一种靶向的嵌合乙肝核心抗原治疗性疫苗及其用途.pdf

《一种靶向的嵌合乙肝核心抗原治疗性疫苗及其用途.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种靶向的嵌合乙肝核心抗原治疗性疫苗及其用途.pdf（9页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 103463633 A (43)申请公布日 2013.12.25 CN 103463633 A *CN103463633A* (21)申请号 201210185406.2 (22)申请日 2012.06.07 A61K 39/29(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 31/20(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12N 15/51(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C07K 7/08(2006.01) (71)申请人 复旦大学 地址 200433 上。

2、海市杨浦区邯郸路 220 号 (72)发明人 史训龙 鞠佃文 周珮 黄海 周伟 张培 冯美卿 李继扬 朱海燕 叶丽 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 31268 代理人 吴桂琴 (54) 发明名称 一种靶向的嵌合乙肝核心抗原治疗性疫苗及 其用途 (57) 摘要 本发明属于生物医药领域， 涉及一种靶向表 皮生长因子受体突变体 3 的嵌合乙肝核心抗原 治疗型疫苗及其用途， 本发明的治疗型疫苗由表 皮生长因子受体突变体 3 表位抗原和乙肝核心抗 原病毒样颗粒制备成嵌合抗原， 该治疗型疫苗中 EGFRvIII表位和乙肝核心抗原HBc能同时诱导抗 EGFRvIII 。

3、和 HBc 的抗体及相应的细胞免疫， 对病 毒性乙肝病人及肝癌具有协同治疗作用， 可用于 临床治疗肝癌及乙肝携带者肝癌病人。对预防和 减低我国原发性肝癌的发生率具有显著地临床意 义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103463633 A CN 103463633 A *CN103463633A* 1/1 页 2 1. 一种靶向的嵌合乙肝核心抗原治疗性疫苗， 其特征在于， 该治疗性疫苗包含乙肝核 心抗原 HBc 重组嵌合病毒样颗粒。

4、， 其嵌合抗原表位是 EGFRvIII 表位抗原。 2. 根据权利要求 1 所述的靶向的嵌合乙肝核心抗原治疗性疫苗， 其特征在于， 所述的 EGFRvIII 表位抗原为一段 14 个氨基酸残基组成的多肽片段 ： Leu-Glu-Glu-Lys-Lys-Gly-A sn-Tyr-Val-Val-Thr-Asp-His-Cys。 3. 根据权利要求 1 所述的靶向的嵌合乙肝核心抗原治疗性疫苗， 其特征在于， 所述的 EGFRvIII 表位抗原的嵌合位点是 HBc 分子的 N 端， C 端及 HBc 优势免疫环中的一个或者多 个。 4. 权利要求 1 的靶向的嵌合乙肝核心抗原治疗性疫苗的制备方法， 。

5、其特征在于， 其包 括 ： 1) 制备嵌合乙肝病毒核心抗原， 将编码表皮生长因子突变体 3 的 DNA 片段， 通过基因工程手段整合入乙肝病毒核心抗 原的 N 末段， C 末端或免疫优势区中的一个或者多个 ； 2) 重组整合的 HBc-EGFRvIII 基因片段导入大肠杆菌， 酵母或其他系统的表达质粒中 进行表达优化， 制得嵌合乙肝病毒核心抗原 ； 3) 制得的嵌合乙肝病毒核心抗原纯化后与其他佐剂制成完整的治疗性疫苗。 5. 根据权利要求 5 的方法， 其特征在于， 所述其他佐剂选自细胞因子或氢氧化铝。 6. 根据权利要求 5 的方法， 其特征在于， 所述疫苗制成溶液， 悬液， 气溶胶， 乳液。

6、， 固体 或脱水物形式。 7. 权利要求 1 的靶向的嵌合乙肝核心抗原治疗性疫苗在制备治疗肝癌及乙肝携带者 肝癌制剂中的用途。 8. 根据权利要求 7 的用途， 所述的治疗性疫苗的给药途径为皮下注射给药或粘膜给 药。 权 利 要 求 书 CN 103463633 A 2 1/5 页 3 一种靶向的嵌合乙肝核心抗原治疗性疫苗及其用途 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 涉及一种靶向表皮生长因子受体突变体 3 的嵌合乙肝 核心抗原治疗性疫苗及其用途， 尤其是表皮生长因子受体突变体 3EGFRvIII 和乙肝核心抗 原 HBc 病毒颗粒及其在治疗原发性肝癌及乙肝病毒引起的肝癌药物中的用途。。

