技术领域
本发明涉及用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂，其含 有具有粒细胞集落刺激因子(以下称为“G-CSF”)活性的多肽作为活 性成分，还涉及调动多能干细胞从组织进入外周血的药物，该药物含 有具有G-CSF活性的多肽作为活性成分。
背景技术
G-CSF是一种使中性粒细胞的前体细胞增殖或分化，以及激活成 熟的中性白细胞的多肽。在骨髓移植、肿瘤化疗导致的中性白细胞减 少症、骨髓增生异常综合征、再生不良性贫血、先天性或突发性中性 白细胞减少症、人免疫缺陷病毒(HIV)感染等情况中，G-CSF主要用于 加速中性白细胞的增生(Shorei ni Manabu G-CSF no Rinsho(Clinic of G-CSF Learned from Cases)，Yasuo Ikeda主编，Iyaku Journal，Osaka发 行，第64-92页(1999))。最近有报道G-CSF令外周血中的干细胞增加 (Shorei ni Manabu G-CSF no Rinsho(Clinic of G-CSF Learned from Cases)，Yasuo Ikeda主编，Iyaku Journal，Osaka发行，第139-168页 (1999))。就干细胞而言，造血干细胞、成体干细胞(组织干细胞)等 为人们所熟知。
已经显示，通过G-CSF的作用转移到外周血的造血干细胞包括不 同的亚型(Blood， 84，2795-2801(1994))。包括G-CSF、细胞粘附分子、 趋化因子、金属蛋白酶等的血细胞生成因子，相互间与干细胞从骨髓 到外周血的转移相关(Experimental Hematology， 30，973-981(2002))。 趋化因子受体CXCR4和它的配体CXCL12(基质细胞衍生因子1， SDF-1)，通过G-CSF而与干细胞从骨髓到外周血的转移相关，并且除 了G-CSF，环磷酰胺也具有同等的生理活性(The Journal of Clinical Investigation， 111，187-196(2003))。
已知趋化因子CXCR4抑制剂AMD-3100(美国专利5,612,478) 也具有将造血干细胞从骨髓转移到外周血的活性(American Society of Hematology(美国血液学协会)，Philadelphia，USA，2002年6月6日-10 日)。
作为调动造血干细胞进入外周血的方法之一，给予粒细胞集落刺 激因子(G-CSF)的方法已为人们所知(Blood， 90，903-908(1997))。
而且，据报道，在将通过G-CSF调动而从细胞中分离出来进入人 外周血的CD34+细胞移植到心肌梗塞模型上时，引起了血管再生并且 改善了心脏功能(Nature Medicine， 7，430-436(2001)，WO2001/94420)。
并且，由于梗死区域的心肌和血管的再生是通过在造成心肌梗塞 前，施予小鼠G-CSF和干细胞因子(SCF)而引起的，因而也认为， 造血干细胞是在G-CSF的作用下流出到外周血中，从而使梗死的心肌 得到再生(Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 98，10344-10349(2001))。
Corti等报道了通过对小鼠施予G-CSF和SCF，脑内骨髓源性神经 元的数量增加(Experimental Neurology， 173(2)，433-452(2002))。
而且，在人体中，当移植通过给予G-CSF而调动到外周血的细胞 时，在人体接受者的肝脏、消化道上皮和皮肤(N.England J.Med.， 346， 738-746(2002))以及口腔上皮(Lancet， 361，1084-1088(2003))内检测 到供体源性细胞(donor-derived cell)。
但是，除了造血系统，组织中尚未发现通过施予G-CSF而调动的 哪种类型的干细胞导致组织分化。更进一步，除了血细胞系统和循环 器官系统的疾病外，尚未发现是否有其他疾病可以通过施予G-CSF或 移植通过G-CSF调动的干细胞来进行治疗。
伴有肺组织破坏的严重疾病包括肺气肿、慢性支气管炎、慢性阻 塞性肺疾病(下文称为“COPD”)、囊性纤维化、突发性间质性肺炎(肺 纤维化)、弥漫性肺纤维化、结核、哮喘等。特别是在肺气肿和COPD 中，肺泡的破坏是显著的(Shoji Kudo，Kokyuki Shikkan no Chiryo to Kango(Treatment and Nursing of Respiratory Organ Disease)，Nankodo 2002年3月发行，和Shorei ni Manabu G-CSF no Rinsho(Clinic of G-CSF Learned form Cases)，Yasuo Ikeda主编，Iyaku Journal，Osaka发行，第64 页-92页(1999))。肺气肿、慢性支气管炎和COPD是在支气管、细支 气管或肺泡中产生炎性病变的疾病，并且当肺泡破裂进展时可导致呼 吸困难。由于目前没有治疗肺组织破坏的有效方法，因此需要开发高 效的预防药物、治疗药物和治疗方法。
已知视黄酸与胎儿期肺的成熟有关。据报道，将视黄酸施予肺泡 被弹性蛋白酶破坏的大鼠后，其肺泡被修复(Nature Medicine， 3， 675-677(1997))。另据报道，视黄酸衍生物RO444753(Journal of Medicinal Chemistry， 31，2182-2192(1988))对肺气肿也有同样的治疗效 果(American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine， 165(8)， A825(2002))。尽管已有用视黄酸治疗伴有肺泡破裂的疾病的各种病例 的报道，但他们中的任何一个都没有获得高效。
近年来，作为干细胞移植试验的结果，已经发现肺泡频繁地从干 细胞分化出来(Cell， 105，369-377(2001))。
包括肝硬化在内的慢性肝脏，位于导致30岁到64岁年龄组死亡 的原因的前列。同样，包括在死亡原因第一位的恶性肿瘤(癌)之内 的是由于肝硬化之类的肝脏疾病所导致的肝癌，其造成22,900名男性 死亡(排在肺癌和胃癌之后而位居第三)和9,400名女性死亡(排在胃 癌、肺癌和结肠癌之后而位居第四)。肝炎病毒是导致肝炎的主要原因， 其感染人数中感染乙型肝炎病毒的为1,500,000人，而感染丙型肝炎病 毒的为2,500,000人。尽管施予干扰素作为这些病毒性肝炎的抗病毒药 物，但是仍然无法完全阻止其转化到肝硬化。而且，根据Ministry of Health and Welfare in Japan(日本厚生省)进行的调查，目前大约 2,200,000人每天饮5gou(相当于0.9升)或更多的酒，例如精制的清 酒。在这些成问题的饮酒者中，经常会出现例如脂肪肝、酒精性肝炎 和肝硬化等肝病患者。每年大约有300,000人新发展成为肝硬化，包括 病毒性和酒精性肝硬化。然而，目前实在没有治疗肝硬化的方法。近 来，据报道，将骨髓细胞移植到可以作为酒精性肝炎模型的四氯化碳 肝病模型中，通过肝纤维消失和肝细胞再生而改善肝功能(The Second Meeting of the Japanese Society for Regenerative Medicine，Kobe，2003年 3月11日至12日)。
在日本由于目前需要透析的人数接近170,000，对能够完全治愈肾 功能不全的肾脏再生药物有着巨大的临床需求，但除了肾移植，实在 没有其他有效的治疗手段。最近，据报道，肾小球和肾小管上皮细胞 是从骨髓细胞分化而来的，还发现肾组织是从骨髓干细胞分化而来的 (Kidney International， 62，1285-1290(2002))。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病 的药剂，其含有具有G-CSF活性的多肽作为活性成分，或者提供调动 多能干细胞从组织进入外周血的药物，该药物含有具有G-CSF活性的 多肽作为活性成分。
本发明涉及到以下(1)到(35)项。
(1)一种用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂，其含有具有 粒细胞集落刺激因子活性的多肽作为活性成分。
(2)根据(1)所述的药剂，其中所述的多肽含有SEQ ID NO：1代表 的氨基酸序列。
(3)根据(1)所述的药剂，其中所述的多肽由SEQ ID NO：1代表的 氨基酸序列中至少一个氨基酸残基被删除、取代和/或增加的氨基酸序 列组成，并且具有粒细胞集落刺激因子活性。
(4)根据(1)所述的药剂，其中所述的多肽由与SEQ ID NO：1代表 的氨基酸序列有80％或更多的同源性的氨基酸序列组成，并且具有粒 细胞集落刺激因子活性。
(5)根据(1)到(4)中任意一项所述的药剂，其中所述的多肽是具 有粒细胞集落刺激因子活性的化学修饰多肽。
(6)根据(5)所述的药剂，其中所述的多肽用聚亚烷基二醇修饰。
(7)一种用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂，其含有(a) 具有粒细胞集落刺激因子活性的多肽和(b)视黄酸或视黄酸衍生物， 其中(a)和(b)可同时给药，间隔一段时间而分别给药，或作为含 有(a)和(b)两者的单一药物给药。
(8)一种用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂，其含有(a) 具有粒细胞集落刺激因子活性的多肽和(b)CXCR4抑制剂，其中(a) 和(b)可同时给药，间隔一段时间而分别给药，或作为含有(a)和 (b)两者的单一药物给药。
