以悬浮微载体细胞培养系统产制的疫苗及其方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101869702 B (45)授权公告日 2013.08.14 CN 101869702 B *CN101869702B* (21)申请号 200910137825.7 (22)申请日 2009.04.21 A61K 39/00(2006.01) A61K 39/145(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61K 39/205(2006.01) A61P 31/14(2006.01) A61P 31/16(2006.01) C12N 7/00(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (73)专利权人 施怀哲维克有限公司 地址 。

2、中国香港铜锣湾勿地臣街 1 号时代广 场 2 座 2201-2207 室 (72)发明人 郭村勇 陈旭中 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 万志香 曾旻辉 CN 1390604 A,2003.01.15, 权利要求 1-6、 说明书第 3 页第 13 行 - 第 4 页第 5 行、 实施例 1 和 2. (54) 发明名称 以悬浮微载体细胞培养系统产制的疫苗及其 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种以悬浮微载体细胞培养系 统产制的疫苗及其方法， 包括如下技术步骤 ： (1) 将制苗用细胞接种到含有培养基与微载体的培养 罐内 ； (2) 将上述细胞与。

3、微载体混合均匀， 使细胞 贴附在微载体上 ； (3) 在适当温度下， 提供上述细 胞足够的养分及气体， 使细胞在上述微载体上继 续生长 ； (4) 将制苗用病毒制成病毒悬浮液， 接种 于上述细胞上， 继续培养 ； 每隔 1 3 日收获病毒 液或含有病毒的细胞， 并且更换培养液 ； (5) 将上 述收获的病毒液纯化后， 视需要进行灭活， 灭活后 的病毒液加入适当佐剂， 不经灭活的病毒液则加 入适当的冻干保护剂， 充分混匀后定量分装， 即得 到所需的疫苗。 该方法生产工艺简单、 可显著提高 疫苗产量和质量。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 赵彦豪 权利要求书 1 页 说明书 17。

4、 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书17页 附图1页 (10)授权公告号 CN 101869702 B CN 101869702 B *CN101869702B* 1/1 页 2 1. 以悬浮微载体细胞培养系统产制疫苗的方法， 其特征在于 ： 包括如下技术步骤 ： (1) 将制苗用细胞接种到含有培养基与微载体的培养罐内 ； (2) 将上述细胞与微载体混合均匀， 使细胞贴附在微载体上 ； (3) 在适当温度下， 以培养液液面升降方式， 提供上述细胞足够的养分及气体， 使细胞 在上述微载体上继续生长 ； (4) 将制苗用的病毒制成病毒悬。

5、浮液， 接种于上述细胞上， 继续培养 ； 于一定时间或一 段时间连续收获病毒液， 并且更换培养基 ； (5) 将上述收获的病毒液纯化后， 加入适当的冻干保护剂， 充分混匀后定量分装， 即得 到所需的活毒疫苗 ； 所述步骤 (1) 中的细胞为狗肾细胞， 所述步骤 (4) 中的病毒为禽流感病毒 ； 或所述步骤 (1) 中的细胞为仓鼠幼鼠肾细胞、 兔肾细胞或非洲绿猴肾细胞， 所述步骤 (4) 中的病毒为猪伪狂犬病病毒 ； 或所述步骤(1)中的细胞为猪肾细胞、 仓鼠肾细胞或非洲绿猴肾细胞， 所述步骤(4)中 的病毒为日本脑炎病毒 ； 或所述步骤 (1) 中的细胞为仓鼠幼鼠肾细胞， 所述步骤 (4) 中。

6、的病毒为牛流行热病 毒 ； 或所述步骤 (1) 中的细胞为非洲绿猴肾细胞， 所述步骤 (4) 中的病毒为狂犬病病毒。 2. 以悬浮微载体细胞培养系统产制疫苗的方法， 其特征在于 ： 包括如下技术步骤 ： (1) 将制苗用细胞接种到含有培养基与微载体的培养罐内 ； (2) 将上述细胞与微载体混合均匀， 使细胞贴附在微载体上 ； (3) 在适当温度下， 以培养液液面升降方式， 提供上述细胞足够的养分及气体， 使细胞 在上述微载体上继续生长 ； (4) 将制苗用的病毒制成病毒悬浮液， 接种于上述细胞上， 继续培养 ； 于一定时间或一 段时间连续收获病毒液， 并且更换培养基 ； (5) 将上述收获的病。