7、 背景技术 0002 表皮生长因子受体 III 突变体 3(EGFRvIII) 是表皮生长因子受体 （EGFR）的 一种最多见， 也是近年受本领域研究关注的突变体。研究显示， 该突变体除了在胶质瘤 细胞中广泛分布， 还在乳腺癌， 卵巢癌， 非小细胞肺癌等肿瘤细胞中均有发现， 更重要的 是到目前为止还未见有 EGFRvIII 在正常组织中表达的报道， 这意味着以该突变体作为 靶点而发展的抗肿瘤药物将能避免靶向野生型 EGFR 所带来的副作用， 增加临床使用 的安全性， 显示了 EGFRvIII 作为完全的肿瘤特异性的受体， 可成为新的理想的肿瘤特 异 性 靶 点 （Marc H,Ganesan 。

8、V,Phil W,et al,Nucl Med Biol,2009,36:117-128 ； Wang S,Guo P,Wang X.M,Mol Cancer Ther.2008,7:407-417 ； Farnaz Y,Vidya B,Shay E.P,et al,Mol Cancer Ther.2008,7:3586-3597 ； James M.R,Joshua O.S,Kim M.C,et al,Breast Cancer Res Tr,2004,87:87-95 ； Sinto S,Jeffrey S,Stephan J.R,et al,BBA-Rev Cancer,2006,176。

9、6:120-139） 。胶质细胞瘤作为最早发现 EGFRvIII 存在的肿瘤细胞， 基于 该突变体的用于治疗脑瘤 （胶质细胞瘤） 的EGFRvIII多肽疫苗取得了极大的成功， 已经进入 III期临床试验 ； EGFRvIII在其他肿瘤如乳腺癌、 卵巢癌等的研究也不断深入。 基于上述的 发展， 本申请拟提供 EGFRvIII 对于其它高表达该突变体的肿瘤是有希望的靶点。 0003 中国科研人员分别 2005， 2006 年报道在 EGFRvIII 肝癌及癌旁组织中高表达 （欧 超 , 吴飞翔 , 罗元等 , 癌症 ,2005,24:166-169 ； 徐立 , 张昌卿 , 冯凯涛等 , 中山大学。

10、学报 ( 医学科学版 ),2006,27:467-471.） ， 以及 EGFRvIII 参与了肝癌细胞的转化及肿瘤的生成 的报道， 这些研究结果显示了我国肝癌发病机理及类型与国外肝癌是有差异的。 0004 科学界越来越认同 HBV 慢性感染是肝癌形成的主要病因之一， HBV 慢性感染能极 大的增加肝癌的患病风险， 相对非感染者， 其患肝癌危险性甚至达到几十倍。众所周知， 中 国是HBV患者最多的国家， 有超过1亿的HBV感染者， 每年其中0.4-0.6%的慢性HBV感染者 被诊断为肝癌， 而肝癌患者治疗过程中都存在着免疫耐受及耐药等导致治疗失败的情况， 这意味着在中国 HBV 感染与肝癌的发。

11、生密切相关。同时提示， 仅仅针对肝癌的治疗， 并不能 改变患者 HBV 感染引发的肝癌高危险性。 0005 EGFRvIII 的表位抗原制作多肽疫苗尚存在如下缺陷 ： 由于其缺乏天然蛋白的三 维结构， 免疫原性差， 半衰期短， 机体免疫应答低， 还可能引起免疫耐受等， 也不能激活抗 HBV 效应。 0006 病毒样颗粒 （Virus-Like Particles， VLPs） 这一表位展示载体的进展为肝癌和 HBV 合并治疗方案带来了可能性及可行性。与活病毒疫苗相比， 病毒样颗粒无感染性， 因此 安全性大大提高。目前， VLPs 用于制备的预防性疫苗有， 人类乳头瘤病毒样颗粒、 人类免疫 说 。

