R‑2‑甲基‑3‑巯基丙酸在制备抑制产NDM‑1耐药细菌活性的药物中的用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201110409294.X (22)申请日 2011.12.09 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103156833 A (43)申请公布日 2013.06.19 (73)专利权人 天津市国际生物医药联合研究院 地址 300457 天津市滨海新区经济技术开 发区洞庭路220号 (72)发明人 饶子和 杨诚 陈悦 白翠改 郭宇 徐寅通 夏强 王泰一 李宁宁 徐峰 (74)专利代理机构 北京德恒律师事务所 11306 代理人 陆鑫 房岭梅 (51)Int.Cl. A。

2、61K 31/19(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (56)对比文件 Jin, Wanchun 等.Comparative study of the inhibition of metallo-lactamas (IMP-1 and VIM-2) by thiol compounds that contain a hydrophobic group. Biological & Pharmaceutical Bulletin .2004,第27卷(第6 期), Jin, Wanchun 等.Comparative study of the inhibition of m。

3、etallo-lactamas (IMP-1 and VIM-2) by thiol compounds that contain a hydrophobic group. Biological & Pharmaceutical Bulletin .2004,第27卷(第6 期), 王卫萍等.不同酶抑制剂检测金属-内酰 胺酶的比较和改进. 临床检验杂志 .2004,第22 卷(第06期), 王春新等.利用2-巯基丙酸检测产金属- 内酰胺酶细菌. 江苏大学学报(医学版) .2003, 第13卷(第04期), 王春新等.利用2-巯基丙酸检测产金属- 内酰胺酶细菌. 江苏大学学报(医学版) .200。

4、3, 第13卷(第04期), 孙长贵.产NDM-1酶细菌研究进展. 实验与 检验医学 .2011,第29卷(第02期), 审查员 肖瑛 (54)发明名称 (R)-2-甲基-3-巯基丙酸在制备抑制产NDM- 1耐药细菌活性的药物中的用途 (57)摘要 本发明提供了(R)-2-甲基-3-巯基丙酸在制 备抑制耐药细菌活性的药物中的用途， 其中所述 (R)-2-甲基-3-巯基丙酸的结构式如下： 该化合物可以有效地抑制NDM- 1的活性。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 103156833 B 2017.07.14 CN 103156833 B 1.(R)-2-甲基-3-巯基丙酸在制备抑制产。

5、新德里金属 -内酰胺酶耐药细菌活性的药物 中的用途， 其中所述(R)-2-甲基-3-巯基丙酸的结构式如下： 2.根据权利要求1所述的用途， 其中所述耐药细菌对于 -内酰胺类抗生素、 氨基糖苷 类、 喹诺酮类抗菌药物具有耐药性。 3.根据权利要求1所述的用途， 其中所述产新德里金属 -内酰胺酶耐药细菌选自大肠 埃希菌、 肺炎克雷伯菌、 阴沟肠杆菌、 变形杆菌、 弗劳地枸橼酸菌、 产酸克雷伯菌、 摩根摩根 菌、 普罗威登菌中的一种或多种。 4.根据权利要求1所述的用途， 其中所述药物包含所述(R)-2-甲基-3-巯基丙酸和一种 或多种 -内酰胺类抗生素。 5.根据权利要求4所述的用途， 其中所述 。

6、-内酰胺类抗生素选自青霉素类、 头孢菌素 类、 头霉素类、 硫霉素类、 单环 -内酰胺类和碳青霉烯类抗生素中的一种或多种。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 103156833 B 2 (R)-2-甲基-3-巯基丙酸在制备抑制产NDM-1耐药细菌活性的 药物中的用途 技术领域 0001 本发明涉及药学领域， 具体而言， 涉及(R)-2-甲基-3-巯基丙酸的用途。 背景技术 0002 在被称为抗生素 “黄金时代” 的20世纪五六十年代， 全世界每年死于感染性疾病的 人数约为700万， 这一数字到1999年上升到了2000万。 病死率升高的主要原因是耐药菌带来 的用药困难。 0003 目前。