7、毒液纯化后， 以灭活剂进行灭活， 并加入适当的佐剂， 充分混匀后 定量分装， 即得到所需的灭活疫苗 ； 所述步骤 (1) 中的细胞为狗肾细胞， 所述步骤 (4) 中的病毒为禽流感病毒 ； 或所述步骤 (1) 中的细胞为仓鼠幼鼠肾细胞、 兔肾细胞或非洲绿猴肾细胞， 所述步骤 (4) 中的病毒为猪伪狂犬病病毒 ； 或所述步骤(1)中的细胞为猪肾细胞、 仓鼠肾细胞或非洲绿猴肾细胞， 所述步骤(4)中 的病毒为日本脑炎病毒 ； 或所述步骤 (1) 中的细胞为仓鼠幼鼠肾细胞， 所述步骤 (4) 中的病毒为牛流行热病 毒 ； 或所述步骤 (1) 中的细胞为非洲绿猴肾细胞， 所述步骤 (4) 中的病毒为狂犬。

8、病病毒。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的以悬浮微载体细胞培养系统产制疫苗的方法， 其特征在 于 ： (1) 步骤中的微载体为玻璃圆珠、 聚酯纤维圆片、 或聚酯纤维平板。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的以悬浮微载体细胞培养系统产制疫苗的方法， 其特征在 于 ： (4) 步骤是以 1 至 5 天为时间单位收获 1 次病毒液， 并连续收获病毒液。 5. 一种根据权利要求 1 或 2 所述方法制备的疫苗。 权 利 要 求 书 CN 101869702 B 2 1/17 页 3 以悬浮微载体细胞培养系统产制的疫苗及其方法 技术领域 0001 本发明属于生物制品技术领域， 更具体是涉及一种。

9、以悬浮微载体细胞培养系统生 产的疫苗以及其方法。 背景技术 0002 目前公知的全病毒疫苗生产方法， 多以鸡胚胎蛋、 动物组织或细胞培养方式来产 制病毒 ； 然而， 以鸡胚胎蛋产制病毒有蛋源质量及来源不稳定等问题， 而以动物组织产制全 病毒疫苗则含有太多外来的蛋白质， 容易使施打对象引起过敏反应和神经方面的并发症 ； 因此， 较佳的方式是找到对该病毒具有感受性的细胞， 以细胞培养方式来大量产制病毒。 0003 以贴附型细胞培养生产病毒以制造全病毒疫苗 ( 包括活毒及灭活疫苗 )， 其中细 胞的大量培养是生产疫苗的关键之一， 传统上， 制苗用细胞系 ( 贴附型 ) 的培养， 先经过 EDTA- 。

10、胰酶细胞分散消化传代， 以细胞培养液于适当温度下在培养盘或培养瓶内培养， 形 成良好单层时， 用于继续传代或接种病毒。目前实验室或企业大多使用转瓶自动培养系统 (Roller BottleSystem)， 使细胞可以获得充足的气体及养分交换。 0004 然而， 这种传统式细胞培养工艺的缺点是 ： 准备时间繁杂， 无法一次大量培养细 胞， 而且每一个培养盘或培养瓶只能培养单层细胞。 若要短时间内大量培养， 所需要的空间 与设备使用及维护成本非常庞大， 增加企业人力、 物力的成本负担。 0005 由此可知， 以上述细胞培养方式制造全病毒疫苗具有诸多缺点， 亟需加以改良。 发明内容 0006 本发明。

11、的目的在于克服现有工艺存在的不足之处， 提供一种以悬浮微载体细胞培 养系统产制疫苗的方法以及根据此方法制得的疫苗。该方法具有生产工艺简单且稳定、 易 操作， 病毒含量高， 批间差异小， 质量易控制， 可显著提高疫苗产量和质量。 利用本发明生产 的疫苗安全性好、 免疫效力高， 对病毒攻毒具有完全的免疫保护作用。 0007 为达到上述目的， 本发明采取了如下的技术方案 ： 0008 以悬浮微载体细胞培养系统产制疫苗的方法， 包括下列技术步骤 ： 0009 1. 将制苗用细胞接种到含有培养基与微载体的培养罐内 ； 0010 2. 将上述细胞与微载体混合均匀， 使细胞贴附在微载体上 ； 0011 3.。

12、 在适当温度下， 提供上述细胞足够的养分及气体， 使细胞在上述微载体上继续 生长 ； 0012 4. 将制苗用的病毒制成病毒悬浮液， 接种于上述细胞上， 继续培养 ； 每隔数日收 获病毒液， 并且更换培养基 ； 0013 毒种鉴定 ： 各种疫苗须完全符合 中华人民共和国药典 及 / 或 中华人民共和国 兽药典 规范， 无细菌、 霉菌、 支原体及外源病毒污染。 0014 5. 将上述收获的病毒液纯化后， 依照是否需要灭活而加入灭活剂或不加入灭活 剂， 灭活后的病毒液加入适当佐剂， 不经灭活的病毒液则加入适当的冻干保护剂， 充分混匀 说 明 书 CN 101869702 B 3 2/17 页 4 。