(9)根据(8)所述的药剂，其中所述的CXCR4抑制剂是AMD-3100 或其衍生物。
(10)根据(1)到(9)中任意一项所述的药剂，其中伴有组织破坏 的疾病选自神经疾病、循环器官系统疾病、肝脏疾病、胰腺疾病、消 化道系统疾病、肾脏疾病、皮肤疾病和肺疾病。
(11)根据(10)所述的药剂，其中所述的神经疾病选自脑梗塞、脑 血管意外、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病、脊髓损伤、抑 郁症和躁狂抑郁性精神病。
(12)根据(10)所述的药剂，其中所述的循环器官系统疾病选自阻 塞性血管疾病、心肌梗塞、心脏衰竭和冠状动脉疾病。
(13)根据(10)所述的药剂，其中所述的肝脏疾病选自乙型肝炎、 丙型肝炎、酒精性肝炎、肝硬化和肝功能不全。
(14)根据(10)所述的药剂，其中所述的胰腺疾病选自糖尿病和胰 腺炎。
(15)根据(10)所述的药剂，其中所述的消化道系统疾病选自克朗 氏病和溃疡性结肠炎。
(16)根据(10)所述的药剂，其中所述的肾脏疾病选自IgA肾病、 肾小球肾炎和肾功能不全。
(17)根据(10)所述的药剂，其中所述的皮肤疾病选自褥疮、烧伤、 缝合伤、撕裂伤、切割伤、咬伤、皮炎、阿利贝尔氏瘢痕瘤、瘢痕瘤、 糖尿病性溃疡、动脉性溃疡和静脉性溃疡。
(18)根据(10)的所述药剂，其中所述的肺疾病选自肺气肿、慢性 支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化、突发性间质性肺炎(肺 纤维化)、弥漫性肺纤维化、结核或哮喘。
(19)一种调动多能干细胞从组织进入外周血的药物，其含有具有粒 细胞集落刺激因子活性的多肽作为活性成分。
(20)根据(19)所述的药物，其中所述的多肽含有SEQ ID NO：1代 表的氨基酸序列。
(21)根据(19)所述的药物，其中所述的多肽由SEQ ID NO：1代表 的氨基酸序列中至少一个氨基酸残基被删除、取代和/或增加的氨基酸 序列组成，并且具有粒细胞集落刺激因子活性。
(22)根据(19)所述的药物，其中所述的多肽由与SEQ ID NO：1代 表的氨基酸序列有80％或更多的同源性的氨基酸序列组成，并且具有 粒细胞集落刺激因子活性。
(23)根据(19)到(22)中任意一项所述的药物，其中所述的多肽 是具有粒细胞集落刺激因子活性的化学修饰多肽。
(24)根据(23)所述的药物，其中所述的多肽用聚亚烷基二醇修饰。
(25)一种调动多能干细胞从组织进入外周血的药物，其含有(a)具 有粒细胞集落刺激因子活性的多肽和(b)视黄酸或视黄酸衍生物，其 中(a)和(b)可同时给药，间隔一段时间而分别给药，或作为含有 (a)和(b)两者的单一药物给药。
(26)一种调动多能干细胞从组织进入外周血的药物，其含有(a)具 有粒细胞集落刺激因子活性的多肽和(b)CXCR4抑制剂，其中(a) 和(b)可同时给药，间隔一段时间而分别给药，或作为含有(a)和 (b)两者的单一药物给药。
(27)根据(26)所述的药物，其中所述的CXCR4抑制剂是AMD-3100 或其衍生物。
(28)一种用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的方法，包括施予 具有粒细胞集落刺激因子活性的多肽。
(29)一种用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的方法，包括同时 施予或间隔一段时间而分别施予(a)具有粒细胞集落刺激因子活性的 多肽和(b)视黄酸或视黄酸衍生物。
(30)一种用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的方法，包括同时 施予或间隔一段时间而分别施予(a)具有粒细胞集落刺激因子活性的 多肽和(b)CXCR4抑制剂。
(31)一种调动多能干细胞从组织进入外周血的方法，包括施予具有 粒细胞集落刺激因子活性的多肽。
(32)一种调动多能干细胞从组织进入外周血的方法，包括同时施予 或间隔一段时间而分别施予(a)具有粒细胞集落刺激因子活性的多肽 和(b)视黄酸或视黄酸衍生物。
(33)一种调动多能干细胞从组织进入外周血的方法，包括同时施予 或间隔一段时间而分别施予(a)具有粒细胞集落刺激因子活性的多肽 和(b)CXCR4抑制剂。
(34)具有粒细胞集落刺激因子活性的多肽在制造用于预防和/或治疗 伴有组织破坏的疾病的药剂中的用途。
(35)具有粒细胞集落刺激因子活性的多肽在制造用于调动多能干细 胞从组织进入外周血的药物中的用途。
1.用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂
在本发明中，伴有组织破坏的疾病包括神经疾病、循环器官系统 疾病、肝脏疾病、胰腺疾病、消化道系统疾病、肾脏疾病、皮肤疾病 和肺疾病等。
神经疾病包括脑梗塞、脑血管意外、帕金森病、阿尔茨海默病、 亨廷顿舞蹈病、脊髓损伤、抑郁症和躁狂抑郁性精神病等。
循环器官系统疾病包括阻塞性血管疾病、心肌梗塞、心脏衰竭和 冠状动脉疾病等。
肝脏疾病包括乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝炎、肝硬化和肝功 能不全等。
胰腺疾病包括糖尿病、胰腺炎等。
消化道系统疾病包括克朗氏病和溃疡性结肠炎等。
肾脏疾病包括IgA肾病、肾小球肾炎和肾功能不全等。
皮肤疾病包括褥疮、烧伤、缝合伤、撕裂伤、切割伤、咬伤、皮 炎、阿利贝尔氏瘢痕瘤、瘢痕瘤、糖尿病性溃疡、动脉性溃疡和静脉 性溃疡等。
肺疾病包括肺气肿、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、囊性纤 维化、突发性间质性肺炎(肺纤维化)、弥漫性肺纤维化、结核、哮喘 等。
具有G-CSF活性的多肽包括含有SEQ ID NO：1代表的氨基酸序列 的多肽，或由SEQ ID NO：1代表的氨基酸序列中至少一个氨基酸残基 被删除、取代和/或增加的氨基酸序列所组成的、并且具有G-CSF活性 的多肽。
实例包括那托司亭(nartograstim)(商品名：Neu-up，Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.制造)、非格司亭(filgrastim)(商品名：Gran，SANKYO 制造；商品名：Granulokine，Hoffmann-La Roche制造；商品名： Neupogen，Amgen制造)、来格司亭(1enograstim)(商品名：Neutrogin， Chugai Pharmaceutical制造；商品名：Granocyte，Aventis制造)、聚乙 二醇化非格司亭(pegfilgrastim)(商品名：Neulasta，Amgen制造)、 沙格司亭(sargramostim)(商品名：Leukine，Schering制造)等。
同时，具有G-CSP活性的多肽包括如下多肽，当用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)检测其氨基酸序列与含有SEQ ID NO：1 所代表的氨基酸序列的G-CSF的同源性时，优选同源性为60％或更多， 更优选80％或更多，进一步优选90％或更多，并且最优选95％或更多。 其中由SEQ ID NO：1所代表的氨基酸序列中至少一个氨基酸残基被取 代、并具有G-CSF活性的多肽的实例在表1中示出。
表1 从N-末端氨基酸 起的位置 (SEQ ID NO：1 的G-CSF) 在不同多肽中的取代氨基酸 a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) 1st(Thr) 3rd(Leu) 4th(Gly) 5th(Pro) 17th(Cys) * Glu Lys Ser Ser Val Ile Arg Ser Ser Cys Ile Arg Ser Ser Tyr Ile Arg Ser Ser Arg Thr Arg Ser Ser * Thr Arg Ser Ser Asn Glu Arg Ser Ser Ile Thr Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Ser * * Arg * Ser Ala Thr Tyr Arg Ser * * * * Ser
*未取代的氨基酸
进一步地，具有G-CSF活性的多肽可以被化学修饰。
化学修饰的方法包括WO00/51626中所描述的方法等，并且包括 具有G-CSF活性的多肽，举例来说，用诸如聚乙二醇(PEG)的聚亚 烷基二醇修饰。
本发明含有具有G-CSF活性的多肽作为活性成分的药物，可以作 为治疗药物而单独给药，但通常优选作为药物制剂而提供，该药物制 剂通过将本发明的药物与至少一种药学上可接受的载体混合，并通过 制药领域已知的任何方法制造。
优选采用治疗上最有效的给药途径，实例包括口服给药和胃肠外 给药，例如口腔、气道、直肠、肌肉内、皮下、皮内和静脉给药。其 中，优选肌肉内、皮下、皮内、静脉或气道给药。
剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、软膏剂、胶带剂、干 粉剂、例如气雾剂的吸入剂等。
举例来说，在诸如片剂的固体制剂的制备中，可以使用赋形剂， 例如乳糖；崩解剂，例如淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁；粘合剂，例 如羟丙基纤维素；表面活性剂，例如脂肪酸酯；增塑剂，例如甘油； 和类似物。
适合于肌肉内、皮下、皮内、静脉或气道给药的药物制剂包括注 射剂、喷雾剂等。
