技术领域
本发明涉及芋螺毒素SO3的治疗性应用。
背景技术
缺血性脑损伤是一种严重危害健康的疾病。多年来人们对脑缺血造成 的神经元损伤的病理生理基础进行了深入的研究，发现钙离子在此过程中 起着关键的作用。神经元细胞膜上的电压敏感型Ca2+通道 (Voltage-Sensitive Calcium Channels，VSCCs)负责Ca2+的内流。在生 理情况下，神经细胞外Ca2+浓度为1～2mmol/L，而胞内则小于200 nmol/L，相差10,000多倍，这种差别是细胞执行正常生理功能必不可少的。 脑缺血后，VSCCs开放延长，Ca2+内流增加，胞内Ca2+水平很快升高， 而胞外则降至原来浓度1/10。体外海马脑片CA1细胞实验证实缺氧可诱 导细胞内Ca2+([Ca2+]i)的增加，是神经元及突触功能发生不可逆损伤 的重要原因。胞内Ca2+超载可触发一系列损伤性病理生理改变，导致兴 奋性氨基酸(EAA)如谷氨酸等大量释放，造成细胞持久过度兴奋；激活 磷脂酶A2(PLA2)和激活磷脂酶C(PLC)，引起花生四烯酸(AA)级联反 应，破坏细胞正常膜结构，促进氧自由基生成；异常激活Ca2+依赖性蛋 白酶、核酸酶，破坏细胞骨架，降解DNA分子；胞内Ca2+超载超过一定 程度还可以引起线粒体Ca2+超载，破坏氧化磷酸化过程。因此缺血损伤 进程中对VSCCS进行干预是一种重要的治疗手段。研究表明，L型VSCCs 拮抗剂DHPs在轻中度脑缺血中早期运用，可以起到一定程度的保护作用。 这就提示作为N型VSCCs阻断剂在缺血性脑损伤中的潜在保护作用。
N型VSCCs阻断剂芋螺毒素MVIIA是一种含25个氨基酸残基的短 肽，其氨基酸序列为：CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC(SEQ ID NO：2)。在国外，动物模型实验研究首先证明了芋螺毒素MVIIA有神经 保护作用。Valentino等(Proc Nalt Acad Sci USA.1993，90：7894-7897)首先运用大鼠全脑缺 血模型对MVIIA的神经保护作用进行了研究。大鼠全脑缺血模型(全脑缺 血处理15min后恢复供血)建立后，立即经静脉注射MVIIA(15mg/kg)， 5天后进行检测。实验结果表明海马CA1区神经元细胞损伤明显低于对照 组(P＜0.001)。在剂量效应(0.2～15mg/kg)研究中，分别缺血后1、6hr 给药。6hr组损伤评分一致低于给予相应剂量的1hr组，相对于对照组减 少海马CA1区神经元损伤50％(ED50)前者需要的MVIIA剂量是 12.5mg/kg，而后者为2.3mg/kg。根据此特点进一步的开展时间效应研究， 在缺血模型建立后6、12、24、48hr分别给予静脉注射单剂量MVIIA (5mg/kg)。和对照组相比，在6、12及24hr时间点MVIIA均表现出显 著的神经保护作用(P＜0.001)，但它们各自之间没有明显的区别。为证 明MVIIA是阻止而不是简单的延搁细胞损伤，在给药后(5mg/kg)5和12 天分别检测损伤情况，和对照组相比均有显著意义(P＜0.001)。同时， 体内微透析分析表明，MVIIA对高K+诱发的神经元Glu释放无明显抑制 作用，提示其神经保护功能可能与兴奋性氨基酸的作用无关。Zhao等(Acta Physiol Scand.1994，150：459-461)报道了缺血后15min使用MVIIA可显著减少大鼠大 脑中动脉阻断(MCAO)2hr所致脑梗死面积，且在处理组中有3只动物 未发现梗死灶。Yenari等(Brain Res.1996，739：36-45)运用MRI在大鼠MCAO 30min 模型也显示，处理组脑梗死面积显著小于对照组。Miguel等(Journal of Neurological Sciences.1997，153：25-31)通过兔局部脑缺血模型亦得到类似结果。Bowersox等(Brain Res.1997，747：343-347)的实验结论还证实，MVIIA在阻断交感神经释放NE引起 血压下降的同时，仍表现显著的脑保护作用。