13、后定量分装， 即得到灭活或活毒疫苗。 0015 成品检验 ： 各种疫苗皆按 中华人民共和国药典 及 / 或 中华人民共和国兽药典 进行检验， 应符合相关规定， 对该疫苗施用人体或动物安全无副作用。 0016 上述技术方案中， (1) 步骤中的微载体为玻璃圆珠、 聚酯纤维圆片、 聚酯纤维平板。 0017 上述技术方案中， (3) 步骤是以搅拌通气或是以培养液液面升降方式， 使细胞获得 气体交换。 0018 上述技术方案中， 步骤 (2)、 (3)、 (4) 中所述的细胞培养温度是 36 37， 并含有 2.5 5二氧化碳。 0019 上述技术方案中， (1) 步骤中的细胞为狗肾细胞 (MDCK)。

14、， (4) 步骤中的病毒为禽流 感病毒 (H5N1)。 0020 上述技术方案中， (1)步骤中的细胞为仓鼠幼鼠肾细胞(BHK)、 兔肾细胞(PK13)或 非洲绿猴肾细胞 (VERO)， (4) 步骤中的病毒为猪伪狂犬病病毒 (PRV)。 0021 上述技术方案中， (1) 步骤中的细胞为猪肾细胞 (PK)、 仓鼠肾细胞 (HK) 或非洲绿 猴肾细胞 (VERO)， (4) 步骤中的病毒为日本脑炎病毒 (JEV)。 0022 上述技术方案中， (1) 步骤中的细胞为仓鼠幼鼠肾细胞 (BHK)， (4) 步骤中的病毒 为牛流行热病毒 (BEFV)。 0023 上述技术方案中， (1) 步骤中的细。

15、胞为非洲绿猴肾细胞 (VERO)， (4) 步骤中的病毒 为狂犬病病毒 (rabies virus)。 0024 本发明所提供的以悬浮微载体细胞培养系统产制疫苗的方法， 与其它现有技术相 互比较时， 更具有下列优点 ： 0025 1. 本发明所提供的细胞培养方法， 在一个瓶子内可以让细胞贴附的面积大增， 可 以减少培养瓶、 培养基的使用， 其效能为传统转瓶自动培养系统的数十倍， 可以节省许多成 本及人力， 亦可减少操作人员与病毒接触的机会， 减少操作人员感染人畜共通病毒 ( 如 ： 禽 流感 H5N1 病毒、 日本脑炎病毒、 狂犬病病毒 ) 的机会。 0026 2. 本发明提供的方法细胞接种量。

16、低， 容易控制， 且病毒感染效率高， 生产效能高。 附图说明 0027 请参阅以下有关本发明一较佳实施例的详细说明及其附图， 将可进一步了解本发 明的技术内容及其目的功效 ； 有关该实施例的附图为 ： 0028 图 1 为本发明的制备流程图。 具体实施方式 0029 下面的说明部分及示意图， 仅具示范说明性而非限制性。 0030 实施例 1 禽流感活毒疫苗的制作 0031 1.1 病毒与细胞株 0032 用来制作禽流感疫苗的病毒须由政府授权的单位提供， 为 H5N1 重配疫苗原型株 (reassortant)， 该病毒株是分离自高致病性禽流感病毒株 ( 例如 ： A/Hong Kong/213。

17、/2003 或 A/VietNam/1194/2004， 或 NIBRG-14)。经过致病性测试， 结果显示 H5N1 重配疫苗原型株 病毒不具有致病性后， 才可用来制作 H5N1 禽流感疫苗。并且使用对该病毒株具有良好的感 说 明 书 CN 101869702 B 4 3/17 页 5 受性的细胞系 ( 本实施例选用狗肾细胞系 Madin Darby Canine Kidney， MDCK)， 作为制苗 用细胞系， 通过感染并大量繁殖 H5N1 禽流感病毒。 0033 细胞系、 种毒株及量产用病毒株， 都是依照 中华人民共和国药典 及 中华人民共 和国兽药典 所规定， 来进行特性试验、 病毒。

18、含量试验及外来物质试验。 0034 1.2 方法 0035 (1) 将制苗用狗肾细胞系 (MDCK 细胞 ) 细胞接种到含有 DMEM 液体培养基 (GIBCO 公司 )( 含体积百分比为 10的犊牛血清 ) 与微载体的培养罐内 ； 0036 (2) 于 37、 5 CO2培养环境下， 利用温和搅拌， 或抽、 放真空方式使液体培养基 液面在培养罐内小幅度升降， 作用约 1 小时， 使上述细胞与微载体混合均匀， 并使细胞贴附 在微载体上 ； 0037 (3) 于 37、 5 CO2培养环境下， 同样利用搅拌或抽、 放真空的方式， 提供上述细 胞足够的养分及气体， 使细胞在上述微载体上生长约 4 。

