技术领域
本发明属于化学、生物与材料的交叉领域，具体涉及一种叶酸偶联羧甲基壳 聚糖纳米粒作为光控释放NO载体的制法。
背基技术
一氧化氮(NO)可被人体内皮细胞合成，是一种重要的生理调节剂，广泛分 布于全身多种器官，亦被认为是重要的生物信使分子。NO能有效防止血小板凝结 与活化，减少细菌粘附，并具有杀死癌细胞的功能。NO的缺乏会导致器官功能失 调，引发高血压、心脏病、呼吸系统疾病等。为治疗因NO缺乏而引起的各种疾病， 相关研究者设计并合成了多种NO供体，尤其是以偶氮二烯醇亲核NO供体为代表， 它们是近几年发展起来的一种性能优良的NO供体，通常是将含有仲胺基团的亲核 化合物与NO气体在一定压力下反应制得，能够在生理环境中自发释放NO。鉴于 此类NO供体制备条件苛刻(高压)以及制备产物释放NO难以控制(释放条件与 速率)等问题，在一定程度上抑制了它们的应用价值，发展一种更高效的NO供体， 兼具制备方法简单，产物稳定及NO释放可控等优点，已成为当前NO供体相关领 域重要的研究目标之一。
羧甲基壳聚糖(CMC)是壳聚糖经羧甲基化反应后生成的一种水溶性衍生物，性 质稳定，生物相容性高，可降解性好且毒性小。它既含有碱性阳离子(-NH3+)基团， 又含有弱酸性阴离子(-COO-)基团，是一种两亲性聚电解质，将CMC发展为纳米 粒药物(如NO)载体将具有良好应用前景。纳米粒药物载体分为被动靶向和主动 靶向，被动靶向是利用载体的亲/疏水性、静电吸附、载体尺寸/质量、pH值等理 化因素易被位于肝、脾、肺及骨髓的单核、巨噬细胞系统摄取，增强抗肿瘤药物对 位于单核/巨噬细胞系统的肿瘤化疗效果。相比而言，主动靶向的效果更显著，它 是通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，使药物能准确送达肿瘤细胞中，实现 恶性肿瘤细胞的靶向治疗。由于叶酸受体在肿瘤细胞外膜过度表达，说明肿瘤细胞 与叶酸(FA)之间存在密切关系，当FA通过侧基连接于CMC羧基(CMC-FA)，其依 然保持正常的受体亲和力，可通过受体胞吞作用被内在化。叶酸受体在多种人体肿 瘤细胞的过度表达为特效药物对肿瘤的靶向提供了一种有效方式，叶酸受体介导的 细胞摄粒过程，即为FA的选择性主动靶向作用(K.Sumanta，et a1.，J. Mater.Sci.∶ Mater.Med.，2010，21，1587)。
铁/硫/亚硝酰基离子簇Roussin粗苏打盐阴离子Fe4S3(NO)7-(RBS，Na+盐)可 被用作NO前体，早期研究证实了RBS可在紫外/可见波长光照射下，在生物学相 关浓度下产生NO释放，但在暗室，水溶性RBS是稳定的(F.W. Fliteny，et al.，Br.J. Pharmacol.，1992，107，842；F.W. Fliteny，et al.，Br.J. Pharmacol.，1996，117，1549)。 因此，将RBS负载进入CMC-FA纳米粒体系，可制得兼具生物相容、主动靶向及 肿瘤细胞内光控释放NO性质于一体的高质量纳米粒药物载体。
截至目前，有关CMC-FA纳米粒药物载体的制备方法已有中国专利报道，如 钱秀珍等设计了一种叶酸-羧甲基壳聚糖修饰的pH敏感多柔比星和紫杉醇脂质体 (公开号：CN102225051A和CN102488658A)，但尚未见基于CMC-FA纳米粒负 载RBS形成CMC-FA-RBS复合纳米粒NO载体(即新型NO供体)，及基于CMC-FA 纳米粒的光控释放NO体系制备的相关中国专利报道。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种方法简单，快 速、成本低的叶酸偶联羧甲基壳聚糖纳米粒作为光控释放NO载体的制法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种叶酸偶联羧甲基壳聚糖纳米 粒作为光控释放NO载体的制法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)称取质均分子量400kDa，脱乙酰度90％，羧甲基度1.112的羧甲基壳聚 糖粉末(CMC)溶于去离子水，用0.22μM滤纸过滤后制成CMC水溶液，向其中滴 加NaOH溶液，调节pH值为碱性，在避光下加入叶酸(FA)，磁力搅拌均匀，升高 至一定温度下反应；