12、明 书 CN 103463633 A 3 2/5 页 4 缺陷病毒样颗粒、 流感病毒样颗粒、 肝炎病毒样颗粒等。默克公司的预防和治疗宫颈癌的 VLP 疫苗在 2006-2007 年已经分别上市， 意味着 VLPs 的安全性及有效性都获得了认可。采 用 HBV 核心颗粒 （HBc） 作为表位载体的疟疾疫苗也在 2004-2005 年进入临床一期， 显示 HBc 的安全性及强佐剂样作用都已经获得了实验证实。因此， 寻找一种既提高多肽疫苗与抗体 的亲和力及增加免疫原性， 又能激活机体抗病毒作用的靶向的嵌合乙肝核心抗原治疗原发 性肝癌及乙肝病毒引起的肝癌药物势在必行。 0007 与本发明相关的现有技术。

13、还有 ： 0008 1.Yang W.L,Wu G， BarthR.F， et al,Molecular Targeting and Treatment of Composite EGFR and EGFRvIII-Positive Gliomas Using Boronated Monoclonal Antibodies.Clin.Cancer Res.200814:883-891. 0009 2.Bruce G，Laura D.F,The cancer vaccine roller coaster,Nat Biotechnol,2009,27:129-139 0010 3.Karina D。

14、.S,Marianne W， Dorte A.O,et al,Mutant Epidermal Growth Factor Receptor in Benign,Borderline,and Malignant Ovarian Tumors.Clin Cancer Res,2008,14:3278-3282. 0011 4.Wang H.M,Jiang H,Zhou M,et al,Epidermal growth factor receptor vIII enhances tumorigenicity and resistance to 5-fluorouracil in human hep。

15、atocellular carcinoma.Cancer Lett,(2009),doi:10.1016/j.canlet.2009.01.01. 0012 5.Chan L.Y， Tse C.H,Mo F,et al,High Viral Load and Hepatitis B Virus Subgenotype Ce Are Associated With Increased Risk of Hepatocellular Carcinoma. J Clin Oncol,2008,26:177-182. 0013 6.Alessandro R.Z,Pierre V.D,Daniel S,T。

16、he global impact of vaccination against hepatitis B:A historical overview.Vaccine,2008,26:6266-6273. 0014 7Yuen M.F,Tanaka Y， Fong Y.T,et al,Independent risk factors and predictive score for the development of hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis B.J Hepato,2009,50:80-88 0015 8.Elizabeth V.。

17、L.G， David A.A,Virus-like particles:Passport to immune recognition.Methods,2006,40:60-65. 0016 9.Sarah E.B,Kelly L.W， Christine M.O,et a1,Host,viral and vaccine factors that determine protective efficacy induced by rotavirus and virus-like particles(VLPs).Vaccine,2006,24:1170-1179. 0017 10.Joel R.H,。

18、Leslie D,James A.W， et al,Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge.Vaccine,2009,27:530-541. 0018 11.Larisa I.K,Alexander A.I,Alexey M.E,et al,Combined virus-like particle-based polyepitope DNA/protein HIV21vac。

19、cine design immunogenicity and toxicity studies.Vaccine,2007,58:1212. 0019 12.Adriaan F.G， Chris F.M,Pai O.R,et a1,A novel recombinant virus-like particle vaccine for prevention of porcine parvovirus-induced reproductive 说 明 书 CN 103463633 A 4 3/5 页 5 failure.Vaccine,2006,245:481-549 0020 13.Schwarz。

20、 T.F,Dubin G， Human papillomavirus(HPV)16/18l1AS04virus-l ike particle(VLP)cervical cancer vaccine is immunogenic and well-tolerated 18months after vaccination in women up to age 55years,ASCO Meeting Abstracts Jun 202007:3007. 0021 14.Newton Sergio De Carvalho,Cervical cancer vaccination:The real me。

21、aning of cross-protection and its impact on the prevention. Vaccine,2008,26:6293-6294 0022 15.Giane A.O,Kristiane W， J.Mauricio C.C,et al,Safety and Enhanced Immunogenicity of a Hepatitis B Core Particle Plasmodium falciparum Malaria Vaccine Formulated in Adjuvant Montanide ISA 720in a Phase I Trial。

22、.Infect immun,2005:3587-3597 0023 16.Elizabeth H.N,Giane A.O,J.Mauricio C.C,et al,Phase I Testing of a Malaria Vaccine Composed of Hepatitis B Virus Core Particles Expressing Plasmodium falciparum Circumsporozoite Epitopes.Infect Immun,2004:6519-6527 0024 17.Chen S,Yu L,Jiang C,et al.Pivotal study o。