在体外培养细胞的实验中MVIIA也表现出神经保护活性。Pringle等 (Stroke.1996，27：2124-2130)利用大鼠海马切片培养实验模型对MVIIA的神经保护 作用进行了研究。从10d年龄大鼠中取海马切片培养到14d时开始实验。 在缺氧3hr而后复氧24hr的体外缺氧损伤实验模型中，在缺氧前或缺氧 3hr后加入MVIIA对海马CA1、CA3区神经细胞具有明显保护作用 (P＜0.01)。缺氧3hr后加入MVIIA的保护作用呈剂量效应，EC50为 50nmol/L。而L-型VSCCs拮抗剂DHPs及混合型钙通道拮抗剂 SB201823-A均无保护作用。
新的研究还表明，MVIIA可以改善鼠脑损伤后线粒体的呼吸功能，包 括ATP合成(P/O值)、呼吸控制指数(RCI)、Ca2+转运、电子传递 活性(琥珀酸和NAD样物质)均有明显改善(Bowersox SS，etc.Toxicon，1998，36：1651-1658)。 这在1例脑卒中和1例癫痫病人的脑组织的相关实验中得到证实，为MVII A临床应用治疗重型颅脑损伤提供了一定的实验依据。MVIIA现已成为第 一个运用于临床实验治疗中风所造成的缺血性脑损伤及改善外伤造成的 脑损伤的多肽类钙拮抗剂。
国内目前尚无其他开展芋螺毒素的神经保护功用的研究。芋螺毒素 SO3是通过对我国南海的线纹芋螺(Conus striatus)毒管基因克隆(卢松柏 等，科学通报，44(16)：1737-1739，1999)并经肽合成而得到的，其 氨基酸序列为：CKAAGKPCSRIAYNCCTGSCRSGKC(SEQ ID NO：1， C端酰氨化)。该肽含25个氨基酸残基，三对二硫键，属于超O家族芋 螺毒素。应用热板法、光热辐射法及化学刺激法测定了其对小鼠的镇痛活 性的半数有效剂量(ED50)为0.75ug/kg，活性比吗啡高千倍以上。然而，现 有技术中并不清楚芋螺毒素SO3或其类似物或衍生物的其它治疗性应用。 本发明首次公开了芋螺毒素SO3或其类似物肽或衍生物在治疗或缓解因 缺血或缺氧造成的神经损伤中的应用。
发明内容
芋螺毒素SO3含25个氨基酸残基，三对二硫键，属于超O家族芋螺 毒素，其序列如下：CKAAGKPCSRIAYNCCTGSCRSGKC(SEQ ID NO： 1)。在本发明中出乎意料的发现，芋螺毒素SO3或其类似物或衍生物可 以有效用于治疗、缓解或预防因缺血或缺氧造成的神经损伤，其副作用很 低。
因此，在一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其中含有芋螺 毒素SO3或其类似物或衍生物作为活性成分以及药学上可接受的载体。
在另一个方面中，本发明提供了一种试剂盒，其中上述药物组合物以 及使用说明书。
在又一个方面中，本发明涉及芋螺毒素SO3或其类似物或衍生物在制 备可用于治疗、缓解或预防缺血或缺氧造成的神经损伤的药物中的用途。
具体实施方式
在本发明的上下文中，术语“类似物”被定义为因一或多个、优选1 -5个、更优选1-3个、尤其优选1-2个、最优选1个氨基酸残基的取 代、插入、缺失和/或添加而与亲本肽有所不同、但仍保留了与亲本肽相同 的生物学活性的肽，或者是亲本肽与其它肽/多肽构成的融合蛋白。所述其 它肽/多肽可以是例如有助于亲本肽的靶向性的肽，以便特异性给药，或者 可以是能够提高亲本肽的半寿期的肽，等等。
术语“衍生物”是亲本肽中的一个或多个氨基酸残基被非天然存在的 氨基酸残基所取代，或者在氨基酸残基上连接了一或多个取代基或者缀合 了其它聚合物后所衍生的肽，例如发生了烷基化，酰基化，形成了酯或酰胺。
本发明提供了一种药物组合物，其中含有芋螺毒素SO3或其类似物或 衍生物作为活性成分以及药学上可接受的载体。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物中含有芋螺毒素SO3(SEQ ID NO：1)。
