本申请案主张2008年6月17申请的美国临时专利申请案第61,073,142号、2007年7月24日申请的美国临时专利申请案第60/951,692号和2007年7月24日申请的美国临时专利申请案第60/951,691号的优先权，各自全文以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明提供IL-18受体抗原结合蛋白和编码所述IL-18受体抗原结合蛋白的多核苷酸。还提供表达载体和包含所述表达载体用于产生抗原结合蛋白的宿主细胞。此外，提供诊断和治疗IL-18受体所介导疾病的组合物和方法。
背景技术
IL-18是属于IL-1配体家族的促炎细胞因子(proinflammatory cytokine)。冈村(Okamura)等人，1995，自然(Nature)378：88-91。也称作IFN-γ诱导因子的IL-18，是在TH1反应中主要通过其在T细胞和自然杀伤细胞中诱导IFN-γ产生的能力而起重要作用的细胞因子。IL-18在结构和功能上都与IL-1家族有关。就结构而言，IL-18和IL-1β共有相当多的一级氨基酸序列并且均折叠为β折叠多肽。就功能而言，IL-18诱导IL-1、TNF、Fas配体和数种细胞因子的基因表达和合成。
IL-18的活性经由通过形成IL-18受体(IL-18R)复合物而起始的信号转导途径转导。IL-18R包括称作α-IL-18受体(α-IL-18R)(先前鉴别为IL-1R相关蛋白(IL-1Rrp)的IL-1R家族成员)的结合链，和称作β-IL-18受体(β-IL-18R)(也是IL-1R家族成员并且先前鉴别为AcPL)的链；两条链是信号传导所必需的。博恩(Born)等人，1998，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)273：29445-50。IL-18/IL-18R复合物募集IL-1R活化激酶和TNF受体相关因子6，从而磷酸化核因子kappaB(NFkappaB)诱导激酶，随后活化NFkappaB。先天与后天免疫IL-18都参与。荻纳利罗(Dinarello)，1999，变态反应与临床免疫学杂志(J.AllergyClin.Immun).103：11-24。
在发病机理中IL-18含量增加和/或IL-18介导信号牵连已在多种人类疾病状态中证实，包括自身免疫疾病(WO2004/002519；WO2005/063290；WO2004/034988；马拉特(Mallat)等人，2002，循环研究(Circ.Res.)91：441-448)，肝病(费涅托(Finitto)等人，2004，肝脏(Liver)53：392-400；筒井(Tsutsui)等人，2000，免疫学评论(Immunological Reviews)174：192-209；卢威兹克(Ludwiczek)等人，2002，临床免疫学杂志(J.Clinical Immunology) 22：331-337)，胰病和心血管疾病(戈德斯(Gerdes)等人，2002，实验医学杂志(J.Exp.Med.)195：245-257；WO03/080104；WO02/060479；WO01/85201；瑞本(Raeburn)等人，2002，美国生理学杂志-心脏和循环生理学(Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.)283：H650-H657)。因此，需要产生能够调节IL-18/IL-18受体相互作用的新颖药剂。
发明内容
本文提供α-和β-IL-18受体(本文也共同称作“IL-18受体”或“IL-18R”)抗原结合蛋白和编码它们的多核苷酸。IL-18受体抗原结合蛋白抑制、干扰或调节由IL-18介导的至少一种生物反应，并因而可用于改善IL-18所介导疾病或病症的影响。还提供用于产生α-和β-IL-18受体抗原结合蛋白的表达系统(包括细胞系)和用于诊断和治疗与异常IL-18活性相关的疾病的方法。
在一个实施例中，抗原结合蛋白结合α-和β-IL-18受体，并且包含(a)支架结构(scaffold structure)；和(b)至少一个互补决定区(complementary determining region，CDR)，其选自SEQ ID NO：89-139中任一者的CDRH区或SEQ ID NO：140-190中任一者的CDRL区。在此实施例中，尤其有用的是分别具有SEQ ID NO：91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139或SEQ ID NO：142、145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190的CDRH3或CDRL3区的抗原结合蛋白。其它实施例利用具有选自SEQ ID NO：89-139中任一者的CDRH区和SEQ ID NO：140-190中任一者的CDRL区的一个CDR的抗原结合蛋白(例如，抗原结合蛋白具有两个CDR区(一个重链区和一个轻链区)；而在一个具体实施例中，抗原结合蛋白具有CDRH3与CDRL3区)。
抗原结合蛋白可与分别具有SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71氨基酸序列的IL-18受体α-或β-链结合。
本文描述包含重链氨基酸序列和/或轻链氨基酸序列的抗原结合蛋白，所述重链氨基酸序列包含至少一个选自由以下组成的群组的CDR：(a)SEQ ID NO：89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137中任一者的CDRH1；(b)SEQ ID NO：90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138中任一者的CDRH2；和(c)SEQ ID NO：91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139中任一者的CDRH3；所述轻链氨基酸序列包含至少一个选自由以下组成的群组的CDR：(a)SEQ ID NO：140、143、146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188中任一者 的CDRL1；(b)SEQ IDNO：141、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189中任一者的CDRL2；和(c)SEQ ID NO：142、145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190中任一者的CDRL3。
在某些方面中，抗原结合蛋白包含一个具有SEQ ID NO：89-139中任一者的CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链氨基酸序列和/或一个具有SEQ ID NO：140-190中任一者的CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链氨基酸序列。优选的抗原结合蛋白包含一个选自由SEQ NO：1-17组成的群组的重链氨基酸序列和/或一个选自由SEQ ID NO：18-34组成的群组的轻链氨基酸序列。优选的CDRH3包括SEQ ID NO：91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139中任一者中所阐明的那些CDRH3。优选的CDRL3包括SEQ ID NO：142、145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190中任一者中所阐明的那些CDRL3。
在某些方面中，抗原结合蛋白包含一个或多个IgG重链或IgG轻链，包括IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型的那些IgG重链或IgG轻链。优选的IgG重链包括(但不限于)SEQ ID NO：73、77、81和85中所阐明的那些IgG重链。优选的IgG轻链包括(但不限于)SEQ ID NO：75、79、83和87中所阐明的那些IgG轻链。
如本文所述，与由成熟α-IL-18受体(SEQ ID NO：69)所形成的三维结构的氨基酸残基250-253和267-271结合的抗原结合蛋白尤其适用于阻断IL-18与IL-18受体的相互作用。
抗原结合蛋白可以是单克隆抗体、人类抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或其片段。抗体片段包括(但不限于)微型抗体(miniboby)、域抗体(domainantibody)、F(ab)片段、F(ab′)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段、双链抗体(diabody)或单链抗体分子。
在其它方面中，本文提供编码一个或多个IL-18受体抗原结合蛋白的分离核酸。所述核酸可包含在载体内并且与控制序列可操作地连接。本文还提供用所述分离核酸转化的宿主细胞。
另外，本文提供包含IL-18受体抗原结合蛋白和医药学上可接受的载剂的医药组合物。所述医药组合物适用于预防或治疗患者与IL-18受体相关的病况的方法中，所述方法包含向患者投与有效量的所述医药组合物。与IL-18受体相关的疾病和病况包括炎症性疾病和自身免疫疾病(诸如牛皮癣、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎(juvenileidiopathic arthritis)、斯蒂尔病(Still′s disease)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、骨关节炎、溃疡性关节炎、乳糜泻(coeliac disease)、牛皮癣性关节炎(psoriatic arthritis)、慢性阻塞性肺病、哮喘(尤其慢性重症哮喘)、急性呼吸窘迫综合征、败血症(sepsis)、阿尔茨海默病(Alzheimer disease)、狼疮、过敏性鼻炎、特发性血小板减少性紫癜(idiopathicthrombocytopenic purpura)、移植、特应性皮肤炎、II型糖尿病、克罗恩病(Crohn′s disease)、炎症性肠病、多发性硬化症、自身免疫性肝炎、HIV、特应性皮肤炎、重症肌无力、结节病(sarcoidosis))、肝病(诸如肝炎)、胰病(诸如慢性胰腺炎或急性胰腺炎)和心血管疾病(诸如急性心脏病发作、粥样斑块破裂(atheromatous plaque rupture)、缺血后心力衰竭、再灌注损伤、血管炎症、慢性心力衰竭、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎的心血管并发症和粥样硬化形成(atherogenesis))。
本文进一步提供抑制IL-18与IL-18受体结合的方法，其包含使IL-18受体与IL-18受体抗原结合蛋白接触。IL-18受体抗原结合蛋白结合IL-18受体后，将防止或阻断受体与IL-18的结合。
附图说明
图1A、图1B、图1C、图1D、图1E、图1F、图1G、图1H、图1I、图1J、图1K、图1L、图1M、图1N、图1O、图1P和图1Q描述α-和β-IL-18受体抗原结合蛋白的VH和VL可变域的核酸和氨基酸序列。
图2A、图2B、图2C、图2D和图2E显示抗原结合蛋白的各种重链可变区和轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区。各种重链区和轻链区的氨基酸序列在SEQ ID NO：1-34中鉴别。个别CDR的序列在SEQ ID NO：89-190中鉴别。
图3A和图3B描述α-和β-IL-18受体抗原结合蛋白的重链可变序列和轻链可变序列的氨基酸序列比对。CDR1、CDR2和CDR3区突出显示为灰色。
图4描述显示重链可变区和轻链可变区序列的各种可能组合的图表。显示了每一重链可变区和每一轻链可变区的二聚体。当天然存在抗体通常是四聚体时，抗体可包含所述二聚体中两个二聚体的组合。
图5描述形成一个具体抗原结合蛋白实施例的表位(epitope)的α-IL-18受体氨基酸序列的部分。以粗体显示促成抗原结合表位的人类IL-18受体序列的氨基酸(氨基酸243-271)。经实验确定影响结合的具体氨基酸是粗体形式。
图6描述完整AMH6重链核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：74和73)。箭头表示前导序列的裂解位点。
图7描述完整AML12轻链核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：76和75)。箭头表示前导序列的裂解位点。
图8描述完整AMH4重链核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：78和77)。箭头表示前导序列的裂解位点。
图9描述完整AML14轻链核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：80和79)。箭头表示前导序列的裂解位点。
图10描述完整AMH9重链核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：82和81)。箭头表示前导序列的裂解位点。
图11描述完整AML9轻链核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：84和83)。箭头表示前导序列的裂解位点。
图12描述完整AMH11重链核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：86和85)。箭头表示前导序列的裂解位点。
图13描述完整AML7轻链核苷酸和氨基酸序列(分别是SEQ ID NO：88和87)。箭头表示前导序列的裂解位点。
具体实施方式
本文所用的分段标题仅是出于组织目的而不应解释为限制所述的标的物。
标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化、蛋白质纯化等。可根据制造商的说明书或如在业界通常所完成或如本文所述，实行酶促反应和纯化技术。以下程序和技术通常可根据业界所熟知的常规方法并且如本说明书通篇所引用和论述的各种一般性参考文献和更具体的参考文献中所述来执行。参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人，2001，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第3版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，美国纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，N.Y.)，其就任何目的以引用的方式并入本文中。除非提供具体定义，否则结合本文所述的分析化学、有机化学和医药化学所用的命名法和其实验程序与技术是业界所熟知并常用的那些命名法和程序与技术。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、调配和传送、和患者的治疗。
A.一般概述
本文提供结合α-或β-IL-18受体的抗原结合蛋白；人类α-和β-IL-18受体的氨基酸序列分别于SEQ ID NO：69和71中描述。本发明抗原结合蛋白包含一个支架结构，其具有一个或多个如图2A-图2E、图3A和图3B中所述的互补决定区(CDR)，即SEQ IDNO：1-34的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3部分(还参见SEQ IDNO：89-292，其描述各种CDR的氨基酸序列)。在某些实施例中，抗原结合蛋白的支架 结构是基于抗体(包括(但不限于)单克隆抗体、人类抗体、鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体)、抗体片段(诸如微型抗体、域抗体、F(ab)片段、F(ab′)片段、F(ab)2片段、F(ab′)2片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段)、合成抗体(本文有时称作“抗体模拟物(antibody mimetic)”)、抗体融合物(有时称作“抗体共轭物(antibody conjugate)”)，包括Fc融合物。下文进一步描述和定义各种结构。
如下进一步描述，α-和β-IL-18受体抗原结合蛋白适用于治疗与IL-18活性相关的病况，包括TH1驱动的自身免疫疾病(WO2004/002519；WO2005/063290；WO2004/034988；马拉特(Mallat)等人，2002，循环研究(Circ.Res.)91：441-448)、肝病(费涅托(Finitto)等人，2004，肝脏(Liver)53：392-400；筒井(Tsutsui)等人，2000，免疫学评论(Immunological Reviews)174：192-209；卢威兹克(Ludwiczek)等人，2002，临床免疫学杂志(J.Clinical Immunology)22：331-337)、胰病(吉田(Yoshida)等人，1998，抗癌研究(Anticancer Res.)18：333-5)和心血管疾病(戈德斯(Gerdes)等人，2002，实验医学杂志(J.Exp.Med.)195：245-257；WO03/080104；WO02/060479；WO01/85201；瑞本(Raeburn)等人，2002，美国生理学杂志-心脏和循环生理学(Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.)283：H650-H657)。抗原结合蛋白的其它用途包括例如，IL-18相关疾病或病况的诊断，和用以确定α-或β-IL-18受体存在与否的筛检试验。还提供α-或β-IL-18受体抗原结合蛋白，尤其包括至少一个互补决定区(CDR)的抗原结合蛋白，所述至少一个互补决定区包括如下更全面描述的重链CDR和/或轻链CDR和其组合。
本发明抗原结合蛋白干扰、阻断或调节IL-18与IL-18受体之间的相互作用。在一些实施例中，抗原结合蛋白中断IL-18途径，借此降低IL-18的至少一种生物活性，包括(但不限于)诱导IFN-γ产生、诱导杀伤细胞形成和增强杀伤细胞的细胞毒性。如本文实例部分所证实，降低IL-18诱导的KG细胞IFN-γ产生的抗原结合蛋白包括那些包含AMH8和AML11、AMH9和AML9、AMH10和AML8、AMH11和AML7、AMH15和AML3、AMH13和AML4、AMH13和AML5、AMH16和AML2、AMH2和AML16、AMH2和AML17、AMH1和AML16、AMH1和AML17、AMH4和AML14、AMH4和AML15、AMH3和AML14、AMH3和AML15、AMH6和AML12、AMH6和AML13、AMH5和AML12以及AMH5和AML13的抗原结合蛋白。
因此本发明抗原结合蛋白可用以鉴别与IL-18或IL-18受体诱导的免疫反应相关的病况。此外，抗原结合蛋白可用以调节和/或抑制IL-18或IL-18受体介导的免疫反应，因而具有治疗和预防由过度免疫反应所引起的各种疾病(例如炎症性疾病)的功效。因此，本发明的α-和β-IL-18受体抗原结合蛋白可用于诊断、预防或治疗与IL-18和IL-18受 体介导的信号转导途径相关的疾病或病况。
B.IL-18受体抗原结合蛋白
在一方面中，提供结合α-或β-IL-18受体的抗原结合蛋白。如本文所用的“抗原结合蛋白”意指特异性结合指定抗原的蛋白质。在具体实施例中，抗原是人类α-或β-IL-18受体。
如本文所用的“蛋白质”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。在一些实施例中，所述两个或两个以上共价连接的氨基酸是通过肽键连接。如下所述，蛋白质可由天然存在的氨基酸和肽键构成，例如当蛋白质使用表达系统和宿主细胞重组制备时。或者，蛋白质可包括合成氨基酸(例如，高苯丙氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和正亮氨酸)或拟肽结构，即“肽或蛋白质类似物”，诸如类肽(peptoid)(参见西蒙(Simon)等人，1992，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)89：9367，其以引用的方式并入本文中)，其可抵抗蛋白酶或其它生理和/或储存条件。尤其当抗原结合蛋白通过业界熟知的常规方法体外(in vitro)合成时，可引入所述合成氨基酸。此外，可使用拟肽、合成和天然存在的残基/结构的任何组合。“氨基酸”还包括亚氨基酸残基，诸如脯氨酸和羟基脯氨酸。氨基酸“R基团”或“侧链”可以是(L)-构型或(D)-构型。在一个具体实施例中，氨基酸是(L)-构型或(D)-构型。
在某些方面中，本发明提供结合IL-18受体(在一些实施例中是人类IL-18受体)的重组抗原结合蛋白。就此而言，“重组蛋白质”是使用重组技术，即经由如本文所述的重组核酸表达所形成的蛋白质。在业界熟知产生重组蛋白质的方法和技术。
在一些实施例中，抗原结合蛋白是分离的蛋白质或实质上纯的蛋白质。“分离的”蛋白质不带有至少一些在其自然状态中通常相关的材料，优选以重量计构成所给样品中总蛋白质的至少约5％、更优选至少约50％。“实质上纯的”蛋白质包含以重量计总蛋白质的至少约75％，其中优选为至少约80％，尤其优选为至少约90％。定义包括在不同生物体或宿主细胞中从一种生物体产生抗原结合蛋白。或者，蛋白质可经由使用诱导型启动子或高表达启动子，以与通常所见浓度相比显著较高的浓度制备，以便使蛋白质以高浓度水平制备。
抗原结合蛋白可与IL-18受体、优选人类IL-18受体特异性结合。如本文所用的“特异性结合”意指平衡解离常数是至少10-6M、优选为10-7M至10-10M、更优选为＜10-8M至＜10-10M、甚至更优选为＜10-9M至＜10-10M。在一个具体实施例中，抗原结合蛋白与具有SEQ ID NO：69或71氨基酸序列的人类IL-18受体结合。以下详述优选抗原结合蛋白所特异性结合的α-或β-IL-18受体中的表位。
在抗原结合蛋白用于治疗性应用的实施例中，IL-18受体抗原结合蛋白的重要特征是其是否可抑制、干扰或调节IL-18受体的一种或多种生物活性。在此情况下，当过量抗体使与IL-18受体结合的IL-18量降低或反之增加至少约20％、40％、60％、80％、85％或更多(例如通过在体外竞争结合试验中测量结合)时，抗原结合蛋白与IL-18的受体特异性结合和/或实质上抑制IL-18与其受体的结合。IL-18受体具有许多独特生物效应，所述效应可在不同细胞型中用许多不同试验测量。IL-18受体抗原结合蛋白抑制、干扰或调节IL-18生物活性的能力可(例如)通过如实例4中所述测量对KG1细胞中IFN-γ释放的抑制作用或使用测量抗原结合蛋白抑制IFN-γ释放的能力的类似试验来测定。
并非所有与抗原特异性结合的抗原结合蛋白都可以阻断抗原与其正常配体结合并因此而抑制或调节抗原的生物效应。如业界所知，这种作用可能取决于抗原结合蛋白与抗原的何部分结合，以及抗原和抗原结合蛋白(在此情况下，是IL-18受体和IL-18受体抗原结合蛋白)的绝对和相对浓度。能够抑制或调节IL-18受体的生物活性在本文中意指，当IL-18浓度在某一范围内时(例如在约EC80或EC90时)(在所述范围内，一种药剂抑制其生物活性的作用可显而易见)，抗原结合蛋白能够例如将在IL-18存在下所观察到的IFN-γ释放(如在实例4的KG1细胞试验或类似试验中所测量)抑制至少约20％、40％、60％、80％、85％、90％、95％、99％或更多。EC80在本文中意指观察到IL-18最大效应80％所需的IL-18量。若IL-18浓度远远超过EC90，则由于IL-18过量，使得抑制剂的作用可能不太明显。抑制、干扰或调节IL-18受体生物活性所需的抗原结合蛋白浓度可广泛变化并且可能取决于抗体与IL-18受体结合的紧密程度。举例来说，在KG1细胞试验中每个IL-18分子一分子或更少抗原结合蛋白可能就足以抑制、干扰或调节生物活性。在一些实施例中，当IL-18浓度是约EC50至约EC90时，可能需要IL-18受体/抗体比率为约1,000∶1至约1∶1,000(包括约2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶100、1∶500、1∶1,000或更多)来抑制、干扰或调节IL-18受体的生物活性。IL-18受体抗原结合蛋白比率还可能在这些值之间。
作为一般结构，本发明抗原结合蛋白包含(a)支架和(b)一个或多个CDR，即对抗原结合特异性和亲和力起决定作用的区。如本文所用的“互补决定区”或“CDR”是指构成抗原结合的主要表面接触点的结合蛋白区。一个或多个CDR被嵌入抗原结合蛋白的支架结构中。抗原结合蛋白的支架结构可以是抗体或其片段或变异体的框架，或者事实上可能是完全合成的。下文进一步描述抗原结合蛋白的各种支架结构。
1.互补决定区(CDR)
抗原结合蛋白可具有6个CDR(如天然存在抗体的每个“臂”通常形成的)，例如一 个重链CDR1(“CDRH1”)、一个重链CDR2(“CDRH2”)、一个重链CDR3(“CDRH3”)、一个轻链CDR1(“CDRL1”)、一个轻链CDR2(“CDRL2”)、一个轻链CDR3(“CDRL3”)。如整个说明书中结合生物材料(诸如多肽、核酸、宿主细胞和诸如此类)使用的术语“天然存在”是指在自然界中所见的材料。在天然存在的抗体中，CDRH1通常包含约五(5)至约七(7)个氨基酸，CDRH2通常包含约十六(16)至约十九(19)个氨基酸，而CDRH3通常包含约三(3)至约二十五(25)个氨基酸。CDRL1通常包含约十(10)至约十七(17)个氨基酸，CDRL2通常包含约七(7)个氨基酸，而CDRL3通常包含约七(7)至约十(10)个氨基酸。图2A-图2E、图3A和图3B中描述优选的CDR。
本部分下面进一步描述天然存在抗体内CDR的结构和特性。简单来说，在传统抗体支架中，CDR被嵌入重链和轻链可变区中的框架内，在其中它们构成负责抗原结合和识别的区域。见上文(卡巴特(Kabat)等人，1991，具有免疫学重要性的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美国国立卫生研究院(Public HealthService N.I.H.)，美国马里兰州贝塞斯达(Bethesda，MD)；还参见考狄亚(Chothia)和莱斯克(Lesk)，1987，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196：901-917；考狄亚(Chothia)等人，1989，自然(Nature)342：877-883)，在一个框架区(指定框架区1-4，FR1、FR2、FR3和FR4，卡巴特(Kabat)等人，1991，同上；还参见考狄亚(Chothia)和莱斯克(Lesk)，1987，同上)内，可变区包含至少三个重链CDR或轻链CDR。见下文。然而，本发明所提供的CDR不仅可用以定义传统抗体结构的抗原结合域，而且可嵌入多种如本文所述的其它支架结构中。
在某些实施例中，抗原结合蛋白的一个或多个CDR各自独立地选自SEQ IDNO：89-139中任一者的CDRH区和SEQ ID NO：140-190中任一者的CDRL区。因此，在一个实施例中，本发明提供结合α-或β-IL-18受体的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含(a)支架结构(如下所述)；和(b)至少一个CDR，其选自SEQ ID NO：89-139中任一者的CDRH区和SEQ ID NO：140-190中任一者的CDRL区。在此实施例中，尤其有用的是具有CDRH3或CDRL3区的抗原结合蛋白。其它实施例利用具有选自SEQ IDNO：89-139中任一者的CDRH区和SEQ ID NO：140-190中任一者的CDRL区的一个CDR的抗原结合蛋白(例如，抗原结合蛋白具有两个CDR区(一个CDRH区和一个CDHL区)；一个具体实施例是具有CDRH3与CDRL3区的抗原结合蛋白)。
如所属领域的技术人员所了解，尤其有用的实施例可含有1、2、3、4、5或6个独立选择的SEQ ID NO：89-190的CDR。然而，如所属领域的技术人员所了解，具体实施例通常利用非重复CDR的组合，例如抗原结合蛋白通常并非由两个CDRH2区形成，等 等。
在一些实施例中，产生包含一个CDRH3区和一个CDRL3区的抗原结合蛋白，特别是其中CDRH3区选自SEQ ID NO：91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139中任一者的CDRH3区，并且CDRL3区选自SEQID NO：142、145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190中任一者的CDRL3区。图4中描述特定组合。
在其它实施例中，使用包含独立地选自SEQ ID NO：89-139的CDRH1、CDRH2和CDRH3区的抗原结合蛋白。在更具体实施例中，尤其有用的是具有选自SEQ ID NO：1-17中任一者同一可变区的所有三个CDRH区的此类型抗原结合蛋白。
在另外实施例中，使用包含独立地选自SEQ ID NO：140-190的CDRL1、CDRL2和CDRL3区的抗原结合蛋白。在更具体实施例中，尤其有用的是具有选自SEQ ID NO：18-34中任一者同一可变区的所有三个CDRL区的此类型抗原结合蛋白。
在另一个实施例中，抗原结合蛋白包含独立地选自SEQ ID NO：89-139的CDRH1、CDRH2和CDRH3区(而在一个实施例中具有选自同一序列识别号(SEQ ID NO)的所有三个区)和独立地选自SEQ ID NO：140-190的CDRL1、CDRL2和CDRL3区(而在一个实施例中具有选自SEQ ID NO：1-34中任一者同一可变区的所有三个区)。
在本发明另一方面中，提供结合α-或β-IL-18受体的抗原结合蛋白，其中分离的抗原结合蛋白包含一个含有CDRH1、CDRH2或CDRH3(各自选自SEQ ID NO：89-139中任一者)的重链氨基酸序列或其片段，或一个含有CDRL1、CDRL2或CDRL3(各自选自SEQID NO：140-190中任一者)的轻链氨基酸序列或其片段。如本文所用的重链可变区或轻链可变区“片段”包括至少一个CDR和SEQ ID NO：1-34抗体框架的至少一部分框架区，所述部分包含至少一个氨基酸。
在另一方面中，本发明提供结合α-或β-IL-18受体的抗原结合蛋白，其中分离的抗原结合蛋白包含一个含有CDRH1、CDRH2和CDRH3(各自独立地选自SEQ IDNO：89-139中任一者)的重链氨基酸序列，或一个含有CDRL1、CDRL2和CDRL3(各自独立地选自SEQ ID NO：140-190中任一者)的轻链氨基酸序列。在一个具体实施例中，CDR来自SEQ ID NO：1-17的同一相邻重链氨基酸序列或来自SEQ ID NO：18-34的同一相邻轻链氨基酸序列。
本发明又一方面提供结合α-或β-IL-18受体的分离抗原结合蛋白，其中分离的抗原结合蛋白包含一个含有CDRH1、CDRH2和CDRH3(各自独立地选自SEQ ID NO：89-139中任一者)的重链氨基酸序列，和一个含有CDRL1、CDRL2和CDRL3(各自独立地选自 SEQ ID NO：140-190中任一者)的轻链氨基酸序列。在一个具体实施例中，重链CDR来自SEQ ID NO：1-17的同一相邻重链氨基酸序列，而轻链CDR来自SEQ ID NO：18-34的同一相邻轻链氨基酸序列。
本发明另一方面提供结合α-或β-IL-18受体的分离抗原结合蛋白，其中分离的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO：1-17中任一者的重链氨基酸序列或SEQ ID NO：18-34中任一者的轻链氨基酸序列。
本发明另一方面提供结合α-或β-IL-18受体的分离抗原结合蛋白，其中分离的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO：1-17中任一者的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：18-34中任一者的轻链氨基酸序列。应注意SEQ ID NO：1-17的任一重链序列可与SEQ ID NO：18-34的任一轻链序列混合和相配。所得可能组合描述于图4中。图4中显示每一重链可变区和每一轻链可变区组合的二聚体。当大多数抗体是四聚体时，本发明抗原结合蛋白可包含所述二聚体中任两者的任何组合，因此包括异四聚体(hetero-tetramer)与同四聚体(homo-tetramer)，其中同四聚体(例如，两个相同二聚体)是特定的。
在又一方面中，本发明抗原结合蛋白包含SEQ ID NO：73-88所述序列中的任一者。
表1根据序列识别号来提供序列的简短说明。本发明可变区内的CDR在图2A-图2E、图3A和图3B中鉴别。
表1
序列表的简短说明
简短说明 序列识别号 编码重链可变区AMH1的氨基酸序列 SEQ ID NO：1 编码重链可变区AMH2的氨基酸序列 SEQ ID NO：2 编码重链可变区AMH3的氨基酸序列 SEQ ID NO：3 编码重链可变区AMH4的氨基酸序列 SEQ ID NO：4 编码重链可变区AMH5的氨基酸序列 SEQ ID NO：5 编码重链可变区AMH6的氨基酸序列 SEQ ID NO：6 编码重链可变区AMH7的氨基酸序列 SEQ ID NO：7 编码重链可变区AMH8的氨基酸序列 SEQ ID NO：8 编码重链可变区AMH9的氨基酸序列 SEQ ID NO：9 编码重链可变区AMH10的氨基酸序列 SEQ ID NO：10 编码重链可变区AMH11的氨基酸序列 SEQ ID NO：11 编码重链可变区AMH12的氨基酸序列 SEQ ID NO：12 编码重链可变区AMH13的氨基酸序列 SEQ ID NO：13 编码重链可变区AMH14的氨基酸序列 SEQ ID NO：14 编码重链可变区AMH15的氨基酸序列 SEQ ID NO：15 编码重链可变区AMH16的氨基酸序列 SEQ ID NO：16
编码重链可变区AMH17的氨基酸序列 SEQ ID NO：17 编码轻链可变区AML1的氨基酸序列 SEQ ID NO：18 编码轻链可变区AML2的氨基酸序列 SEQ ID NO：19 编码轻链可变区AML3的氨基酸序列 SEQ ID NO：20 编码轻链可变区AML4的氨基酸序列 SEQ ID NO：21 编码轻链可变区AML5的氨基酸序列 SEQ ID NO：22 编码轻链可变区AML6的氨基酸序列 SEQ ID NO：23 编码轻链可变区AML7的氨基酸序列 SEQ ID NO：24 编码轻链可变区AML8的氨基酸序列 SEQ ID NO：25 编码轻链可变区AML9的氨基酸序列 SEQ ID NO：26 编码轻链可变区AML10的氨基酸序列 SEQ ID NO：27 编码轻链可变区AML11的氨基酸序列 SEQ ID NO：28 编码轻链可变区AML12的氨基酸序列 SEQ ID NO：29 编码轻链可变区AML13的氨基酸序列 SEQ ID NO：30 编码轻链可变区AML14的氨基酸序列 SEQ ID NO：31 编码轻链可变区AML15的氨基酸序列 SEQ ID NO：32 编码轻链可变区AML16的氨基酸序列 SEQ ID NO：33 编码轻链可变区AML17的氨基酸序列 SEQ ID NO：34 编码重链可变区AMH1的核苷酸序列 SEQ ID NO：35 编码重链可变区AMH2的核苷酸序列 SEQ ID NO：36 编码重链可变区AMH3的核苷酸序列 SEQ ID NO：37 编码重链可变区AMH4的核苷酸序列 SEQ ID NO：38 编码重链可变区AMH5的核苷酸序列 SEQ ID NO：39 编码重链可变区AMH6的核苷酸序列 SEQ ID NO：40 编码重链可变区AMH7的核苷酸序列 SEQ ID NO：41 编码重链可变区AMH8的核苷酸序列 SEQ ID NO：42 编码重链可变区AMH9的核苷酸序列 SEQ ID NO：43 编码重链可变区AMH10的核苷酸序列 SEQ ID NO：44 编码重链可变区AMH11的核苷酸序列 SEQ ID NO：45 编码重链可变区AMH12的核苷酸序列 SEQ ID NO：46 编码重链可变区AMH13的核苷酸序列 SEQ ID NO：47 编码重链可变区AMH14的核苷酸序列 SEQ ID NO：48 编码重链可变区AMH15的核苷酸序列 SEQ ID NO：49 编码重链可变区AMH16的核苷酸序列 SEQ ID NO：50 编码重链可变区AMH17的核苷酸序列 SEQ ID NO：51 编码轻链可变区AML1的核苷酸序列 SEQ ID NO：52 编码轻链可变区AML2的核苷酸序列 SEQ ID NO：53 编码轻链可变区AML3的核苷酸序列 SEQ ID NO：54 编码轻链可变区AML4的核苷酸序列 SEQ ID NO：55 编码轻链可变区AML5的核苷酸序列 SEQ ID NO：56 编码轻链可变区AML6的核苷酸序列 SEQ ID NO：57 编码轻链可变区AML7的核苷酸序列 SEQ ID NO：58 编码轻链可变区AML8的核苷酸序列 SEQ ID NO：59 编码轻链可变区AML9的核苷酸序列 SEQ ID NO：60