7、， 细菌耐药性问题已经非常严重。 在发达国家， 有510的住院病人发生 过一次或更多的感染。 美国每年发生医院感染的患者约为200万， 死亡90000人， 经济损失达 45亿57亿美元。 在发展中国家， 发生医院感染的危险要高出发达国家2倍20倍。 我国医 院感染发生率为6左右， 但漏报率很高， 可达50以上， 致死率尚不清楚。 主要感染部位依 次为下呼吸道、 泌尿道及手术切口感染等。 0004 2010年8月， 著名医学杂志 柳叶刀 报道了一例对所有 -内酰胺类抗菌药物耐药、 对环丙沙星也不敏感、 仅对粘菌素敏感的病例， 深入研究发现其携带肺炎克雷伯菌 (Klebsiella pneumon。

8、iae)编码的一种新型金属 -内酰胺酶， 并根据患者可能感染地点(印 度新德里)将这种酶命名为新德里金属 -内酰胺酶(NDM-1， New Delhi metallo- - lactamase-1)。 0005 根据上述研究结果， 英国、 印度等国研究人员在印度、 巴基斯坦、 英国等开展了较 大范围的流行病学调查， 产NDM-1肠杆菌科细菌占所检测细菌的1.2-13， 主要菌种为大 肠埃希菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯菌， 其它细菌还有阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、 变形杆菌(Proteus species)、 弗劳地枸橼酸菌(Citrobacte。

9、r freundii)、 产酸 克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、 摩根摩根菌(Morganella morganii)、 普罗威登菌 (Providencia Ewing)等； 这些细菌主要引起尿路、 血流、 伤口、 肺部和导管相关感染等。 不 到一个月的时间内， 在美国、 加拿大、 日本、 韩国、 澳大利亚、 比利时以及我国大陆、 香港、 台 湾地区等都已经有感染病例报道。 0006 由于产NDM-1细菌的蔓延十分迅速， 有关产NDM-1细菌感染治疗的临床和基础研究 还较少。 目前已经阐明NDM-1属于B类 -内酰胺酶超家族中的一员， 在其活性部位结合有锌 离子， 因此又称。

10、为金属 -内酰胺酶。 其水解底物包括青霉素类、 头孢菌素类和碳青霉烯类 等， 表现为产酶细菌对这些药物广泛耐药。 与之前发现的其他B类 -内酰胺酶相比， NDM-1具 有能够水解几乎所有的 -内酰胺类抗生素， 且耐受大多数 -内酰胺酶抑制剂等特点。 NDM-1 的存在是导致NDM-1超级细菌几乎对所有 -内酰胺抗菌药物耐药的分子基础， 同时由于细 菌具有其它耐药机制， 对氨基糖苷类、 喹诺酮类等也多耐药， 目前只对多粘菌素和替加环素 具有较高体外敏感性。 0007 NDM-1能轻易地从一种细菌跳到另一种上面， 科学家忧虑NDM-1跟危险性病毒接 合， 变成无法医治的人传人病毒， 并且NDM-1。

11、是一种多重抗药性细菌， 一旦在全球散播， 抗生 说 明 书 1/4 页 3 CN 103156833 B 3 素作废的时期将拉开序幕， 因此开发能够抑制NDM-1活性的药物迫在眉睫。 发明内容 0008 本发明提供了化合物(R)-2-甲基-3-巯基丙酸的用途， 具体而言， 提供了其在制备 抑制耐药细菌活性的药物中的用途， 尤其是在制备抑制产NDM-1耐药细菌活性的药物中的 用途， 其中(R)-2-甲基-3-巯基丙酸的结构式如下： 0009 0010 在该用途中， 所述耐药细菌是指对于几乎所有的 -内酰胺类抗菌药物具有耐药 性， 同时对氨基糖苷类、 喹诺酮类抗菌药物也多具有耐药性的细菌。 在一个。

12、具体实施例中， 耐药细菌是指产NDM-1耐药细菌。 产NDM-1耐药细菌选自大肠埃希菌、 肺炎克雷伯菌、 阴沟肠 杆菌、 变形杆菌、 弗劳地枸橼酸菌、 产酸克雷伯菌、 摩根摩根菌、 普罗威登菌等中的一种或多 种。 0011 所述抑制耐药细菌的活性的药物包含上面所述的化合物(R)-2-甲基-3- 巯基丙 酸和一种或多种 -内酰胺类抗生素。 -内酰胺类抗生素选自青霉素类、 头孢菌素类、 头霉素 类、 硫霉素类、 单环 -内酰胺类和碳青霉烯类抗生素中的一种或多种。 0012 本发明涉及的化合物可以购买获得， 也可以通过简单的合成制备得到。 0013 本发明化合物(R)-2-甲基-3-巯基丙酸对NDM。