23、fiodine-131-labeled chimeric tumor necrosis treatment radioimmunotherapy in patients with advanced lung cancer.J Clin Oncol.2005,23:1538-47. 0025 18.Ju D.W， Tao Q,Lou G.L,et al.Interleukin 18transfection enhances anti-tumor immunity induced by dendritic cell-tumor cell conjugates.Cancer Res,2001,61:。

24、3735-3740 0026 19.Ju D.W， Yang Y， Tao Q,et al.Interleukin-18Gene Transfer Increases Antitumor Effects of Suicide Gene Therapy through efficient induction of antitumor immunity.Gene Ther,2000,7:1672-1679 0027 20.Ju D.W， Tao Q,Cheng D.S,et al.Adenovirus-mediated lymphotactin gene transfer improves the。

25、rapeutic efficacy of cytosine deaminase suicide gene therapy in established murine colon carcinoma.Gene Ther,2000,7:329-338. 发明内容 0028 本发明的目的是提供新的靶向表皮生长因子受体突变体 3 的嵌合乙肝核心抗原 治疗性疫苗及其用途， 尤其是表皮生长因子受体突变体 3EGFRvIII 和乙肝核心抗原 HBc 病 毒颗粒及其在治疗原发性肝癌及乙肝病毒引起的肝癌药物中的用途。 0029 本发明的靶向表皮生长因子受体突变体 3 的嵌合乙肝核心抗原治疗性疫苗， 采 用乙肝病。

26、毒核心颗粒作为 EGFRvIII 多肽表位的疫苗载体， 利用其强大的佐剂样作用， 激 活高效的机体免疫反应， 以期打破肿瘤和病毒慢性感染所产生的免疫耐受， 同时引起针对 EGFRvIII 表位肽和 HBc 载体的免疫反应， 达到主要针对肝癌治疗及附带乙肝病毒感染进行 双重免疫治疗的效果。 0030 本发明的靶向表皮生长因子受体突变体 3 的嵌合乙肝核心抗原治疗性疫苗其特 征在于， 包含乙肝核心抗原 HBc 重组嵌合病毒样颗粒， 其嵌合抗原表位是 EGFRvIII 表位抗 说 明 书 CN 103463633 A 5 4/5 页 6 原。 0031 本发明中， EGFRvIII 表位抗原为一段 。

27、14 个氨基酸残基组成的多肽片段 ： Leu-Glu- Glu-Lys-Lys-Gly-Asn-Tyr-Val-Val-Thr-Asp-His-Cys。 0032 本发明中， EGFRvIII 表位抗原的嵌合位点可以是 HBc 分子的 N 端， C 端及 HBc 优势 免疫环中的一个或者多个。 0033 本发明通过以下方法制备靶向表皮生长因子受体突变体 3 的嵌合乙肝核心抗原 治疗性疫苗 ： 0034 1， 制备嵌合乙肝病毒核心抗原， 0035 将编码表皮生长因子突变体 3（PEP-3） 的 DNA 片段， 通过常规的基因工程手段整 合入乙肝病毒核心抗原的 N 末段， C 末端或免疫优势区中的。

28、一个或者多个 ； 0036 2， 重组整合的 HBc-EGFRvIII 基因片段导入大肠杆菌， 酵母或其他系统的表达质 粒中进行表达优化， 制得嵌合乙肝病毒核心抗原 （HBc） ； 0037 3， 制得的嵌合嵌合 HBc 抗原纯化后与其他佐剂如 GM-CSF 等制成完整的治疗性疫 苗， 所述疫苗可制成溶液， 悬液， 气溶胶， 乳液， 固体或脱水物形式， 例如作为冻干粉在无菌 管形瓶中保存。 0038 给药途径为皮下注射给药、 粘膜给药， 剂型包括注射液、 气雾剂等。 0039 本发明中， 其他佐剂包括细胞因子， 氢氧化铝等， 但是不限定上述范围。 0040 本发明的治疗型疫苗中， EGFRvI。

