抗菌有效成分.该品粉末局部使用，对于犬动脉切开出血有明显的止血作用；地锦草能抑制白喉杆菌的生长，亦有中和白喉毒素的作用，能降低白喉杆菌外毒素所致豚鼠死亡。该品抑菌、杀菌和中和白喉毒素的作用，以酊剂最好，煎剂次之，浸膏较差。
党参：为桔梗科党参属植物党参Codonopsis pilosula(Franch)Nannf.的根。味甘、微酸，性平；归脾、肺经。具有补中益气(善益脾气)、健脾益肺、抗癌、降压、抗缺氧、抗衰老之功效，还可以增强机体免疫力，提高超氧化物歧化酶的活性，增强消除自由基的能力，具有调节胃肠运动、抗溃疡、抑制胃酸分泌、降低胃蛋白酶活性的作用。
配方解析：本发明中地锦草、墨旱莲、侧柏叶、千里光均具有凉血止血、清热之功效，可有效缓解血热妄行、脏器出血、纤维素性渗出之内脏病变，共为主药，体现传统医学之“留有一分血，保有一分命”的精髓；生石膏具清热泻火、生津止渴之功，可有效解除发热、喜饮之主要症状，为辅药；党参补中益气，健脾益肺，与生石膏配伍，凸显益气清热之功，清热不伤正，同时健脾补肺不恋邪，迅速恢复脾胃功能，水谷精微得以消化吸收，气、血、津液生化之源充足，阴平阳秘，机体康复为佐使药。
鸡大肠杆菌病的病因病机：鸡大肠杆菌病属外感湿热邪疫之症。当机体抵抗力下降时，大肠杆菌首先侵袭外表、皮毛。由于肺和皮毛相表里，出现杂毛、发热、畏寒、喜饮，继而出现鼻腔有粘液，眼睛流泪等症状；热邪侵入脾胃，脾胃腐熟食物功能失调，则出现完谷不化、料便，继而导致肠分清泌浊受阻，出现黄绿稀便；如热邪侵入心包络，由于心主神志，出现精神萎靡、神昏、嗜睡，剖检可见心包积液，心包膜混浊、增厚；如热邪侵袭肝脏，导致肝脏肿大出血，肝被膜增厚甚或成纤维素渗出膜。由于正邪相搏，邪胜于正，血热妄行，脾脏统血功能失调，血溢于脉管之外，而大量器官出血，如腺胃、气管、喉头、皮下、肠道等。因此，选用凉血止血之药，解除内在器官黏膜出血之主证；选用清热泻火之药，清除体内热，以达标本兼治之目的。
本发明的有益效果：本发明针对鸡大肠杆菌临床证候，科学组方，分别进行了组方、生产工艺、体外抗菌、大肠杆菌攻毒保护等试验。结果表明该制剂能很好的预防和治疗鸡大肠杆菌病，且无毒副作用。本发明组方简单，与动辄10几味甚至20几味的药方相比，具有组方精炼，主次分明，针对性强，产品质量易于控制，鉴别容易等优点。
具体实施方式
实施例1
配比(重量份)：生石膏30、千里光15、墨旱莲15、侧柏叶20、地锦草10、党参10。
(1)药物称量：按上述重量份称取各味中草药，生石膏4层纱布单包；
(2)第一次煎煮：生石膏与其余多味药分别加6倍量温水(40～50℃)浸泡1小时；生石膏先煎30分钟，再加其余中草药煮沸30分钟，过滤；
(3)第二次煎煮：滤渣再加入4倍量温水(40～50℃)浸泡1小时，煮沸1小时，过滤，合并两次滤液；
(4)浓缩：滤液真空减压(<60kpa)浓缩至1g生药/1ml药液；
(5)澄清：36℃加入6％KBT-ZTC5％溶液(科立尔研发的天然中药澄清剂)，搅拌，静置30min，过夜；
(6)精滤后加入0.3％苯甲酸钠防腐；
(7)灌装：药液温度下降至50℃时，边搅拌边灌装，封口。
使用方法：预防用量为，0.25～0.5g/kg体重，饮水，2次/日，连用3～5日；治疗，1～1.5g/kg体重，饮水，2次/日，连用5～7日。