在又一个实施方式中，本发明的药物组合物中含有芋螺毒素SO3类似 物。在本领域中众所周知，可以对多肽/肽进行适当的氨基酸修饰而仍不影 响其功能。例如，可以用侧链性质相似的氨基酸残基取代亲本肽中的相应 残基，即进行保守性取代。或者，可以在肽的氨基末端添加甲硫氨酸或其 它肽/多肽，以构建融合蛋白，以促进其纯化或延长其半寿期。在多肽/肽 中引入氨基酸修饰的技术是普通技术人员所熟知的，包括定点诱变、丙氨 酸扫描突变等，在这方面有众多的现有技术可供参考。对于短肽而言，还 可通过肽化学合成法而方便地制备。
还可以对应用于本发明中的SO3肽进行各种修饰，包括对其中的氨基 酸残基的侧链进行修饰，或缀合上其它的有机聚合分子，以提高其半寿期 等。这样的方法在现有技术中也是众所周知的。这种经过修饰的芋螺毒素 SO3衍生物同样可用于本发明中。
中国专利申请99106070.9(CN1237584A)和00128525.4(CN 1296012A) 中公开了制备芋螺毒素SO3的方法。这两篇文献的公开内容全文引入本文 作为参考。
在本发明的药物组合物中，还可以含有药学上可接受的载体。“药学 可接受的载体”是指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释剂、胶囊材 料等。
本发明的药物组合物可以制备成适当的剂型。适当剂型的实例包括： 用于口服给药的片剂、胶囊、包衣片、颗粒剂、溶液和糖浆；用于注射给 药的无菌溶液和缓释剂型。
这些剂型中也可以含有其他惯用成分，例如：防腐剂、稳定剂、表面 活性剂、缓冲液、调节渗透压的盐、乳化剂、增甜剂、着色剂、调味剂等 等。
如果特定治疗需要，本发明的药物组合物可含有同时给药比较有效的 其他药理学活性成分。
在本发明的药物组合物中，芋螺毒素SO3或其类似物或衍生物的量可 以根据下列已知因素而在较宽的范围内变化，诸如：欲治疗疾病的类型、 疾病的严重程度、病人的体重、剂型、所选用的给药途径以及每天的给药 次数等。不过，最佳量可以由本领域技术人员容易而常规地确定。一般地， 芋螺毒素SO3或其类似物或衍生物在本发明的药物组合物中的量为能确 保给药水平达到0.01μg/kg/天至10mg/kg/天的量，优选达到0.1μg/kg/ 天至1mg/kg/天的量，更优选达到1μg/kg/天至0.1mg/kg/天的量。有关药 物制剂的内容在现有技术中有诸多教导，参阅例如“Remington药物科学” (1985)或Remington：药物科学与实践，19版，1995。
可以用制药工业的常规技术制备本发明芋螺毒素SO3或其类似物或 衍生物的注射用组合物，这些技术包括适当地溶解和混合各组分以得到所 需的最终产物。
根据一种方法，将芋螺毒素SO3或其类似物或衍生物溶解于一定量 的水中，其中水的量稍小于所制备的组合物的最终体积。按需要加入等渗 剂、防腐剂和缓冲剂，并在需要时用酸如盐酸、或碱如氢氧化钠水溶液调 节溶液的pH值。最后，用水调节溶液体积得到所需的组分浓度。
等渗剂例如有氯化钠、甘露糖醇、甘油。
防腐剂例如有苯酚、间甲酚、甲基对羟基苯甲酸酯、苄醇。
适宜的缓冲剂如乙酸钠和磷酸钠。
本发明的药物组合物的剂型可以利用药剂师所熟知的技术进行制备， 这些技术包括混合、制粒、压缩、溶解、灭菌等。
作用对象
术语“患者”是指可以施用芋螺毒素SO3或其类似物或衍生物的任何 动物，优选哺乳动物，尤其是人。可用本发明方法进行治疗的具体患者包 括人以及非人灵长动物、绵羊、马、牛、山羊、猪、狗、猫、兔、豚鼠、 仓鼠、沙鼠、大鼠和小鼠等。
给药途径和试剂盒
本发明的药物组合物可以采用医学上可接受的任何方式对患者给药。 包括通过肠胃外途径注射，例如静脉内、血管内、动脉内、皮下、肌内、 脑内、椎管内(包括蛛网膜下腔内和硬膜外腔内)或其它方式，以及经口、 鼻、眼、直肠或局部给药。本发明还特别包括缓释给药方式(通过诸如储 存注射途径)。