(2)将反应后产物冷却至室温，用凝胶柱分离，于某一波长处监测洗脱过程， 收集洗脱时流出的第一波峰的溶液，然后将其冷冻干燥，得到叶酸偶联的羧甲基壳 聚糖(CMC-FA)偶联物；
(3)将所得CMC-FA偶联物溶于1％醋酸水溶液，制得CMC-FA的醋酸溶液， 加入Roussin粗苏打盐Fe4S3(NO)7-(RBS，Na+盐)，在磁力搅拌下滴加多聚磷酸钠 水溶液，然后继续搅拌反应，即得负载RBS的CMC-FA纳米粒混悬液；
(4)所得混悬液被超速离心，弃除上清夜，收集沉淀物，分散在去离子水中， 冷冻干燥，冻干样研磨至粉末状，即为CMC-FA-RBS纳米粒。
步骤(1)中所述的CMC浓度1～10mg/mL，pH7～9，CMC与FA质量比5～10∶1， 反应温度50～100℃，反应时间30～120min。
步骤(2)中所述的监测波长为360～370nm，冷冻干燥时间12～24h。
步骤(3)中所述的CMC-FA的醋酸溶液浓度5～10mg/mL，RBS钠盐浓度 0.1～0.5mmol/L，多聚磷酸钠浓度0.5～1.0mg/mL，反应时间30～120min。
步骤(4)中所述的离心速度5000～14000rpm/min，离心时间30～60mmin，冷 冻干燥时间12～24h。
与现有技术相比，本发明选用生物相容的羧甲基壳聚糖为载体，在其上偶联叶 酸，制备出具有肿瘤细胞叶酸受体靶向的偶联物，然后在RBS钠盐存在下进行物 理交联，得到负载RBS的羧甲基壳聚糖-叶酸复合物纳米粒载体。与现有技术相比， 本发明方法简单，快捷、成本低，制备产物可发展为兼具叶酸受体靶向和细胞内光 控释放一氧化氮的纳米粒载体，为高效的壳聚糖药物载体研究提供了一种新的发展 方向。
附图说明
图1为羧甲基壳聚糖-叶酸偶联物(CMC-FA)的结构示意图；
图2为负载RBS钠盐阴离子的CMC-FA偶联物(CMC-FA-RBS)纳米粒的化学 结构及作为纳米载体光控释放NO的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
羧甲基壳聚糖-叶酸偶联物(CMC-FA)及负载RBS钠盐阴离子的CMC-FA偶联 物(CMC-FA-RBS)纳米粒载体的结构示意图参见图1和2，详细的制备步骤如下： (1)配置5mg/mL的CMC水溶液，用NaOH溶液调节pH值为8.0，加入FA并调 节浓度至1mg/mL，在磁力搅拌下混合均匀，将混合液升温至60℃后反应60mmin。 (2)反应结束后将产物过凝胶柱分离，在363nm波长处收集洗脱液，冷冻干燥12h， 得到CMC-FA偶联物。(3)配置CMC-FA的水溶液5mg/mL，在磁力搅拌下加入 RBS钠盐并调节浓度至0.1mmol/L，再加入多聚磷酸钠并调节浓度为0.5mg/mL， 混合均匀的体系继续搅拌反应60min。(4)反应结束后将产物在10000rpm/min下 高速离心30min，去除上清液，收集沉淀物，冷冻干燥12h后得到CMC-FA-RBS 复合纳米粒。
采用氢核磁共振谱和红外光谱表征产物的组成，采用透射和扫描电子显微镜观 察产物的形貌，采用动态光散射仪测定产物的尺寸及分布，采用550nm可见光照 射产物使其释放NO，采用Griess试剂法测定产物释放的NO含量。
实施例2
配置6mg/mL的CMC水溶液，用NaOH溶液调节pH值为8.0，加入FA并调 节浓度至1.2mgg/mmL，在磁力搅拌下混合均匀，将混合液升温至60℃后反应60min。 反应结束后将产物过凝胶柱分离，在363nm波长处收集洗脱液，冷冻干燥12h， 得到CMC-FA偶联物。配置CMC-FA的水溶液6mg/mL，在磁力搅拌下加入RBS 钠盐并调节浓度至0.12mmol/L，再加入多聚磷酸钠并调节浓度0.6mg/mL，混合 均匀的体系继续搅拌反应60min。反应结束后将产物在10000rpm/min下高速离心 30min，去除上清液，收集沉淀物，冷冻干燥12h后得到CMC-FA-RBS复合纳米 粒。产物的表征手段与研究方法同实施例1。