实施方式2复方中药体外抗菌试验
1试验材料
1.1供试药剂：
组方一(白头翁汤)：白头翁25、黄连25、黄柏25、秦皮25；水煎煮，1g生药/1ml药液；
组方二(郁金散)：郁金12、大黄12、栀子12、黄芩15、黄柏12、黄连25、诃子12、白芍12；水煎煮，1g生药/1ml药液；
组方三(实施例1的药物)：生石膏30、千里光15、墨旱莲15、侧柏叶20、地锦草10、党参10。
1.2试验药物均购于济南市建联中药有限公司，经鉴别符合2010版《中华人民共和国兽药药典》(二部)要求；编号为09-29的大肠杆菌，血清型为O24，山东省农业科学院家禽研究所分离的地方株；牛肉浸膏、蛋白胨、营养琼脂，北京双旋微生物培养基制品厂。
1.3主要仪器设备超净工作台，济南杰康净化设备厂产品；ZD-85A数显气浴恒温振荡器，常州普天仪器制造有限公司产品。双碟，陶瓦盖，钢管等。
2试验方法
2.1药液的制备上述制剂6000r/min离心3min，取上清液121℃高压灭菌15min，4℃冰箱保存备用。
2.2菌液制备取09-29菌液0.1mL接种于5mL普通NB培养基，至恒温气浴振荡器中，150r/min，37℃培养过夜，细菌含量为30.0×1010CFU/mL。菌液低温离心，取白色沉淀，用无菌PBS液稀释至菌液体积备用。
2.3药敏试验管碟法(抗生素效价测定法)用刻度吸管吸取普通营养琼脂培养基加于双碟中，每碟20ml，盖上陶瓦盖，待凝固；取培养好的试验，按0.5％的比例将菌液加到冷至约45℃的普通营养琼脂培养基中，混合均匀，用刻度吸管吸取加于铺好底层的双碟中，立即转动双碟，使含菌培养基均匀铺于底层之上，盖上陶瓦盖，待凝固；用镊子将钢管摆放于凝固好的培养基上，用微量移液器将中药药液加于钢管中，每管300μl。转入37℃恒温培养箱，培养24h，取出测量抑菌直径，取平均值。
3结果
表1复方中药体外抗菌效果(mm)
备注：*抑菌圈边界透明清晰。
从表1可以看出：三种组方均有不同程度的抑菌作用，以组方3的抑菌圈直径最大。
4结论：本发明的制剂体外抑菌效果最好，对大肠杆菌具有明显的抑制作用。
实施方式2复方制剂体内抗大肠杆菌试验
1试验材料
1.1试验药物组方1、组方3中药材均购于济南市建联中药有限公司，经鉴别符合2010版《中华人民共和国兽药药典》(二部)要求；编号为09-29的大肠杆菌，血清型为O24，山东省农业科学院家禽研究所分离的地方株；19日龄SPF公鸡，山东省农业科学院家禽研究所试验场提供；牛肉浸膏、蛋白胨、营养琼脂，北京双旋微生物培养基制品厂。
1.2主要仪器设备超净工作台，济南杰康净化设备厂产品；ZD-85A数显气浴恒温振荡器，常州普天仪器制造有限公司产品，SPF鸡饲养隔离器，苏州冯氏实验动设备有限公司产品。
2、试验方法
2.1菌液制备取09-29菌液0.1mL接种于5mL普通NB培养基，至恒温气浴振荡器中，150r/min，37℃培养过夜，细菌含量为30.0×1010CFU/mL。菌液低温离心，取白色沉淀，用无菌PBS液稀释至菌液体积备用。
2.2大肠杆菌LD50测定选用19日龄SPF公雏，分为0.2mL、0.3mL、0.4mL组，每组10只鸡，腹腔接种菌液。经统计0.4mL组48h死亡率为50％，此即为大杆菌LD50，依此确定为接种剂量。