29、II 表位和乙肝核心抗原 HBc 能同时诱导抗 EGFRvIII 和 HBc 的抗体及相应的细胞免疫， 对病毒性乙肝病人及肝癌具有协同治疗作用， 可用于临床中的肝癌及乙肝携带者肝癌病人。 对预防和减低我国原发性肝癌的发生率具有 显著地临床意义。 附图说明 0041 图 1 是 HBc-EGFRvIII 融合蛋白发酵及纯化产物的 SDS-PAGE 和 dot-blot 分析， 其 中， 泳道 1-2 为发酵产物， 泳道 3 为低分子量蛋白标准， 泳道 4 为纯化产物。 0042 图 2 是抗 EGFRvIII 及 HBc 抗体滴度检测， 0043 其中， 融合蛋白疫苗免疫 2 次后一周， 用 E。

30、LISA 方法检测抗 EGFRvIII 及 HBc 抗体 滴度， 与生理盐水对照组相比， 本发明疫苗组能激发高强度的体液免疫效果。 0044 图 3 是 IL4 和 IFN 的检测， 0045 其中， 融合蛋白疫苗免疫 3 次后一周， 采集脾脏， 用流式细胞仪检测 IL4 和 IFN 阳性的细胞丰度， 结果显示， 发现融合蛋白免疫 3 次后， 与生理盐水组相比， 细胞免疫被明 显激活。 具体实施方式 0046 实施例 1 制备嵌合 HBc 重组菌 0047 编码乙肝核心抗原 HBc 的基因片段由乙肝病毒颗粒经 PCR 方法获得， 截取 1-149 个氨基酸残基， 5 和 3 端分别加上 Bam。

31、HI 和 PstI 的酶切位点。编码 EGFRvIII 的表位抗 原 PEP-3（Leu-Glu-Glu-Lys-Lys-Gly-Asn-Tyr-Val-Val-Thr-Asp-His-Cys） 的 DNA 片段用 重叠 PCR 的方法插入 HBc 免疫优势区 78-79 位氨基酸残基中间。将嵌合的 HBc 片段通过 说 明 书 CN 103463633 A 6 5/5 页 7 BamHI和PstI的酶切， 连接导入大肠杆菌表达质粒PcoldIV， 重组大肠杆菌表达质粒导入大 肠杆菌表达宿主菌 JM109。 0048 实施例 2 嵌合 HBc-EGFRvIII 融合蛋白的发酵和纯化 0049 。

32、将鉴定阳性的重组菌落接入 5mL LB 培养液中 ,37振荡培养至培养液的 A600 达 0.4-0.6。各取 2mL 培养菌液加入 200mL 氨苄青霉素的 LB 培养液中 , 振荡培养 3h, 然后加 入 IPTG 至终浓度为 1mmol/L, 低温培养 16h, 诱导蛋白表达。收集细菌用裂解缓冲液和超 声细胞粉碎机裂解细菌 , 分别收集上清和沉淀。将沉淀 ( 包涵体 ) 充分溶解于 8mol/L 尿 素中 , 室温 16h, 收集上清 , 在含复性液的透析袋中透析 48h, 收集上清即为复性后的表达 蛋白， 经离子交换柱和分子量， 纯化后经 SDS-PAGE 鉴定为 17kD 左右， 用。

33、 dot-blot 方法， 使 用 HBc 抗体检测， 发现表达和纯化的蛋白呈阳性反应， 结果如图 1 所示。 0050 实施例 3 疫苗诱导 EGFRvIII 特异性抗体及细胞免疫应答实验 0051 在 6 个雌性的 BALB/c 小鼠中试验， 每小鼠在 0， 21， 42 天皮下注射 10g 融合蛋白 和 10g 佐剂。另取 6 个雌性小鼠作为阴性对照， 注射生理盐水。在第二次免疫后一周， 检 测抗 EGFRvIII 的抗体， 结果如图 2 所示， 有超过 105的抗 EGFRvIII 表位的抗体滴度， 及超 过 103滴度的针对 HBc 的抗体滴度。在第三次免疫后一周， 检测脾脏中细胞免疫反应 （IL4 和 IFN） ， 结果如图 3 所示， 3 次免疫以后， HBc-EGFRvIII 融合蛋白疫苗能诱导大量的 IL4 及 IFN 细胞因子分泌， 引发有效的细胞免疫效应。 说 明 书 CN 103463633 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103463633 A 8 2/2 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 103463633 A 9 。