19、7 天， 直到细胞长满整个微载体， 更换新的 DMEM 培养液并加入体积百分比为 2的犊牛血清， 准备接种病毒 ； 0038 (4) 将制苗用的 H5N1 重配疫苗原型株病毒以 DMEM 液体培养基制成病毒悬浮液 ( 接种浓度为 10-4M.O.I.( 感染复数， Multiplicity of infection)， 接种于上述细胞上， 置于 34、 5 CO2培养环境下继续培养， 同样利用搅拌或抽、 放真空的方式， 提供细胞足够 的养分及气体 ； 经过 2 3 日收获病毒液， 置于 4保存 ； 收获的病毒液进行毒种鉴定以确 认合乎各项标准 ； 0039 毒种鉴定 0040 (a) 病毒含量。

20、 ： 以噬斑形成单位 (plaque forming unit， PFU) 方法计算病毒含量， 每 1.0mL 病毒含量须 1106PFU。 0041 (b) 纯净性 ： 应无细菌、 霉菌、 支原体及外源病毒污染。 0042 (5) 经检验合格的病毒含量 1106PFU/mL H5N1 重配疫苗原型株病毒抗原原液 经过离心纯化后， 以甲醛 (formaldehyde) 或 2- 溴乙胺 (binary ethyleneimine， BEI) 将病 毒灭活后， 经氢氧化铝佐剂或以乳化 ( 水包油， w/o) 或双相乳化 ( 水包油包水， w/o/w) 制 成油质疫苗， 并定量分装， 加盖密封后储。

21、存于 2 8得到成品。将制成的 3 批疫苗编号为 H5N1-T001、 H5N1-T002、 H5N1-T003。 0043 成品检验 ： 按 中华人民共和国兽药典 进行检验， 应符合规定， 对施打动物安全无 副作用。疫苗病毒含量 1106PFU/mL。无菌检验按 中国兽药典 附录 15 页进行检验， 应无细菌生长。 0044 1.3 结果 0045 病毒含量 ： H5N1 重配疫苗原型株病毒接种 MDCK 细胞后， 收获病毒液， 共 3 批， 分别 测定病毒含量， 每 1mL 病毒含量分别为 109.02PFU、 109.15PFU、 109.06PFU。 0046 无菌检验 ： 三批产品均。

22、无菌生长。 0047 比较以本发明 “悬浮微载体细胞培养系统” 与现有转瓶培养系统， 培养 MDCK 细胞 系， 以增殖禽流感病毒 H5N1， 两系统细胞培养的病毒产量如表 1-1 所示。 0048 表 1-1 不同培养系统增殖禽流感病毒 H5N1 的产量比较 说 明 书 CN 101869702 B 5 4/17 页 6 0049 0050 上述对比试验结果可知， 以本发明悬浮微载体细胞培养系统生产的禽流感疫苗与 现有方法生产的疫苗对鸡只均具有良好的安全性及免疫效果， 且以本发明悬浮微载体细胞 培养系统生产禽流感疫苗的产量， 远大于现有转瓶培养系统生产的产量。 0051 实施例 2 0052。

23、 2.1 猪伪狂犬病活毒疫苗的制作 0053 2.1.1 病毒与细胞株 0054 用来制作猪伪狂犬病活毒疫苗的病毒， 是将伪狂犬病病毒 (Pseudorabies virus， PRV) 强毒株 (LC) 上的 gI 醣蛋白及胸腺核苷激酶 (TK) 双基因以遗传工程方式去除而成的 基因缺损弱毒株。经过致病性测试， 结果显示 gI 醣蛋白及胸腺核苷激酶 (TK) 双基因缺损 弱毒株 (LCM 株 ) 病毒不具有致病性后， 才可用来制作猪伪狂犬病活毒疫苗。并且使用对该 病毒株具有良好的感受性的细胞系(本实施例选用仓鼠幼鼠肾细胞BHK细胞 ； 其它细胞如 ： 兔肾细胞(PK13)或非洲绿猴肾细胞(V。

24、ERO)也对猪伪狂犬病毒有良好的感受性)， 作为制苗 用细胞系， 通过感染并大量繁殖猪伪狂犬病病毒。 0055 2.1.2 方法 0056 (1) 将制苗用 BHK 细胞接种到含有体积百分比为 10的犊牛血清 DMEM 液体培养 基 (GIBCO 公司 ) 与微载体的培养罐内 ； 0057 (2) 于 36 37、 5 CO2培养环境下， 利用温和搅拌， 或抽、 放真空方式使液体培 养基液面在培养罐内小幅度升降， 作用约 1 3 小时， 使上述细胞与微载体混合均匀， 并使 细胞贴附在微载体上 ； 0058 (3) 于 36 37、 5 CO2培养环境下， 同样利用搅拌或抽、 放真空的方式， 提。