举例来说，在注射剂的制备中，可使用水、盐水、例如大豆油的 植物油、溶剂、增溶剂、张度剂(tonicity agent)、防腐剂、抗氧化剂 等。
同样，吸入剂是通过单独使用具有G-CSF活性的多肽或与载体等 一起而制备的，该载体不会刺激接受者的口腔和气道粘膜，并且能够 通过将具有G-CSF活性的多肽分散成微细颗粒而促进其吸收。该载体 包括乳糖、甘油等。根据具有G-CSF活性的多肽和要使用的载体的特 性，可以制成例如气雾剂和干粉剂的制剂。此外，也可以将例如口服 制剂的添加剂的成分加入到这些胃肠外制剂中。
尽管剂量和给药频率根据预期的治疗效果、给药方法、治疗周期、 年龄、体重等变化，但通常，优选的给药剂量是每个成人每天0.01μg/kg 到10mg/kg。
2.粒细胞集落刺激因子和其他药物的组合使用
本发明所使用的具有G-CSF活性的多肽的活性，可通过将视黄酸、 视黄酸衍生物或CXCR4抑制剂组合使用而增强。
可以使用任意视黄酸衍生物，只要它们能与视黄酸受体结合，实 例包括视黄酸衍生物如棕榈视黄醇、视黄醇、视黄醛、3-脱氢视黄酸 (3-dehydroretinoic acid)、3-脱氢视黄醇和3-脱氢视黄醛；原维生素A 如α-胡罗卜素、β-胡罗卜素、γ-胡罗卜素、β-隐黄质和海胆酮；和类似 物。其他实例包括莫维A胺(商品名：Tasmaderm，Hoffmann-La Roche 制造，见美国专利4,105,681)、在WO 02/04439中描述的化合物、他 扎罗汀(Tazaroten)(商品名：Tazorac，Allergan制造，见EP284288)、 AGN-194310和AGN-195183(Allergan制造，见WO 97/09297)，视黄 酸TopiCare(商品名：Avita，Mylan Laboratories制造)、UAB-30(CAS 号205252-59-1，UAB Research Foundaion制造)等。
CXCR4抑制剂包括AMD-3100等。
本发明所使用的具有G-CSF活性的多肽和视黄酸、视黄酸衍生物 或CXCR4抑制剂可以以单一剂型(混合型剂型)或以多种剂型的组合 来使用或给药，只要各自的活性成分包含在内。当以多种剂型的组合 来使用时，它们可以同时使用或给药，或者间隔一段时间使用或给药。 同样，这些药物制剂可以以例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、软 膏剂、胶带剂、例如干粉剂和气雾剂的吸入剂等形式使用。
本发明所使用的具有G-CSF活性的多肽与视黄酸、视黄酸衍生物 或CXCR4抑制剂的优选剂量比例(重量/重量)，可以根据视黄酸、视 黄酸衍生物或CXCR4抑制剂的组合以及视黄酸、视黄酸衍生物或 CXCR4抑制剂的功效任选地调整。例如，使用的比例可以是1/50,000 (粒细胞集落刺激因子/视黄酸、视黄酸衍生物或CXCR4抑制剂)到 100/1，优选从1/10,000到20/1，并且更优选从1/1,000到10/1。
当以多种药物制剂的组合给药时，例如，(a)含有具有G-CSF活 性的多肽的第一组分和(b)含有视黄酸、视黄酸衍生物或CXCR4抑 制剂的第二组分，能够如上所述分别配方而制备药盒，并且各个组分 能够通过同时使用该药盒或间隔一段时间使用该药盒而给药，从而经 过相同或不同路径而到达相同受体。
可使用的药盒是包括两个或更多容器(例如小瓶、袋子等)和内 容物的药盒，其中容器的材料、形状等没有特别的限制，只要该容器 在储存过程中，作为内容物的组分不会由于外界温度和光而变性，或 者来自容器的化学组分不会分解，并且它也具有以下的样式，作为内 容物的第一组分和第二组分能够通过不同途径(如管子等)给药，或 同样的途径给药。实例包括片剂药盒、注射剂药盒、吸入剂药盒等。
上述药物制剂能够根据传统的方法，通过使用药学上可接受的稀 释剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、表面活性剂、水、盐水、 植物油增溶剂、张度剂、防腐剂、抗氧化剂等而制备。
在制备片剂时，举例来说，可以使用例如乳糖的赋形剂；例如淀 粉的崩解剂；例如硬脂酸镁的润滑剂；例如羟丙基纤维素的粘合剂； 例如脂肪酸酯的表面活性剂；例如甘油的增塑剂；和类似物。
在制备注射剂时，可使用例如水、盐水、植物油如大豆油、溶剂、 增溶剂、张度剂、防腐剂、抗氧化剂等。
同样，吸入剂是通过将具有G-CSF活性的多肽单独使用，或与不 会刺激接受者的口腔和气道粘膜，并能够使具有G-CSF活性的多肽分 散成微细颗粒而促进其吸收的载体或类似物一起使用而制备的。载体 包括乳糖、甘油等。而且，也可以在这些胃肠外制剂中加入诸如口服 制剂添加剂的组分。
尽管剂量和给药频率根据期望的治疗效果、给药方法、治疗周期、 年龄、体重等变化，但通常，优选每个成人每天给与具有G-CSF活性 的多肽的剂量是0.01μg/kg到10mg/kg，或者视黄酸、视黄酸衍生物或 CXCR4抑制剂的剂量是0.1mg/kg到100mg/kg。
3.调动多能干细胞进入外周血的药物
如上述第1或第2项所述的用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾 病的药剂，能够调动多能干细胞进入外周血，并通过调动多能干细胞 使损伤的组织再生。
4.使用本发明的药物治疗疾病的方法
当使用本发明的用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂来 作为治疗疾病的方法时，可以采用任何方法，例如通过直接给予患者 上述第1项中所述的本发明的药剂而使损伤区域得到修复，或者回收 通过上述第3项所述的药物而调动到外周血的多能干细胞，并将回收 的多能干细胞直接移植到损伤区域内，或将其在体外分化成为细胞或 组织后再移植到损伤区域。
当治疗中使用多能干细胞或分化细胞时，通过采用例如 Hemonetics制造的Hemolite 2 Plus用盐水洗涤多能干细胞或分化细胞。 使用的装置包括那些在一个完全密闭的系统内进行培养细胞的浓缩、 洗涤和回收的装置，并且优选能接近100％地清除例如在培养和分化中 所使用的细胞因子等物质的装置。由此回收的多能干细胞或由此分化 的细胞，在治疗中能通过常规的滴注法静脉注射，或直接注射到病变 区域。
5.评估本发明的用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂的方 法
(1)脑或神经系统组织
例如，根据下述方法能够证实本发明的用于预防和/或治疗伴有组 织破坏的疾病的药剂可以用于治疗伴有脑或神经系统组织破坏的疾 病。
将上述本发明的用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂施 予实验动物，例如小鼠、大鼠或猴子，并且如果观察到伴有破坏的症 状的缓解，或者鉴别出分化的脑或神经系统的细胞，就可以证实该药 物对于治疗伴有脑或神经系统组织破坏的疾病有效。优选的实验动物 是由局部缺血、施予6-羟多巴胺(6-OHDA)、施予红藻氨酸等而造成 脑损伤的动物。本发明的用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药 剂的给药途径包括皮下给药。
例如，脑内分化的神经系统细胞可以通过以下的方法检测。
预先照射致死剂量的放射线后，制作骨髓嵌合体(chimeric)小鼠， 其移植了取自同一品系能够组成表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因小 鼠的骨髓，并将该骨髓嵌合体小鼠的脑用上述方法造成损伤，然后施 予本发明的用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂。通过测定 GFP的荧光强度可以鉴别出分化的神经系统细胞。
(2)肝脏组织
例如，根据下述方法能够证实，本发明的用于预防和/或治疗伴有 组织破坏的疾病的药剂可以用于治疗伴有肝脏组织破坏的疾病。
将上述本发明用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂施与 肝细胞破坏的小鼠模型，并且如果观察到伴有破坏的症状的缓解或肝 脏内新细胞增殖的加速，可以证实该药剂对于治疗伴有肝脏组织破坏 的疾病有效。表现出伴有肝细胞破坏的疾病的动物模型包括主要将四 氯化碳酯酶注入腹腔的模型(American Journal of Pathology， 161， 2003-2010(2002))、肝脏部分切除的模型(Arch.Pathol.， 12，186-202 (1931))等。进一步地，具有肝脏破坏病态的基因修饰动物包括富马酰 乙酸盐(酯)水解酶(FAH)-缺乏小鼠(Nature Medicine， 6，1229-1234 (2000))等。
肝细胞的破坏可通过测定血浆中或血清中的GPT(谷丙转氨酶)、 GOT(谷草转氨酶)、胆红素、γ-GTP等的浓度进行评估。
肝脏内肝细胞的分化可以通过以下方法检测。
预先照射致死剂量的放射线后，制作骨髓嵌合体小鼠，其移植了 取自同一品系能够组成表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因小鼠的骨髓， 将该骨髓嵌合体小鼠的肝脏用上述方法造成损伤，然后施予本发明的 具有G-CSF活性的用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂作为 活性成分。基于GFP的荧光可以鉴别出分化的肝细胞。
(3)胰腺组织
例如，根据下述方法能够证实，本发明的用于预防和/或治疗伴有 组织破坏的疾病的药剂可以用于治疗伴有胰腺组织破坏的疾病。