编码轻链可变区AML10的核苷酸序列 SEQ ID NO：61 编码轻链可变区AML11的核苷酸序列 SEQ ID NO：62 编码轻链可变区AML12的核苷酸序列 SEQ ID NO：63 编码轻链可变区AML13的核苷酸序列 SEQ ID NO：64 编码轻链可变区AML14的核苷酸序列 SEQ ID NO：65 编码轻链可变区AML15的核苷酸序列 SEQ ID NO：66 编码轻链可变区AML16的核苷酸序列 SEQ ID NO：67 编码轻链可变区AML17的核苷酸序列 SEQ ID NO：68 人类α-IL-18受体的氨基酸序列 SEQ ID NO：69 人类α-IL-18受体的核苷酸序列 SEQ ID NO：70 人类β-IL-18受体的氨基酸序列 SEQ ID NO：71 人类β-IL-18受体的核苷酸序列 SEQ ID NO：72 AMH6的完整重链的氨基酸序列 SEQ ID NO：73 AMH6的完整重链的核苷酸序列 SEQ ID NO：74 AML12的完整轻链的氨基酸序列 SEQ ID NO：75 AML12的完整轻链的核苷酸序列 SEQ ID NO：76 AMH4的完整重链的氨基酸序列 SEQ ID NO：77 AMH4的完整重链的核苷酸序列 SEQ ID NO：78 AML14的完整轻链的氨基酸序列 SEQ ID NO：79 AML14的完整轻链的核苷酸序列 SEQ ID NO：80 AMH9的完整重链的氨基酸序列 SEQ ID NO：81 AMH9的完整重链的核苷酸序列 SEQ ID NO：82 AML9的完整轻链的氨基酸序列 SEQ ID NO：83 AML9的完整轻链的核苷酸序列 SEQ ID NO：84 AMH11的完整重链的氨基酸序列 SEQ ID NO：85 AMH11的完整重链的核苷酸序列 SEQ ID NO：86 AML7的完整轻链的氨基酸序列 SEQ ID NO：87 AML7的完整轻链的核苷酸序列 SEQ ID NO：88 分别编码重链可变区AMH1的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：89、90、91 分别编码重链可变区AMH2的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：92、93、94 分别编码重链可变区AMH3的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：95、96、97 分别编码重链可变区AMH4的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：98、99、100 分别编码重链可变区AMH5的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：101、102、103 分别编码重链可变区AMH6的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：104、105、106 分别编码重链可变区AMH7的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：107、108、109 分别编码重链可变区AMH8的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：110、111、112 分别编码重链可变区AMH9的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：113、114、115 分别编码重链可变区AMH10的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：116、117、118 分别编码重链可变区AMH11的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：119、120、121 分别编码重链可变区AMH12的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：122、123、124 分别编码重链可变区AMH13的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：125、126、127 分别编码重链可变区AMH14的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：128、129、130 分别编码重链可变区AMH15的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：131、132、133 分别编码重链可变区AMH16的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：134、135、136
分别编码重链可变区AMH17的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：137、138、139 分别编码轻链可变区AML1的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：140、141、142 分别编码轻链可变区AML2的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：143、144、145 分别编码轻链可变区AML3的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：146、147、148 分别编码轻链可变区AML4的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：149、150、151 分别编码轻链可变区AML5的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：152、153、154 分别编码轻链可变区AML6的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：155、156、157 分别编码轻链可变区AML7的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：158、159、160 分别编码轻链可变区AML8的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：161、162、163 分别编码轻链可变区AML9的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：164、165、166 分别编码轻链可变区AML10的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：167、168、169 分别编码轻链可变区AML11的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：170、171、172 分别编码轻链可变区AML12的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：173、174、175 分别编码轻链可变区AML13的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：176、177、178 分别编码轻链可变区AML14的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：179、180、181 分别编码轻链可变区AML15的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：182、183、184 分别编码轻链可变区AML16的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：185、186、187 分别编码轻链可变区AML17的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列 SEQ ID NO：188、189、190 分别编码重链可变区AMH1的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：191、192、193 分别编码重链可变区AMH2的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：194、195、196 分别编码重链可变区AMH3的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：197、198、199 分别编码重链可变区AMH4的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：200、201、202 分别编码重链可变区AMH5的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：203、204、205 分别编码重链可变区AMH6的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：206、207、208 分别编码重链可变区AMH7的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：209、210、211 分别编码重链可变区AMH8的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：212、213、214 分别编码重链可变区AMH9的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：215、216、217 分别编码重链可变区AMH10的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：218、219、220 分别编码重链可变区AMH11的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：221、222、223 分别编码重链可变区AMH12的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：224、225、226 分别编码重链可变区AMH13的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：227、228、229 分别编码重链可变区AMH14的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：230、231、232 分别编码重链可变区AMH15的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：233、234、235 分别编码重链可变区AMH16的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：236、237、238 分别编码重链可变区AMH17的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：239、240、241 分别编码轻链可变区AML1的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：242、243、244 分别编码轻链可变区AML2的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：245、246、247 分别编码轻链可变区AML3的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：248、249、250 分别编码轻链可变区AML4的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：251、252、253 分别编码轻链可变区AML5的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：254、255、256 分别编码轻链可变区AML6的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：257、258、259 分别编码轻链可变区AML7的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：260、261、262 分别编码轻链可变区AML8的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：263、264、265
分别编码轻链可变区AML9的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：266、267、268 分别编码轻链可变区AML10的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：269、270、271 分别编码轻链可变区AML11的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：272、273、274 分别编码轻链可变区AML12的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：275、276、277 分别编码轻链可变区AML13的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：278、279、280 分别编码轻链可变区AML14的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：281、282、283 分别编码轻链可变区AML15的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：284、285、286 分别编码轻链可变区AML16的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：287、288、289 分别编码轻链可变区AML17的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列 SEQ ID NO：290、291、292
2.支架(Scaffold)
如本文所述，抗原结合蛋白可包含植入有(多个)CDR的支架结构。支架结构可基于抗体(包括(但不限于)单克隆抗体、人类抗体、鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体)、抗体片段(诸如微型抗体、域抗体、F(ab)片段、F(ab′)片段、F(ab)2片段、F(ab′)2片段、Fv片段、scFv片段、Fd片段)、合成抗体(本文有时称作“抗体模拟物”)、抗体融合物(有时称作“抗体共轭物”)，包括Fc融合物。一些实施例包括使用人类支架成分。因而，本发明至少涵盖下述包含一个或几个如SEQ ID NOs：89-190、优选SEQ IDNOs：89-189中所鉴别的CDR的任一支架，其可与IL-18受体结合和/或抑制IL-18受体的生物活性。在一些实施例中，支架包含一个或几个如SEQ ID NOs：1-17中所鉴别的重链可变区和/或一个或几个如SEQ ID NOs：18-34中任一者所鉴别的轻链可变区。在一些实施例中，支架包含如SEQ ID NOs：77-88中任一者所鉴别的IgG链。
在一个实施例中，植入有一个或几个CDR的支架是抗体。本文所用的术语“抗体”是指具有传统抗体结构，包含至少2个、更通常4个多肽链的多聚体蛋白(multimericprotein)。抗体与抗原特异性结合并且可能抑制或调节抗原的生物活性。在某些实施例中，抗体通过重组DNA技术产生。在其它实施例中，抗体通过天然存在抗体的酶或化学裂解产生。
传统抗体结构单元通常包含四聚体。每一四聚体通常由相同的两对多肽链组成，每一对具有一个“轻链”(分子量通常约25kDa的)和一个“重链”(分子量通常约50-70kDa)。每个链的氨基端部分包括一个主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每个链的羧基端部分界定一个主要负责效应功能(effector function)的恒定区。人类轻链分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链分类为μ(mu)、δ(delta)、γ(gamma)、α(alpha)或ε(epsilon)重链，抗体的同型(isotype)分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚类(subclass)，包括(但不限于)IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM的亚类包 括(但不限于)IgM1和IgM2。
在轻链和重链内，可变区和恒定区由一个具有约十二(12)或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括一个具有约十(10)或更多个氨基酸的“D”区。通常参见保罗(PaulW.)编，1989基础免疫学(Fundamental Immunology)，第7章，第二版，美国纽约乌鸦出版社(Raven Press，N.Y.)。每一轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。
一些天然存在的抗体(例如骆驼和大羊驼中所见的)是由两个重链组成的二聚体而不包括轻链。摩德曼斯(Muldermans)等人，2001，生物技术杂志(J.Biotechnol.)74：277-302；德斯迈特(Desmyter)等人，2001，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276：26285-26290。骆驼抗体的结晶学研究显示CDR3区形成与抗原相互作用的表面并因此对抗原结合至关重要(如在更典型的四聚抗体中)。
重链和轻链的可变区通常显示通过三个高变区(也称作互补决定区或CDR)连接的相对保守框架区(FR)的相同一般结构。CDR是抗体(或如本文所述的抗原结合蛋白)的高变区，其负责抗原识别和结合。每一对中两个链的CDR通过框架区对准，从而能够与特异表位结合。从N-端至C-端，轻链与重链均包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。对于每个域的氨基酸指派是根据卡巴特建立的具有免疫学意义的蛋白质序列(Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest)的定义。考狄亚(Chothia)等人，1987，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196：901-917；考狄亚等人，1989，自然(Nature)342：878-883。
CDR构成抗原结合的主要表面接触点。参见例如考狄亚(Chothia)和莱斯克(Lesk)，1987，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196：901-917。此外，轻链的CDR3和尤其重链的CDR3可构成轻链和重链可变区内抗原结合的最重要决定子(determinant)。参见例如，考狄亚和莱斯克，1987，同上；德西利奥(Desiderio)等人，2001，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)310：603-615；许(Xu)和戴维斯(Davis)，2000，免疫(Immunity)13：37-45；德斯迈特(Desmyter)等人，2001，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276：26285-26290；和摩德曼斯(Muyldermans)，2001，生物技术杂志(J.Biotechnol.)74：277-302。在一些抗体中，重链CDR3看似构成抗原与抗体之间的主要接触区域。德斯迈特等人，2001，同上。其中CDR3单独变化的体外选择流程可用以改变抗体的结合特性。摩德曼斯，2001，同上；德西利奥等人，2001，同上。
天然存在的抗体链通常包括信号序列，其引导抗体链进入分泌蛋白质的细胞途径并且不存在于成熟抗体中。编码抗体链的多核苷酸可编码天然存在的信号序列或异源信号序列(如下所述)。
在一个实施例中，抗原结合蛋白是一种单克隆抗体，其具有一(1)至六(6)个来自SEQID NO：89-190中任一者的所述CDR，如本文所述。本发明抗体可具有任何类型，包括IgM、IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgD、IgA或IgE抗体。在具体实施例中，抗原结合蛋白是IgG型抗体。在更具体实施例中，抗原结合蛋白是IgG2型抗体。
在一些实施例中，例如当抗原结合蛋白是具有完整重链和完整轻链的抗体时，CDR全部来自同一物种，例如人类。然而，在一些实施例中，支架成分可以是来自不同物种的混合物。因而，若抗原结合蛋白是抗体，则所述抗体可以是嵌合抗体和/或人源化抗体。一般来说，两种“嵌合抗体”是指合并来自不止一个物种的区域的抗体。举例来说，“嵌合抗体”传统上包含来自小鼠(或有时是大鼠)的可变区和来自人类的恒定区。
举例来说，在抗原结合蛋白含有小于6个来自上述序列的CDR的实施例中，额外CDR可来自其它物种(例如，鼠CDR)或可以是不同于序列中所述那些CDR的人类CDR。举例来说，可使用来自本文所鉴别的适当序列的人类CDRH3和CDRL3区，其中CDRH1、CDRH2、CDRL1和CDRL2任选地选自替代物种或不同的人类抗体序列或其组合。举例来说，本发明CDR可替代市售相应嵌合或人源化抗体的CDR区。
本发明具体实施例利用是人类成分的抗原结合蛋白支架成分。
“人源化抗体”通常是指以可变域框架区替代人类抗体中所见序列的非人类抗体。通常，在人源化抗体中，除CDR外整个抗体由人类来源的多核苷酸编码或除其CDR内外与这种抗体相同。将CDR(其中一些或全部由来源于非人类生物体的核酸编码)移植入人类抗体可变区的β折叠框架中产生抗体，所述抗体的特异性由所移植的CDR决定。这类抗体的产生描述于(例如)WO 92/11018；琼斯(Jones)，1986，自然(Nature)321：522-525；范霍亚恩(Verhoeyen)等人，1988，科学(Science)239：1534-1536中。人源化抗体还可使用具有基因工程免疫系统的小鼠产生。洛基(Roque)等人，2004，生物技术进展(Biotechnol.Prog.)20：639-654。在本发明中，所鉴别的CDR是人类的，因此就此而言，人源化抗体与嵌合抗体都包括一些非人类CDR；例如，可产生包含CDRH3和CDRL3区的人源化抗体，其中其它CDR区中的一者或多者具有不同特殊来源。
在一个实施例中，IL-18抗原结合蛋白是多特异性抗体，并且尤其是双特异性抗体，有时也称作“双链抗体(diabody)”。这些抗体可以与两种(或更多种)不同抗原结合。双链抗体可以用业界已知的多种方法制造(霍利格(Holliger)和温特(Winter)，1993，(生物技术近期述评Current Opinion Biotechnol.)4：446-449)，例如化学法制备或从二次杂交瘤(hybrid hybridoma)制备。
在一个实施例中，IL-18抗原结合蛋白是全人抗体，即完全由人类成分组成的抗体。 在此实施例中，如上所述，具体结构包含所述含有图2A-图2E、图3A和图3B中所述CDR区的完整重链和完整轻链。其它实施例利用一种或多种本发明CDR，而其它CDR、框架区、J和D区、恒定区等来自其它人类抗体。举例来说，本发明CDR可替代许多人类抗体、尤其市售相应抗体的CDR。
在一个实施例中，IL-18抗原结合蛋白是抗体片段，即保留对a-或β-IL-18受体的结合特异性的本文所述任一抗体的片段。
特异性抗体片段包括(但不限于)(i)由VL、VH、CL和CH1域组成的Fab片段；(ii)由VL、VH、CL和CH1域加上重链铰链区组成的Fab′片段；(ii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH域组成的Fv片段；(iv)由单个可变区组成的dAb片段(沃德(Ward)等人，1989，自然(Nature)341：544-546)；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab′)2片段，是一种包含两个相连Fab′片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH域和VL域通过肽连接体连接，所述肽连接体使两个域结合形成抗原结合位点(伯德(Bird)等人，1988，科学(Science)242：423-426；休斯顿(Huston)等人，1988，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)85：5879-5883)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；和(ix)“双链抗体(diabody)”或“三链抗体(triabody)”，是通过基因融合所构建的多价或多特异性片段(汤姆林森(Tomlinson)等人，2000，酶学方法(MethodsEnzymol.)326：461-479；WO94/13804；霍利格(Holliger)等人，1993，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)90：6444-6448)。抗体片段可加以修饰。举例来说，分子可通过并入连接VH和VL域的双硫键(disulphide bridge)来稳定化(赖特(Reiter)等人，1996，自然-生物技术(Nature Biotech.)14：1239-1245)。此外，如本文所述，这些片段的非CDR成分优选是人类序列。
在一个实施例中，IL-18抗原结合蛋白是微型抗体。微型抗体是包含与CH3域连接的scFv的最小化抗体样蛋白(antibody-like protein)。胡(Hu)等人，1996，癌症研究(CancerRes.)56：3055-3061。
在一个实施例中，IL-18抗原结合蛋白是域抗体；参见例如美国专利第6,248,516号。域抗体(dAb)是抗体的功能性结合域，对应于人类抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。dAB的分子量为约13kDa或小于完整抗体尺寸的十分之一。dAB在多种宿主(包括细菌、酵母和哺乳动物细胞系统)中良好表达。此外，dAb极稳定，且甚至在经受苛刻条件(诸如冰冻干燥或热变性)之后仍保留活性。参见例如美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；美国专利第2004/0110941号；欧洲专利0368684；美国专利6,696,245、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609。
在一个实施例中，IL-18抗原结合蛋白是抗体融合蛋白或抗体片段融合物，诸如Fc融合物(有时在本文中总称为“抗体共轭物”)。共轭搭配物可以是蛋白质的或非蛋白质的；后者通常在抗原结合蛋白(参见关于抗原结合蛋白的共价修饰的论述)上和在共轭搭配物上使用官能团产生。举例来说，连接体在业界已知；例如，如众所周知的同双功能连接体或异双功能连接体(homo-or hetero-bifunctional linker)(参见，1994皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Company)关于交联剂的产品目录、技术部分，第155-200页，其以引用的方式并入本文中)。
合适的共轭物包括(但不限于)如下所述标记物、药物和细胞毒性剂，包括(但不限于)细胞毒性药物(例如，化学治疗剂)或毒素或所述毒素的活性片段。合适毒素和其相应片段包括白喉毒素A链(diptheria A chain)、外毒素A链(exotoxin A chain)、篦麻毒素A链(ricin A chain)、相思子毒素A链(abrin A chain)、麻疯树毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和诸如此类。细胞毒性剂还包括通过使放射性同位素与抗原结合蛋白共轭、或使放射性核素与已与抗原结合蛋白共价连接的螯合剂结合而制备的放射化学试剂。其它实施例利用卡奇霉素(calicheamicin)、阿瑞他汀(auristatin)、格尔德霉素(geldanamycin)和美登素(maytansine)。
在一个实施例中，IL-18抗原结合蛋白是抗体类似物，有时称作“合成抗体”。举例来说，新近多项工作利用替代蛋白质支架或具有移植CDR的人工支架。所述支架包括(但不限于)为稳定结合蛋白的三维结构而引入的突变以及由(例如)生物相容性聚合物组成的完全合成支架。参见例如，科恩杜弗(Korndorfer)等人，2003，蛋白质：结构、功能和生物信息学(Proteins：Structure，Function，and Bioinformatics)，第53卷，第1期：121-129。洛基(Roque)等人，2004，生物技术进展(Biotechnol.Prog.)20：639-654。此外，可使用肽抗体模拟物(peptide antibody mimetic，“PAM”)以及基于利用纤维连接蛋白(fibronection)成分作为支架的抗体模拟物的支架。可用以产生IL-18抗原结合蛋白的替代支架评述于海因(Hey)等人，2005，生物技术趋势(Trends Biotechnol.)23：514-22和宾兹(Binz)等人，自然-生物技术(Nature Biotechnology)23：1257-68(两者均以全文引用的方式并入本文)中。
3.CDR变异体
本发明还包括SEQ ID NO：89-190中所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列的变异体。因此变异CDR包括在如本文所用CDR的定义之内。这些变异体属于以下三类中的一类或多类：取代、插入或缺失变异体，其中前者是特定的。
如业界所知，可使用许多不同程序来鉴别一种蛋白质或核酸相对于一种已知序列所具有的序列一致性(identity)或相似性(similarity)程度。
对于氨基酸序列而言，序列一致性和/或相似性通过使用业界已知的标准技术(包括(但不限于)史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)，1981，应用数学进展(Adv.Appl.Math.)2：482的局部序列一致性算法(local sequence identity algorithm)，尼德曼(Needleman)和温斯迟(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48：443的序列一致性比对算法(sequence identity alignment algorithm)，皮尔逊(Pearson)和李普曼(Lipman)，1988，美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.)85：2444的相似性搜索法(search for similaritymethod)，这些算法的计算机实施(威斯康星(Wisconsin)遗传学分析软体包(WisconsinGenetics Software Package)，遗传学分析计算机集团(Genetics Computer Group)，美国威斯康星州麦迪逊市科学驱动路575号(575 Science Drive，Madison，Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，由德弗罗(Devereux)等人，1984，核酸研究(Nucl.Acid Res.)12：387-395所述的Best Fit序列程序)确定，优选使用默认设置(default setting)，或通过检验(inspection)。优选地，百分比一致性通过基于以下参数的FastDB计算：错配罚分(mismatch penalty)是1；空位罚分(gap penalty)是1；空位大小罚分(gap size penalty)是0.33；和连接罚分(joining penalty)是30，“当前序列比较和分析方法(Current Methods inSequence Comparison and Analysis)”，大分子测序与合成-所选方法和应用(MacromoleculeSequencing and Synthesis，Selected Methods and Applications)，第127-149页(1988)，阿兰R.丽丝出版公司(Alan R.Liss，Inc)。
有用算法的一个例子是PILEUP。PILEUP使用渐进、成对比对从一组相关序列建立多重序列比对。它还可以绘制显示用以建立比对的聚类关系的关系树。PILEUP使用冯(Feng)和杜丽特尔(Doolittle)，1987，分子进化杂志(J.Mol.Evol.)35：351-360的渐进比对方法的简化形式；所述方法类似于希金斯(Higgins)和夏普(Sharp)，1989，CABIOS5：151-153所述的方法。有用PILEUP参数包括默认空位权重值(default gap weight)3.00、默认空位长度权重值(default gap length weight)0.10和加权端空位(weighted end gap)。