实施例3
配置7mg/mL的CMC水溶液，用NaOH溶液调节pH值为8.5，加入FA并调 节浓度至1.4mg/mL，在磁力搅拌下混合均匀，将混合液升温至70℃后反应90min。 反应结束后将产物过凝胶柱分离，在363nm波长处收集洗脱液，冷冻干燥18h， 得到CMC-FA偶联物。配置CMC-FA的水溶液7mg/mL，在磁力搅拌下加入RBS 钠盐并调节浓度至0.14mmol/L，再加入多聚磷酸钠并调节浓度0.7mg/mL，混合 均匀的体系继续搅拌反应90min。反应结束后将产物在12000rpm/min下高速离心 45min，去除上清液，收集沉淀物，冷冻干燥24h后得到CMC-FA-RBS复合纳米 粒。产物的表征手段与研究方法同实施例1。
实施例4
配置8mg/mL的CMC水溶液，用NaOH溶液调节pH值为8.5，加入FA并调 节浓度至1.6mg/mL，在磁力搅拌下混合均匀，将混合液升温至70℃后反应90min。 反应结束后将产物过凝胶柱分离，在363nm波长处收集洗脱液，冷冻干燥18h， 得到CMC-FA偶联物。配置CMC-FA的水溶液8mg/mL，在磁力搅拌下加入RBS 钠盐并调节浓度至0.16mmol/L，再加入多聚磷酸钠并调节浓度0.8mg/mL，混合 均匀的体系继续搅拌反应90min。反应结束后将产物在12000rpm/min下高速离心 45min，去除上清液，收集沉淀物，冷冻干燥24h后得到CMC-FA-RBS复合纳米 粒。产物的表征手段与研究方法同实施例1。
实施例5
配置10mg/mL的CMC水溶液，用NaOH溶液调节pH值为9.0，加入FA并 调节浓度至2.0mg/mL，在磁力搅拌下混合均匀，将混合液升温至80℃后反应120 min。反应结束后将产物过凝胶柱分离，在363nm波长处收集洗脱液，冷冻干燥 24h，得到CMC-FA偶联物。配置CMC-FA的水溶液10mg/mL，在磁力搅拌下加 入RBS钠盐并调节浓度至0.2mmol/L，再加入多聚磷酸钠并调节浓度1.0mg/mL， 混合均匀的体系继续搅拌反应120min。反应结束后将产物在12000rpm/min下高 速离心45min，去除上清液，收集沉淀物，冷冻干燥24h后得到CMC-FA-RBS复 合纳米粒。产物的表征手段与研究方法同实施例1。
实施例6
配置10mg/mL的CMC水溶液，用NaOH溶液调节pH值为7.0，加入FA并 调节浓度至1.0mg/mL，在磁力搅拌下混合均匀，将混合液升温至100℃后反应30 min。反应结束后将产物过凝胶柱分离，在370nm波长处收集洗脱液，冷冻干燥 12h，得到CMC-FA偶联物。配置CMC-FA的水溶液5mg/mL，在磁力搅拌下加入 RBS钠盐并调节浓度至0.1mmol/L，再加入多聚磷酸钠并调节浓度0.5mg/mL，混 合均匀的体系继续搅拌反应30min。反应结束后将产物在14000rpm/min下高速离 心30min，去除上清液，收集沉淀物，冷冻干燥12h后得到CMC-FA-RBS复合纳 米粒。产物的表征手段与研究方法同实施例1。
实施例7
配置5mg/mL的CMC水溶液，用NaOH溶液调节pH值为9.0，加入FA并调 节浓度至1.0mg/mL，在磁力搅拌下混合均匀，将混合液升温至50℃后反应120min。 反应结束后将产物过凝胶柱分离，在360nm波长处收集洗脱液，冷冻干燥24h，得 到CMC-FA偶联物。配置CMC-FA的水溶液10mg/mL，在磁力搅拌下加入RBS 钠盐并调节浓度至0.5mmol/L，再加入多聚磷酸钠并调节浓度1mg/mL，混合均匀 的体系继续搅拌反应120mmin。反应结束后将产物在5000rpm/min下高速离心60min， 去除上清液，收集沉淀物，冷冻干燥24h后得到CMC-FA-RBS复合纳米粒。产物 的表征手段与研究方法同实施例1。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术 人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润 饰也应视为本发明的保护范围。