将上述本发明的用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂施 予胰腺细胞破坏的小鼠模型，如果观察到伴有破坏的症状的缓解或胰 腺内新细胞增殖的加速，可以证实该药剂对于治疗伴有胰腺组织破坏 的疾病有效。
表现出伴有胰腺β细胞破坏的疾病的动物模型包括主要将链脲霉 素注入腹腔的模型(The Journal of Clinical Investigation， 48，2129-2139 (1969))、胰腺部分切除的模型(The Journal of Clinical Investigation， 71， 1544-1553(1983))等。能自发产生具有胰腺β细胞破坏病态的疾病的 动物包括非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠(Exp.Animal， 29，1-13(1980))、 BioBreeding(BB)大鼠(Diabetes， 31，Suppl.1，7-13(1982))等。
胰腺β细胞破坏症状的改善情况可通过测定血浆中或血清中的胰 岛素、葡萄糖等的浓度，以及葡萄糖耐量试验时的葡萄糖耐量等进行 评估。进一步地，改善情况也可以通过基于体重改变、进食量、尿糖 水平的测定等与疾病相关的变化来检测。
胰腺内胰腺细胞的分化可以通过以下方法进行检测。
预先照射致死剂量的放射线后，制作骨髓嵌合体小鼠，其移植了 取自同一品系能够组成表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因小鼠的骨髓， 将该骨髓嵌合体小鼠的胰腺用上述方法造成损伤，并随后施予本发明 的用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂。基于GFP的荧光可 以鉴别出分化的胰腺细胞。
(4)肾脏组织
例如，根据下述方法能够证实，本发明的用于预防和/或治疗伴有 组织破坏的疾病的药剂可以用于治疗伴有肾脏组织破坏的疾病。
将上述本发明的用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂施 予肾脏细胞破坏的小鼠模型，如果观察到伴有破坏的症状的缓解或肾 脏内新细胞增殖的加速，可以证实该药剂能有效用于治疗伴有肾脏组 织破坏的疾病。至于肾脏破坏模型，优选各种肾小球肾炎模型。表现 出类似于肾小球肾炎的病态的动物模型包括通过静脉注射抗-Thy-1抗 体而导致的抗-Thy-1肾小球肾炎模型(Kidney and Dialysis，1991年特 刊，肾病模型，Tokyo Igaku-sha发行)、通过肾小球基底膜抗体诱导的 Masugi肾小球肾炎模型(Kidney and Dialysis，1991年特刊，肾病模型， Tokyo Igaku-sha发行)等，并且表现出类似于肾功能不全的病态的动 物模型包括将牛血清白蛋白(BSA)注入腹腔的模型(Kidney International， 55，890-898(1999))。
肾脏细胞破坏症状的改善可通过测定尿蛋白排出量等进行评估。
肾脏内肾脏细胞的分化可以通过以下方法进行检测。
预先照射致死剂量的放射线后，制作骨髓嵌合体小鼠，其移植了 取自同一品系能够组成表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因小鼠的骨髓， 将该骨髓嵌合体小鼠的肾脏用上述方法造成损伤，然后施予本发明的 用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂。基于GFP的荧光可以 鉴别出分化的肾脏细胞。
(5)肺组织
例如，根据下述方法能够证实，本发明的用于预防和/或治疗伴有 组织破坏的疾病的药剂可以用于治疗伴有肺组织破坏的疾病。
将上述本发明的用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂施 予肺细胞破坏的小鼠模型，如果观察到伴有破坏的症状的缓解或肺内 新细胞增殖的加速，可以证实该药剂对于治疗伴有肺组织破坏的疾病 有效。至于肺破坏模型，优选类似肺气肿的模型。表现出类似于肺气 肿的病态的动物模型包括将主要含有酯酶的蛋白酶制剂注入肺内的模 型(Environment Research， 33，454-472(1984))、吸烟模型(Chest， 121， 增刊，188S-191S(2002))等。表现出肺组织破坏病态的转基因动物包括 白介素13转基因小鼠(The Journal of Clinical Investigation， 106， 1081-1093(2000))、肿瘤坏死因子-α转基因小鼠(American Journal of Physiology：Lung Cellular Molecular Physiology， 280，L39-L49(2001)) 等。
肺细胞破坏症状的改善可通过分析肺切片的组织影像、测定肺湿 重和体积等进行评估。肺切片的组织影像可以通过测定平均线性截取 长度、肺泡面积等进行分析。平均线性截取长度可以通过在肺切片样 本的显微图像上画一预定长度的方格，测量与线性线交叉的肺泡壁和 毗邻的与线性线交叉的肺泡壁之间的距离，计算其平均值而获得。进 一步地，非侵入性测量方法包括肺的X射线成像、X射线计算机体层 成像(X射线CT)、磁共振成像(MRI)等。尽管不是直接的，但是 肺的组织破坏也可以通过基于以下与疾病相关的变化的测定来评估， 即体重和呼吸功能的测定、在预定时间内运动量和移动距离的测定、 运动耐量试验、血氧分压的测定、作为肺泡弹性蛋白降解产物的锁链 素的尿浓度和血浓度的测定、或类似测定。
肺内细胞的分化可以通过以下方法进行检测。
预先照射致死剂量的放射线后，制作骨髓嵌合体小鼠，其移植了 取自同一品系能够组成表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因小鼠的骨髓， 将该骨髓嵌合体小鼠的肺用上述方法造成损伤，然后施予本发明的用 于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂。基于GFP的荧光可以鉴 别出分化的肺细胞。
(6)骨骼肌组织
例如，根据下述方法能够证实，本发明的用于预防和/或治疗伴有 组织破坏的疾病的药剂可以用于治疗伴有骨骼肌组织破坏的疾病。
将上述本发明的用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂施 予骨骼肌破坏的小鼠模型，如果观察到伴有破坏的症状的缓解或骨骼 肌内新细胞增殖的加速，可以证实该药剂对于治疗伴有骨骼肌组织破 坏的疾病有效。表现出类似于骨骼肌组织破坏的病态的动物模型包括 主要将例如心脏毒素的肌毒性蛇毒或例如盐酸丁哌卡因的局部麻醉剂 注入骨骼肌的模型(Igaku-no Ayumi (Advance in Medical Science)， 179， 276-280(199))等。具有骨骼肌破坏病态的转基因动物包括营养障碍基 因缺陷mdx小鼠(Shinkei Shinpo(Advance in Nerves)， 45，54-62(2001)) 等。
骨骼肌组织破坏症状的改善可通过基于骨骼肌纤维的直径和数量 以及肌肉纤维化和脂肪变化的形态学观察进行评估。而且，非侵入性 测量方法包括肌肉计算机体层成像(肌肉CT)、磁共振成像(MRI) 等。尽管不是直接的，但是这种改善也可以通过基于血清肌酸激酶 (CK)值的测定等与疾病相关的变化来评估。
骨骼肌内细胞的分化可以通过以下方法进行检测。
预先照射致死剂量的放射线后，制作骨髓嵌合体小鼠，其移植了 取自同一品系能够组成表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因小鼠的骨髓， 将该骨髓嵌合体小鼠的骨骼肌用上述方法造成损伤，然后施予本发明 的用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂。基于GFP的荧光可 以鉴别出分化的和成形的骨骼肌细胞。
(7)皮肤组织
例如，根据下述方法能够证实，本发明的用于预防和/或治疗伴有 组织破坏的疾病的药剂可以用于治疗伴有皮肤组织破坏的疾病。
将上述本发明的用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂施 予皮肤破坏的小鼠模型，如果观察到伴有破坏的症状的缓解或皮肤内 新细胞增殖的加速，可以证实该药剂对于治疗伴有皮肤组织破坏的疾 病有效。表现出类似于皮肤组织破坏的病态的动物模型包括主要在难 处理的模型动物上，例如遗传性糖尿病小鼠(db/db)、遗传性肥胖小鼠 (ob/ob)、用类固醇治疗的小鼠或肝病大鼠等，人为制作成皮肤全层缺 失伤、烧伤、缺血性溃疡(褥疮)或感染伤的皮肤损伤模型(Tanpakushitsu Kakusan koso(Protein，Nucleic acid Enzyme)， 45，1145-1151(2000))。
皮肤组织损伤症状的改善可通过伤口面积的测定、皮肤撕裂张力 的测定、渗出液量的测定、白细胞浸润数量的测定、血管生成数量的 测定、肉芽内产生的细胞和胶原数目的测定等进行评估。
皮肤内细胞的分化可以通过以下方法进行检测。
预先照射致死剂量的放射线后，制作骨髓嵌合体小鼠，其移植了 取自同一品系能够组成表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因小鼠的骨髓， 将该骨髓嵌合体小鼠的皮肤用上述方法造成损伤，然后施予本发明的 用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂。基于GFP的荧光可以 鉴别出分化的皮肤细胞。
6.评估调动多能干细胞进入外周血的药物的方法