有用算法的另一个例子是BLAST算法，在以下文献中描述：阿特休尔(Altschul)等人，1990，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410；阿特休尔(Altschul)等人，1997，核酸研究(Nucleic Acids Res.)25：3389-3402；和凯伦(Karin)等人，1993，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)90：5873-5787。特别有用的一个BLAST程序是WU-BLAST-2程序，其获自阿特休尔(Altschul)等人，1996，酶学方法(Methods in Enzymology)266：460-480。WU-BLAST-2使用若干个搜索参数，其中大部分设置为默认值。可调参数 设定以下值：重叠跨度(overlap span)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，字阈值(wordthreshold)(T)＝II。HSP S和HSP S2参数是动态值并由程序本身确定，取决于特定序列的组成和特定数据库(针对其搜索所关注序列)的组成；但可调整所述值以提高灵敏性。
另一种有用算法是空位BLAST(gapped BLAST)，如由阿特休尔(Altschul)等人，1993，核酸研究(Nucl.Acids Res.)25：3389-3402所报导。空位BLAST使用BLOSUM-62替代计分(substitution score)；阈值T参数设为9；触发非空位延伸(ungapped extension)的二次打击法(two-hit method)使空位长度k改变10+k的值；Xu设为16并且Xg设为40(数据库搜索阶段)和67(算法的输出阶段)。空位比对由相应于约22位(bit)的计分触发。
通常，个别变异CDR相对于本文所述序列之间的氨基酸同源性、相似性或一致性至少是80％，并且更通常，同源性或一致性优选增加，即至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％。
以类似方式，关于本文所鉴别的结合蛋白的核酸序列的“百分比(％)核酸序列一致性”是定义为候选序列中等同于抗原结合蛋白编码序列中核苷酸残基的核苷酸残基百分比。一种具体方法利用设为默认参数的WU-BLAST-2的BLASTN模组，其中重叠跨度和重叠分数分别设为1和0.125。
通常，编码个别变异CDR的核苷酸序列与本文所述核苷酸序列之间的核酸序列同源性、相似性或一致性至少是60％，并且更通常，同源性或一致性优选增加，即至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％。
核苷酸序列之间的同源性通常通过其彼此杂交的能力来定义。本文提及的术语“选择性杂交”意指可检测地和特异性地结合。根据本发明的多核苷酸、寡核苷酸和其片段在使与非特异性核酸可检测地结合的明显量最小化的杂交和洗涤条件下，选择性地杂交于核酸链。可使用高严格条件以达成如业界所知和本文所论述的选择性杂交条件。
高严格条件在业界已知；参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人，2001，同上，和精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)，第2版，奥苏贝尔(Ausubel)等人编，约翰威立出版公司(John Wiley&Sons)，1992，两者均以引用的方式并入本文中。严格条件与序列相关并且随环境不同而不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导见于迪积森(Tijssen)，生物化学和分子生物学技术-利用核酸探针的杂交(Techniques In Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic AcidProbes)，“杂交原理和核酸检测策略综述(Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid assays)”(1993)中。
通常，将严格条件选为在限定离子强度和pH值下低于特定序列的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm是在平衡状态下与目标序列互补的探针50％与目标序列杂交的温度(在限定离子强度、pH值和核酸浓度下)(当目标序列过量存在时，在Tm下，在平衡状态下50％探针被占用)。严格条件将是在pH 7.0至8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐)并且对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度至少约30℃而对于长探针(例如大于50个核苷酸)而言至少约60℃的那些条件。还可借助添加诸如甲酰胺的去稳定剂来达成严格条件。
在另一个实施例中，使用不太严格的杂交条件；例如，如业界所知，可使用中度或低严格条件；参见，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，2001，同上；奥苏贝尔(Ausubel)等人，1992，同上和迪积森(Tijssen)，1993，同上。
通常使用盒式突变或PCR突变或业界所熟知的其它技术，通过编码抗原结合蛋白的DNA中核苷酸的定点突变产生编码变异体的DNA，并且此后如本文所述在细胞培养中表达重组DNA，来制备本发明的变异体。然而，包含具有多达约100-150个残基的变异CDR的抗原结合蛋白片段可使用完善技术通过体外合成来制备。变异体通常显示与天然存在的类似物相同的定性生物活性，例如与IL-18受体结合和抑制信号传导，尽管也可选择如下更全面描述的特征改变的变异体。
因此，“变异CDR”是与本发明的亲本CDR具有指定同源性、相似性或一致性的CDR并且共有生物功能，包括(但不限于)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的亲本CDR特异性和/或活性。举例来说，变异体通常与以下所述的同一IL-18受体表位结合，并且对IL-18受体信号传导具有类似抑制作用。
尽管预定引入氨基酸序列变异的位点或区域，但突变本身无需预定。举例来说，为优化给定位点处突变的性能，可在目标密码子或区域进行随机突变并筛检表达后的抗原结合蛋白CDR变异体以获得具有所要活性的最佳组合。人们熟知在序列已知DNA的预定位点处进行取代突变的技术，例如，M13引物突变和PCR突变。突变体的筛检使用诸如IL-18受体结合的抗原结合蛋白活性的试验进行。
氨基酸取代通常具有单个残基；插入通常是约一(1)至约二十(20)个氨基酸残基，尽管可容许相当大的插入。缺失范围是约一(1)至约二十(20)个氨基酸残基，尽管在一些情况下缺失可能大得多。
可使用取代、缺失、插入或其任何组合来达成最终衍生物或变异体。通常这些改变在少数氨基酸上进行以使分子变化程度最小，尤其是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性。然而，在某些情况下可能容许较大改变。当希望抗原结合蛋白的CDR特征变化较 小时，通常根据如表2所示的以下图表进行取代。
表2
原始残基 示范性取代
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln、His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn、Gln
Ile Leu、Val
Leu Ile、Val
Lys Arg、Gln、Glu
Met Leu、Ile
Phe Met、Leu、Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp、Phe
Val Ile、Leu
功能或免疫性的实质改变通过选择与表2中所示那些取代相比不太保守的取代而进行。举例来说，可进行对以下具有更显著影响的取代：变化区域中多肽主链的结构，例如α螺旋或β折叠结构；分子在目标位点处的电荷或疏水性；或侧链体积(bulk)。一般预期多肽特性产生最大变化的取代是如下的取代：(a)用亲水性残基(例如丝氨酰基或苏氨酰基)取代疏水性残基(例如白氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基)，或反之后者取代前者；(b)用半胱氨酸或脯氨酸取代其它任何残基，或反之后者取代前者；(c)用具有正电性侧链的残基(例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)取代负电性残基(例如谷氨酰基或天冬氨酰基)，或反之后者取代前者；或(d)用具有大体积(bulky)侧链的残基(例如苯丙氨酸)取代无侧链的残基(例如甘氨酸)，或反之后者取代前者。
变异体通常显示与天然存在的类似物相同的定性生物活性并且引发与其相同的免疫反应，尽管需要时也可选择变异体来改变抗原结合蛋白的特征。或者，可设计变异体以致改变抗原结合蛋白的生物活性。举例来说，可如本文所述改变或去除糖基化位点(glycosylation site)。
4.VH和VL变异体
如上所述，在本发明的一些实施例中提供分别包含以下序列或分别由以下序列组成的抗原结合蛋白：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17的重链可变区和/或SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34的轻链可变区或其如上所定义的片段。因此，在那些实施例中，抗原结合蛋白不仅包含至少一个在SEQ ID NO：1-34中所述的CDR或其变异体，而且包含至少部分所述框架序列。此外，本发明涵盖所述重链可变序列或轻链可变序列的变异体。
“变异VH”或“变异重链可变区”和“变异VL”或“变异轻链可变区”通常与本文中所述的那些可变区共有至少80％的氨基酸同源性、相似性或一致性，并且更通常，同源性或一致性优选增加，即至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％。编码个别变异VH和VL的核苷酸序列与本文所述核酸序列之间的核酸序列同源性、相似性或一致性至少是60％，并且更通常，同源性或一致性优选增加，即至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％。此外，“变异VH”或“变异重链可变区”和“变异VL”或“变异轻链可变区”通常共有生物功能，包括(但不限于)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的亲本CDR特异性和/或活性。举例来说，变异体通常与以下所述的同一IL-18受体表位结合，并且对IL-18受体信号传导具有类似抑制作用。
上文概述了产生变异体的方法以及确定序列同源性、相似性和一致性的方法，参见V.B.1部分。
在一些实施例中，还可包括恒定区变异体。优选的恒定区变异体包括改变含有变异的抗体生物功能的那些变异体。举例来说，抗体可含有一种变异，所述变异改变抗体活化互补序列或诱导抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)的能力。所述变异体可包括引起抗体糖基化变化的那些变异。
C.IL-18受体和IL-18受体表位
本文的“IL-18受体”或“IL-18R”意指与配体(包括(但不限于)IL-18)结合并因此在细胞内起始信号转导途径的细胞表面受体。IL-18受体复合物由称作“α-IL-18受体”(α-IL-18R)或“IL-18Rα链”的IL-18结合链和称作“β-IL-18受体”(“β-IL-18R”)或“IL-18Rβ链”的信号链组成。如本文所用的术语“IL-18受体”总的指α-和β-IL-18受体。
本文所揭示的抗原结合蛋白结合IL-18Rα链，其中的人类氨基酸序列描述于SEQ IDNO：69(其核酸序列描述于SEQ ID NO：70中)中，或结合IL-18Rβ链，其中的人类氨基酸 序列描述于SEQ ID NO：71(其核酸序列描述于SEQ ID NO：72中)中。在一个具体实施例中，IL-18受体是人类受体，尽管在一些情况下，可使用其它物种。此外，如下所述，IL-18受体蛋白也可包括片段。
如下所述，抗原结合蛋白与特定表位的结合是特异性的。
“表位”、“抗原决定子”和本文中语法上等效词汇意指抗原(例如IL-18受体)中可被抗原结合蛋白特异性结合的区域。如所属领域的技术人员所了解，表位可以是线性(linear)表位或构象(conformational)表位。“线性表位”是指包含以线性方式连接的至少约五(5)个且不大于约二十(20)个氨基酸的序列的表位，所述氨基酸自身或作为较大序列一部分，与本发明抗原结合蛋白结合。“构象表位”是指三维、二级和/或三级结构可以是抗体结合的实质方面的表位。包含构象表位的氨基酸通常(但并不一律)不包含蛋白质一级结构的线性序列。因此，构象表位可由具有非同源线性氨基酸序列的蛋白质所共有。不受理论束缚，构象表位可共有，因为由抗体所识别的三级结构在两个或两个以上氨基酸序列之间可以共有。在一个实施例中，合适的IL-18受体表位包括由本发明抗原结合蛋白所识别的任何表位。
本发明提供在人类IL-18Rα的第三Ig域(尤其由氨基酸残基243-271所界定的区域)中识别构象表位(由SEQ ID NO：69的氨基酸残基250-253(即，残基MFGE)和氨基酸残基267-271(即，残基MRIMT)构成)并与构象表位结合的抗原结合蛋白。此表位的氨基酸结构描述于图5中。与此表位结合的抗原结合蛋白在阻断IL-18与IL-18R的相互作用方面尤其有效。业界熟知确定抗原结合蛋白结合表位的方法并且一种方法描述于本文的实例4中。
实例4证实当由氨基酸243-271所界定的表位内的残基(例如250-253或267-271)变成相应小鼠残基时，某些人类IL-18R抗原结合蛋白结合人类IL-18Rα的能力显著降低。因此，本文提供结合人类IL-18R的抗原结合蛋白，但当人类IL-18Rα链的残基250-253经相应小鼠氨基酸取代时，这种结合降低。本文还提供结合人类IL-18R的抗原结合蛋白，但当人类IL-18Rα链的残基267-271经相应小鼠氨基酸取代时，这种结合降低。
D.抗原结合蛋白的共价修饰
抗原结合蛋白的共价修饰包括在本发明的范围之内并且通常是(但并不总是)翻译后进行。举例来说，通过使抗原结合蛋白的特定氨基酸残基与能够与选定侧链或N-端残基或C-端残基反应的有机衍生剂反应，来将几种类型的抗原结合蛋白共价修饰引入分子中。
半胱氨酰基残基最常见与α-卤代乙酸(和相应胺)(诸如氯乙酸或氯乙酰胺)反应，得 到羧甲基或羧氨基甲基衍生物。半胱氨酰基残基还可通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫醚、甲基2-吡啶基二硫醚、对氯汞苯甲酸盐、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑反应来衍生。
组氨酰基残基可通过在pH 5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)反应来衍生，因为此试剂对组氨酰基侧链具有相对特异性。还可使用对溴苯甲酰甲基溴(para-bromophenacyl bromide)；反应优选在pH 6.0下在0.1M二甲胂酸钠(sodiumcacodylate)中进行。
赖氨酰基和氨基端残基可与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。以这些试剂衍生具有逆转赖氨酰基残基电荷的效果。其它适用于衍生含α-氨基的残基的试剂包括酰亚胺酯(imidoester)类，诸如甲基吡啶亚胺甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate)、吡哆醛(pyridoxal)、硼氢化氯(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4-戊二酮和与乙醛酸酯(glyoxylate)的转氨酶催化反应。
精氨酰基残基通过与一种或若干种常规试剂(尤其苯基乙二醛(phenylglyoxal)、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮(ninhydrin))反应而得以修饰。精氨酸残基的衍生需要使反应在碱性条件下进行，因为胍官能团具有高pKa。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。
酪氨酰基残基的特定修饰(尤其关注的是将光谱标记物引入酪氨酰基残基中)可通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应来进行。最常见分别使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷来形成O-乙酰基酪氨酰基物质和3-硝基衍生物。使用125I或131I将酪氨酰基残基碘化，来制备放射免疫试验中所使用的经标记蛋白质，上述氯胺(chloramine)T方法是适合的。
羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳化二亚胺(R′-N＝C＝N-R′)(其中R和R′任选地是不同烷基，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳化二亚胺)反应而选择性修饰。此外，天冬氨酰基和谷氨酰基残基可通过与铵离子反应而转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。
以双功能试剂衍生适用于使抗原结合蛋白与用于多种方法中的水不溶性支撑基质或表面交联。常用的交联剂包括例如，1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如，与4-叠氮水杨酸的酯)、同双功能酰亚胺酯(homobifunctionalimidoester)，包括二琥珀酰亚胺酯，诸如3，3′-二硫双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)，和双功能马来酰亚胺，诸如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷。诸如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫基]丙酰亚 胺酯的衍生剂可产生能够在有光时形成交联的光可活化中间体。或者，反应性、水不溶性基质，诸如溴化氰活化碳水化合物和美国专利第3,969,287号、第3,691,016号、第4,195,128号、第4,247,642号、第4,229,537号和第4,330,440号中所述的反应性基质，用于蛋白质固定。
通常分别将谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基进行去酰胺基化而得到相应谷氨酰基和天冬氨酰基残基。或者，这些残基可以在略微酸性的条件下进行去酰胺基化。这些残基的任一种形式都属于本发明的范围之内。
其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰基或苏氨酰基残基羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α-氨基的甲基化(克雷顿(T.E.Creighton)，蛋白质：结构与分子特性(Proteins：Structure and Molecular Properties)，弗里曼出版公司(W.H.Freeman&Co.)，美国旧金山(San Francisco)，第79-86页[1983])、N-端胺的乙酰化和任何C-端羧基的酰胺化。
1.糖基化(Glycosylation)
包括在本发明范围内的抗原结合蛋白另一类型共价修饰包含改变蛋白质的糖基化模式。如业界所知，糖基化模式取决于蛋白质的序列(例如，存在或不存在以下所述的特定糖基化氨基酸残基)或产生蛋白质的宿主细胞或生物体。以下论述特定表达系统。
多肽的糖基化通常是N连接或O连接。N连接是指碳水化合物部分附接于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸)是碳水化合物部分酶促附接于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中存在这些三肽序列中任一种都可产生潜在糖基化位点。经O连接的糖基化是指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附接于羟基氨基酸，最常见是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
向抗原结合蛋白添加糖基化位点通常通过改变氨基酸序列，使得其含有上述三肽序列中的一种或多种而方便地完成(N连接糖基化位点)。还可通过向起始序列添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代来造成改变(O连接糖基化位点)。简单起见，抗原结合蛋白氨基酸序列优选经由DNA水平的变化而改变，尤其通过使编码目标多肽的DNA在预先选定的碱基处突变以便产生将会翻译成所要氨基酸的密码子。
提高抗原结合蛋白上碳水化合物部分数目的另一种方式是通过糖苷(glycoside)化学或酶促偶合至蛋白质。这些程序的有利之处在于其不需要在宿主细胞中产生具有N连接或O-连接糖基化的糖基化能力的蛋白质。取决于所用偶合模式，可将所述糖附接于(a) 精氨酸和组氨酸、(b)游离羧基、(c)游离巯基，诸如半胱氨酸的那些巯基、(d)游离羟基，诸如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些羟基、(e)芳香族残基，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些芳香族残基、或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于1987年9月11日公开的WO 87/05330和阿普林(Aplin)和瑞斯顿(Wriston)，1981，CRC生物化学评论(CRC Crit.Rev.Biochem.)，第259-306页中。
存在于起始抗原结合蛋白上碳水化合物部分的去除可用化学法或酶促法完成。化学去糖基化需要将蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大多数或所有糖裂解，而同时保留多肽完整。化学去糖基化是由哈基穆丁(Hakimuddin)等人，1987，生物化学与生物物理文献(Arch.Biochem.Biophys.)259：52和艾吉(Edge)等人，1981，分析生物化学(Anal.Biochem.)118：131描述。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可通过使用如由索塔库拉(Thotakura)等人，1987，酶学方法(Meth.Enzymol.)138：350所述的多种内糖苷酶和外糖苷酶实现。在潜在糖基化位点处的糖基化可通过使用如由杜兹金(Duskin)等人，1982，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)257：3105所述的化合物衣霉素(tunicamycin)防止。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键合(linkage)的形成。
2.聚乙二醇化(PEGylation)
抗原结合蛋白的另一类型共价修饰包含以美国专利第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号或第4,179,337号中所阐明的方式，使抗原结合蛋白与各种非蛋白质聚合物连接，所述非蛋白质聚合物包括(但不限于)各种多元醇，诸如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯(polyoxyalkylene)。此外，如业界所知，氨基酸取代可在抗原结合蛋白内各位置进行，以利于添加诸如聚乙二醇(PEG)的聚合物。
3.标记物(label)和效应基团(effector group)
在一些实施例中，本发明抗原结合蛋白的共价修饰包含添加一种或多种标记物。
术语“标记基团”意指任何可检测标记物。合适标记基团的实例包括(但不限于)以下各物：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、 131I)、荧光基团(例如，FITC、若丹明(rhodamine)、镧系元素磷光体)、酶基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团或由二次报导体(secondary reporter)所识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位点、金属结合域、表位标签(epitope tag))。在一些实施例中，将标记基团经由各种长度的间隔臂与抗原结合蛋白偶合以降低潜在位阻。用于标记蛋白质的各种方法在业界已知并且可用以实施本发明。
术语“效应基团”意指与充当细胞毒性剂的抗原结合蛋白偶合的任何基团。合适效应基团的实例是放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、 125I、131I)。其它合适基团包括毒素、治疗基团或化学治疗基团。合适基团的实例包括卡奇霉素、阿瑞他汀、格尔德霉素和美登素。在一些实施例中，将效应基团经由各种长度的间隔臂与抗原结合蛋白偶合以降低潜在位阻。
一般来说，标记物属于多种类别(取决于用于其检测的试验)：a)同位素标记物，其可以是放射性或重同位素；b)磁性标记物(例如，磁性颗粒)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料；酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素化基团；和f)由二次报导体识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位点、金属结合域、表位标签等)。在一些实施例中，将标记基团经由各种长度的间隔臂与抗原结合蛋白偶合以降低潜在位阻。用于标记蛋白质的各种方法在业界已知并且可用以实施本发明。
具体标记物包括光学染料，包括(但不限于)发色团、磷光体和荧光团，其中在许多情形中后者是特定的。荧光团可以是“小分子”荧光体(fluores)或蛋白质荧光体。
“荧光标记物”意指可经由其固有荧光特性检测的任何分子。合适的荧光标记物包括(但不限于)荧光素(fluorescein)、若丹明、四甲基若丹明、曙红(eosin)、藻红(erythrosin)、香豆素(coumarin)、甲基香豆素(methyl-coumarin)、芘(pyrene)、孔雀绿(Malacite green)、芪(stilbene)、荧光黄(Lucifer Yellow)、瀑布蓝J(Cascade BlueJ)、德州红(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒冈绿(Oregon green)、阿历克斯-氟(Alexa-Fluor)染料(阿历克斯-氟350、阿历克斯-氟430、阿历克斯-氟488、阿历克斯-氟546、阿历克斯-氟568、阿历克斯-氟594、阿历克斯-氟633、阿历克斯-氟660、阿历克斯-氟680)、瀑布蓝、瀑布黄和R-藻红素(phycoerythrin，PE)(分子探针公司(Molecular Probes)，美国俄勒冈州尤金(Eugene，OR))、FITC、若丹明和德州红(皮尔斯公司(Pierce)，美国伊利诺伊州罗克福德(Rockford，IL))、Cy 5、Cy 5.5、Cy 7(安玛西亚生命科学公司(Amersham Life Science)，美国宾夕法尼亚州匹兹堡(Pittsburgh，PA))。包括荧光团在内的合适光学染料描述于理查德P.豪格兰德(Richard P.Haugland)的分子探针手册(Molecular Probes Handbook)中，其借此以引用的方式明确并入。
合适的蛋白质类荧光标记物还包括(但不限于)绿色荧光蛋白，包括水母(Renilla)、海笔(Ptilosarcus)或多管水母(Aequorea)物种的绿色荧光蛋白(GFP)(查尔菲(Chalfie)等人，1994，科学(Science)263：802-805)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(克隆技术实验室公司(Clontech Laboratories，Inc.)，基因库(Genbank)登录号U55762)，蓝色荧光蛋白(BFP，量 子生物技术公司(Quantum Biotechnologies，Inc.)麦森诺夫西街1801号(1801deMaisonneuve Blvd.West)，第8层，加拿大魁北克蒙特利尔(Montreal，Quebec，Canada)H3H1J9；斯塔博(Stauber)，1998，生物技术(Biotechniques)24：462-471；海姆(Heim)等人，1996，当代生物学(Curr.Biol.)6：178-182)，增强型黄色荧光蛋白(EYFP，克隆技术实验室公司(Clontech Laboratories，Inc.))，荧光素酶(有海(Ichiki)等人，1993，免疫学杂志(J.Immunol.)150：5408-5417)，β-半乳糖苷酶(诺兰(Nolan)等人，1988，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)85：2603-2607)和水母(Renilla)(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美国专利第5292658号、第5418155号、第5683888号、第5741668号、第5777079号、第5804387号、第5874304号、第5876995号、第5925558号)。以上引用的参考文献全部以引用的方式明确并入本文中。
E.编码IL-18受体抗原结合蛋白的多核苷酸
在某些方面中，本发明提供编码SEQ ID NO：1-34、73、75、77、79、81、83、85、87、89-190的IgG、可变区和CDR的核酸分子。在一个实施例中，核酸具有SEQ IDNO：35-68、74、76、78、80、82、84、86、88和191-292中任一者的核苷酸序列。
如本文所述，可变区或CDR核酸分别编码可变区或CDR蛋白质。本文的“核酸”意指任何核酸，包括DNA与RNA。本发明的核酸通常是聚核酸(polynucleic acid)；即，由3′，5′磷酸二酯键共价连接的个别核苷酸的聚合物。
视用途而定，核酸可以是双股、单股或含有双股或单股序列的部分。如所属领域的技术人员所了解，对单个股(“魏特逊(Watson)”)的描述也定义另一股(“克里克(Crick)”)的序列；因此SEQ ID NO：35-68中所述的核酸序列也包括这些序列的互补序列。本文的术语“重组核酸”意指一般通过经核酸内切酶操作核酸，以自然界中不常见的形式最初体外形成的核酸。因此，出于本发明的目的，将线性形式的经分离抗原结合蛋白核酸或通过连接正常情况下未连接的DNA分子所体外形成的表达载体皆视为重组的。应了解，一旦制得重组核酸并将其再引入宿主细胞或生物体中，其就将非重组复制，即使用宿主细胞的体内(in vivo)细胞机制(machinery)而非体外操作；然而，出于本发明的目的，曾经重组产生的所述核酸(尽管之后非重组地复制)仍被视为重组的。
如所属领域的技术人员所了解，由于遗传密码的简并性(degeneracy)，故可制备非常多的核酸，这些核酸全部编码本发明的CDR(和抗原结合蛋白的重链和轻链或其它成分)。因此，倘若鉴别出一个特定氨基酸序列，诸如SEQ ID NO：1-34，那么所属领域的技术人员可制得许多不同核酸，即通过以不改变所编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单修改一个或多个密码子的次序。
F.产生抗原结合蛋白的方法
本发明还提供呈质粒形式的表达系统和构建体、表达载体、转录或表达盒，其包含至少一种如上的多核苷酸。此外，本发明提供包含所述表达系统或构建体的宿主细胞。
通常，用于任一宿主细胞的表达载体将含有用于质粒维持和用于克隆和表达外源核苷酸序列的序列。所述序列在某些实施例中总称为“侧翼序列(flanking sequence)”，其通常包括以下一种或多种核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列(complete intron sequence)、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷化序列(polyadenylationsequence)、用于插入编码待表达多肽的核酸的多位点接头区(polylinker region)，和可选标记(marker)元件。以下论述所述各序列。
任选地，载体可含有编码“标签(tag)”的序列，即位于IL-18受体抗原结合蛋白编码序列5′或3′端的寡核苷酸分子；寡核苷酸序列编码多聚His(polyHis)(诸如6His(hexaHis))，或另一“标签”，诸如FLAG、HA(血球凝集素流感病毒)，或myc，存在针对其的市售抗体。所述标签通常在多肽表达之后融合至多肽，并且可作为从宿主细胞亲和纯化或检测IL-18受体抗原结合蛋白的一种手段。亲和纯化可通过例如柱色谱法，使用针对所述标签的抗体作为亲和基质来完成。任选地，标签随后可通过各种手段(诸如使用某些用于裂解的肽酶)从经纯化的IL-18受体抗原结合蛋白去除。
侧翼序列可以是同源(即来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源(即来自不同于宿主细胞物种或菌株的物种)、杂交(即来自不止一种来源的侧翼序列的组合)、合成或天然的。因而，侧翼序列的来源可以是任何原核或真核生物体、任何有脊椎或无脊椎生物体、或任何植物，但前提是侧翼序列在宿主细胞机制中起作用并且可由宿主细胞机制活化。
适用于本发明载体的侧翼序列可通过业界所熟知若干方法中的任一种获得。通常，本文适用的侧翼序列通过定位(mapping)和/或通过限制性核酸内切酶消化而预先鉴别并因此可使用适当限制性核酸内切酶从恰当的组织来源分离。在一些情况下，可能已知侧翼序列的全核苷酸序列。这时，侧翼序列可使用本文所述用于核酸合成或克隆的方法合成。
不管侧翼序列是全部还是仅一部分已知，其均可使用聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，PCR)和/或通过用合适探针(诸如来自同一物种或另一物种的寡核苷酸和/或侧翼序列片段)筛检基因组文库(genomic library)来获得。倘若侧翼序列未知，便可从可能含有(例如)编码序列或甚至另一种或多种基因的较大片DNA分离含有侧翼序列的 DNA片段。分离可如下完成：通过限制性核酸内切酶消化产生恰当DNA片段，之后使用琼脂糖凝胶纯化、凯杰 柱色谱(美国加利福尼亚州查茨沃思(Chatsworth，CA))或所属领域技术人员所知的其它方法分离。所属领域的一般技术人员很容易了解为实现此目的的合适酶的选择。
复制起点通常是那些市售原核表达载体的一部分，并且起点有助于在宿主细胞中扩增载体。若所选载体不含复制起点位点，则可基于已知序列进行化学合成并连接到载体中。举例来说，来自质粒pBR322(纽英伦生物技术有限公司(New England Biolabs)，美国马萨诸塞州贝弗利(Beverly MA))的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，并且各种病毒起源(例如，SV40、多瘤病毒(polyoma)、腺病毒(adenovirus)、水泡性口炎病毒(vesicularstomatitus virus，VSV)或乳头瘤病毒(papillomaviruses)(诸如HPV或BPV))适用于在哺乳动物细胞中克隆载体。哺乳动物表达载体一般不需要复制起点成分(例如，通常仅使用SV40起点，因为其还含有病毒早期启动子)。