13、-1具有很好的抑制效果， 从而可以减 少甚至消除NDM-1对 -内酰胺类抗生素的水解， 解决由于NDM-1引起的耐药性。 因此， 将(R)- 2-甲基-3-巯基丙酸与 -内酰胺类抗生素联用， 通过明显抑制NDM-1的活性， 可以进一步提 高抗生素的疗效， 从而能够治疗由NDM-1引起的耐药细菌感染， 具有良好的药物应用前景。 附图说明 0014 图1示出了药筛酶活体系底物亚安培南一水合物的化学结构式及其与NDM-1的作 用位点。 0015 图2示出了底物亚安培南一水合物反应前后全波长扫描的紫外吸收光谱图的比较 结果。 0016 图3示出了根据本发明实施例的(R)-2-甲基-3-巯基丙酸的NDM。

14、-1剩余活性分数对 浓度对数的曲线图。 具体实施方式 0017 下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。 0018 木发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义， 即便如此， 本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释， 提及的术语和短语如有与 公知含义不一致的， 以本发明所表述的含义为准。 本文所用的缩略语通常为本领域技术人 员所熟知的， 或者可以是根据基础知识易于理解的。 所用的一部分缩略语及其含义如下所 示： 0019 NDM-1 新德里金属 -内酰胺酶-1 说 明 书 2/4 页 4 CN 103156833 B 4 0020 HEPES 4-羟乙基哌嗪乙。

15、磺酸 0021 ddH2O 双蒸水 0022 ep管 Eppendorf微量离心管 0023 BSA 小牛血清蛋白 0024 IC50 半数抑制浓度 0025 药理活性测试部分 0026 本发明的活性测试方法以亚胺培南一水合物作为NDM-1的底物进行活性检测， 亚 胺培南一水合物的结构式见图1， 其中 表示NDM-1裂解底物的反应部位。 其酶活机制 是： 底物亚胺培南一水合物的母核部分具有OC-N-CC共轭结构， 表明底物可产生紫外吸 收。 由于NDM-1可以水解 -内酰胺环酰胺键， 因此NDM-1与底物反应时可以水解底物的酰胺 键， 导致共轭结构被破坏， 从而使紫外吸收消失。 通过对比NDM。

16、-1与底物反应前后的全波长 扫描紫外吸收光谱图发现， 底物在300nm处有最强紫外吸收， 如图2所示。 如果化合物对NDM- 1具有抑制作用， 则阻止了NDM-1对底物的水解， 导致底物的紫外吸收值降低减慢， 由此可以 判断化合物对NDM-1是否具有抑制效果， 从而进行NDM-1抑制剂药物的筛选。 0027 本发明的活性测试方法包括以下6个步骤： 0028 步骤1.NDM-1底物储备液的制备 0029 将亚胺培南一水合物(Imipenem monohydrate， 购自Sigma公司)溶于50mM HEPES (购自BioBasic公司)中， 配制成10mM的底物储备液备用。 0030 步骤2。

17、.化合物的处理 0031 将化合物溶解于95DMSO+5ddH2O， 配制成100mM浓度的溶液， 然后将配制好的 化合物溶液放置在1.5ml ep管中， 于4下保存备用。 0032 步骤3.NDM-1蛋白缓冲液的配制 0033 将NDM-1(由本实验室MDC蛋白纯化组提供， 制备方法参见Yu Guo， Jing Wang等， A structural view of the antibiotic degradation enzyme NDM-1 form a superbug.Protein & Cell， 2011， 2(5)： 384-394)溶解在蛋白缓冲液(pH6.8)中， 配制成 。

18、50nM的NDM-1蛋白缓冲液， 其中蛋白缓冲液含有50mM HEPES、 5 M ZnCl2(购自BioBasic公 司)、 10 g/ml BSA(购自上海生工工程有限公司)。 0034 步骤4.NDM-1药筛酶活体系的建立 0035 NDM-1药筛酶活体系中包含的成分， 其体积和浓度见表1。 0036 表1NDM-1的药筛酶活体系 0037 体系 体积 浓度 NDM-1 100 l 50nM 底物 50 l 600 M 化合物 2 l 100mM 总计 152 l 0038 检测体系设置阴性对照， 阴性对照体系中加入2 l 95DMSO双蒸水溶液取代化合 物， 用于检测NDM-1的活性。。