25、供上 述细胞足够的养分及气体， 使细胞在上述微载体上生长约25天， 直到细胞长满整个微载 体， 更换新的 DMEM 培养液并加入体积百分比为 2的犊牛血清， 准备接种病毒 ； 0059 (4)将猪伪狂犬病gI-/TK-双基因缺损株(LCM株)病毒以DMEM液体培养基(含体 积百分比为 2的犊牛血清 ) 制成病毒悬浮液 ( 接种浓度为 1 TCID50/ 细胞 )， 接种于上述 细胞上， 置于 36 37、 5 CO2培养环境下继续培养， 同样利用搅拌或抽、 放真空的方式， 提供细胞足够的养分及气体 ； 每隔 18 24 小时 ( 当细胞病变 (CPE) 达 90以上 ) 收获病 毒液， 置于 。

26、4保存 ； 收获的病毒液进行毒种鉴定以确认合乎各项标准 ； 0060 毒种鉴定 0061 (a)病毒含量 ： 将收获的病毒液用DMEM液体培养基做10倍系列稀释， 取10-6、 10-7、 10-83 个稀释度， 每个稀释度分别接种 BHK 细胞 4 瓶， 在 36 37、 5 CO2培养箱中培养 说 明 书 CN 101869702 B 6 5/17 页 7 16 120 小时， 每日观察并纪录细胞病变 (CPE)， 按 Reed-Muench 计算 TCID50， 每 1.0mL 病 毒含量须 1105TCID50。 0062 (b) 纯净性 ： 按 中华人民共和国兽药典 进行， 应无细菌。

27、、 霉菌、 支原体及外源病 毒污染。 0063 (c) 特异性 ： 将收获的病毒液用 DMEM 液体培养基稀释为 103TCID50/mL， 与等量抗 PRV 家兔免疫血清等量混合， 经 37感作一小时后分别接种于猪肾 (PK)、 兔肾 (RK) 等株化 细胞经培养 5 日， 须无细胞变性效应， 并经次代同源细胞继代培养 7 日， 也须无细胞变性效 应， 并分别以天竺鼠、 鹅及鸡的 1红血球进行吸附试验， 均须呈阴性反应。 0064 (5) 经检验合格的病毒含量 1105TCID50/mL 猪伪狂犬病 gI-/TK-双基因缺损株 (LCM 株 ) 病毒抗原原液经过离心纯化后， 以 50 ( 体。

28、积比 ) 乳糖作为冻干保护剂， 充分摇 匀后冻结真空干燥， 并定量分装， 加盖密封后储存于 2 8得到成品。将制成的 3 批疫苗 编号为 PR-T1、 PR-T2、 PR-T3。 0065 成品检验 ： 按 中华人民共和国兽药典 进行检验， 应符合规定， 对施打动物安全无 副作用。疫苗病毒含量 1105TCID50/mL。无菌检验 ： 按 中国兽药典 附录 15 页进行检 验， 应无细菌生长。 0066 2.1.3 结果 0067 病毒含量 ： 猪伪狂犬病 gI-/TK-双基因缺损株 (LCM 株 ) 病毒接种 BHK 细胞后， 收 获病毒液， 共 3 批， 分别测定病毒含量， 每 1mL 病。

29、毒含量分别为 107.15TCID50、 107.20TCID50、 107.35TCID50。 0068 疫苗性状试验结果见表 2-1。 0069 表 2-1 三批疫苗性状试验结果 0070 0071 0072 无菌试验为阴性， 结果见表 2-2。 0073 表 2-2 三批疫苗无菌试验结果 说 明 书 CN 101869702 B 7 6/17 页 8 0074 0075 每批疫苗抽 10 只样品溶解后进行试验。 0076 BHI ： 脑心抽出液培养基 (Brain Heart Infusion Broth) 接种检体后， 经 37培 养 1 周。 0077 PPLO Agar ： 支原体。

30、固体培养基。 0078 检体先接种于Friis液体培养基内， 经1周取培养液移至PPLO Agar， 于5CO2条 件下继续培养 1 周， 然后以显微镜检查是否有支原体菌落生成。 0079 特异性试验 ： 无其它病毒污染， 结果见表 2-3。 0080 表 2-3 三批疫苗特异性试验结果 0081 0082 0083 PK ： 猪肾细胞系 0084 RK ： 兔肾细胞系 说 明 书 CN 101869702 B 8 7/17 页 9 0085 CPE ： 细胞病变 0086 2.2 本发明制得的猪伪狂犬病活毒疫苗与同类产品的比较试验 0087 2.2.1 材料 0088 (1) 疫苗 ： 猪伪。