转录终止序列通常位于多肽编码区的3′端并用以终止转录。通常，原核细胞中的转录终止序列是富含G-C的片段，之后是多聚T(poly-T)序列。虽然所述序列容易从文库中克隆或甚至作为载体的一部分从市场上购买，但它也容易使用核酸合成方法(诸如本文所述的那些方法)合成。
可选择标记基因编码在选择性培养基中所生长的宿主细胞存活和生长所必需的蛋白质。典型选择标记基因编码以下蛋白质：(a)对原核宿主细胞赋予抗生素或其它毒素(例如氨苄西林(ampicillin)、四环素(tetracycline)或卡那霉素(kanamycin))抗性的蛋白质；(b)补充细胞的营养缺陷型缺乏(auxotrophic deficiency)的蛋白质；或(c)提供不能从复合(complex)培养基或限定(defined)培养基获得的关键养分的蛋白质。具体可选标记是卡那霉素抗性基因、氨苄西林抗性基因和四环素抗性基因。有利的是，新霉素(neomycin)抗性基因也可用于在原核和真核两种宿主细胞中的选择。
其它可选基因可用以扩增将要表达的基因。扩增是基因(为产生对生长或细胞存活至关重要的蛋白质所必需的)在连续多代重组细胞的染色体内前后(in tandem)重复(reiterated)的过程。适用于哺乳动物细胞的可选标记实例包括二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)和无启动子胸苷激酶(promoterless thymidine kinase)基因。将哺乳动物细胞转化子置于选择压力之下，其中仅转化子借助于载体中存在的可选基因独特适应而存活。选择压力是通过在培养基中选择试剂的浓度连续升高的条件下培养转化细胞，借此导致可选基因和编码另一基因(诸如与IL-18受体多肽结合的抗原结合蛋白抗体)的DNA都扩增而施加。作为结果，从扩增的DNA合成诸如IL-18受体抗原 结合蛋白的大量多肽。
核糖体结合位点通常是rnRNA的翻译起始所必需的并且特征是希恩-达尔加莫(Shine-Dalgamo)序列(原核生物)或科扎克(Kozak)序列(真核生物)。所述元件通常位于启动子的3′端和待表达多肽的编码序列5′端。
在一些情况下(诸如在真核宿主细胞表达系统中需要糖基化时)，可操纵各种前导肽(presequence)或前序列(prosequence)来改良糖基化或产率。举例来说，可改变特定信号肽的肽酶裂解位点或添加还可影响糖基化的前序列。最终蛋白产物可能在-1位置(相对于成熟蛋白的第一个氨基酸)具有一个或多个易于表达的其它氨基酸，这一个或多个其它氨基酸可能不完全去除。举例来说，最终蛋白产物可能具有在肽酶裂解位点中所见的一个或两个氨基酸残基，其附接于氨基端。或者，使用一些酶裂解位点可产生所要多肽的略截短形式(如果酶在成熟多肽内的所述区域切断)。
本发明的表达和克隆载体通常含有由宿主生物体所识别并且与编码IL-18受体抗原结合蛋白的分子可操作地连接的启动子。启动子是位于结构基因的起始密码子上游(即5′端)(通常在约100至1000bp内)而控制结构基因转录的非转录序列。常规将启动子归为两类：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子在其控制下回应于培养条件的一些改变(诸如存在或不存在养分或温度改变)，起始从DNA的增高水平的转录。另一方面，组成型启动子一致地转录其可操作地连接的基因，即几乎不控制基因表达。人们熟知由多种潜在宿主细胞所识别的大量启动子。一种合适启动子通过利用限制性酶消化从来源DNA去除启动子并将所要启动子序列插入载体中，而与编码构成本发明IL-18受体抗原结合蛋白的重链或轻链的DNA可操作地连接。
业界还熟知适合用于酵母宿主的启动子。酵母增强子宜与酵母启动子一起使用。适合用于哺乳动物宿主细胞的启动子已为人熟知，包括(但不限于)获自病毒基因组的启动子，所述病毒诸如多瘤病毒(polyoma virus)、鸡痘病毒(fowlpox virus)、腺病毒(adenovirus)(诸如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒(bovine papilloma virus)、禽类肉瘤病毒(avian sarcoma virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、反转录病毒(retroviruses)、B型肝炎病毒(hepatitis-B virus)和最佳的猴病毒40(Simian Virus 40，SV40)。其它适合的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克(heat-shock)启动子和肌动蛋白(actin)启动子。
可能受到关注的其它启动子包括(但不限于)：SV40早期启动子(本诺伊斯特(Benoist)和查姆伯恩(Chambon)，1981，自然Nature 290：304-310)；CMV启动子(托勒森(Thornsen)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)81：659-663)；劳氏(Rous)肉瘤病 毒的3′长末端重复序列所含有的启动子(山本(Yamamoto)等人，1980，细胞(Cell)22：787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(瓦格纳(Wagner)等人，1981，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)78：1444-1445)；金属硫蛋白(metallothionine)基因的启动子和调控序列(普林斯特乐(Prinster)等人，1982，自然(Nature)296：39-42)；和原核启动子，诸如β-内酰胺酶启动子(维拉-卡玛洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)75：3727-3731)；或tac启动子(德波儿(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)80：21-25)。还关注以下动物转录控制区，其显示组织特异性并且已被用于转基因动物中：在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I型基因控制区(斯威夫特(Swift)等人，1984，细胞(Cell)38：639-646；奥尼兹(Ornitz)等人，1986，冷泉港定量生物学研讨会(Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.)50：399-409；麦克唐纳(MacDonald)，1987，肝脏病学(Hepatology)7：425-515)；在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(哈纳汗(Hanahan)，1985，自然(Nature)315：115-122)；在淋巴细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(葛洛斯彻荻尔(Grosschedl)等人，1984，细胞(Cell)38：647-658；阿达姆斯(Adames)等人，1985，自然(Nature)318：533-538；亚历克斯(Alexander)等人，1987，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)7：1436-1444)；在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制区(莱德尔(Leder)等人，1986，细胞(Cell)45：485-495)；在肝脏中具有活性的白蛋白基因控制区(平克尔特(Pinkert)等人，1987，基因与发育(Genes and Devel.)1：268-276)；在肝脏中具有活性的α-胎儿蛋白基因控制区(克鲁姆洛夫(Krumlauf)等人，1985，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)5：1639-1648；汉默(Hammer)等人，1987，科学(Science)253：53-58)；在肝脏中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(凯西(Kelsey)等人，1987，基因与发育(Genes and Devel.)1：161-171)；在骨髓细胞中具有活性的β-球蛋白基因控制区(蒙诺格莱姆(Mogram)等人，1985，自然(Nature)315：338-340；科里亚斯(Kollias)等人，1986，细胞(Cell)46：89-94)；在脑的少突胶质细胞中具有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(雷德海德(Readhead)等人，1987，细胞(Cell)，48：703-712)；在骨胳肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(萨尼(Sani)，1985，自然(Nature)314：283-286)；和在下丘脑中具有活性的促性腺释放激素基因控制区(梅森(Mason)等人，1986，科学(Science)234：1372-1378)。
可将增强子序列插入载体中以增强较高级真核生物对编码构成本发明IL-18受体抗原结合蛋白的轻链或重链的DNA转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常长度约10-300bp，其作用于启动子以增强转录。增强子不太依赖取向和位置，已在转录单元的5′和3′端多个位置发现。已知可从哺乳动物基因获得的若干增强子序列(例如，球蛋白、 弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎儿蛋白和胰岛素)。然而，通常使用来自病毒的增强子。业界已知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子是用于活化真核启动子的示范性增强元件。虽然增强子可在载体中定位于编码序列的5′或3′端，但其通常位于启动子的5′端位点处。可将编码适当天然或异源信号序列(前导序列或信号肽)的序列并入表达载体中，促进抗体的细胞外分泌。信号肽或前导序列的选择取决于将要产生抗体的宿主细胞类型，并且异源信号序列可替代天然信号序列。在哺乳动物宿主细胞中起作用的信号肽实例包括以下各物：美国专利第4,965,195号中所述的白介素-7(IL-7)的信号序列；考斯曼(Cosman)等人，1984，自然(Nature)312：768中所述的白介素-2受体的信号序列；欧洲专利第0367566号中所述的白介素-4受体信号肽；美国专利第4,968,607号中所述的I型白介素-1受体信号肽；欧洲专利第0460846号中所述的II型白介素-1受体信号肽。
本发明表达载体可由诸如市售载体的起始载体构建。所述载体可能含有或可能不含有所有所要的侧翼序列。在本文所述侧翼序列中有一个或多个尚未存在于载体中的情况下，它们可个别获得并连接到载体中。所属领域的技术人员熟知用于获得各侧翼序列的方法。
在载体已构建并且编码构成IL-18受体抗原结合序列的轻链、重链或轻链和重链的核酸分子已插入载体中恰当位点之后，可将所完成的载体插入合适宿主细胞中用于扩增和/或多肽表达。将IL-18受体抗原结合蛋白的表达载体转化至选定宿主细胞中可通过熟知方法完成，所述方法包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其它已知技术。所选方法部分程度上随所用宿主细胞的类型而变。所述方法和其它合适方法为所属领域的技术人员所熟知并且例如在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，2001，同上中阐明。
当在适当条件下培养时，宿主细胞合成IL-18受体抗原结合蛋白，之后所述IL-18受体抗原结合蛋白可从培养基(若宿主细胞将其分泌至培养基中)中或直接从产生其的宿主细胞(若不被分泌出来)中收集。适当宿主细胞的选择取决于各种因素，诸如所要表达水平、活化所希望或所必需的多肽修饰(诸如糖基化或磷酸化)和折叠成生物活性分子的容易性。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系在业界熟知并且包括(但不限于)可获自美国菌种保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)的永生化细胞系，包括(但不限于)中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞、海拉细胞(HeLa cell)、幼仓鼠肾(babyhamster kidney，BHK)细胞、猴子肾细胞(monkey kidney cell，COS)、人类肝细胞癌瘤细 胞(例如，Hep G2)和许多其它细胞系。在某些实施例中，细胞系的选择可经由确定哪些细胞系具有高表达水平并组成性地产生(constitutively produce)具有IL-18受体结合特性的抗原结合蛋白来进行。在另一个实施例中，可选择来自不制备其自身抗体但具有制备和分泌异源抗体能力的B细胞谱系的细胞系。
G.IL-18受体抗原结合蛋白用于诊断和治疗目的的用途
本发明抗原结合蛋白适用于在生物样品中检测IL-18受体和鉴别产生IL-18受体蛋白的细胞或组织。特异性结合IL-18受体的本发明抗原结合蛋白可用于治疗需要治疗患者的IL-18受体介导的疾病。举例来说，本发明的IL-18受体抗原结合蛋白可用于诊断试验中，例如检测和/或量化组织或细胞中所表达IL-18受体的结合试验。此外，本发明的IL-18受体抗原结合蛋白可用以阻止IL-18受体与其配体(例如IL-18)形成复合物，借此调节细胞或组织中IL-18受体的生物活性。因此，结合IL-18受体的抗原结合蛋白可调节和/或阻断与其它结合化合物的相互作用并因而在改善IL-18受体介导的疾病中可具有治疗用途。在具体实施例中，IL-18受体抗原结合蛋白可阻断IL-18与其受体结合，从而可破坏由IL-18受体诱导的信号转导级联。
1.适应症
在疾病发病机理中IL-18含量增加和/或IL-18介导信号牵连已于多种病状和疾病中证实。因此本发明抗原结合蛋白用以调节或抑制免疫反应并且在治疗和预防由过度免疫反应所引起的各种疾病中具有功效(参见，WO2004/002519；WO2005/063290；WO2004/034988；马拉特(Mallat)等人，2002，循环研究(Circ.Res.)91：441-448)。因此，本发明的IL-18受体抗原结合蛋白可用于诊断、预防或治疗与IL-18相关的疾病或病状。
与IL-18相关的疾病或病状意指在患者中发作是由IL-18与IL-18受体的相互作用引起或阻止的任何疾病或病状。疾病或病状的严重程度还可通过IL-18与IL-18受体的相互作用增加或降低。举例来说，IL-18与以下疾病有关：自身免疫疾病(WO2004/002519；WO2005/063290；WO2004/034988；马拉特(Mallat)等人，2002，循环研究(Circ.Res.)91：441-448)、肝病(费涅托(Finitto)等人，2004，肝脏(Liver)53：392-400；筒井(Tsutsui)等人，2000，免疫学评论(Immunological Reviews)174：192-209；卢威兹克(Ludwiczek)等人，2002，临床免疫学杂志(J.Clinical Immunology)22：331-337)、胰病和心血管疾病(戈德斯(Gerdes)等人，2002，实验医学杂志(J.Exp.Med.)195：245-257；WO03/080104；WO02/060479；WO01/85201；瑞本(Raeburn)等人，2002，美国生理学杂志-心脏和循环生理学(Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.)283：H650-H657)。
与IL-18相关的自身免疫疾病实例包括牛皮癣、炎症性关节炎(诸如类风湿性关节 炎)(WO2005/063290；卡内提(Cannetti)等人，2003，免疫学杂志(J.Immunol.)171：1009-1015；查里斯(Charles)等人，1999，免疫学杂志(J.Immunol.)163：1521-1528；库南(Cunnane)等人，2000，在线风湿病学杂志(Online J.Rheumatol.)27：58-63；吉本(Yoshimoto)，1998，免疫学杂志(J.Immunol.)161：3400-3407)、狼疮(WO2005/063290)、I型糖尿病、II型糖尿病、克罗恩病(Crohn′s disease)(尼德奥(Niederau)，1997，在线NLM(Online NLM))、炎症性肠病(WO2004/002519)、多发性硬化症、自身免疫性肝炎(筒井(Tsutsui)等人，2000，同上)、原发性胆汁性肝硬化症(primary biliary cirrhosis，PBC)、获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)、特应性皮肤炎(小西(Konishi)等人，2002，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)99：11340-11345)、重症肌无力和结节病。
在类风湿性关节炎中，已证实在患者血清和滑液中有增高含量的成熟IL-18。在一些研究中，证实IL-18含量与疾病活动度(disease activity)和对疾病改善治疗(diseasemodifying treatment)的反应有关。在全身型幼年特发性关节炎和密切相关的成人发作型斯蒂尔病中始终测量到IL-18的极高血清含量。WO2005/063290；卡内提(Cannetti)等人，2003，免疫学杂志(J.Immunol.)171：1009-1015；查里斯(Charles)等人，1999，免疫学杂志(J.Immunol.)163：1521-1528；库南(Cunnane)等人，2000，在线风湿病学杂志(Online J.Rheumatol.)27：58-63；吉本(Yoshimoto)，1998，免疫学杂志(J.Immunol.)161：3400-3407。
与IL-18相关的其它形式关节炎包括例如，强直性脊柱炎、背痛、腕淤积综合征(carpaldeposition syndrome)、埃勒斯-当洛综合征(Ehlers-Danlos-Syndrome)、痛风(gout)、幼年型关节炎、红斑狼疮、肌炎、成骨不全症(osteogenesis imperfecta)、骨质疏松症、多动脉炎；多肌炎、牛皮癣性关节炎、赖特综合征(Reiter′s syndrome)、硬皮病(scleroderma)、伴有肠病的关节炎、白塞病(Behcets′s disease)、儿童关节炎、关节变性病(degenerative jointdisease)、纤维肌痛症(fibromyalgia)、感染性关节炎、莱姆病(Lyme disease)、马凡氏综合征(Marfan syndrome)、骨关节炎、骨坏死、佩吉特病(Pagets Disease)、风湿性多肌痛(Polymyalgia rheumatica)、假性痛风(pseudogout)、反射性交感神经萎缩症(reflexsympathetic dystrophy)、类风湿性关节炎、风湿症(rheumatism)、舍格伦综合征(sjogren′ssyndrome)、家族性腺瘤性息肉症(familial adenomatous polyposis)和诸如此类。戴(Dai)等人，2004，类风湿性关节炎(Arthritis Rheum.)50：432-443；川岛(Kawashima)等人，2004，在线关节炎研究和治疗(Online Arthritis Res.Ther.)6：R39-R45；麦尔斯(Myers)等人，2004，风湿病学(Rheumatology)43：272-276；魏(Wei)等人，2001，美国免疫学会(AmericanAssociation Of Immunologists)，第517-521页。
当与患有溃疡性结肠炎或非炎症性肠病的患者相比时，在患有克罗恩病的患者中也发现高含量的IL-18。肠上皮细胞与固有层(lamina propria)单核细胞均已当场(in situ)鉴别为IL-18产生增加的来源。已证实克罗恩病病变(lesion)有IL-18R表达细胞浸润。尼德奥(Niederau)，1997，在线NLM(Online NLM)。
也已暗示IL-18与溃疡性结肠炎和乳糜泻相关。
已证实来自多发性硬化症患者的中枢神经系统(CNS)病变、脑脊髓液和血清含有增加含量的IL-18信息(message)或蛋白质。在病变内，小胶质细胞(microglia)和巨噬细胞(macrophage)被认为是IL-18的来源。在患有非炎症性CNS疾病的个体的对照组织活检中未能检测到IL-18。在患有复发-缓解型(relapsing-remitting)疾病的部分患者(patientsubset)中已发现IL-18含量特别高；并且已发现与缓解期间相比，在复发期间IL-18含量增加。黄(Huang)等人，2004，多发性硬化症(Mult.Scler.)10：482-7；凯米(Kami)等人，2002，神经免疫学杂志(J.Neuroimmunol.)125：134-40；洛赛(Losy)等人，2001，斯堪的纳维亚神经病学学报(Acta Neurol.Scand.)104：171-3；尼克莱蒂(Nicoletti)等人，2001，神经学(Neurology)57：342-4；法斯宾德(Fassbender)等人，1999，神经学(Neurology)53：1104-6。
在牛皮癣患者中，报导有IL-18的血清含量增加，其与皮肤病变的程度和PASI计分有关。已在病变皮肤中证实与非病变或正常皮肤对照组相比，IL-18与IL-18R mRNA均过度表达。文献所记载的牛皮癣皮肤中IFN-γ和TNF-α的过度表达与IL-18所发挥的生物活性一致。艾里凯恩(Arican)等人，2005，炎症介质(Mediators Inflamm.)2005：273-9；皮斯金(Piskin)等人，2004，实验皮肤病学(Exp.Dermatol.)13：764-72；肯潘金(Companjen)等人，2004，欧洲胞质运动网(Eur.Cytokine Netw.)15：210-6；彼得札克(Pietrzak)等人，2003，皮肤性病学杂志(Acta Derm.Venereol.)83：262-5。
有各种其它自身免疫疾病与患病组织中或血清中IL-18含量增加相关。这些疾病包括全身性红斑狼疮、特应性皮肤炎、重症肌无力、I型糖尿病和结节病。IL-18还可能牵连于哮喘、阿尔茨海默病、过敏性鼻炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、移植和移植物抗宿主疾病(GvHD)中。
IL-18还牵连于肝脏或肝病中以及与肝脏损害或损伤相关的病状中。肝脏损害或损伤可能有各种病因。例如，其可能是由于病毒或细菌感染、酒精滥用、免疫失调或癌症。肝脏损伤还包括胆管损害，和在诸如酒精性肝炎、肝硬化、病毒性肝炎、原发性胆汁性肝硬化症和酒精相关肝坏死性炎症(alcohol-related hepatic necro-inflammation)等病状中的肝脏损害。费涅托(Finitto)等人，2004，肝脏(Liver)53：392-400；筒井(Tsutsui)等人， 2000，免疫学评论(Immunological Reviews)174：192-209；卢威兹克(Ludwiczek)等人，2002，临床免疫学杂志(J.Clinical Immunology)22：331-337。
与IL-18相关的肝病包括C型肝炎和B型肝炎。IL-18已牵连于自身免疫性与传染性肝炎的发病机理中。据认为其经由上调促凋亡分子(proapoptotic molecule)(包括FasL)而促使肝细胞死亡。已有人提议C型肝炎中干扰素-α的有益作用可能是经由降低的IL-18含量而介导。相反，IL-18投与在B型肝炎的转基因模型中具有有益作用，从而经由增加的NK和CTL活性改良病毒清除(viral clearance)。费涅托(Finitto)等人，2004，肝脏(Liver)53：392-400；筒井(Tsutsui)等人，2000，免疫学评论(Immunological Reviews)174：192-209；卢威兹克(Ludwiczek)等人，2002，临床免疫学杂志(J.Clinical Immunology)22：331-337。
除B和C型肝炎病毒外，迄今为止已发现至少4种引起病毒相关肝炎的其它病毒，其称作A、D、E和G型肝炎病毒。
IL-18还与心血管疾病相关，所述疾病包括粥样斑块破裂、缺血后心力衰竭、再灌注损伤、动脉粥样硬化、慢性心力衰竭、类风湿性关节炎的心血管并发症和其它心血管病。人们认为IL-18在败血症或内毒素休克的环境下明显降低心输出量。IL-18是炎症过程与粥样硬化形成之间的一个重要联系，尤其是有越来越多的证据证明在慢性炎症性病状(包括类风湿性关节炎(RA)和狼疮)患者中，源于心血管病因的大量过量死亡。已证实IL-18含量是心脏事件所引起死亡的强大而独立的预测指标(预测能力强于CRP含量)。戈德斯(Gerdes)等人，2002，实验医学杂志(J.Exp.Med.)195：245-257；WO03/080104；WO02/060479；WO01/85201；瑞本(Raeburn)等人，2002，美国生理学杂志-心脏和循环生理学(Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.)283：H650-H657。
IL-18还可能与肺病有关，所述肺病诸如，慢性阻塞性肺病(Chronic ObstructedPulmonary Disease，COPD)、慢性重症哮喘和急性呼吸窘迫综合征(Acute RespiratoryDistress Syndrome，ARDS)。
2.诊断方法
本发明抗原结合蛋白可用于诊断目的来检测、诊断或监控与IL-18或IL-18受体相关的疾病和/或病状。本发明提供使用所属领域技术人员已知的经典免疫组织学方法检测样品中IL-18受体的存在情况(例如，迪积森(Tijssen)，1993，酶免疫试验实践与理论(Practice and Theory of Enzyme Immunoassays)，第15卷(伯顿(R.H.Burdon)和尼朋伯格(P H.van Knippenberg)编，爱思唯尔(Elsevier)，阿姆斯特丹(Amsterdam)；左拉(Zola)，1987，单克隆抗体：技术手册(Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques)，第147-158页 (CRC出版公司(CRC Press，Inc.))；亚尔卡宁(Jalkanen)等人，1985，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)101：976-985；亚尔卡宁(Jalkanen)等人，1987，细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)105：3087-3096)。IL-18受体的检测可体内或体外进行。
本文所提供的诊断应用包括使用抗原结合蛋白检测IL-18受体的表达和配体与IL-18受体的结合。适用于检测IL-18受体存在的方法实例包括免疫试验，诸如酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和放射免疫试验(radioimmunoassay，RIA)。
对于诊断应用而言，抗原结合蛋白通常以可检测标记基团标记。合适的标记基团包括(但不限于)以下各物：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、 111In、125I、131I)、荧光基团(例如，FITC、若丹明、镧系元素磷光体)、酶基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团或由二次报导体所识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位点、金属结合域、表位标签)。在一些实施例中，将标记基团经由各种长度的间隔臂与抗原结合蛋白偶合以降低潜在位阻。用于标记蛋白质的各种方法在业界已知并且可用以实施本发明。
本发明一个方面提供对表达IL-18受体的一种或多种细胞的鉴别。在一个具体实施例中，抗原结合蛋白以标记基团标记并且检测经标记抗原结合蛋白与IL-18受体的结合。在另一具体实施例中，体内检测抗原结合蛋白与IL-18受体的结合。在另一具体实施例中，使用业界已知的技术分离并测量抗原结合蛋白-IL-18受体。参见例如，哈露(Harlow)和琳恩(Lane)，1988，抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，纽约冷泉港(New York：Cold Spring Harbor)(1991年版和定期增刊)；约翰E.科林根(John E.Coligan)编，1993，当代免疫学实验指南(Current Protocols In Immunology)纽约约翰威立出版公司(New York：John Wiley&Sons)。
本发明另一方面提供对与本发明抗原结合蛋白竞争结合IL-18受体的测试分子存在的检测。一种这样的试验实例包括在含有一定量IL-18受体的溶液中在存在或不存在测试分子的情况下检测游离抗原结合蛋白的量。游离抗原结合蛋白(即未与IL-18受体结合的抗原结合蛋白)的量增加指示测试分子能够与抗原结合蛋白竞争结合IL-18受体。在一个实施例中，抗原结合蛋白以标记基团标记。或者，标记测试分子并且在存在或不存在抗原结合蛋白的情况下，监控游离测试分子的量。
3.治疗方法：医药调配物，投药途径
在一些实施例中，本发明提供包含治疗有效量的一种或多种本发明抗原结合蛋白连 同医药学上可接受的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂一起的医药组合物。此外，本发明提供通过投与所述医药组合物治疗患者的方法。术语“患者”包括人类个体和动物个体。
优选地，可接受的调配材料在所用剂量和浓度下对接受者无毒。在具体实施例中，提供包含治疗有效量的IL-18受体抗原结合蛋白的医药组合物。
在某些实施例中，可接受的调配材料优选在所用剂量和浓度下对接受者无毒。在某些实施例中，医药组合物可包含用于改变、维持或保存(例如)组合物pH值、渗透压(osmolarity)、粘度、澄清度、颜色、等渗性(isotonicity)、气味、无菌度、稳定性、溶解或释放速率、吸附或穿透性的调配材料。在所述实施例中，合适的调配材料包括(但不限于)氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；膨化剂(诸如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(诸如咖啡碱、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；双糖；和其它碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐平衡离子(诸如钠)；防腐剂(诸如氯化苯甲烃铵(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(诸如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(诸如泊洛尼克(pluronic)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯类(诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯)、曲拉通(triton)、缓血酸胺(tromethamine)、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙伯(tyloxapal)；稳定性增强剂(诸如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(诸如碱金属卤化物，优选是氯化钠或氯化钾，甘露糖醇、山梨糖醇)；传送媒剂；稀释剂；赋形剂和/或医药佐剂。参见，雷明登氏制药科学(REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES)，第18版，(吉尔莫(A.R.Genrmo)编)，1990，马克出版公司(Mack Publishing Company)。
在某些实施例中，最佳医药组合物将由所属领域的技术人员依据(例如)期望投药途径、传送形式和所要剂量确定。参见，例如雷明登氏制药科学，同上。在某些实施例中，所述组分可能影响本发明抗原结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在某些实施例中，医药组合物中的主要媒剂或载剂实质上可以是水性或非水性的。举例来说，合适媒剂或载剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，并且可能补充有不经肠投与的组合物中所常用的其它材料。中性缓冲生理盐水或与血清白蛋白混合 的生理盐水是另外的示范性媒剂。在具体实施例中，医药组合物包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲剂或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲剂，并且可进一步包括山梨糖醇或其合适替代物。在本发明某些实施例中，IL-18受体抗原结合蛋白组合物可通过使具有所要纯度的所选组合物与任选使用的调配剂(雷明登氏制药科学，同上)混合而以冷冻干燥饼或水溶液形式制备储存。此外，在某些实施例中，IL-18受体抗原结合蛋白产物可使用适当赋形剂(诸如蔗糖)调配为冷冻干燥产物。
本发明医药组合物可选择进行不经肠传送。或者，组合物可选择进行吸入或经由消化道(诸如经口)传送。所述医药学上可接受的组合物的制备处在所属技术领域的范围之内。
调配组分优选存在浓度是投药部位可接受的。在某些实施例中，缓冲剂用以将组合物维持在生理pH值或略低的pH值，通常在约5至约8的pH值范围内。
当预期不经肠投药时，用于本发明的治疗组合物可提供为包含所要IL-18受体抗原结合蛋白在医药学上可接受媒剂中的无热原质、不经肠可接受的水溶液形式。尤其适用于不经肠注射的媒剂是无菌蒸馏水，在其中将IL-18受体抗原结合蛋白调配为恰当保存的无菌、等渗溶液。在某些实施例中，制备可包括将所要分子与可提供产物(其可经由积存注射(depot injection)传送)受控或持续释放的试剂一起调配，所述试剂诸如可注射微球体、生物可降解颗粒、聚合化合物(诸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体。在某些实施例中，还可使用能够提升循环中持续时间的透明质酸(hyaluronic acid)。在某些实施例中，可使用可植入药物传送装置来引入所要抗原结合蛋白。