对于本发明调动多能干细胞进入外周血的药物的评估如下。
从同一品系能组成表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因小鼠上收集 药物诱导的细胞，或收集药物调动的细胞，并将能够标记细胞的基因， 例如绿色荧光蛋白(GFP)导入这些细胞，再将这些细胞通过静脉或心 室内施用。基于GFP的荧光可以鉴别出分化的细胞。
下面基于参考实施例和实验实施例对本发明预防剂和/或治疗剂的 效果进行详细描述。
参考实施例1
通过施予具有G-CSF活性的多肽增加外周血中的单核细胞：
将那托司亭(商品名：Neu-up，Kyowa Hakko Kogyo有限公司制造) 以100μg/kg的剂量连续5天皮下注射到3只9周龄的雄性SD (Sprague-Dawley)大鼠(Charles River Japan)，给药开始后的第6天 从腹主动脉收集外周血。用NycoPrep 1.077Animal(Axis-Shield制造) 通过密度梯度离心浓缩单核细胞部分，并测定细胞数目。结果，单核 细胞从(2.32±0.16)×106细胞/ml(平均值±标准差)增加到(4.29±0.93) ×106细胞/ml(平均值±标准差)。其中包含干细胞。
参考实施例2
通过施予G-CSF调动到外周血的细胞的特性：
(1)调动到通过施用G-CSF而调动的外周血的细胞，移植到经过X 射线照射的小鼠
通过施予G-CSF而调动进入外周血的细胞的特性，通过将该细胞 移植到小鼠进行分析。
将10周龄、体内所有细胞都整合了GFP基因并表达GFP蛋白的 小鼠(F4，C57BL/6×129系)分成包括3只小鼠的F组和包括1只小 鼠的G组，并将下述药剂施予每只小鼠。具体地，F组每只小鼠连续5 天每天皮下注射10μg的G-CSF(Kyowa Hakko Kogyo有限公司制造， 商品名：Neu-up)。G组每只小鼠连续5天每天皮下注射200μl的PBS (磷酸盐缓冲液)(pH7.4)(Life Technologies制造)。
在最后一次给药的后一天，将F组和G组的每只小鼠用乙醚麻醉， 并从眼静脉收集外周血，收集在预先装有肝素钠(Takeda Chemical Industries有限公司制造)的管内，令所收集的外周血经过100-μm的细 胞滤器(Becton Dickinson制造)。至于G组的小鼠，切下股骨，用剪 刀切除附着在股骨上的肌肉以使整个股骨暴露，然后用剪刀剪除股骨 两端，将装有Terumo公司制造的27G针头并含有PBS的注射针的前 端插入股骨的膝关节侧的切割端，通过将PBS吹入试管而收集骨髓细 胞，并令所收集的骨髓细胞经过100-μm的细胞滤器(Becton Dickinson 制造)。
这样所收集到的外周血或骨髓细胞按照如下方式从尾静脉注入到 C57BL/6小鼠进行移植。
首先，准备8周龄的C57BL/6小鼠(CLEA Japan)，在从尾静脉注 射的前一天，预先用X射线照射装置(Hitachi Medico制造)照射12Gy 剂量的X射线。这些小鼠被分成H组、I组、J组和K组。H组每一只 小鼠的尾静脉内移植入300μl的取自F组小鼠的外周血；I组每一只小 鼠的尾静脉内移植入300μl的取自G组小鼠的外周血；J组每一只小 鼠的尾静脉内移植入3.0×106个取自G组小鼠的骨髓细胞；K组小鼠 不进行移植。
结果，I组和K组的所有小鼠在移植的7到10天内死亡，而H组 和J组的小鼠在移植8周后仍然存活。但是，在移植骨髓的J组的一些 小鼠中，观察到外表和行为的异常，例如，毛脱落和皮肤溃疡和歪着 头行走以及步态不自然。在移植施予G-CSF的小鼠的外周血的H组中， 没有观察到外表和行为的异常。
结果表明具有分化为例如皮肤的组织的能力的干细胞，通过施予 G-CSF而调动进入小鼠的外周血中。
(2)解剖经过细胞移植的小鼠
将(1)中获得的H组小鼠解剖并将其灌注和固定，切下每一个器 官。
具体地，小鼠通过腹腔内注射戊巴比妥钠(Dainippon Pharmaceutical有限公司制造)进行麻醉，用70％的乙醇润湿整个身体， 剥除大腿的皮肤，用剪刀将从膝到大腿根部区域切开以暴露股动脉和 股静脉。它们用丝制缝合线(Natsume Seisakusho有限公司制造)绑扎， 从绑扎处将大腿切断。切除其上的胫骨，用剪刀去除附着在胫骨上的 肌肉以暴露整个胫骨，用剪刀剪除胫骨两端，将装有Terumo公司制造 的23G针头并含有PBS的注射针的前端插入胫骨的膝关节侧的切端， 通过将PBS吹入试管而收集骨髓细胞。
另一方面，通过剖腹术和开胸术使小鼠的心脏暴露，将Terumo公 司制造的带翼(wing)的25G静脉注射针插入左心室，切除右心耳， 20ml的PBS流入并灌注整个身体。将此时从心脏溢出的血液作为外周 血收集在分配有100单位肝素钠(Takeda Chemical Industries有限公司 制造)的管内。
当所有的PBS流尽后，20ml的固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS] 通过同样的操作流入进行固定。
然后，将肺连同气管一起切下，将装有与Terumo公司制造的 surflow留置针(20G)相连的导管并含有用PBS稀释两倍的OCT(最 佳切除温度，optimum cutting temperature)化合物(Miles制造)的20-ml 的注射器插入气管，用丝制缝合线(Natsume Seisakusho有限公司制造) 将导管的前端与气管连接起来，经过气管将10ml的用PBS稀释两倍 的OCT溶液注入肺内。注射完毕后，将肺切成几个平方毫米的小块， 用OCT化合物包埋并用经过干冰冷却的异戊烷进行冷冻。
同样切下小鼠的其他器官，浸入4℃的固定液[4％PFA(多聚甲醛)， PBS]2小时，用PBS冲洗，浸入高糖溶液[20％蔗糖，PBS]，允许在4 ℃静置过夜，第二天，将其切成几个平方毫米的的小块，用OCT化合 物包埋并用经过干冰冷却的异戊烷进行冷冻。
这样经过冷冻的组织用恒冷切片机切成厚度10μm的切片，粘附 在涂有APS(Matsunami制造)的载玻片上，充分干燥后制成冰冻切片。
上述操作制得的外周血细胞用等量的0.9％的NaCl稀释，在1.4ml 的Nyco Prep 1.077Animal(Daiichi Pure Chemicals有限公司制造)上 分层，室温下以600×g离心30分钟。收集界面上的一层单核细胞悬 液，与1ml的PBS混合，室温下以400×g离心15分钟。弃去上清液， 沉淀的单核细胞悬浮于0.5ml的PBS中，用FACS Calibur(Becton Dickinson制造)测定外周单核细胞中GFP阳性细胞的数目比率。结果， GFP阳性细胞的数目比率是90.3％。
至于骨髓细胞，也通过同样的方式用FACS Calibur测定GFP阳性 细胞的数目比率，而GFP阳性细胞占87.3％。
将切下的每个器官所制成的冰冻切片用Zeiss制造的荧光显微镜 Axiophot 2进行观察，证实在体内的几乎所有器官中都存在许多GFP 阳性细胞，例如在肺、心脏、肝脏、脑、胃、皮肤、小肠、大肠、骨 骼肌、胰腺、脾脏、肾脏和气管内。尤其在脑内，在例如嗅球和脉络 丛的区域内观察到许多GFP阳性细胞。结果表明，通过施予G-CSF而 调动进入小鼠外周血的干细胞起着修复机体各种组织的作用。
(3)通过免疫染色鉴定GFP阳性细胞的特性
将(2)中制备的冰冻切片用下面的各种抗体进行染色，来研究 GFP阳性细胞的特性。
首先，将各种器官的组织切片用抗-细胞角蛋白(anti-cytokeratin) 抗体进行免疫染色。细胞角蛋白是上皮细胞的标记物。
将切下的皮肤所制备的冰冻切片放到载玻片上，将该玻片浸入 PBS 5分钟3次。洗涤玻片后，将其浸入用PBS稀释到终浓度为10 mg/ml的蛋白酶K(Gibco BRL制造)15分钟。用PBS洗涤一次后， 将其与固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]在室温下反应15分钟。PBS 洗涤两次后，将其在室温下浸入封闭液[10％猪血清(Dako制造)，PBS] 1小时，在室温下与由含有1.5％猪血清的PBS稀释50倍的一抗[单克 隆鼠抗人细胞角蛋白，Clones AE1/AE3](Dako制造)溶液反应1小时。 用PBS洗涤四次后，在室温下与由含有1.5％猪血清的PBS稀释800 倍的二抗[Cy3-conjugated Affini Pure 山羊抗鼠IgG(H+L)] (Seikagaku公司制造)溶液反应1小时。用PBS洗涤四次后，将含有 DAPI的Vectashield Mounting Medium(Vector Laboratories制造)滴加 到切片上，用盖玻片封片，在Zeiss制造的荧光显微镜Axiophot 2下进 行观察。由于观察到GFP阳性细胞和细胞角蛋白阳性细胞，这表明， 在用于移植的、由G-CSF调动的外周血细胞内，含有具有被带到皮肤 并分化为上皮细胞的能力的干细胞。
大肠的冰冻切片同样用抗细胞角蛋白抗体染色，并在荧光显微镜 下观察，结果，观察到GFP阳性细胞和细胞角蛋白阳性细胞。该结果 表明，在用于移植的、由G-CSF调动的外周血细胞内，含有具有被带 到大肠并分化为上皮细胞的能力的干细胞。
小肠的冰冻切片同样用抗细胞角蛋白抗体和作为血细胞标记物的 CD 45抗体染色。当在荧光显微镜下观察时，观察到GFP阳性细胞和 CD 45阴性细胞。该结果表明，在用于移植的、由G-CSF调动的外周 血细胞内，含有具有被带到小肠并分化为不同于血细胞的细胞的能力 的干细胞。
接着，用抗-CD 45抗体对各种器官进行免疫染色。