19、 0039 步骤5.化合物的初步筛选 说 明 书 3/4 页 5 CN 103156833 B 5 0040 向96微孔板中的每孔中加入100 l的浓度为50nM的NDM-1蛋白缓冲液。 然后向每孔 中加入2 l的浓度为100mM的化合物溶液。 振荡， 室温孵育1分钟后， 每孔加入50 l的600 M的 底物进行反应。 每隔8秒用光谱扫描多功能读数仪(Varioskan Flash， Thermo scientific) 检测一次， 共测20次。 0041 绘制曲线， 取阴性对照曲线斜率的最大处值为V0， 化合物曲线斜率的最大处值为 Vi， 则NDM-1的剩余活性分数Vi/V0。 剩余活性分数。

20、越低， 表示化合物对NDM-1的活性抑制 越强。 当NDM-1的剩余活性分数在0.2以内时， 将进一步测定该化合物的IC50值。 0042 步骤6.化合物的IC50值的测定 0043 将原始浓度为100mM的化合物溶液用95DMSO按1 2(体积比)的比例进行等比稀 释， 共稀释11个浓度梯度。 最终浓度依次为1316、 658、 329、 164.5、 82.2、 41.1、 20.6、 10.3、 5.1、 2.6、 1.3 M。 接着进行化合物的IC50值检测， 向96微孔板中的每孔中加入100 l的浓度 50nM的NDM-1蛋白缓冲液。 然后向每孔中加入2 l的上面配置的11个浓度的化。

21、合物溶液。 振 荡， 室温孵育1分钟后， 每孔加入50 l的600 M的底物进行反应。 每隔8秒用光谱扫描多功能 读数仪检测一次， 共测20次。 然后绘制曲线， 计算NDM-1的剩余活性分数。 最后以化合物浓度 对数(以10为底数)为横坐标， NDM-1的剩余活性分数为纵坐标绘制曲线。 根据曲线， 采用 GraphPad Prism version 5.0软件(GraphPad software公司)计算IC50值。 0044 下列实施例仅用于举例说明本发明， 对本发明没有任何限制。 0045 实施例1(R)-2-甲基-3-巯基丙酸抑制NDM-1的活性测定 0046 将4mg的(R)-2-甲基。

22、-3-巯基丙酸(购自百灵威公司， 纯度为98)， 溶解于95 DMSO双蒸水溶液(332.9 L)中， 配制成100mM浓度的溶液， 然后将该溶液放置在1.5ml ep管 中， 于4下保存。 0047 然后按照上面活性测试方法步骤5(化合物的初步筛选)和步骤6(化合物的IC50值 的测定)中所述的内容进行操作。 然后以(R)-2-甲基-3-巯基丙酸的浓度对数为横坐标， NDM-1的剩余活性分数为纵坐标绘制曲线， 如图3所示。 最后根据该曲线， 采用GraphPad Prism version 5.0软件计算， 得到的IC50值为82.3112.06 M。 0048 根据上述实施例， 可以了解本。

23、发明化合物具有很好的抑制NDM-1活性的作用， 减少 甚至消除对 -内酰胺类抗生素的水解， 从而解决由NDM-1引起的耐药性。 本领域普通技术人 员应当理解， 将本发明化合物与 -内酰胺类抗生素联用， 通过明显抑制NDM-1的活性， 进一 步提高抗生素疗效， 从而能够治疗由NDM-1引起的耐药细菌感染， 具有良好的药物应用前 景。 0049 为了清楚和易于理解的目的， 通过举例说明和实施例详细地描述了上述发明。 可 以在附随的权利要求的范围内进行改变和修改， 这对本领域的技术人员来说是很明显的。 因此， 可以理解， 上面的说明书旨在用于说明而不是用于限制。 因此， 本发明的范围不应参 考上述说明书来确定， 而应当参照下面所附权利要求以及这些权利要求所享有的等同原则 所确定的全部范围确定。 说 明 书 4/4 页 6 CN 103156833 B 6 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/1 页 7 CN 103156833 B 7 。