本发明医药组合物可经调配用于吸入。在这些实施例中，IL-18受体抗原结合蛋白宜调配为可吸入干粉。在具体实施例中，IL-18受体抗原结合蛋白吸入溶液还可以用推进剂调配用于气雾剂传送。在某些实施例中，溶液可经雾化。因此，肺部投药和调配方法另外描述于国际专利申请案第PCT/US94/001875号中，其以引用的方式并入本文中并且描述经化学修饰蛋白质的肺部传送。还预期调配物可经口投与。以此方式投与的IL-18受体抗原结合蛋白可用或不用固体剂型(诸如片剂和胶囊)调配中常用的载剂调配。在某些实施例中，胶囊可设计为在胃肠道中生物利用率最大并且全身循环前(pre-systemic)降解最小之时释放调配物的活性部分。可包括促进IL-18受体抗原结合蛋白吸收的其它试剂。还可采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
优选提供本发明医药组合物包含有效量的一种或多种IL-18受体抗原结合蛋白与适合于制造片剂的无毒赋形剂混合。通过将片剂溶解于无菌水或另一适当媒剂中，可制备 单位剂量形式的溶液。合适赋形剂包括(但不限于)惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
所属领域的技术人员很清楚其它医药组合物，包括持续或受控传送调配物中包含IL-18受体抗原结合蛋白的调配物。多种其它持续或受控传送手段(诸如脂质体载剂、生物可降解微粒或多孔珠粒和积存注射剂)的调配技术也为所属领域的技术人员所知。参见，例如国际专利申请案第PCT/US93/00829号，其以引用的方式并入本文中并且描述用于传送医药组合物的多孔聚合物微粒的受控释放。持续释放制剂可包括呈成型物件形式(例如薄膜或微胶囊)的半透性聚合物基质。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚乳酸(polylactide)(如美国专利第3,773,919号和欧洲专利申请公开案第EP 058481号中所揭示，其各自以引用的方式并入本文中)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(希德曼(Sidman)等人，1983，生物高分子(Biopolymers)2：547-556)、聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)(朗格尔(Langer)等人，1981，生物医学材料研究杂志(J.Biomed.Mater.Res.)15：167-277和朗格尔，1982，化学工艺(Chem.Tech.)12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(朗格尔等人，1981，同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开案第EP 133,988号)。持续释放组合物还可包括脂质体，其可通过业界已知的若干方法中的任一种制备。参见，例如以引用的方式并入的埃普施坦茵(Eppstein)等人，1985，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)82：3688-3692；欧洲专利申请公开案第EP 036,676号；第EP 088,046号和第EP 143,949号。
用于体内投药的医药组合物通常提供为无菌制剂。杀菌可通过无菌过滤膜过滤来完成。当将组合物冷冻干燥时，使用此方法的杀菌操作可于冷冻干燥和复水之前或之后执行。不经肠投与的组合物可储存为冷冻干燥形式或溶液形式。通常将不经肠组合物置于具有无菌取样口(access port)的容器中，例如具有皮下注射针可穿透的塞子的静脉溶液袋或小瓶。
医药组合物一经调配，即可呈溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或者脱水或冷冻干燥粉末形式储存于无菌小瓶中。所述调配物可储存为即用形式或投与前复水的形式(例如冷冻干燥形式)。本发明还提供用于产生单次剂量投药单位的试剂盒。本发明试剂盒可各自含有装干燥蛋白质的第一容器和装水性调配物的第二容器。在本发明某些实施例中，提供含有单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和药粉注射器(lyosyringe))的试剂盒。
待使用的含有IL-18受体抗原结合蛋白的医药组合物的治疗有效量将取决于(例如) 治疗环境和目标。所属领域的技术人员将了解，适当的治疗剂量水平部分取决于所传送的分子、使用IL-18受体抗原结合蛋白的适应症、投药途径以及患者尺寸(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)而变化。在某些实施例中，临床医师可进行剂量滴定和修改投药途径来得到最佳治疗效果。取决于上述因素，典型剂量可在约0.1μg/kg至多达约30mg/kg或更多的范围内。在具体实施例中，剂量可在0.1μg/kg至多达约30mg/kg的范围内，任选地为1μg/kg至多达约30mg/kg或10μg/kg至多达约5mg/kg。
给药频率将取决于调配物中所用特定IL-18受体抗原结合蛋白的药物动力学参数。通常，临床医师投与组合物直至达到实现所要效果的剂量。因此，组合物可呈单剂，或可随时间以两剂或两剂以上(其可含有或可不含相同量的所要分子)投与，或经由植入装置或导管连续输注而投与。对适当剂量的进一步改进由所属领域的一般技术人员按常规进行并且在其常规执行的工作范围内。适当剂量可经由使用合适剂量-反应数据确定。在某些实施例中，可将本发明抗原结合蛋白长时期投与患者。长期投与本发明抗原结合蛋白可最小化通常与并非全人的抗原结合蛋白相关的不利免疫或过敏反应，例如在非人类动物中针对人类抗原产生的抗体，例如在非人类物种中产生的非全人抗体或非人类抗体。
医药组合物的投药途径是根据已知方法，例如经口，经由通过静脉内、腹膜内、脑内(脑实质内(intra-parenchymal))、脑室内(intracerebroventricular)、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉内或病变内途径注射；通过持续释放系统或通过植入装置。在某些实施例中，可通过快速注射(bolus injection)或通过连续输注或通过植入装置投与组合物。
组合物还可经由植入已吸收或囊封有所要分子的薄膜、海绵体或另一种合适材料局部投与。在某些实施例中，使用植入装置时，可将装置植入任何合适组织或器官中，并且所要分子的传送可经由扩散、定时释放丸剂(timed-release bolus)或连续投药而进行。
还可能期望离体(ex vivo)使用本发明的IL-18受体抗原结合蛋白医药组合物。在所述情形中，将已从患者取出的细胞、组织或器官暴露于IL-18受体抗原结合蛋白医药组合物，随后将细胞、组织和/或器官植回患者中。
具体来说，IL-18受体抗原结合蛋白可通过使用诸如本文所述那些方法的方法植入经基因工程改造的某些细胞以表达和分泌所述多肽来进行传送。在某些实施例中，所述细胞可以是动物或人类细胞，并且可以是自体的(autologous)、异源的(heterologous)或异种的(xenogeneic)。在某些实施例中，细胞可永生化。在其它实施例中，为减少免疫反应的机会，可囊封细胞以避免浸润周围组织。在另一些实施例中，囊封材料通常是生物相容性、半渗透性聚合物壳或膜，其允许释放蛋白产物但防止患者免疫系统或其它来自周 围组织的有害因素破坏细胞。
在本说明书全文内所引用的所有参考文献以全文引用的方式明确并入本文中。
以下实例，包括所进行的实验和所达成的结果，仅为说明性目的而提供，而不应理解为限制本发明。
VI.实例
A.实例1：使用pVE414N瞬时表达构建体的抗IL-18受体抗体IgG2和IgG4型式的产生
以下实例描述用以产生各种抗IL18受体结合蛋白IgG2和IgG4型式的瞬时表达构建体的产生，和测试其结合特征和效力的实验方法。
1.构建体的产生
用于瞬时表达AMH9/AML9、AMH11/AML7、AMH3/AML14和AMH6/AML12的IgG4型式的表达构建体通过将SEQ ID NO：74、76、78、80、82、84、86和88的多核苷酸序列亚克隆到瞬时表达载体中而产生。同一可变区的IgG2型式通过将编码那些IgG的可变区的多核苷酸部分亚克隆到独立瞬时表达载体中而产生。
2.瞬时转瓶转染(Transient Roller Bottle Tranfection)
对于每一抗体进行到CosPKB细胞系中的8次转瓶转染。对IgG2的效价如下：
IgG2 效价 AMH9/AML9 33.5 AMH11/AML7 35.1 AMH3/AML14 42.9 AMH6/AML12 41.5
3.各种抗体的效力和交叉反应性试验
KG-1IFN γ释放试验。在体外干扰素-γ(IFN γ)释放试验中测试各种IgG构建体以确定其抑制活性。IFN γ释放试验依据表达内源性IL-18R的人类骨髓单核细胞性KG-1细胞响应于IL-18而释放IFN γ的原理进行。
简单来说，将诸如亲和纯化scFv的试剂随KG-1细胞于96孔组织培养板中预先培育。将IL-18(+TNF α)加入细胞中诱导IFN γ释放。TNF α与IL-18一起添加增强IFN γ反应并因此通过允许使用较低浓度的IL-18而使试验更灵敏。这至少部分上可能是由于TNF α诱导IL-18R表面表达的上调。
在限定的培育期之后，收获细胞上清液并使用ELISA分析IFN γ含量。可通过显示IFN γ释放的降低而在此试验中评定抑制IL-18R所介导信号传导的测试化合物。
从欧洲细胞培养保存中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC，86111306)获得KG-1细胞。使细胞在经补充的伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Iscove′s Dulbeccomodified medium，IMDM)中繁殖并且维持在1-2×106个细胞/毫升。从派普罗科技公司(Peprotech)(200-18)获得重组人类IL-18并从安迪生物公司(R&D Systems)(210-TA)购得重组人类TNF α。在每次实验中监控响应于1nM IL-18(+1.1nM TNF α)所释放的IFN γ量，其在约250pg/ml至4000pg/ml的范围内。
KG-1试验在96孔平底细胞培养板(可斯塔公司(Costar))中进行。抗体的测试溶液(一式两份)纯粹地(neat)(或于杜尔贝可PBS(Dulbecco′s PBS)中稀释为所需浓度)以50μl的体积使用。随后将抗体以6-9个点的1/3稀释系列(6-9point 1/3dilution series)(使用KG-1培养基)滴定，之后添加50μl KG-1细胞同时轻轻混合。始终包括仅具有IL-18的“无抗体”对照组和“仅细胞”对照组。在37℃下用5％CO2培育抗体/细胞混合物30-60分钟之后，添加100μl于KG-1培养基中稀释的IL-18+TNF α同时轻轻混合。IMAC纯化scFv的最终浓度通常在25-200μg/ml的范围内。在所有试验中使用三种参考抑制剂。前两种是针对IL-18R两个不同链的单克隆抗体，RP1(安迪生物公司(R&D Systems)，MAB840)和AcPL(安迪生物公司，MAB1181)。除稀释系列的最终起始浓度是10-20μg/ml之外，这些抗体如上对于scFv所述使用。此外，使用重组IL-18BP/Fc嵌合体(安迪生物公司，119-BP)来中和IL-18。在此情况下，将50μl KG-1培养基加入细胞培养板中，之后添加50μl细胞并且将细胞如以上对抗体所述培育。在一单独96孔“U”形底细胞培养板中，将IL-18BP/Fc以6-9个点的1/2稀释系列(使用KG-1培养基)以60微升/孔的体积滴定。将等体积的IL-18+TNF α加入IL-18BP/Fc稀释系列中。在37℃下用5％CO2培育IL-18BP/Fc/IL-18混合物30-60分钟之后，以100微升/孔加入KG-1细胞培养板中同时轻轻混合。用于稀释系列的IL-18BP/Fc的最终起始浓度是1mg/ml。KG-1细胞的最终浓度是1.5×106个细胞/毫升(即3×105个细胞/孔)并且IL-18以1nM(+1.1nM TNF α)的最终浓度使用。
还滴定IL-18来确定IFN γ反应的EC50。将IL-18以6-10个点的1/2稀释系列(使用KG-1培养基)滴定，其中TNF α保持恒定在1.1nM。在此情况下，将50ml KG-1培养基加入细胞培养板中，之后添加50ml细胞。在37℃下用5％CO2将细胞培养板培育30-60分钟，随后添加100ml经滴定的IL-18同时轻轻混合。对于稀释系列，IL-18的最终浓度起始于5nM。通常，IL-18(+TNF α)的EC50在0.5-1nM的范围内，尽管偶而可见低至0.3nM或高至5nM的最小和最大EC50值。
将KG-1细胞培养板在37℃下用5％CO2培育过夜。通过将180ml培养基移至干净 “U”形底96孔板中，随后将板密封并在1200rpm下离心5分钟而获得细胞上清液。随后将160ml无细胞上清液转移至另一干净“U”形底96孔板中，并且澄清上清液立刻测试或在-20℃下冷冻。
KG-1细胞上清液中IFN γ的量通过标准夹心ELISA试验，使用时间分辨荧光读出器测定。将FLUORONUNC平底96孔板(NUNC，437958)用100毫升/孔的4mg/ml的IFN γ特异单克隆捕捉抗体(capture antibody)(安迪生物公司(R&D Systems)，MAB2851)涂布并在+4℃下静置过夜。用杜尔贝可PBS(Dulbecco′s PBS)冲洗板，随后通过于PBS中添加200毫升/孔3％奶粉并在室温(RT)下培育1-2小时来阻断非特异蛋白结合。将重组人类IFN γ标准物(安迪生物公司，285-IF-100)于试剂稀释剂(0.1％BSA、0.05％吐温-20、20mM Tris、150mM NaCl；pH 7.2-7.4)中稀释至16,000pg/ml，随后以12个点的1/2稀释系列滴定。将阻断缓冲剂从涂布捕捉抗体的板中去除，并加入100毫升/孔IFNγ标准物或澄清细胞上清液。“空白”对照组中加入试剂稀释剂。在室温下培育1-2小时之后，将板用含有0.1％吐温-20的PBS洗涤3次。将生物素标记的抗人类IFN γ多克隆检测抗体(安迪生物公司，BAF285)于补充有2％正常山羊血清的试剂稀释剂中稀释至100ng/ml并且以100毫升/孔添加。在室温下培育1小时之后，将板用含有0.1％吐温-20的PBS洗涤3次。将抗生蛋白链菌素-铕(Streptavidin-Europium)(珀金-埃尔默公司(Perkin-Elmer)，4001-0010)于DELFIA试验缓冲剂(珀金-埃尔默公司，4002-0010)中以1/1000稀释并且以100毫升/孔添加。在室温下培育30-60分钟之后，将板用DELFIA洗涤缓冲剂(珀金-埃尔默公司，1244-114)洗涤7次。添加100毫升/孔的DELFIA增强溶液(珀金-埃尔默公司，4001-0010)并且将板在室温下静置至少10min。利用解离-增强时间分辨荧光测定法，使用Victor2V板读取仪(珀金埃尔默公司)，测量所得荧光信号。
从IFN γ标准物的结果减去ELISA“空白”对照组的平均值，而对于细胞上清液结果，减去“仅细胞”对照组的平均值。使用GraphPad PRISM(格拉夫派得软件公司(GraphPad Software，Inc.))，利用非线性回归(具有可变斜率)计算IFN γ标准曲线。随后通过使用IFN γ标准曲线的“由Y得未知数X(unknown X from Y)”输出值确定细胞上清液中IFN γ的浓度。使用非线性回归(具有可变斜率)并且必要时约束上下限，来计算响应于IL-18的KG-1细胞释放IFN γ的EC50。使用荧光计数数据，将测试化合物对KG-1细胞释放IFN γ的抑制作用标准化为“无抗体”仅IL-18对照组平均值的百分比。随后可使用非线性回归(具有可变斜率)并且分别约束下上限至0和100％来计算测试化合物的IC50值。
在测量对KG1细胞产生IFN-γ的影响的试验中，抗体AMH9/AML9、AMH11/AML7、 AMH3/AML14和AMH6/AML12的IgG2型式的效力至少与原始IgG4型式相当。此外，在测量人类NK细胞的INF-γ产生的试验中，IgG2型式的效力至少与原始IgG4相当。
在测量对由IL-18诱导的猕猴(cynomolgus)PBMC#010182细胞产生INF-γ的影响的试验中，抗体IgG2型式的效力与原始IgG4相当。这确认转化为IgG2不影响测试抗体的猕猴(cyno)交叉反应性。
4.特异性试验
通过ELISA分析各种抗体的IgG针对一组蛋白质的交叉反应性。
将测试抗原以于PBS(杜尔贝可PBS，不含Ca和Mg，英杰公司(Invitrogen)，目录号14190-086)中1μg/ml涂布于蛋白质固定器(Protein Immobiliser)96孔板(艾克斯琼公司(Exiqon)，产品号10203-111-60)上，一式两份，50微升/孔，在4℃下过夜。
使用96孔板洗涤器(宝特(BIO-TEK)，ELX405UV)，将板以每孔300μl PBS-吐温(0.1％)(PBS-T)洗涤三次并以300μl PBS洗涤三次。向经洗涤的板中，每孔添加300μl 3％玛宝PBS(Marvel PBS)(MPBS)以作为阻断剂。将板在室温(RT)下阻断1小时。
如先前所述将板用PBS-T洗涤三次并用PBS洗涤三次。
将抗体(hulgG4)于3％MPBS中稀释至0.5μg/ml。每孔添加50μl经稀释hulgG4。在室温下培育板1小时。如先前所述洗涤板。
将一级检测抗体(单克隆抗人类IgG4克隆HP-6025生物素共轭物，西格玛公司(Sigma)，目录号B-3648)以1∶15,000于3％MPBS中稀释并以50微升/孔加入板中。在室温下以一级检测抗体培育1小时。如先前所述洗涤板。
将二级检测抗体(埃曲阿维汀(ExtrAvidin)过氧化物酶共轭物，西格玛公司(Sigma)，目录号E-2886)以1∶1，000于3％MPBS中稀释并以50微升/孔加入板中。在室温下以二级检测抗体培育30分钟。如先前所述洗涤板。
添加50微升/孔四甲基联苯胺(Tetramethyl-benzidine，TMB)(用于ELISA的液体底物，西格玛公司(Sigma)，目录号T-0440)并在室温下培育10分钟。为停止酶显色反应(colorreaction)，每孔添加50μl 0.5M H2SO4。
在96孔板读取仪(Victor2V板读取仪(珀金埃尔默公司))上以450nm读取板。
特异性抗IL-18受体IgG4抗体仅对人类和猕猴IL-18受体蛋白是阳性。不存在与其它物种的交叉反应性。以上抗体的IgG2型式具有相同交叉反应特性，即其仅与猕猴IL-18受体交叉反应。
B.实例2：IL-18受体抗体的结合亲和力表征
本实例提供测定IL-18受体抗原结合蛋白对细胞表面表达的人类IL-18R α的结合亲 和力的示范性方法。将IL-18受体抗体使用[125I]-波顿-亨特([125I]-Bolton-Hunter)试剂(二碘化；珀金埃尔默生命科学公司(PerkinElmer Life Sciences，Inc.)，美国马萨诸塞州波士顿(Boston，MA))碘化。在氮气流下将提供于无水苯中的1毫居里(millicurie)[125I]-波顿-亨特试剂蒸干。将5微升IL-18受体抗体(16微克)用等体积硼酸盐缓冲生理盐水稀释并随后加入于其原始小瓶中的干燥[125I]-波顿-亨特试剂中。在4℃下培育过夜之后，添加10微升PBS、0.1％明胶并将整个样品转移到平衡过的2mL P6柱(伯乐公司(BioRad)；美国加利福尼亚州海格里斯(Hercules，CA))中，在其中通过以0.1％明胶作为载体蛋白的凝胶过滤，将碘化IL-18受体抗体与游离125I分离。汇合含有碘化抗体的部分、在结合培养基(RPMI 1640，含有2.5％牛白蛋白，Fraction V，20mM海珀斯(Hepes)和0.2％叠氮化钠，pH 7.2)中稀释至100nM浓度并在4℃下储存。通过氨基酸分析，基于抗体的初始蛋白质浓度，计算比活性为3.5×1015cpm/mmol，并且根据对照实验(其中使用碘化抗体的等分试样进行省略[125I]-波顿-亨特试剂的碘化方案)得到70％的回收率。
1.直接平衡结合(Direct Equilibrium Binding)
在37℃下于5％CO2中，于含有20％胎牛血清的IMDM培养基中，在20ng/mL人类TNF α存在下，将KG-1细胞刺激20小时。经刺激的KG-1细胞(最终5×105个细胞/150微升)用PBS洗涤两次，并随后以一定浓度范围的碘化抗体培育。在碘化抗体的单一浓度(约350pM，一式三份)下，在1000倍摩尔过量的未标记抗体存在下，测量非特异性结合，并假定为所存在碘化抗体浓度的线性函数。将所有试剂于含有叠氮化钠(0.2％)的结合培养基中稀释，以抑制细胞对碘化抗体的潜在内化(potential internalization)。
在96孔圆底微量滴定板中在37℃、5％CO2下于小型回转式振荡器(miniorbitalshaker)上培育细胞。4小时之后，将各混合物两个60微升等分试样转移到含有200微升邻苯二甲酸酯油(1.5份邻苯二甲酸二丁酯：1份邻苯二甲酸二辛酯)的冷却400微升聚乙烯离心管中，并在4℃台式微量离心机(索福公司(Sorvall)，美国北卡罗莱纳州阿什维尔(Asheville，NC))中在10,000rpm下旋转1.5分钟，使细胞结合的(cell associated)碘化抗体与游离碘化抗体分离。切开油管，并且将各细胞小球(pellet)和上清液收集于独立的12×75mm玻璃管中并加载到COBRA γ计数器(帕卡德仪器公司(Packard InstrumentCompany)；美国马萨诸塞州波士顿(Boston，MA))上进行cpm测量。将各孔一式两份等分试样的cpm求平均值以便分析。在Prism 3.03版(格拉夫派得软件公司(GraphPadSoftware，Inc)；美国加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego，CA))中经由非线性回归针对简单的1-位点(1-site)结合方程拟合数据。
在37℃下碘化抗体与经刺激KG-1细胞的结合具有81pM的KD和约4700个位点/ 细胞。
2.竞争试验
将经刺激和洗涤的KG-1细胞(最终5×105个细胞/150微升)与单一浓度的碘化抗体(15.6pM)和不同浓度的未标记抗体在结合培养基中培育。在1000倍摩尔过量的未标记抗体存在下测定非特异性结合。刚好在添加细胞之前混合碘化抗体和未标记抗体，即不存在预培育步骤。
在96孔圆底微量滴定板中在37℃、5％CO2下于小型回转式振荡器上培育细胞。4小时后，将各混合物两个60微升等分试样转移到含有200微升邻苯二甲酸酯油(1.5份邻苯二甲酸二丁酯：1份邻苯二甲酸二辛酯)的冷却400微升聚乙烯离心管中，并且在4℃台式微量离心机(索福公司(Sorvall)，美国北卡罗莱纳州阿什维尔(Asheville，NC))中在10,000rpm下旋转1.5分钟，使细胞结合的碘化抗体与游离碘化抗体分离。切开油管，并且将各细胞小球和上清液收集于独立的12×75mm玻璃管中并加载到COBRA γ计数器(帕卡德仪器公司(Packard Instrument Company)；美国马萨诸塞州波士顿(Boston，MA))上进行cpm测量。将各孔一式两份等分试样的cpm求平均值以便分析。在Prism中使用81pM的Kd值经由非线性回归针对单一竞争性抑制方程拟合数据。
未标记抗体结合的Ki是53pM。
C.实例3：抗IL-18受体抗体的活性表征
对于各种IgG构建体如实例1第3部分中所述进行IFN γ释放试验，如下所述。
1.以AMH2/AML16、AMH2/AML17、AMH1/AML16和AMH1/AML17构建体抑制KG1细胞INF γ释放的比较
将以AMH/AML抗原结合蛋白构建体AMH2/AML16、AMH2/AML17、AMH1/AML16和AMH1/AML17处理时对KG1细胞INF-γ释放的抑制作用，与以IL-18结合蛋白(BP)的对照处理相比较。在抑制IFN γ释放上AMH/AML抗原结合蛋白明显更有效，所有均证实ED50在6pM与10pM之间而IL-18BP的ED50是520pM。
2.以AMH4/AML14、AMH4/AML15、AMH3/AML14和AMH3/AML15构建体抑制KG1细胞INF γ释放的比较
将以AMH/AML抗原结合蛋白构建体AMH4/AML14、AMH4/AML15、AMH3/AML14和AMH3/AML15处理时对KG1细胞INF-γ释放的抑制作用，与以IL-18结合蛋白(BP)的对照处理相比较。在抑制IFN γ释放上AMH/AML抗原结合蛋白明显更有效，所有均证实ED50在3pM与7pM之间而IL-18BP的ED50是520pM。
3.以AMH6/AML12、AMH6/AML13、AMH5/AML12和AMH5/AML13构建体抑制 KG1细胞INF γ释放的比较
将以AMH/AML抗原结合蛋白构建体AMH6/AML12、AMH6/AML13、AMH5/AML12和AMH5/AML13处理时对KG1细胞INF-γ释放的抑制作用，与以IL-18结合蛋白(BP)的对照处理相比较。在抑制IFN γ释放上AMH/AML抗原结合蛋白明显更有效，所有均证实ED50在2.9pM与11.3pM之间而IL-18BP的ED50是520pM。
4.AMH8/AML11、AMH9/AML9、AMH10/AML8和AMH11/AML7IgG对KG1细胞INF γ释放的抑制
将以包含AMH8/AML11、AMH9/AML19、AMH10/AML8和AMH11/AML7IgG的组合的AMH/AML IgG抗原结合蛋白构建体对KG1细胞INF-γ释放的抑制作用，与以IL-18结合蛋白(BP)的对照处理相比较。在抑制IFN γ释放上AMH/AML抗原结合蛋白明显更有效，所有均证实ED50在3pM与45pM之间而IL-18BP的ED50是520pM。
5.AMH15/AML3、AMH13/AML4、AMH13/AML5和AMH16/AML2IgG对KG1细胞INF γ释放的抑制
将以包含AMH15/AML3、AMH13/AML4、AMH13/AML5和AMH16/AML2IgG的组合的AMH/AML IgG抗原结合蛋白构建体对KG1细胞INF-γ释放的抑制作用，与以IL-18结合蛋白(BP)的对照处理相比较。在抑制IFN γ释放上AMH/AML抗原结合蛋白明显更有效，所有均证实ED50在17pM与320pM之间而IL-18BP的ED50是520pM。
D.实例4：所述IL-18受体抗体的结合表位鉴别
执行实验来确定人类IL-18受体(IL-18R)中所存在的对于与IL-18受体结合蛋白中的一种或多种结合而言具重要性的氨基酸残基。示范性抗体以高亲和力与人类IL-18R结合但并不结合IL-18R的小鼠直系同源物(ortholog)。实验旨在检测人类与小鼠IL-18R之间不同的氨基酸。这可与IL-18R的三维计算机模型分析相结合，来确定那些氨基酸中有哪些位于受体表面上并因此更可能与抗体相互作用。通过使用定点突变将人类序列的特定氨基酸改变为小鼠序列，并随后测试突变IL-18R分子与抗体的结合，来检测候选氨基酸对抗体识别所起的作用。使用抗体剂量-反应曲线和随后确定EC50浓度(最大结合信号50％所需的抗体浓度)，评定抗体结合不同突变体的相对能力。
鉴别人类IL-18R的表面上对于抗体结合尤其重要并因此促成表位的区域。此区域含有氨基酸243-271(以粗体显示于图5中)。当此区域中的特定氨基酸突变为小鼠序列时，抗体结合减弱(对抗体结合的影响在表3中报告)。氨基酸250-253(MFGE突变)和267-271(MRIMT突变)对抗体结合有最深远的影响，但均不能单独完全影响抗体结合(参见，加下划线的氨基酸残基)。当受体在4个特定测试位点全部突变时，抗体结合几乎消 除。对照抗IL-18R受体抗体的结合受突变影响不明显，表明受体的整体结构未受突变破坏。氨基酸243-271编码所预测IL-18接触点之一，并因此此表位与抗体阻断IL-18与受体结合的能力一致。
表3
以IL-18R和突变IL-18R的抗体结合试验结果
(括号中提供对应于各突变的小鼠氨基酸)
示范性抗体结合： 平均EC50(pM) 相对于huIL18R的 结合能力减小倍数 对照抗体结合： 平均EC50(pM) huIL18R 15.7+/-9.0 0 7.9+/-4.7 EEDV突变(KDDL) 25.3+/-11.9 1.6 6.7+/-4.4 MFGE突变(SIRK) 57.9+/-26.1 3.7 5.9+/-3.7 MRIMT突变(TTTWI) 177.5+/-58.9 11.3 8.5+/-5.1 STGGT(NEEAI) 15.7+/-8.5 0 10.0+/-6.2 EEDV+MRIMT+STGGT 2615.1 2287.3 7.9+/-5.1 EEDV+MRIMT+MFGE+STGGT 过低而不能测量 N/A 10.3+/-5.5 小鼠IL18R 未结合 N/A N/A
人类IL18R在所示残基处突变为小鼠IL18R序列，并且具有抗生物素蛋白(avidin)标签的重组突变受体固定在涂布生物素的珠粒上。随后使用经固定受体在可溶性结合试验中确定相对抗体结合能力。还使用识别不同于示范性抗体的表位的抗hulL-18R抗体进行结合。结合实验全部进行至少两次。平均EC50表示达到最大结合50％所需的抗体浓度。
序列表
<110>安美基公司
<120>IL-18受体抗原结合蛋白
<130>3946/5001
<150>60/951,691
<151>2007-07-24
<150>60/951,692
<151>2007-07-24
<150>61/073,142
<151>2008-06-17
<160>292
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>122
<212>PRT
<213>智人
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<213>智人
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<213>智人
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<213>智人
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<213>智人
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<213>智人
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Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Thr His Ser Leu Ser Thr
85 90 95
Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210>23
<211>106
<212>PRT
<213>智人
<400>23
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Arg Asn Ser Asn Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Thr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
100 105
<210>24
<211>111
<212>PRT
<213>智人
<400>24
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Arg Asn Ser Asn Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Thr Val Thr Trp Tyr Glm Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Val Trp Asp Asp Val Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210>25
<211>111
<212>PRT
<213>智人
<400>25
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Arg Asn Ser Asn Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Thr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Val Trp Asp Asp Lys Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210>26
<211>111
<212>PRT
<213>智人
<400>26
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Arg Asn Ser Asn Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Thr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Val Trp Asp Glu Ile Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210>27
<211>103
<212>PRT
<213>智人
<400>27
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Ser
35 40 45
Ala Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Asn His Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
100
<210>28
<211>111
<212>PRT
<213>智人
<400>28
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Arg Asn Ser Asn Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Thr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Val Trp Asp Asp Val Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
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<211>108
<212>PRT
<213>智人
<400>29
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Ttr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Ser
35 40 45
Ala Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Asn Gly Trp Asn His Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210>30
<211>108
<212>PRT
<213>智人
<400>30
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Val Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Ser
35 40 45
Ala Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Asn Gly Trp Asn His Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210>31
<211>108
<212>PRT
<213>智人
<400>31
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Ser