本发明的药物组合物可以提供于容器中，从而适于在适当分装和保存 期间维持无菌状态，保护活性成分的活性，并便于方便有效地将组合物施 用于患者。对于可注射性剂型，组合物可以作为贮于适于利用针头和注射 器从中取出各成分的带塞小瓶中的形式提供。这种小瓶可供一次性使用或 多次使用。组合物也可作为预充满的注射器的形式提供。在某些情形下， 各组分可以作为液体制剂提供，而另一些情况下，它们可以干燥或冻干状 态提供，这样就需要用标准或供给的稀释剂重溶制剂，使之呈液态。若化 合物作为静脉内给药的液体形式提供，即可以将其贮于适合连接到静脉内 给药线或者导管的无菌包或容器内。在以片剂或丸剂形式口服的情形下， 化合物即可贮于带可移动瓶盖的瓶子中。容器上可以贴有信息单，如化合 物类型，生产商或分装者名称，各指数，建议使用的剂量，恰当贮存的建 议或者给药建议。
下面的实验研究将进一步阐述本发明，而不以任何方式限制本发明的 内容。
实施例
实施例1芋螺毒素SO3的制备
按照中国专利申请00128525.4(CN 1296012A)中公开的方法制备芋螺 毒素SO3，获得纯度超过99％的冻干纯品芋螺毒素SO3。
实施例2芋螺毒素SO3对沙鼠脑缺血后神经元的保护作用
为了研究芋螺毒素SO3对缺血性神经损伤的保护作用，需要建立一个 体外的神经元缺氧损伤模型和一个体内的动物脑缺血损伤模型来对它的 药理作用进行评估。
在哺乳动物的脑组织中，海马区神经元对于缺氧的损伤最为敏感。体 外神经元缺氧模型通常采用原代培养大鼠海马神经元缺氧模型及大鼠海 马脑片缺氧模型。原代培养大鼠海马神经元方法成熟，条件可控性高，并 可进行较多指标的检测，如对细胞内游离钙离子进行检测。动物脑缺血损 伤模型常用大鼠全脑缺血模型及沙土鼠全脑缺血模型。沙土鼠缺乏后交通 动脉及完整的基底动脉环，因而结扎单侧CCA即造成明显脑缺血，被广 泛用于中风病理机制研究。手术操作简单，创伤小，可用于筛选脑活性保 护成分或缺血性保护剂的研究。我们选择了原代培养大鼠海马神经元缺氧 模型及沙土鼠全脑缺血模型作为芋螺毒素SO3的体外和体内神经损伤保 护作用的初步评估模型。
将沙土鼠随机分为4组，每组15只动物：正常组、假手术组、SO3组及生理盐水组。将沙土鼠经2％戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉(65mg/kg)， 游离双侧颈总动脉，用微动脉夹阻断单侧颈总动脉血流，检查远端血流情 况以确保完全阻断血流。30分钟后，移去微动脉夹，观察侧颈总动脉血流 恢复后，丝线缝合切口。假手术组不结扎颈总动脉。SO3组在松开微动脉 夹后立即给予颅内注射3.0μg/kg的芋螺毒素SO3。每组选取手术后有症 状出现的沙土鼠5只，于术后第5天断头处死。迅速手术取脑，先用50ml PBS冲洗血液，然后浸入含4％多聚甲醛PBS中固定8小时。固定结束后， 经背侧海马冠状切开，取约2mm脑组织块，常规石蜡包埋，做病理切片 厚度5μm，HE染色显微镜镜检。于光镜10×40倍)下观察海马CA1、 CA2、CA3区锥体神经元的改变，核皱缩、核溶解者视为坏死神经元。神 经元密度计数：随机观察各区及计数，每区累积计数神经元100个，同时 计正常神经元数。以每百个计数神经元中的存活神经元来表示海马的损伤 程度。结果见表1，与对照组相比，芋螺毒素SO3可显著改善因局部缺血 造成的神经损伤。
表1：芋螺毒素SO3对沙土鼠海马神经元密度的影响
动物数 海马各区神经元密度( X±S)
组别
(n) CA1区 CA2区 CA3区
正常组 5 52.1±1.7 45.5±2.7 44.8±3.1
假手术组 5 48.7±1.9 43.7±2.1 45.2±2.5
SO3组 5 29.2±2.9※ 35.2±1.9※ 37.2±2.2※
NS对照组 5 10.9±2.6 18.9±2.6 23.4±3.1
※和NS对照组相比，P＜0.01
实施例3芋螺毒素SO3对原代培养大鼠海马细胞缺氧的保护作用