将载有切下的肺所制备的冰冻切片的载玻片，通过浸入PBS 5分 钟3次来洗涤，将该载玻片在室温下浸入Dako生物素封闭系统(Biotin Blocking System)(1)溶液(Dako制造)10分钟，用PBS洗涤两次， 在室温下浸入Dako生物素封闭系统(2)溶液(Dako制造)10分钟， 再用PBS洗涤两次。
接着，将其在室温下浸入封闭液[10％猪血清(Dako制造)，PBS]1 小时，再在室温下与由含有1.5％猪血清的PBS稀释100倍的一抗[生 物素抗鼠CD 45(LCA，Ly 5)](BD Pharmingen制造)溶液反应1 小时。用PBS洗涤四次后，在室温下与由含有1.5％猪血清的PBS稀 释到终浓度为5μg/ml的二抗(细菌蛋白，Alexa Fluor 594轭合物 (conjugate))(Molocular Probe制造)溶液反应1小时。用PBS洗涤 四次后，将含有DAPI的Vectashield Mounting Medium(Vector Laboratories制造)滴加到切片上，用盖玻片封片，在荧光显微镜下进 行观察。结果，观察到GFP阳性细胞和CD 45阴性细胞。该结果表明， 在用于移植的、由G-CSF调动的外周血细胞内，含有具有被带到肺并 分化为不同于血细胞的细胞的能力的干细胞。
肝脏的冰冻切片同样用抗-CD 45抗体进行染色，在荧光显微镜下 观察，并观察到GFP阳性细胞和CD 45阴性细胞。该结果表明，在用 于移植的、由G-CSF调动的外周血细胞内，含有具有被带到肝脏并分 化为不同于血细胞的细胞的能力的干细胞。
心脏、脑、胃、皮肤、小肠、大肠、骨骼肌和胰腺的冰冻切片也 同样用抗-CD 45抗体进行染色。当在荧光显微镜下观察时，每个组织 内都观察到GFP阳性细胞和CD 45阴性细胞。该结果表明，在用于移 植的、由G-CSF调动的外周血细胞内，含有具有被带到心脏、脑、胃、 皮肤、小肠、大肠、骨骼肌和胰腺并分化为不同于血细胞的细胞的能 力的干细胞。
实验实施例1
具有G-CSF活性的多肽对经过X射线照射的小鼠的肠上皮的治疗效 果：
经过X射线照射的小鼠的肠上皮、骨髓等不会产生新一代的细胞 (Nature Review Cancer， 3，117-129(2003))。因此，将用X射线照射的 小鼠制成肠上皮破坏模型来检测通过那托司亭调动进入外周血的细胞 是否有助于修复。
(1)将通过施予那托司亭而调动进入外周血的细胞，移植到经过X射 线照射的小鼠
将每只8周龄、体内所有细胞都整合了GFP基因并表达GFP蛋白 的小鼠(C57BL/6×129系)，连续5天每天皮下注射10μg的那托司亭。 至于那托司亭，使用Neu-up 100(Kyowa Hakko Kogyo有限公司制造)， 将其溶解于PBS(磷酸盐缓冲液)(pH7.4)(Life Technologies制造) 使其浓度为100μg/ml。
在最后一次施用那托司亭的后一天，将每只小鼠用乙醚麻醉，从 眼静脉收集外周血，收集在一个预先装有肝素钠(Takeda Chemical Industries有限公司制造)的管内，并令所收集的外周血经过100-μm的 细胞滤器(Becton Dickinson制造)。
将由此收集的外周血，如下所述通过从尾静脉注入到小鼠而移植。
首先，准备8周龄的C57BL/6小鼠(CLEA Japan)，在移植的前一 天，预先用X射线照射装置(Hitachi Medico制造)以12Gy剂量的X 射线进行照射。第二天，从每只小鼠的尾静脉移植入300μl收集的外 周血。其后，检查由此所得的嵌合体小鼠能否存活至少4周(下文称 为“外周血嵌合体小鼠”)。
(2)通过具有G-CSF活性的多肽在外周血嵌合体小鼠的肠上皮细胞中 调动的新生外周血源性细胞
将第(1)项中制备的每一只外周血嵌合体小鼠解剖并灌注和固定， 以切下小肠和大肠。具体地，每只外周血嵌合体小鼠通过腹腔内注射 戊巴比妥钠(Dainippon Pharmaceutical制造)进行麻醉，打开胸腔和 腹腔，暴露心脏，将Terumo公司制造的带翼的25G静脉注射针插入左 心室，切除右心耳，20ml的PBS流入并灌注整个身体。当所有的PBS 流尽以后，20ml的固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]通过同样的操作 流入进行固定。
然后，切下被固定的小鼠的小肠和大肠，浸泡到4℃的固定液[4％ PFA(多聚甲醛)，PBS]中2小时，用PBS冲洗，浸泡到4℃的高糖 溶液(20％蔗糖，PBS)中过夜，第二天，将其切成几个平方毫米的小 块，用OCT化合物包埋并用经过干冰冷却的异戊烷进行冷冻。
这样经过冷冻的组织用恒冷切片机切成厚度10μm的切片，粘附 在涂有APS(Matsunami制造)的载玻片上，充分干燥后制成冰冻切片。
将由此从小肠和大肠制成的冰冻组织切片用抗-细胞角蛋白抗体进 行免疫染色。细胞角蛋白是上皮细胞的标记物。
将载有冰冻切片的载玻片浸入PBS 5分钟3次。在洗涤玻片后， 将其浸入用PBS稀释到终浓度为10mg/ml的蛋白酶K(Gibco BRL制 造)15分钟。用PBS洗涤一次后，将其与固定液[4％PFA(多聚甲醛)， PBS]在室温下反应15分钟。用PBS洗涤两次后，将其在室温下浸入 封闭液[10％猪血清(Dako制造)，PBS]1小时，在室温下与由含有1.5％ 猪血清的PBS稀释50倍的一抗[单克隆鼠抗人细胞角蛋白，Clones AE1/AE3(Dako制造)]溶液反应1小时。用PBS洗涤四次后，在室 温下与由含有1.5％猪血清的PBS稀释800倍的二抗[Cy3-conjugated Affini Pure山羊抗鼠IgG(H+L)(Seikagaku公司制造)]溶液反应1小 时。用PBS洗涤四次后，将含有DAPI的Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories制造)滴加到切片上，用盖玻片封片，并在Zeiss 制造的荧光显微镜Axiophot 2下进行观察。结果，观察到GFP阳性细 胞和细胞角蛋白阳性细胞。因此证实，在被X射线照射破坏的小肠和 大肠内，各种组织的上皮细胞从用于移植的、由那托司亭调动到外周 血的细胞中分化出来。
实验实施例2
具有G-CSF活性的多肽对四氯化碳给药小鼠模型的肝脏的治疗效果：
使用通过施予四氯化碳使其肝脏破坏的小鼠模型，如下检测通过 那托司亭调动到外周血的细胞是否分化为肝细胞。
首先，与实验实施例1的第(1)项的方式一样，通过将那托司亭 调动的外周血从尾静脉注入到预先用X射线照射的小鼠，制成外周血 嵌合体小鼠。然后，将四氯化碳(Wako制造)通过腹腔内注射到外周 血嵌合体小鼠，剂量为2ml/kg。这里，通过用矿物油(Sigma制造) 作为溶剂将四氯化碳对矿物油的体积比调整为2∶3，以制备四氯化碳。
腹腔注射2周后，将每一只小鼠以与实验实施例1的第(2)项相 同的方法进行灌注和固定来切取肝脏。然后，切下固定小鼠的肝脏， 浸泡到4℃的固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]中2小时，用PBS 冲洗，浸泡到4℃的高糖溶液[20％蔗糖，PBS]中过夜，第二天，将其 切成几个平方毫米的小块，用OCT化合物包埋并用经过干冰冷却的异 戊烷进行冷冻。
这样经过冷冻的组织用恒冷切片机切成厚度10μm的切片，粘附 在涂有APS(Matsunami制造)的载玻片上，充分干燥后制成冰冻切片。
将如此由肝脏制成的冰冻组织切片用抗-白蛋白抗体进行免疫染 色。白蛋白是肝细胞的标记物。
将载有用切下的肝脏制成的冰冻切片的载玻片浸入PBS 5分钟3 次。在洗涤玻片后，将其浸入室温下的封闭液[10％猪血清(Dako制造)， PBS]1小时，在室温下与由含有1.5％猪血清的PBS稀释200倍的一抗 [抗鼠白蛋白兔多克隆(Dako制造)]溶液反应1小时。用PBS洗涤四 次后，其在室温下与由含有1.5％猪血清的PBS稀释800倍的二抗[Alexa Fluor 594-抗兔IgG(Molecular Probe制造)]溶液反应1小时。用PBS 洗涤四次后，将含有DAPI的Vectashield Mounting Medium(Vector Laboratories制造)滴加到切片上，用盖玻片封片，并在荧光显微镜下 进行观察。结果，观察到形态类似于肝细胞的GFP阳性细胞和白蛋白 阳性细胞。因此证实，在被四氯化碳破坏的肝脏内，肝细胞从通过那 托司亭调动到外周血的细胞中分化出来。
实验实施例3
具有G-CSF活性的多肽对心脏毒素给药小鼠模型的骨骼肌的治疗效 果：
使用通过施予心脏毒素破坏其骨骼肌的小鼠模型，如下检测通过 那托司亭调动到外周血的细胞是否分化为骨骼肌纤维。
首先，与实验实施例1的第(1)项中的方式一样，通过将那托司 亭调动的外周血从尾静脉注入预先用X射线照射的小鼠，制成外周血 嵌合体小鼠。将心脏毒素通过肌肉注射到外周血嵌合体小鼠的胫前肌， 由此剂量为25到50μl。这里，通过溶解于PBS使得心脏毒素(Latoxan 制造)浓度为1μM而使用。
接着，肌肉注射4周后，切取每一只小鼠的胫前肌，浸泡到4℃的 固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]中2小时，用PBS冲洗，浸泡到4 ℃的高糖溶液[20％蔗糖，PBS]中过夜，第二天，将其切成几个平方毫 米的小块，用OCT化合物包埋并用经过干冰冷却的异戊烷进行冷冻。
这样经过冷冻的组织用恒冷切片机切成厚度10μm的切片，粘附 在涂有APS(Matsunami制造)的载玻片上，充分干燥后制成冰冻切片。
将如此由胫前肌制成的冰冻组织切片用抗支架蛋白抗体进行免疫 染色。支架蛋白是骨骼肌纤维的标记物。