35 40 45
Ala Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Asn Gly Trp Asn His Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210>32
<211>108
<212>PRT
<213>智人
<400>32
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Val Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val IIe Ser
35 40 45
Ala Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Asn Gly Trp Asn His Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210>33
<211>108
<212>PRT
<213>智人
<400>33
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Ser
35 40 45
Ala Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Arg Asn Gly Trp Asn His Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210>34
<211>108
<212>PRT
<213>智人
<400>34
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Val Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Ser
35 40 45
Ala Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Arg Asn Gly Trp Asn His Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210>35
<211>366
<212>DNA
<213>智人
<400>35
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagc ggttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagta atatcaaatg atggaagtaa gaaatattat 180
tcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaaaaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agctgaggac acggctgtat attactgtgc gaaagggtcc 300
agttccatat ggctgaccca gtccctggac cactgggggc aggggaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210>36
<211>366
<212>DNA
<213>智人
<400>36
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagc ggttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagta atatcaaatg atggaagtaa gaaatattat 180
tcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaaaaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agctgaggac acggctgtat attactgtgc gaaagggtcc 300
agttccatat ggctgaccca gtccctggac cactgggggc aggggaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210>37
<211>366
<212>DNA
<213>智人
<400>37
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagc ggttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagta atatcaaatg atggaagtaa gaaatattat 180
tcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaaaaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agctgaggac acggctgtat attactgtgc gaaagggtcc 300
agttccatat ggctgtcgca gtccctggac ggctgggggc aggggaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210>38
<211>366
<212>DNA
<213>智人
<400>38
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagc ggttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagta atatcaaatg atggaagtaa gaaatattat 180
tcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaaaaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agctgaggac acggctgtat attactgtgc gaaagggtcc 300
agttccatat ggctgtcgca gtccctggac ggctgggggc aggggaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210>39
<211>366
<212>DNA
<213>智人
<400>39
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagc ggttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagta atatcaaatg atggaagtaa gaaatattat 180
tcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaaaaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agctgaggac acggctgtat attactgtgc gaaagggtcc 300
agttccatat ggctgacctc ggccctgaac ctgtgggggc aggggaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210>40
<211>366
<212>DNA
<213>智人
<400>40
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagc ggttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagta atatcaaatg atggaagtaa gaaatattat 180
tcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaaaaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agctgaggac acggctgtat attactgtgc gaaagggtcc 300
agttccatat ggctgacctc ggccctgaac ctgtgggggc aggggaccac ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210>41
<211>351
<212>DNA
<213>智人
<400>41
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagc ggttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagta atatcaaatg atggaagtaa gaaatattat 180
tcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaaaaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agctgaggac acggctatat attactgtgc gaaagggtcc 300
agttccatat ggttcgggga gaccgttgac tactgggggc aggggaccac g 351
<210>42
<211>363
<212>DNA
<213>智人
<400>42
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg tttccggata caccctcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcgtg aagatgatga aacaatccac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac 240
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atggtgtggg gcgatttttg gatccagcac tggggccagg ggacactggt caccgtctcc 360
tca 363
<210>43
<211>363
<212>DNA
<213>智人
<400>43
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg tttccggata caccctcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcgtg aagatgatga aacaatccac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac 240
atggaactga gcagcctgcg atctgaggac acggccgttt attactgtgc aacagatctt 300
atggtgtggg gcgatttttg gatccagcac tggggccagg ggacactggt caccgtctcc 360
tca 363
<210>44
<211>363
<212>DNA
<213>智人
<400>44
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg tttccggata caccctcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcgtg aagatgatga aacaatccac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac 240
atggaactga gcagcctgcg atctgaggac acggccgttt attactgtgc aacagatctt 300
atggcctggg actacccgcc catccagcac tggggccagg ggacactggt caccgtctcc 360
tca 363
<210>45
<211>363
<212>DNA
<213>智人
<400>45
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg tttccggata caccctcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcgtg aagatgatga aacaatccac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac 240
atggaactga gcagcctgcg atctgaggac acggccgttt attactgtgc aacagatctt 300
atggtgtgga acttcccccc catccagcac tggggccagg ggacactggt caccgtctcc 360
tca 363
<210>46
<211>348
<212>DNA
<213>智人
<400>46
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg tttccggata caccctcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120
cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcgtg aagatgatga aacaatccac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac 240
atggaactga gcagcctgcg atctgaggac acggccgttt attactgtgc aacagatctt 300
atggtgtggg gcgatttttg gatccagcac tggggcaagg ggacaatg 348
<210>47
<211>354
<212>DNA
<213>智人
<400>47
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtgg cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaattcgg 300
ggcgactacc ggacggacat ctggggccag ggaaccacgg tcaccgtctc ctca 354
<210>48
<211>354
<212>DNA
<213>智人
<400>48
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtgg cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gtccaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaattcgg 300
ggggactacc ggacggacat ctggggccgg ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210>49
<211>354
<212>DNA
<213>智人
<400>49
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggcacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctgggtt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagttcgg 300
ggggactacc ggacggacat ctggggccgg ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210>50
<211>354
<212>DNA
<213>智人
<400>50
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctagatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagttcgg 300
ggggactacc ggacggacat ctggggccgg ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210>51
<211>339
<212>DNA
<213>智人
<400>51
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctagatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagttcgg 300
ggcatatacg gtatggacgt ctggggccgg ggaaccctg 339
<210>52
<211>309
<212>DNA
<213>智人
<400>52
cagcctgtgc tgactcagcc cccctcagtg tccgtgtccc caggacagac tgccagcatc 60
acctgctctg gagataaatt gggggataaa tatgcttcct ggtatcagca gaagccaggc 120
aagtcccctg tactggtcat ctatcaagat tccaatcggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctagg 240
gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg gacagcagca ctgcatcggt gttcggcgga 300
gggaccaag 309
<210>53
<211>324
<212>DNA
<213>智人
<400>53
cagcctgtgc tgactcagcc cccctcagtg tccgtgtccc caggacagac tgccagcatc 60
acctgctctg gagataaatt gggggataaa tatgcttcct ggtatcagca gaagccaggc 120
aagtcccctg tactggtcat ctatcaagat tccaatcggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctagg 240
gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg gaccactcct tgcagcacag gttcggcgga 300
gggaccaagg tcaccgtcct aggt 324
<210>54
<211>324
<212>DNA
<213>智人
<400>54
cagcctgtgc tgactcagcc cccctcagtg tccgtgtccc caggacagac tgccagcatc 60
acctgctctg gagataaatt gggggataaa tatgcttcct ggtatcagca gaagccaggc 120
cagacccctg tactggtcat ctatcaagat tccaatcggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctggct ccaactccgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctagg 240
gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg accagcgccc tgaactcgca gttcggcgga 300
gggaccaagg tcaccgtcct aggt 324
<210>55
<211>324
<212>DNA
<213>智人
<400>55
cagcctgtgc tgactcagcc cccctcagtg tccgtgtccc caggacagac tgccagcatc 60
acctgctctg gagataaatt gggggataaa tatgcttcct ggtatcagca gaagccaggc 120
cagtcccctg tactggtcat ctatcaagat tccaatcggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctggct ccaactctgg ggacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctagg 240
gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg acgcactccc tcagcacgtt gttcggcgga 300
gggaccaagg tcaccgtcct aggt 324
<210>56
<211>324
<212>DNA
<213>智人
<400>56
tcctatgagc tgactcagcc cccctcagtg tccgtgtccc caggacagac tgccagcatc 60
acctgctctg gagataaatt gggggataaa tatgcttcct ggtatcagca gaagccaggc 120
cagtcccctg tactggtcat ctatcaagat tccaatcggc cctcagggat ccctgagcga 180
ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240
gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg acccacagcc tgagcacgtt gttcggcgga 300
gggaccaagc tgaccgtcct aggt 324
<210>57
<211>318
<212>DNA
<213>智人
<400>57
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaaggaactc caacatcgga agttatactg taacctggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaatagtc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct caggctccaa gtctggcacc tcagcctcct tggccatcag tgggctccag 240
tctgaagatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggcccggtg 300
ttcggcggag ggaccaag 318
<210>58
<211>333
<212>DNA
<213>智人
<400>58
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaaggaactc caacatcgga agttatactg taacctggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaatagtc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct caggctccaa gtctggcacc tcagcctcct tggccatcag tgggctccag 240
tctgaagatg aggctgatta ttactgtgtg gtgtgggatg acgtgctgaa tggcccggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333
<210>59
<211>333
<212>DNA
<213>智人
<400>59
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaaggaactc caacatcgga agttatactg taacctggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaatagtc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct caggctccaa gtctggcacc tcagcctcct tggccatcag tgggctccag 240
tctgaagatg aggctgatta ttacttggtc gtgtgggatg acaagctgaa tggcccggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333
<210>60
<211>333
<212>DNA
<213>智人
<400>60
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaaggaactc caacatcgga agttatactg taacctggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaatagtc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct caggctccaa gtctggcacc tcagcctcct tggccatcag tgggctccag 240
tctgaagatg aggctgatta ttactgtgtg gtgtgggacg agatcctgaa tggcccggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333
<210>61
<211>309
<212>DNA
<213>智人
<400>61
tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60
acatgccaag gagacagcct cagaagctat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120
caggcccctg tacttgtcat ctctgctaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180
ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240
gatgaagctg actattactg taactcccgg gacagcagta accatgtggt attcggcgga 300
gggaccaag 309
<210>62
<211>333
<212>DNA
<213>智人
<400>62
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaaggaactc caacatcgga agttatactg taacctggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaatagtc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct caggctccaa gtctggcacc tcagcctcct tggccatcag tgggctccag 240
tctgaagatg aggctgatta ttactgtctc gtgtgggacg acgtcctgaa tggcccggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333
<210>63
<211>324
<212>DNA
<213>智人
<400>63
tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60
acatgccaag gagacagcct cagaagctat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120
caggcccctg tacttgtcat ctctgctaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180
ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240
gatgaggctg actattactg tgcgtcccgg aacggctgga accatgtggt attcggcgga 300
gggaccaagc tgaccgtcct aggt 324
<210>64
<211>324
<212>DNA
<213>智人
<400>64
tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcagggtc 60
acatgccaag gagacagcct cagaagctat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120
caggcccctg tacttgtcat ctctgctaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180
ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240
gatgaggctg actattactg tgcgtcccgg aacggctgga accatgtggt attcggcgga 300
gggaccaagc tgaccgtcct aggt 324
<210>65
<211>324
<212>DNA
<213>智人
<400>65
tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60
acatgccaag gagacagcct cagaagctat tatgcaagct ggtaccagca gaagccagga 120
caggcccctg tacttgtcat ctctgctaaa aacaaccggc cctcagggat cccagaccga 180
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gatgaggctg actattactg tgcgtcccgg aacggctgga accatgtggt attcggcgga 300
gggaccaagc tgaccgtcct aggt 324
<210>66
<211>324
<212>DNA
<213>智人
<400>66
tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcagggtc 60
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ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240
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gggaccaagc tgaccgtcct aggt 324
<210>67
<211>324
<212>DNA
<213>智人
<400>67
tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcaggatc 60
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ttctctggct ccagctcagg aaacacagct tccttgacca tcactggggc tcaggcggaa 240
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<210>68
<211>324
<212>DNA
<213>智人
<400>68
tcgtctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct tgggacagac agtcagggtc 60
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<210>69
<211>541
<212>PRT
<213>智人
<400>69
Met Asn Cys Arg Glu Leu Pro Leu Thr Leu Trp Val Leu Ile Ser Val
1 5 10 15
Ser Thr Ala Glu Ser Cys Thr Ser Arg Pro His Ile Thr Val Val Glu
20 25 30
Gly Glu Pro Phe Tyr Leu Lys His Cys Ser Cys Ser Leu Ala His Glu
35 40 45
Ile Glu Thr Thr Thr Lys Ser Trp Tyr Lys Ser Ser Gly Ser Gln Glu
50 55 60
His Val Glu Leu Asn Pro Arg Ser Ser Ser Arg Ile Ala Leu His Asp
65 70 75 80
Cys Val Leu Glu Phe Trp Pro Val Glu Leu Asn Asp Thr Gly Ser Tyr
85 90 95
Phe Phe Gln Met Lys Asn Tyr Thr Gln Lys Trp Lys Leu Asn Va Ile
100 105 110
Arg Arg Asn Lys His Ser Cys Phe Thr Glu Arg Gln Val Thr Ser Lys
115 120 125
Ile Val Glu Val Lys Lys Phe Phe Gln Ile Thr Cys Glu Asn Ser Tyr
130 135 140
Tyr Gln Thr Leu Val Asn Ser Thr Ser Leu Tyr Lys Asn Cys Lys Lys
145 150 155 160
Leu Leu Leu Glu Asn Asn Lys Asn Pro Thr Ile Lys Lys Asn Ala Glu
165 170 175
Phe Glu Asp Gln Gly Tyr Tyr Ser Cys Val His Phe Leu His His Asn
180 185 190
Gly Lys Leu Phe Asn Ile Thr Lys Thr Phe Asn Ile Thr Ile Val Glu
195 200 205
Asp Arg Ser Asn Ile Val Pro Val Leu Leu Gly Pro Lys Leu Asn His
210 215 220
Val Ala Val Glu Leu Gly Lys Asn Val Arg Leu Asn Cys Ser Ala Leu
225 230 235 240
Leu Asn Glu Glu Asp Val Ile Tyr Trp Met Phe Gly Glu Glu Asn Gly
245 250 255
Ser Asp Pro Asn Ile His Glu Glu Lys Glu Met Arg Ile Met Thr Pro
260 265 270