取新生Wistar大鼠，在无菌条件下分离出双侧海马，用0.125％胰蛋 白酶消化(37℃、30min)分散并制成5×108/L密度的细胞悬液，接种于涂 有多聚-L-赖氨酸的直径35mm塑料培养皿中，每皿2ml，置于36.4℃、 含10％CO2和空气混合气的培养箱(美国FORMA)内进行培养。培养液由 93％Eagle，s MEM，5％马血清，1％N3组合液和1％谷氨酰胺组成。于 培养第3天，在培养液中加入细胞分裂抑制剂阿糖胞苷3mg/L，以抑制 非神经细胞的过度增殖，48h后更换新鲜培养液，以后每周换液2次，每 次更换一半新鲜培养液。取培养12d的海马神经元，分为正常组、三个SO3剂量组(0.1μM、0.5μM及2.5μM)、及缺氧对照组4组。正常组仍 置于36.4℃，10％CO2的二氧化碳培养箱继续培养。SO3组在缺氧前半 小时或缺氧复氧后加入芋螺毒素SO3至终浓度(0.1μM、0.5μM及2.5 μM)。将需要缺氧的细胞移至2000cm3的恒温(36.4℃)密闭容器内， 连续充以无氧气体(90％N2、10％CO2)，流速为0.20L/min，在缺氧条 件下继续培养4h后取出。以0.3％台盼蓝对细胞进行染色3min，4％多聚 甲醛固定细胞。在倒置相差显微镜分下别观察各组海马神经元细胞的形态 变化，并随机观察并计数相邻视野(0.16cm2)的存活神经元(所计数神 经元必须有晕光，长有突起，经0.3％台盼蓝浸染3min不着色)数及神经 元细胞总数。每皿细胞观察25个视野，计算细胞存活率。结果见表2。和 缺氧对照组相比，三个剂量组的芋螺毒素SO3都可以显著降低因缺氧而造 成原代培养大鼠神经元损伤。这表明，在体外培养细胞的实验中芋螺毒素 SO3也具有神经保护活性。
表2 细胞存活率结果
细胞皿数 平均存活率(％) ( X±S)
组别
(N) 缺氧前给药 缺氧后给药
正常细胞 6 94.6±2.7 95.2±2.9
SO3(0.1μM) 6 61.7±54※ 55.4±4.7※
SO3(0.5μM) 6 75.0±6.2※ 64.1±4.5※
SO3(5.0μM) 6 79.2±4.7※ 71.0±5.1※
缺氧对照 6 38.1±3.3 40.4±4.8
※和缺氧对照组相比，P＜0.01
实施例4芋螺毒素SO3对小鼠的急性毒性实验
昆明种成年小白鼠雌雄不限，体重20±2g，每组10只，分为7组。 SO3生理盐水配制，每次脑内给药20μl，各组给药剂量为2.5mg/kg、5 mg/kg、12.5mg/kg、15mg/kg、25mg/kg、62.5mg/kg及125mg/kg。从 结果见表3。LD50结果表明，与ω-芋螺毒素MVIIA相比，芋螺毒素SO3的毒性更低。
表3 急性毒性实验结果
药物 动物数(只) 半数致死剂量(LD50)
SO3 10 13.5mg/kg
MVIIA 10 10.7mg/kg
上面以例示的方式对本发明进行了举例说明，但本发明绝不限于此。 本领域普通技术人员在阅读了整篇说明书之后，完全清楚可对本发明作各 种改动，而仍不偏离本发明的精神和范围。
序列表
<110>军事医学科学院
<120>芋螺毒素SO3的治疗性应用
<130>idc040143
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>芋螺毒素SO3
<400>1
Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro Cys Ser Arg Ile Ala Tyr Asn Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys
20 25
<210>2
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>芋螺毒素MVIIA
<400>2
Cys Lys Gly Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys
1 5 10 15
Thr Gly Ser Cys Arg Ser Gly Lys Cys
20 25