将载有用切下的胫前肌制成的冰冻切片的载玻片浸入PBS 5分钟 3次。在洗涤玻片后，将其浸入用PBS稀释到终浓度为10mg/ml的蛋 白酶K(Gibco BRL制造)15分钟。用PBS洗涤一次后，将其在室温 下与固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]反应15分钟。用PBS洗涤两 次后，室温下浸入封闭液[10％猪血清(Dako制造)，PBS]1小时，在 室温下与由含有1.5％猪血清的PBS稀释40倍的一抗[抗支架蛋白脱脂 的(Delipidized)，完整抗血清D8281(Whole Antiserum D8281)(Sigma 制造)]溶液反应1小时。用PBS洗涤四次后，在室温下与由含有1.5％ 猪血清的PBS稀释800倍的二抗[Alexa Fluor 594-抗兔IgG(Molocular Probe制造)]溶液反应1小时。用PBS洗涤四次后，将含有DAPI的 Vectashield Mounting Medium(Vector Laboratories制造)滴加到切片上， 用盖玻片封片，并在荧光显微镜下进行观察。结果，观察到GFP阳性 和支架蛋白阳性的骨骼肌纤维，其在形态上被判定为骨骼肌。因此证 实，在被心脏毒素破坏的骨骼肌组织内，骨骼肌纤维从通过那托司亭 调动而到外周血的细胞中分化出来。
实验实施例4
具有G-CSF活性的多肽对皮肤损伤小鼠模型的治疗效果：
根据传统的方法[Biological & Pharmaceutical Bulletin(Biol.Pharm. Bull.)， 19，530-535(1996)]，两只6周龄的雌性C57BL/KsJ-db/db Jcl小 鼠(CLEA Japan)通过腹腔内注射戊巴比妥钠(Dainippon Pharmaceutical 制造)进行麻醉，在去除背侧的毛后，用4mm直径的活组织检查环钻 (Kai Industries制造)制成皮肤全层切除伤。
从制作切除伤的那天开始(下文中记述为“0天”)，两只小鼠中的 一只在连续5天内，每天一次皮下注射10μg/body剂量的那托司亭。 另一只小鼠用PBS代替那托司亭给药。将那托司亭(Kyowa Hakko Kogyo有限公司制造)溶解于PBS，使得其浓度为100μg/ml，作为那 托司亭使用。切除伤制成以后，定期测量伤口区域以计算切除伤愈合 程度。伤口面积是通过用数码相机(Nikon COOLPIX 990)对背侧中心 区域所制作的两个切除伤进行拍照，然后使用图像分析软件(NIH Image)测量的。除了伤口面积(mm2)，当0天的伤口面积定为100％ 时的伤口面积比率，在表2中如伤口面积比率(％)所示。
表2 制成切除伤后的天数 0天 3天 7天 10天 那托司亭给药 22.4mm2 (100％) 17.0mm2 (75.9％) 3.3mm2 (14.7％) 0.7mm2 (3.1％) 17.3mm2 (100％) 9.6mm2 (53.5％) 3.0mm2 (17.3％) 2.8mm2 (16.2％) PBS给药 13.2mm2 (100％) 10.7mm2 (81.1％) 6.4mm2 (48.5％) 5.2mm2 (39.4％) 10.5mm2 (100％) 7.8mm2 (74.3％) 7.8mm2 (74.3％) 5.1mm2 (48.6％)
伤口面积(mm2)
(伤口面积比率(％))
如表2所示，与PBS给药的小鼠相比，发现在那托司亭给药的小 鼠身上，加速了伤口面积和伤口面积比率的减少，即皮肤再生加速效 果。
实验实施例5
通过大鼠肺泡破坏模型进行评估(1)：
将猪胰腺弹性蛋白酶(下文称为“弹性蛋白酶”，比活度135单位 /mg蛋白，Elastin Products制造)用盐水(Otsuka Pharmaceutical制造) 稀释到70单位/ml，并将其以500μl气管内施于每只9周龄的雄性SD 大鼠(Charles River Japan)。一个单位的弹性蛋白酶具有的活性可在pH 8.8、30℃下，在20分钟内降解1mg弹性蛋白。两周后，在保持每组 的平均体重基本相同的情况下将其分组，每组10只小鼠。通过将Gran Injection M 300(Kirin Brewery制造)溶解于盐水使其浓度为20μg/ml而 制成待用的非格司亭。在非格司亭给药组中，施予弹性蛋白酶3周后， 连续5天每天一次皮下注射剂量为100μg/kg的非格司亭。在弹性蛋白 酶给药组中，施予弹性蛋白酶后不再施予任何药物。在盐水给药组中， 用盐水代替弹性蛋白酶给药，其后不再施予任何药物。弹性蛋白酶给 药5周后，切取肺并在25cm H2O压力下通过呼吸道注入福尔马林将 其固定，然后通过使用切片测定肺泡破坏的程度。通过在肺切片样本 的显微图像上，画5行长度和宽度各为1.325μm的方格，测量交叉于 线上的肺泡壁，然后将方格线的总长除以交叉的肺泡壁的数量，计算 出平均线性截取长度(Environmental Research， 42，340-352(1987))。
图1以平均值±标准差(SE)的形式显示平均线性截取长度。如 图1所示，通过施用弹性蛋白酶，观察到平均线性截取长度延长，即 肺泡壁的破坏。在非格司亭给药组，16％破坏的肺泡壁得到修复。
实验实施例6
通过大鼠肺泡破坏模型进行评估(2)：
用实验实施例5同样的方式，将那托司亭施予经过弹性蛋白酶处 理造成肺泡破坏的大鼠，并测量肺泡破坏的变化。
通过将Neu-up 250(Kyowa Hakko Kogyo有限公司制造)溶解于 盐水使其浓度为40μg/ml，从而制成待用的那托司亭。施予弹性蛋白酶 3周后，连续5天每天一次皮下施用剂量为200μg/kg的那托司亭，接 着的5周每周给药3次。在弹性蛋白酶给药组，施予弹性蛋白酶后不 再施予任何药物。在盐水给药组，用盐水代替弹性蛋白酶给药，其后 不再施予任何药物。弹性蛋白酶给药8周后，切取肺并根据实验实施 例5的方法分析。图2以平均值±标准差(SE)的形式显示了平均线 性截取长度。
如图2所示，通过施予弹性蛋白酶，观察到平均线性截取长度的 变长，即肺泡壁的破坏。在那托司亭给药组，35％破坏的肺泡壁得到修 复。
实验实施例7
通过大鼠肺泡破坏模型进行评估(3)：
用实验实施例5同样的方式，将全反式视黄酸(下文称为“视黄 酸”)、或那托司亭和视黄酸施予经过弹性蛋白酶处理而造成肺泡破坏 的大鼠，并测量肺泡破坏的变化。通过将视黄酸(Sigma Aldrich制造) 悬浮于玉米油(Wako Pure Chemical Industries制造)使其浓度为3 mg/ml，从而制成待用的视黄酸。通过将Neu-up 100(Kyowa Hakko Kogyo有限公司制造)溶解于盐水使其浓度为20μg/ml，从而制成待用 的那托司亭。施予弹性蛋白酶3周后，连续5天每天一次皮下施用剂 量为100μg/kg的那托司亭。施予弹性蛋白酶3周后，连续3周每天一 次口服剂量为3mg/kg的视黄酸。安排一组单独施予视黄酸(视黄酸给 药组)，而一组视黄酸和那托司亭两者均施用(视黄酸/那托司亭给药 组)。在弹性蛋白酶给药组，施予弹性蛋白酶后不再施予任何药物。在 盐水给药组，用盐水代替弹性蛋白酶给药，其后不再施予任何药物。 弹性蛋白酶给药5周后，切取肺并根据实验实施例5的方法分析。图3 以平均值±标准差(SE)的形式显示了平均线性截取长度。
如图3所示，在视黄酸给药组，14％破坏的肺泡壁得到修复。在视 黄酸/那托司亭给药组，观察到破坏肺泡壁的强烈恢复。
实验实施例8
那托司亭对db/db小鼠的治疗效果：
db/db小鼠是单隐性db基因转基因小鼠，并且已知为II型糖尿病 小鼠模型，其自发显现出明显糖尿病症状，例如肥胖、多食和胰岛素 分泌过多(Joslin’s Diabetes Mellitus，pp.317-349(1995))。由于肥胖大约 发生在db/db小鼠出生后4到5周，并且血糖水平随着体重的增加而增 高，所以认为高血糖状态导致整个机体器官的组织破坏，例如炎症。 因此，经过X射线照射的db/db小鼠，用来检测通过那托司亭调动到 外周血的细胞是否有助于组织修复。
(1)移植骨髓细胞到经过X射线照射的db/db小鼠
首先，在移植通过那托司亭调动到外周血的细胞之前，移植骨髓 细胞。
6周龄的雌性C57BL/KsJ-db/db小鼠(CLEA Japan)用作db/db小 鼠，并在移植前一天用X射线照射装置(Hitachi Medico制造)以12Gy 剂量的X射线进行照射。第二天，从尾静脉给每只小鼠移植3×106个 分离自一只8周龄的、体内所有细胞都整合了GFP基因并表达GFP蛋 白的小鼠(C57BL/6×129系)的骨髓的细胞。
移植4周后，将每只小鼠解剖，并灌注和固定以切下每个器官。
具体地，小鼠通过腹腔内注射戊巴比妥钠(Dainippon Pharmaceutical制造)进行麻醉，打开腹腔和胸腔以暴露心脏，将Terumo 公司制造的带翼的25G静脉注射针插入左心室，切掉右心耳，20ml 的PBS流入并灌注整个身体。当所有的PBS流尽后，用20ml的固定 液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS]通过同样的操作流入进行固定。
然后，切下固定小鼠的所有器官，浸泡到4℃的固定液[4％PFA(多 聚甲醛)，PBS]中2小时，用PBS冲洗，浸泡到4℃的高糖溶液[20％ 蔗糖，PBS]中过夜，第二天，将其切成几平方毫米的小块，用OCT化 合物包埋并用经过干冰冷却的异戊烷进行冷冻。
这样经过冷冻的组织用恒冷切片机切成厚度10μm的切片，粘附 在涂有APS(Matsunami制造)的载玻片上，充分干燥后制成冰冻切片。
将这样制成的每个器官的冰冻组织切片用不同的抗体进行免疫染 色。
结果，在肝脏切片中观察到GFP阳性细胞和白蛋白抗体阳性细胞。 同样，在胰腺切片中观察到GFP阳性细胞和胰岛素抗体阳性细胞，在 心肌切片中观察到GFP阳性细胞和肉瘤α-肌动蛋白抗体阳性细胞。此 外，在脑切片中观察到具有神经元样形状的GFP阳性细胞，和具有浦 肯野氏细胞特有的树突状的GFP阳性细胞。