Glu Gly Lys Trp His Ala Ser Lys Val Leu Arg Ile Glu Asn Ile Gly
275 280 285
Glu Ser Asn Leu Asn Val Leu Tyr Asn Cys Thr Val Ala Ser Thr Gly
290 295 300
Gly Thr Asp Thr Lys Ser Phe Ile Leu Val Arg Lys Ala Asp Met Ala
305 310 315 320
Asp Ile Pro Gly His Val Phe Thr Arg Gly Met Ile Ile Ala Val Leu
325 330 335
Ile Leu Val Ala Val Val Cys Leu Val Thr Val Cys Val Ile Tyr Arg
340 345 350
Val Asp Leu Val Leu Phe Tyr Arg His Leu Thr Arg Arg Asp Glu Thr
355 360 365
Leu Thr Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ala Phe Val Ser Tyr Leu Lys Glu
370 375 380
Cys Arg Pro Glu Asn Gly Glu Glu His Thr Phe Ala Val Glu Ile Leu
385 390 395 400
Pro Arg Val Leu Glu Lys His Phe Gly Tyr Lys Leu Cys Ile Phe Glu
405 410 415
Arg Asp Val Val Pro Gly Gly Ala Val Val Asp Glu Ile His Ser Leu
420 425 430
Ile Glu Lys Ser Arg Arg Leu Ile Ile Val Leu Ser Lys Ser Tyr Met
435 440 445
Ser Asn Glu Val Arg Tyr Glu Leu Glu Ser Gly Leu His Glu Ala Leu
450 455 460
Val Glu Arg Lys Ile Lys Ile Ile Leu Ile Glu Phe Thr Pro Val Thr
465 470 475 480
Asp Phe Thr Phe Leu Pro Gln Ser Leu Lys Leu Leu Lys Ser His Arg
485 490 495
Val Leu Lys Trp Lys Ala Asp Lys Ser Leu Ser Tyr Asn Ser Arg Phe
500 505 510
Trp Lys Asn Leu Leu Tyr Leu Met Pro Ala Lys Thr Val Lys Pro Gly
515 520 525
Arg Asp Glu Pro Glu Val Leu Pro Val Leu Ser Glu Ser
530 535 540
<210>70
<211>1626
<212>DNA
<213>智人
<400>70
atgaattgta gagaattacc cttgaccctt tgggtgctta tatctgtaag cactgcagaa 60
tcttgtactt cacgtcccca cattactgtg gttgaagggg aacctttcta tctgaaacat 120
tgctcgtgtt cacttgcaca tgagattgaa acaaccacca aaagctggta caaaagcagt 180
ggatcacagg aacatgtgga gctgaaccca aggagttcct cgagaattgc tttgcatgat 240
tgtgttttgg agttttggcc agttgagttg aatgacacag gatcttactt tttccaaatg 300
aaaaattata ctcagaaatg gaaattaaat gtcatcagaa gaaataaaca cagctgtttc 360
actgaaagac aagtaactag taaaattgtg gaagttaaaa aattttttca gataacctgt 420
gaaaacagtt actatcaaac actggtcaac agcacatcat tgtataagaa ctgtaaaaag 480
ctactactgg agaacaataa aaacccaacg ataaagaaga acgccgagtt tgaagatcag 540
gggtattact cctgcgtgca tttccttcat cataatggaa aactatttaa tatcaccaaa 600
accttcaata taacaatagt ggaagatcgc agtaatatag ttccggttct tcttggacca 660
aagcttaacc atgttgcagt ggaattagga aaaaacgtaa ggctcaactg ctctgctttg 720
ctgaatgaag aggatgtaat ttattggatg ttcggggaag aaaatggatc ggatcctaat 780
atacatgaag agaaagaaat gagaattatg actccagaag gcaaatggca tgcttcaaaa 840
gtattgagaa ttgaaaatat tggtgaaagc aatctaaatg ttttatataa ttgcactgtg 900
gccagcacgg gaggcacaga caccaaaagc ttcatcttgg tgagaaaagc agacatggct 960
gatatcccag gccacgtctt cacaagagga atgatcatag ctgttttgat cttggtggca 1020
gtagtgtgcc tagtgactgt gtgtgtcatt tatagagttg acttggttct attttataga 1080
catttaacga gaagagatga aacattaaca gatggaaaaa catatgatgc ttttgtgtct 1140
tacctaaaag aatgccgacc tgaaaatgga gaggagcaca cctttgctgt ggagattttg 1200
cccagggtgt tggagaaaca ttttgggtat aagttatgca tatttgaaag ggatgtagtg 1260
cctggaggag ctgttgttga tgaaatccac tcactgatag agaaaagccg aagactaatc 1320
attgtcctaa gtaaaagtta tatgtctaat gaggtcaggt atgaacttga aagtggactc 1380
catgaagcat tggtggaaag aaaaattaaa ataatcttaa ttgaatttac acctgttact 1440
gacttcacat tcttgcccca atcactaaag cttttgaaat ctcacagagt tctgaagtgg 1500
aaggccgata aatctctttc ttataactca aggttctgga agaaccttct ttacttaatg 1560
cctgcaaaaa cagtcaagcc aggtagagac gaaccggaag tcttgcctgt tctttccgag 1620
tcttaa 1626
<210>71
<211>599
<212>PRT
<213>智人
<400>71
Met Leu Cys Leu Gly Trp Ile Phe Leu Trp Leu Val Ala Gly Glu Arg
1 5 10 15
Ile Lys Gly Phe Asn Ile Ser Gly Cys Ser Thr Lys Lys Leu Leu Trp
20 25 30
Thr Tyr Ser Thr Arg Ser Glu Glu Glu Phe Val Leu Phe Cys Asp Leu
35 40 45
Pro Glu Pro Gln Lys Ser His Phe Cys His Arg Asn Arg Leu Ser Pro
50 55 60
Lys Gln Val Pro Glu His Leu Pro Phe Met Gly Ser Asn Asp Leu Ser
65 70 75 80
Asp Val Gln Trp Tyr Gln Gln Pro Ser Asn Gly Asp Pro Leu Glu Asp
85 90 95
Ile Arg Lys Ser Tyr Pro His Ile Ile Gln Asp Lys Cys Thr Leu His
100 105 110
Phe Leu Thr Pro Gly Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Ile Cys Arg Pro
115 120 125
Lys Met Ile Lys Ser Pro Tyr Asp Val Ala Cys Cys Val Lys Met Ile
130 135 140
Leu Glu Val Lys Pro Gln Thr Asn Ala Ser Cys Glu Tyr Ser Ala Ser
145 150 155 160
His Lys Gln Asp Leu Leu Leu Gly Ser Thr Gly Ser Ile Ser Cys Pro
165 170 175
Ser Leu Ser Cys Gln Ser Asp Ala Gln Ser Pro Ala Val Thr Trp Tyr
180 185 190
Lys Asn Gly Lys Leu Leu Ser Val Glu Arg Ser Asn Arg Ile Val Val
195 200 205
Asp Glu Val Tyr Asp Tyr His Gln Gly Thr Tyr Val Cys Asp Tyr Thr
210 215 220
Gln Ser Asp Thr Val Ser Ser Trp Thr Val Arg Ala Val Val Gln Val
225 230 235 240
Arg Thr Ile Val Gly Asp Thr Lys Leu Lys Pro Asp Ile Leu Asp Pro
245 250 255
Val Glu Asp Thr Leu Glu Val Glu Leu Gly Lys Pro Leu Thr Ile Ser
260 265 270
Cys Lys Ala Arg Phe Gly Phe Glu Arg Val Phe Asn Pro Val Ile Lys
275 280 285
Trp Tyr Ile Lys Asp Ser Asp Leu Glu Trp Glu Val Ser Val Pro Glu
290 295 300
Ala Lys Ser Ile Lys Ser Thr Leu Lys Asp Glu Ile Ile Glu Arg Asn
305 310 315 320
Ile Ile Leu Glu Lys Val Thr Gln Arg Asp Leu Arg Arg Lys Phe Val
325 330 335
Cys Phe Val Gln Asn Ser Ile Gly Asn Thr Thr Gln Ser Val Gln Leu
340 345 350
Lys Glu Lys Arg Gly Val Val Leu Leu Tyr Ile Leu Leu Gly Thr Ile
355 360 365
Gly Thr Leu Val Ala Val Leu Ala Ala Ser Ala Leu Leu Tyr Arg His
370 375 380
Trp Ile Glu Ile Val Leu Leu Tyr Arg Thr Tyr Gln Ser Lys Asp Gln
385 390 395 400
Thr Leu Gly Asp Lys Lys Asp Phe Asp Ala Phe Val Ser Tyr Ala Lys
405 410 415
Trp Ser Ser Phe Pro Ser Glu Ala Thr Ser Ser Leu Ser Glu Glu His
420 425 430
Leu Ala Leu Ser Leu Phe Pro Asp Val Leu Glu Asn Lys Tyr Gly Tyr
435 440 445
Ser Leu Cys Leu Leu Glu Arg Asp Val Ala Pro Gly Gly Val Tyr Ala
450 455 460
Glu Asp Ile Val Ser Ile Ile Lys Arg Ser Arg Arg Gly Ile Phe Ile
465 470 475 480
Leu Ser Pro Asn Tyr Val Asn Gly Pro Ser Ile Phe Glu Leu Gln Ala
485 490 495
Ala Val Asn Leu Ala Leu Asp Asp Gln Thr Leu Lys Leu Ile Leu Ile
500 505 510
Lys Phe Cys Tyr Phe Gln Glu Pro Glu Ser Leu Pro His Leu Val Lys
515 520 525
Lys Ala Leu Arg Val Leu Pro Thr Val Thr Trp Arg Gly Leu Lys Ser
530 535 540
Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Trp Ala Lys Met Arg Tyr His Met Pro
545 550 555 560
Val Lys Asn Ser Gln Gly Phe Thr Trp Asn Gln Leu Arg Ile Thr Ser
565 570 575
Arg Ile Phe Gln Trp Lys Gly Leu Ser Arg Thr Glu Thr Thr Gly Arg
580 585 590
Ser Ser Gln Pro Lys Glu Trp
595
<210>72
<211>1800
<212>DNA
<213>智人
<400>72
atgctctgtt tgggctggat atttctttgg cttgttgcag gagagcgaat taaaggattt 60
aatatttcag gttgttccac aaaaaaactc ctttggacat attctacaag gagtgaagag 120
gaatttgtct tattttgtga tttaccagag ccacagaaat cacatttctg ccacagaaat 180
cgactctcac caaaacaagt ccctgagcac ctgcccttca tgggtagtaa cgacctatct 240
gatgtccaat ggtaccaaca accttcgaat ggagatccat tagaggacat taggaaaagc 300
tatcctcaca tcattcagga caaatgtacc cttcactttt tgaccccagg ggtgaataat 360
tctgggtcat atatttgtag acccaagatg attaagagcc cctatgatgt agcctgttgt 420
gtcaagatga ttttagaagt taagccccag acaaatgcat cctgtgagta ttccgcatca 480
cataagcaag acctacttct tgggagcact ggctctattt cttgccccag tctcagctgc 540
caaagtgatg cacaaagtcc agcggtaacc tggtacaaga atggaaaact cctctctgtg 600
gaaaggagca accgaatcgt agtggatgaa gtttatgact atcaccaggg cacatatgta 660
tgtgattaca ctcagtcgga tactgtgagt tcgtggacag tcagagctgt tgttcaagtg 720
agaaccattg tgggagacac taaactcaaa ccagatattc tggatcctgt cgaggacaca 780
ctggaagtag aacttggaaa gcctttaact attagctgca aagcacgatt tggctttgaa 840
agggtcttta accctgtcat aaaatggtac atcaaagatt ctgacctaga gtgggaagtc 900
tcagtacctg aggcgaaaag tattaaatcc actttaaagg atgaaatcat tgagcgtaat 960
atcatcttgg aaaaagtcac tcagcgtgat cttcgcagga agtttgtttg ctttgtccag 1020
aactccattg gaaacacaac ccagtccgtc caactgaaag aaaagagagg agtggtgctc 1080
ctgtacatcc tgcttggcac catcgggacc ctggtggccg tgctggcggc gagtgccctc 1140
ctctacaggc actggattga aatagtgctg ctgtaccgga cctaccagag caaggatcag 1200
acgcttgggg ataaaaagga ttttgatgct ttcgtatcct atgcaaaatg gagctctttt 1260
ccaagtgagg ccacttcatc tctgagtgaa gaacacttgg ccctgagcct atttcctgat 1320
gttttagaaa acaaatatgg atatagcctg tgtttgcttg aaagagatgt ggctccagga 1380
ggagtgtatg cagaagacat tgtgagcatt attaagagaa gcagaagagg aatatttatc 1440
ttgagcccca actatgtcaa tggacccagt atctttgaac tacaagcagc agtgaatctt 1500
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gagtctctac ctcatctcgt gaaaaaagct ctcagggttt tgcccacagt tacttggaga 1620
ggcttaaaat cagttcctcc caattctagg ttctgggcca aaatgcgcta ccacatgcct 1680
gtgaaaaact ctcagggatt cacgtggaac cagctcagaa ttacctctag gatttttcag 1740
tggaaaggac tcagtagaac agaaaccact gggaggagct cccagcctaa ggaatggtga 1800
<210>73
<211>467
<212>PRT
<213>智人
<400>73
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
1 5 10 15
Gly Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Gly Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Asn Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ser
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Ser Ser Ser Ile Trp Leu Thr Ser Ala Leu
115 120 125
Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
145 150 155 160
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys
210 215 220
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu
225 230 235 240
Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210>74
<211>1427
<212>DNA
<213>智人
<400>74
gtcgacgccg ccaccatggg gtcaaccgcc atccttggcc tcctcctggc tgtcctgcag 60
ggagggcgcg ccgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcgtggtcca gcctgggagg 120
tccctgagac tctcctgtgc agcgtctgga ttcaccttca gcggttatgg catgcactgg 180
gtccgccagg ctccaggcaa ggggctggag tgggtggcag taatatcaaa tgatggaagt 240
aagaaatatt attcagactc cgtgaagggc cgattcacca tctccagaga caattccaaa 300
aacacgctgt atctgcagat gaacagcctg agagctgagg acacggctgt atattactgt 360
gcgaaagggt ccagttccat atggctgacc tcggccctga acctgtgggg gcaggggacc 420
acggtcaccg tctcctcagc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcgccctgc 480
tccaggagca cctccgagag cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 540
gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gctctgacca gcggcgtgca caccttccca 600
gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 660
aacttcggca cccagaccta cacctgcaac gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg 720
gacaagacag ttgagcgcaa atgttgtgtc gagtgcccac cgtgcccagc accacctgtg 780
gcaggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840
acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccccga ggtccagttc 900
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccacg ggaggagcag 960
ttcaacagca cgttccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgttg tgcaccagga ctggctgaac 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080
atctccaaaa ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacacct 1260
cccatgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatgag cggccgc 1427
<210>75
<211>233
<212>PRT
<213>智人
<400>75
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val
20 25 30
Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg
35 40 45
Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val
50 55 60
Leu Val Ile Ser Ala Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly
85 90 95
Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Asn Gly
100 105 110
Trp Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
115 120 125
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
130 135 140
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
165 170 175
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
180 185 190
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
195 200 205
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
210 215 220
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230
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<211>733
<212>DNA
<213>智人
<400>76
gtcgacgttt aaacgccgcc accatggaga cagacacact cctgctatgg gtactgctgc 60
tctgggttcc aggttccact ggttcgtctg agctgactca ggaccctgct gtgtctgtgg 120
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gctggtacca gcagaagcca ggacaggccc ctgtacttgt catctctgct aaaaacaacc 240
ggccctcagg gatcccagac cgattctctg gctccagctc aggaaacaca gcttccttga 300
ccatcactgg ggctcaggcg gaagatgagg ctgactatta ctgtgcgtcc cggaacggct 360
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gctgccaggt cacgcatgaa gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt 720
cataggcggc cgc 733
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<212>PRT
<213>智人
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Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
1 5 10 15
Gly Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Gly Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Asn Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ser
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
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Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Ser Ser Ser Ile Trp Leu Ser Gln Ser Leu
115 120 125
Asp Gly Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
145 150 155 160
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys
210 215 220
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu
225 230 235 240
Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro GluAsn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
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<212>DNA
<213>智人
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atggggtcaa ccgccatcct tggcctcctc ctggctgtcc tgcagggagg gcgcgccgag 60
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tccatatggc tgtcgcagtc cctggacggc tgggggcagg ggaccacggt caccgtctcc 420
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gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540
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tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcaactt cggcacccag 660
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cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg accgtcagtc 780
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tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cacctcccat gctggactcc 1260
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320
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ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404
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<211>233
<212>PRT
<213>智人
<400>79
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val
20 25 30
Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg
35 40 45
Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val
50 55 60
Leu Val Ile Ser Ala Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly
85 90 95
Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Asn Gly
100 105 110
Trp Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
115 120 125
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
130 135 140
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
165 170 175
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
180 185 190
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
195 200 205
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
210 215 220
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230
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<211>710
<212>DNA
<213>智人
<400>80
atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
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<211>466
<212>PRT
<213>智人
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Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
1 5 10 15
Gly Arg Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu
35 40 45
Thr Glu Leu Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Gly Phe Asp Arg Glu Asp Asp Glu Thr Ile His Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser GluAsp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Thr Asp Leu Met Val Trp Gly Asp Phe Trp Ile Gln
115 120 125
His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
145 150 155 160
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