31、狂犬病活毒疫苗 ( 以悬浮微载体细胞培养系统制得 )3 批， 批号 ： PR-T1、 PR-T2、 PR-T3。 猪伪狂犬病活毒疫苗(以转瓶自动培养系统制得)1批， 批号 ： PR-RB1。 0089 (2) 实验动物 ： 1 月龄断奶仔猪、 易感后备母猪， PR 疾病抗体均为阴性 ( 血清中和 价 1 2)。 0090 (3) 病毒 ： 猪伪狂犬病毒 (PRV)TNL 强毒株。 0091 2.2.2 方法 0092 (1) 安全性试验 0093 a. 对仔猪的安全性试验 ： 取 1 月龄 PR 病毒抗体阴性 ( 血清中和抗体 1 2) 断 奶仔猪 16 头， 随机分为 4 组， 各组分别注射。

32、 PR-T1、 PR-T2、 PR-T3 批和 PR-RB1 疫苗， 每头均 肌肉注射疫苗 4ml， 连续观察 21 日， 同时测温、 观察采食、 呼吸等情况。 0094 b. 后备母猪的安全性试验 ： 取后备母猪 8 头， 配种前 4 周分别肌肉接种 PRV(LCM)-gI-/TK-疫苗 ( 批号 ： PR-T1) 和 PR-RB1 疫苗各 4 头， 8ml/ 头。免疫后测温， 每日 作常规临床观察。 配种怀孕后观察是否发生早产、 流产、 死胎、 木乃伊胎及弱仔等繁殖障碍， 连续观察至分娩。 0095 (2) 抗体检测与攻毒保护试验 ： 取 1 月龄 PR 病毒抗体阴性 ( 血清中和抗体 1。

33、2)易感仔猪20头， 随机分为5组， 每组4头， 1、 2、 3组分别各肌肉注射PR-T1、 PR-T2、 PR-T3 三批 PRV(LCM)-gI-/TK-疫苗 2ml/ 头， 4 组肌肉注射 PR-RB1 疫苗 2ml/ 头， 5 组作为负 对照， 21 日后采血分离血清测定中和抗体效价， 同时每头猪滴鼻 105.0TCID502ml 的 PRV(TNL 强毒 ) 病毒， 连续观察 14 日， 测量并观察仔猪临床表现。 0096 2.2.3 结果 0097 (1) 安全性试验 0098 1 月龄断奶仔猪分别注射免疫 4ml 的疫苗 (PR-T1、 PR-T2、 PR-T3)、 PR-RB1。

34、 疫苗后， 仔猪无体温升高， 采食、 精神状况及生长发育情况均正常， 试验仔猪均存活。后备母猪免疫 8ml的疫苗(PR-T1)和PR-RB1疫苗后， 均无体温变化， 食欲正常。 正常配种后， 未发生目标病 征。结果表明， 三批实验疫苗和 PR-RB 疫苗对靶动物超剂量接种是安全的。结果见表 2-4。 0099 表 2-4 疫苗安全性试验结果 0100 说 明 书 CN 101869702 B 9 8/17 页 10 0101 (2) 抗体检测与攻毒保护试验 0102 以中和试验方法检测疫苗免疫后的血清中和抗体， 结果表明无论是 PR-T1、 PR-T2、 PR-T3 疫苗还是 PR-RB1 疫。

35、苗免疫后抗体均在 1 16 以上， 攻毒后均 4/4 保护， 对照 4/4 发 病， 结果见表 2-5。 0103 表 2-5 疫苗免疫效力试验结果 0104 0105 比较以本发明 “悬浮微载体细胞培养系统” 与现有转瓶培养系统， 培养 BHK 细胞 系， 以增殖猪伪狂犬病病毒， 两系统细胞培养的病毒产量如表 2-6 所示。 0106 表 2-6 不同培养系统增殖猪伪狂犬病病毒的产量比较 说 明 书 CN 101869702 B 10 9/17 页 11 0107 0108 上述对比试验结果可知， 以本发明悬浮微载体细胞培养系统生产的猪伪狂犬病疫 苗与现有方法生产的疫苗对易感仔猪和后备母猪均。

36、具有良好的安全性及免疫效果， 且以本 发明悬浮微载体细胞培养系统生产猪伪狂犬病疫苗的产量， 远大于现有转瓶培养系统生产 疫苗的产量。 0109 实施例 3 0110 3.1 日本脑炎活毒疫苗的制作 0111 3.1.1 病毒与细胞株 0112 用来制作日本脑炎活毒疫苗的病毒是 “at” 株， 该病毒株是采自受日本脑炎感染的 猪只， 以仓鼠肾细胞 (hamster kidney cell， HK cell) 经过传代 220 代， 成为弱毒株。经过 致病性测试， 结果显示该弱毒株病毒不具有致病性后， 才可用来制作日本脑炎活毒疫苗。 并 且使用对该病毒株具有良好的感受性的细胞系 ( 本实施例选用仓。