因此证实，在经过X射线照射的db/db小鼠的移植试验中，肝细 胞、胰腺β细胞、心肌细胞、神经元和浦肯野氏细胞从骨髓细胞中分 化出来。
(2)将通过施用那托司亭调动到外周血的细胞移植到经过X射线照射 的db/db小鼠
接着，将通过施用那托司亭调动到外周血的细胞，以与上述第(1) 项同样的方式，移植到经过X射线照射的db/db小鼠。
首先，每只8周龄的、体内所有细胞都整合了GFP基因并表达GFP 蛋白的小鼠(C57BL/6×129系)，连续5天每天皮下注射10μg的那 托司亭。至于那托司亭，是通过将Neu-up 100(Kyowa Hakko Kogyo 有限公司制造)溶解于PBS(磷酸盐缓冲液)(pH 7.4)(Life Technologies 制造)中，使其浓度为100μg/ml而使用的。
最后一次施用那托司亭的后一天，每只小鼠用乙醚进行麻醉，从 眼静脉收集外周血，收集在一个预先装有肝素钠(Takeda Chemical Industries有限公司制造)的管内，令所收集的外周血经过100-μm的细 胞滤器(Becton Dickinson制造)。
将这样所收集到的外周血，如下所述通过从尾静脉注入到db/db 小鼠进行移植。
首先，将6周龄的雌性C57BL/KsJ-db/db小鼠(CLEA Japan)作 为待接收移植的db/db小鼠，并在移植前一天用X射线照射装置 (Hitachi Medico制造)以9.5Gy剂量的X射线进行照射。第二天， 从尾静脉对每只小鼠移植300μl剂量的所收集的外周血。
移植4周后，将每只小鼠解剖，并灌注和固定以及切下每个器官， 并将所有器官包埋而制成冰冻切片。
将由此冰冻的每个器官的切片用不同的抗体进行免疫染色。
结果，在肝脏切片中观察到GFP阳性细胞和白蛋白抗体阳性细胞。 同样，在胰腺切片中观察到GFP阳性细胞和胰岛素抗体阳性细胞，在 心肌切片中观察到GFP阳性细胞和肉瘤α-肌动蛋白抗体阳性细胞，在 小肠和胃切片中观察到GFP阳性细胞和细胞角蛋白抗体阳性细胞。此 外，在脑切片中观察到NeuN抗体阳性细胞和具有神经元样形状的GFP 阳性细胞。而且，在肺切片中观察到位于肺泡上皮细胞处的GFP阳性 细胞。
因此证实，在经过X射线照射的db/db小鼠的移植试验中，肝细 胞、胰腺β细胞、心肌细胞、小肠上皮细胞、胃上皮细胞、神经元和 肺泡上皮细胞，从由那托司亭调动到外周血的细胞中分化出来。
实验实施例9
那托司亭对骨髓嵌合体小鼠的作用：
将6周龄的雌性C57BL/6小鼠(CLEA Japan)和6周龄的雌性 C57BL/KsJ-db/db小鼠(CLEA Japan)用X射线照射装置(Hitachi Medical Corp.制造)以9.5Gy剂量的X射线进行照射。第二天，从尾 静脉给每只小鼠移植3×106个分离自一只6到8周龄的、表达GFP蛋 白的雄性小鼠(C57BL/6×129系)的骨髓的细胞。
将小鼠分成那托司亭给药组和对照组，并进行下列处理。对那托 司亭给药组，移植7天后，每只小鼠连续14天每天皮下注射10μg的 那托司亭。至于那托司亭，是通过将Neu-up(Kyowa Hakko Kogyo有 限公司制造)溶解于PBS使其浓度为100μg/ml而使用的。同样，对 于对照组，移植7天后，用PBS代替那托司亭连续给药14天。
骨髓移植1个月后，将每只小鼠解剖，并灌注和固定以切下肝脏、 肺和肾脏。具体地，每只外周血嵌合体小鼠通过腹腔内注射戊巴比妥 钠(Dainippon Pharmaceutical制造)进行麻醉，打开腹腔和胸腔以暴 露心脏，将Terumo公司制造的带翼的25G静脉注射针插入左心室，切 掉右心耳，20ml的PBS流入并灌注整个身体。其后，20ml的固定液 [4％PFA(多聚甲醛)，PBS]通过同样的操作流入进行固定。然后，将 肺连同气管按照原状一起切下，将装有与Surflow留置针(20G)(Terumo 公司制造)相连的导管、含有用PBS稀释两倍的OCT化合物(Miles 制造)的20-ml注射器插入气管，通过丝制缝合线(Natsume Seisakusho 制造)将导管的顶端与气管相连，通过气管将10ml用PBS稀释两倍 的OCT溶液注入肺内。注射完毕后，将肺切成几平方毫米的小块，用 OCT化合物包埋并用经过干冰冷却的异戊烷进行冷冻。同样也切下每 只小鼠的肝脏和肾脏，浸泡到4℃的固定液[4％PFA(多聚甲醛)，PBS] 中2小时，用PBS冲洗，浸泡到4℃的高糖溶液[20％蔗糖，PBS]中过 夜，第二天，将其切成几平方毫米的小块，用OCT化合物包埋并用经 过干冰冷却的异戊烷进行冷冻。这样经过冷冻的组织用恒冷切片机切 成厚度10μm的切片，粘附在涂有APS(Matsunami制造)的载玻片 上，充分干燥后制成冰冻切片。
在这样制成的冰冻组织切片中，将肝脏切片用抗-白蛋白抗体进行 免疫染色。白蛋白是肝细胞的标记物。
将载有用切下的肝脏制成的冰冻切片的载玻片浸入PBS 5分钟3 次。在洗涤玻片后，室温下浸入封闭液[10％猪血清(Dako制造)，PBS] 1小时，室温下与由含有1.5％猪血清的PBS稀释200倍的一抗[抗鼠白 蛋白兔多克隆(Dako制造)]溶液反应1小时。用PBS洗涤四次后， 在室温下与由含有1.5％猪血清的PBS稀释800倍的二抗[Alexa Fluor 594-抗兔IgG(Molecular Probe制造)]溶液反应1小时。用PBS洗涤 四次后，将含有DAPI的Vectashield Mounting Medium(Vector Laboratories制造)滴加到切片上，用盖玻片封片，在荧光显微镜下进 行观察。
每个小鼠制作30张冰冻切片，计量GFP阳性细胞和白蛋白阳性细 胞的数目。图4以平均值±标准差的形式显示了单位面积的GFP阳性 细胞和白蛋白阳性细胞的数目。如图4所示，那托司亭给药组的 C57BL/6小鼠增加了大约4.5倍，那托司亭给药组的C57BL/KsJ-db/db 小鼠增加了大约4.8倍。因此，通过施用那托司亭，分化为肝细胞的骨 髓源性细胞得到增加。
进一步，计量肺和肾脏冰冻切片的GFP阳性细胞的数目。结果发 现，通过施用那托司亭，增加了GFP阳性细胞的数目。
附图说明
图1显示了施用弹性蛋白酶后的肺泡平均线性截取长度的变化， 和施用非格司亭的作用。纵座标表示平均线性截取长度(μm)。
图2显示了施用弹性蛋白酶后的肺泡平均线性截取长度的变化， 和施用那托司亭的作用。纵座标表示平均线性截取长度(μm)。##代表 P＜0.01(与弹性蛋白酶给药组比较，威耳康松氏秩和检验)。
图3显示了施用弹性蛋白酶后的肺泡平均线性截取长度的变化， 和施用视黄酸或视黄酸/那托司亭的作用。纵座标表示平均线性截取长 度(μm)。##代表P＜0.01(与弹性蛋白酶给药组比较，威耳康松氏秩 和检验)。
图4显示了那托司亭给药或无那托司亭给药后的每单位面积的 GFP阳性细胞和白蛋白阳性细胞的数目。纵坐标的单位是细胞数/cm2。 #代表P＜0.05(Student’s t-test)。WT和db分别代表C57BL/6小鼠组和 C57BL/KsJ-db/db小鼠组。
具体实施方式
下面基于实施例对本发明作详细描述，但本发明不限于此。
实施例1
注射剂(那托司亭)：
根据常用的方法，制备具有下列组分的注射剂。
那托司亭 25μg
聚山梨醇酯80 2.5g
乳糖 5mg
盐水 0.5ml
实施例2
注射剂(那托司亭和全反式视黄酸的单一制剂)：
根据常用的方法，制备具有下列组分的注射剂。
那托司亭 25μg
全反式视黄酸 1.0mg
聚山梨醇酯80 2.5g
乳糖 5mg
盐水 0.5ml
产业上的适用性
本发明提供用于预防和/或治疗伴有组织破坏的疾病的药剂，其含 有粒细胞集落刺激因子作为活性成分。
序列表
<110>协和发酵工业株式会社
<120>
<130>11570WO1
<150>JP 2003-139604
<151>2003-05-16
<160>1
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>174
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
1 5 10 15
Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln
20 25 30
Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val
35 40 45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys
50 55 60
Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser
65 70 75 80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser
85 90 95
Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp
100 105 110
Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro
115 120 125
Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe
130 135 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe
145 150 155 160
Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
165 170