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Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
210 215 220
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
225 230 235 240
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
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<211>1401
<212>DNA
<213>智人
<400>82
atggggtcaa ccgccatcct tggcctcctc ctggctgtcc tgcagggagg gcgcgcccag 60
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gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 480
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ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 840
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gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1020
aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 1080
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140
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gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 1260
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320
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<212>PRT
<213>智人
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Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
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Ser Asn Ile Gly Ser Tyr Thr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu
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Val Trp Asp Glu Ile Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys
145 150 155 160
Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala
165 170 175
Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys
180 185 190
Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro
195 200 205
Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu
210 215 220
Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
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<212>DNA
<213>智人
<400>84
atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gctagccagt ctgtgctgac tcagccaccc tcagcgtctg ggacccccgg gcagagggtc 120
accatctctt gttctggaag gaactccaac atcggaagtt atactgtaac ctggtaccag 180
cagctcccag gaacggcccc caaactcctc atctatagta atagtcagcg gccctcaggg 240
gtccctgacc gattctcagg ctccaagtct ggcacctcag cctccttggc catcagtggg 300
ctccagtctg aagatgaggc tgattattac tgtgtggtgt gggacgagat cctgaatggc 360
ccggtgttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggcc aaccgaaagc ggcgccctcg 420
gtcactctgt tcccgccctc ctctgaggag cttcaagcca acaaggccac actggtgtgt 480
ctcataagtg acttctaccc gggagccgtg acagtggcct ggaaggcaga tagcagcccc 540
gtcaaggcgg gagtggagac caccacaccc tccaaacaaa gcaacaacaa gtacgcggcc 600
agcagctatc tgagcctgac gcctgagcag tggaagtccc acagaagcta cagctgccag 660
gtcacgcatg aagggagcac cgtggagaag acagtggccc ctacagaatg ttcatag 717
<210>85
<211>466
<212>PRT
<213>智人
<400>85
Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly
1 5 10 15
Gly Arg Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu
35 40 45
Thr Glu Leu Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Gly Phe Asp Arg Glu Asp Asp Glu Thr Ile His Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp
85 90 95
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100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Thr Asp Leu Met Val Trp Asn Phe Pro Pro Ile Gln
115 120 125
His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
145 150 155 160
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
210 215 220
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
225 230 235 240
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
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<211>1401
<212>DNA
<213>智人
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atggggtcaa ccgccatcct tggcctcctc ctggctgtcc tgcagggagg gcgcgcccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120
tgcaaggttt ccggatacac cctcactgaa ttatccatgc actgggtgcg acaggctcct 180
ggaaaagggc ttgagtggat gggaggtttt gatcgtgaag atgatgaaac aatccacgca 240
cagaagttcc agggcagagt caccatgacc gaggacacat ctacagacac agcctacatg 300
gaactgagca gcctgcgatc tgaggacacg gccgtttatt actgtgcaac agatcttatg 360
gtgtggaact tcccccccat ccagcactgg ggccagggga cactggtcac cgtctcctca 420
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 480
agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 660
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 720
aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 780
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 840
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 900
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 960
gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1020
aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 1080
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 1260
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380
tccctgtctc cgggtaaatg a 1401
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<212>PRT
<213>智人
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Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ala Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
20 25 30
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Arg Asn
35 40 45
Ser Asn Ile Gly Ser Tyr Thr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly
50 55 60
Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu
85 90 95
Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val
100 105 110
Val Trp Asp Asp Val Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys
145 150 155 160
Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala
165 170 175
Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys
180 185 190
Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro
195 200 205
Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu
210 215 220
Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230 235
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<212>DNA
<213>智人
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atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gctagccagt ctgtgctgac tcagccaccc tcagcgtctg ggacccccgg gcagagggtc 120
accatctctt gttctggaag gaactccaac atcggaagtt atactgtaac ctggtaccag 180
cagctcccag gaacggcccc caaactcctc atctatagta atagtcagcg gccctcaggg 240
gtccctgacc gattctcagg ctccaagtct ggcacctcag cctccttggc catcagtggg 300
ctccagtctg aagatgaggc tgattattac tgtgtggtgt gggatgacgt gctgaatggc 360
ccggtgttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggcc aaccgaaagc ggcgccctcg 420
gtcactctgt tcccgccctc ctctgaggag cttcaagcca acaaggccac actggtgtgt 480
ctcataagtg acttctaccc gggagccgtg acagtggcct ggaaggcaga tagcagcccc 540
gtcaaggcgg gagtggagac caccacaccc tccaaacaaa gcaacaacaa gtacgcggcc 600
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gtcacgcatg aagggagcac cgtggagaag acagtggccc ctacagaatg ttcatag 717
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<211>5
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Gly Tyr Gly Met His
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<212>PRT
<213>智人
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Gly Arg
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<212>PRT
<213>智人
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Ser Ser Ser Ile Trp Leu Thr Gln Ser Leu Asp His
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Gly Tyr Gly Met His
1 5
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<212>PRT
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Val Ile Ser Asn Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg
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<211>12
<212>PRT
<213>智人
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Ser Ser Ser Ile Trp Leu Thr Gln Ser Leu Asp His
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<213>智人
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Gly Tyr Gly Met His
1 5
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<212>PRT
<213>智人
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Val Ile Ser Asn Asp Gly Ser Lys Tys Tyr Ser Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg
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<211>12
<212>PRT
<213>智人
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Ser Ser Ser Ile Trp Leu Ser Gln Ser Leu Asp Gly
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Gly Tyr Gly Met His
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<213>智人
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Gly Arg
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<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>100
Ser Ser Ser Ile Trp Leu Ser Gln Ser Leu Asp Gly
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Gly Tyr Gly Met His
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<213>智人
<400>102
Val Ile Ser Asn Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg
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<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>103
Ser Ser Ser Ile Trp Leu Ser Gln Ser Leu Asp Gly
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<212>PRT
<213>智人
<400>104
Gly Tyr Gly Met His
1 5
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<212>PRT
<213>智人
<400>105
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Gly Arg
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<211>12
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<213>智人
<400>106
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<213>智人
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1 5
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<212>PRT
<213>智人
<400>108
Val Ile Ser Asn Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg
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<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>109
Ser Ser Ser Ile Trp Phe Gly Glu Thr Val Asp Tyr
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<210>110
<211>5
<212>PRT
<213>智人
<400>110
Glu Leu Ser Met His
1 5
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<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>111
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1 5 10 15
Gly Arg
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<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>112
Leu Met Val Trp Gly Asp Phe Trp Ile Gln His
1 5 10
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<211>5
<212>PRT
<213>智人
<400>113
Glu Leu Ser Met His
1 5
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<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>114
Gly Phe Asp Arg Glu Asp Asp Glu Thr Ile His Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Arg
<210>115
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>115
Leu Met Val Trp Gly Asp Phe Trp Ile Gln His
1 5 10
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<211>5
<212>PRT
<213>智人
<400>116
Glu Leu Ser Met His
1 5
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<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>117
Gly Phe Asp Arg Glu Asp Asp Glu Thr Ile His Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Arg
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<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>118
Leu Met Ala Trp Asp Tyr Pro Pro Ile Gln His
1 5 10
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<212>PRT
<213>智人
<400>119
Glu Leu Ser Met His
1 5
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<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>120
Gly Phe Asp Arg Glu Asp Asp Glu Thr Ile His Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Arg
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<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>121
Leu Met Val Trp Asn Phe Pro Pro Ile Gln His
1 5 10
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<211>5
<212>PRT
<213>智人
<400>122
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<212>PRT
<213>智人
<400>123
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Gly Arg
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<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>124
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1 5 10
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<211>5
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<213>智人
<400>126
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Gly Arg
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<212>PRT
<213>智人
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1 5
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<212>PRT
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<400>129
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg
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<211>8
<212>PRT
<213>智人
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1 5
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<212>PRT
<213>智人
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1 5 10
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<211>8
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1 5
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1 5 10
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<400>136
Arg Gly Asp Tyr Arg Thr Asp Ile
1 5
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Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
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<211>11
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Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
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<211>9
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<212>PRT
<213>智人
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1 5 10
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<211>7
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<400>144
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<211>10
<212>PRT
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1 5 10
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Ser Gly Asp lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Ser
1 5 10
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<211>7
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<400>147
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1 5 10
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1 5 10
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<400>150
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Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Ser
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<212>PRT
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<400>153
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<211>10
<212>PRT
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<400>154
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1 5 10
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Ser Asn Ser Gln Arg Pro Ser
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1 5 10
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Ser Gly Arg Asn Ser Asn Ile Gly Ser Tyr Thr Val Thr
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1 5
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Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
1 5 10
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<212>PRT
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<400>168
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1 5
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Ser Gly Arg Asn Ser Asn Ile Gly Ser Tyr Thr Val Thr
1 5 10
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<212>PRT
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<400>171
Ser Asn Ser Gln Arg Pro Ser
1 5
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<211>11
<212>PRT
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<400>172
Leu Val Trp Asp Asp Val Leu Asn Gly Pro Val
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Attorney Docket No.003946-005000
11095337.1