37、鼠肾细胞 (HK) ； 其它细胞 如 ： 猪肾细胞 (PK) 与非洲绿猴肾细胞 (VERO) 也对日本脑炎病毒有良好的感受性 )， 作为制 苗用细胞系， 通过感染并大量繁殖日本脑炎病毒。 0113 3.1.2 方法 0114 (1)将制苗用HK细胞接种到MEM液体培养基(GIBCO公司， 内含体积百分比为10 的犊牛血清、 0.01M NaHCO3、 0.1mg/ml硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)、 100,000IU青霉 素 G 钠盐 (Penicillin G Sodium) 与微载体的培养罐内 ； 0115 (2) 于 37、 5 CO2培养环境下， 利用温和搅拌， 。

38、或抽、 放真空方式使液体培养基 液面在培养罐内小幅度升降， 作用约 2 小时， 使上述细胞与微载体混合均匀， 并使细胞贴附 在微载体上 ； 0116 (3) 于 37、 5 CO2培养环境下， 同样利用搅拌或抽、 放真空的方式， 提供上述细 胞足够的养分及气体， 使细胞在上述微载体上生长约 2 5 天， 直到细胞长满整个微载体， 更换新的 MEM 培养液并加入体积百分比为 10的犊牛血清， 准备接种病毒 ； 0117 (4) 将日本脑炎弱毒株 (JEV-“at” strain) 病毒以 MEM 液体培养基 ( 含体积百分 比为 10的犊牛血清 ) 制成病毒悬浮液 ( 接种浓度为 0.005M.。

39、O.I.)， 接种于上述细胞上， 置于 37、 5 CO2培养环境下继续培养， 同样利用搅拌或抽、 放真空的方式， 提供细胞足够 的养分及气体 ； 每隔 3 5 天收获病毒液， 置于 4保存 ； 收获的病毒液进行毒种鉴定以确 认合乎各项标准 ； 0118 毒种鉴定 0119 (a) 病毒含量 ： 将收获的病毒液用 MEM 液体培养基做 10 倍系列稀释， 取 10-6、 10-7、 说 明 书 CN 101869702 B 11 10/17 页 12 10-83个稀释度， 每个稀释度分别接种HK细胞4瓶， 在3637、 5CO2培养箱中培养16 120 小时， 每日观察并纪录细胞病变 (CPE。

40、)， 按 Reed-Muench 计算 TCID50， 每 1.0mL 病毒含量 须 1105TCID50。 0120 (b) 纯净性 ： 应无细菌、 霉菌、 支原体及外源病毒污染。 0121 (c) 特异性 ： 将收获的病毒液用 MEM 液体培养基稀释为 200pfu/mL， 加入等量中和 抗体价为 104以上 ( 以噬斑法测定 ) 的抗猪瘟病毒家兔免疫血清， 经 37感作 1.5 小时后 接种于仓鼠肾细胞 (HK) 经培养 5 日， 须无细胞变性效应， 并经次代同源细胞继代培养 7 日， 也须无细胞变性效应， 并分别以天竺鼠、 鹅及鸡的 1红血球进行吸附试验， 均须呈阴性反 应。 0122。

41、 (5) 经检验合格的病毒含量 1105TCID50/mL 日本脑炎弱毒株病毒抗原原液 经过离心纯化后， 以 50 ( 体积比 ) 乳糖作为冻干保护剂， 并加入 5g/ml 卡那霉素 (kanamycin)、 5IU/mL 青霉素 (Penicillin)， 充分摇匀后冻结真空干燥， 并定量分装， 加盖 密封后储存于 2 8得到成品。将制成的 3 批疫苗编号为 JE-T01、 JE-T02、 JE-T03。 0123 成品检验 ： 按 中华人民共和国药典 及 中华人民共和国兽药典 进行检验， 应符 合规定， 对施打动物安全无副作用。疫苗病毒含量 1105TCID50/mL。无菌检验 ： 按 中。

42、国 兽药典 附录 15 页进行检验， 应无细菌生长。 0124 3.1.3 结果 0125 病毒含量 ： 日本脑炎弱毒株病毒接种 HK 细胞后， 收获病毒液， 共 3 批， 分别测定病 毒含量及疫苗性状， 试验结果见表 3-1。 0126 表 3-1 三批疫苗性状试验结果 0127 0128 无菌试验为阴性， 结果见表 3-2。 0129 表 3-2 三批疫苗无菌试验结果 说 明 书 CN 101869702 B 12 11/17 页 13 0130 0131 每批疫苗抽 10 只样品溶解后进行试验。 0132 BHI ： 脑心抽出液培养基 (Brain Heart Infusion Brot。