2.3人工感染鸡大肠杆菌模型构建选取19日龄SPF公雏，无菌腹腔接种离心菌液0.4mL/只。
2.4试验分组试验分中药组、攻菌组和空白对照组，每组30只鸡。中药组分别设预防组、治疗组，编号为1-1、1-2等。
2.5用药方法攻菌前、后均按2mL/kg体重分上下午两次灌服，试验组提前1天灌药，攻菌对照组与空白对照组，同步灌服等量生理盐水。
2.6数据处理详细记录攻菌24h和48h累计死亡率。所有数据均以平均值±标准差表示，并统计其差异性。
3结果
3.1最早死亡时间预防效果1-1、1-2、攻菌对照均为攻菌后8h，其余各组均为攻菌后24h。
3.224h死亡率1-1组极显著高于3-1组，1-2组与3-2组差异不显著，1-2组、3-1组均极显著低于攻菌对照组，3-2组显著低于攻菌对照组。
3.396h存活率1-1组、1-2组均极显著低于5-1组、5-2组，与攻毒对照组差异不显著；5-1组、5-2组均极显著高于攻菌对照组。
表2复方中药体内抗菌效果表(h、％)
4结论以最早死亡时间、24h死亡率和96h存活率为评价指标，组方3预防和治疗效果显著优于组方1。
实施方式3大肠杆菌病临床疗效试验
本试验选用鸡大肠杆菌自然发病病例，使用复方制剂进行治疗，以进一步确定其临床疗效和安全性。
1试验材料
1.1药物组方3按规定工艺制成每mL药液含生药1g；对照药物，白头翁口服液，烟台绿叶动物保健品有限公司生产，批号为20120603。
1.2实验动物30日龄自然发病AA肉鸡。
2试验方法
2.1大肠杆菌病发病鸡群的选择：鸡群出现精神沉郁、羽毛蓬乱、翅下垂、闭目嗜睡、独居一隅或聚堆，排黄绿色稀粪，剖检出现心包炎、肝周炎、气囊炎等特征性病变，取肝脏病料进行细菌分离鉴定，确诊为大肠杆菌病。
2.2试验分组：将同一发病鸡群分为3组，分别为制剂1组、制剂2组和白头翁口服液治疗组，作为阳性药物对照。
2.3用药：试验组，鸡每天每kg体重剂量为1mL，分上、下午2次饮水用药，连用5天；白头翁口服液对照组，鸡每天每kg体重剂量为1mL，分上、下午2次饮水用药，连用5天。
2.4观察指标
2.4.1临床症状：给药后，每天观察两组的外观表现，行为活动，精神状况，粪便情况，发病和死亡情况等，观察鸡群临床症状改善状况。
2.4.2体重：用药前和用药后分别取样对两组鸡的体重进行称量。
2.4.3死亡率：每天记录死亡数，最后计算死亡率。
3结果与分析
3.1临床症状情况
制剂用药组用药2天后，鸡群精神状况开始好转，死亡数开始下降。用药5天后，死亡停止，鸡群基本恢复正常。
白头翁口服液对照组用药3天后，鸡群精神状况开始好转，死亡开始减少。用药5天后，鸡仍有零星死亡。用药后7天，鸡群基本恢复正常。
从临床表现上进行总体评判，制剂治疗组较白头翁口服液对照组效果更加明显。
3.2体重
用药前(30日龄)和用药结束时(36日龄)时各组的体重结果见表3。试验组增重率极显著高于白头翁对照组。
表3各组的体重情况
备注：**表示差异极显著，p＜0.01.
3.3死亡情况
试验组鸡群存活率分别为94.6％，较白头翁口对照组高2.2个百分点，差异显著。
表4制剂治疗鸡大肠杆菌病临床疗效结果(只，％)
备注：*表示差异显著，p＜0.05.
4结论
通过对两组鸡群临床症状、雏鸡增重及死亡率进行综合对比分析，结果表明试验药与白头翁口服液相比，具有极显著增加体重，显著降低死亡率的作用。