43、h) 接种检体后， 经 37培 养 1 周。 0133 PPLO Agar ： 支原体固体培养基。 0134 检体先接种于Friis液体培养基内， 经1周取培养液移至PPLO Agar， 于5CO2条 件下继续培养 1 周， 然后以显微镜检查是否有支原体菌落生成。 0135 特异性试验 ： 无其它病毒污染， 结果见表 3-3。 0136 表 3-3 三批疫苗特异性试验结果 0137 0138 HK ： 仓鼠肾细胞 0139 CPE ： 细胞病变 0140 3.2 本发明制得的日本脑炎活毒疫苗与同类产品的比较试验 0141 3.2.1 材料 0142 (1) 疫苗 ： 日本脑炎活毒疫苗 ( 以悬。

44、浮微载体细胞培养系统制得 )3 批， 批号 ： JE-T01、 JE-T02、 JE-T03。猪温活毒疫苗 ( 以转瓶自动培养系统制得 )1 批， 批号 ： JE-RB01。 0143 (2) 实验动物 ： 4 周龄断奶仔猪， 体重为 2 3kg， 日本脑炎抗体均为阴性 ( 血清中 和价 0.9)。 说 明 书 CN 101869702 B 13 12/17 页 14 0144 3.2.2 方法 0145 (1) 安全性试验 0146 取 4 周龄日本脑炎病毒抗体阴性 ( 血清中和抗体 0.9) 断奶仔猪 8 头， 随机分为 4 组， 各组分别注射 JE-T01、 JE-T02、 JE-T03。

45、 批和 JE-RB01 疫苗， 每头均肌肉注射建议剂量 疫苗 (2mL)， 连续观察 14 日， 同时测体重、 观察采食、 神经学上的症状等情况。 0147 (2) 抗体检测试验 0148 取 4 周龄日本脑炎病毒抗体阴性 ( 血清中和抗体 1 10) 易感仔猪 10 头， 随机 分为 5 组， 每组 2 头， 第 1、 2、 3 组分别各肌肉注射 1 倍剂量的 JE-T01、 JE-T02、 JE-T03 疫苗， 第 4 组肌肉注射 1 倍剂量的 JE-RB01 疫苗， 第 5 组不注射任何疫苗， 以作为负对照 ； 免疫 14 日后采血分离血清， 以测定中和 (NT) 抗体力价与血凝抑制 (。

46、HI) 抗体力价。 0149 3.2.3 结果 0150 (1) 安全性试验 0151 4 周龄断奶仔猪分别注射免疫建议剂量的疫苗 (JE-T01、 JE-T02、 JE-T03)、 JE-RB01 疫苗后， 仔猪无体温升高， 采食、 精神状况及生长发育情况均正常， 试验仔猪均存 活。 结果表明， 三批实验疫苗和JE-RB01疫苗对靶动物超剂量接种是安全的。 结果见表3-4。 0152 表 3-4 疫苗安全性试验结果 0153 0154 (2) 抗体检测试验 0155 以中和试验方法检测疫苗免疫后的血清中和抗体， 结果表明无论是 JE-T01、 JE-T02、 JE-T03 疫苗还是 JE-R。

47、B01 疫苗免疫后抗体力价均在 1 20 以上， 结果见表 3-5。 0156 表 3-5 疫苗免疫效力试验结果 说 明 书 CN 101869702 B 14 13/17 页 15 0157 0158 0159 比较以本发明 “悬浮微载体细胞培养系统” 与现有转瓶培养系统， 培养 HK 细胞系， 以增殖日本脑炎病毒， 两系统细胞培养的病毒产量如表 3-6 所示。 0160 表 3-6 不同培养系统增殖日本脑炎病毒的产量比较 0161 0162 上述对比试验结果可知， 以本发明悬浮微载体细胞培养系统生产的日本脑炎疫苗 与现有方法生产的疫苗对易感仔猪均具有良好的安全性及免疫效果， 且以本发明悬浮。

48、微载 体细胞培养系统生产日本脑炎疫苗的产量， 远大于现有转瓶培养系统生产疫苗的产量。 0163 实施例 4 0164 4.1 牛流行热灭活疫苗的制作 0165 4.1.1 病毒与细胞株 0166 以牛流行热病毒强毒株 (bovine ephemeral fever virus， BEFV， 例如 ： Tn73 或 Tn88128株)制作牛流行热灭活疫苗， 并且使用对该病毒株具有良好的感受性的细胞系(本 实施例选用仓鼠幼鼠肾细胞 BHK)， 作为制苗用细胞系， 通过感染并大量繁殖牛流行热病毒。 0167 4.1.2 方法 说 明 书 CN 101869702 B 15 14/17 页 16 0168 (1)将制苗用BHK细胞接种到MEM液体培养基(GIBCO公司， 内含体积百分比为7 的犊牛血清、 0.01M NaHCO3、 0.1mg/ml硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate)、 100,000。