使用含有载脂蛋白AI及其突变体的重组高密度脂蛋白的雷帕霉素制剂.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103354749 A (43)申请公布日 2013.10.16 CN 103354749 A *CN103354749A* (21)申请号 201180062879.7 (22)申请日 2011.10.25 10-2010-0104942 2010.10.26 KR A61K 47/42(2006.01) A61K 9/20(2006.01) A61K 31/436(2006.01) A61P 9/10(2006.01) (71)申请人 岭南大学校产学协力团 地址 韩国庆尚北道 (72)发明人 曹京铉 (74)专利代理机构 北京信慧永光知识产权代理 有限责任公司 1。

2、1290 代理人 张淑珍 杨国强 (54) 发明名称 使用含有载脂蛋白 A-I 及其突变体的重组高 密度脂蛋白的雷帕霉素制剂 (57) 摘要 本发明涉及使用包含载脂蛋白突变体的重组 高密度脂蛋白的雷帕霉素制剂。更具体而言， 本 发明涉及如下雷帕霉素制剂 ： 该制剂通过使用包 含 V156K 载脂蛋白突变体的重组高密度脂蛋白， 改善了雷帕霉素的溶解度并增强了多种医疗效果 （如抗老化和抗动脉硬化） 。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2013.06.26 (86)PCT申请的申请数据 PCT/KR2011/007966 2011.10.25 (87)PCT申请的公布数据 WO。

3、2012/057492 KO 2012.05.03 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103354749 A CN 103354749 A *CN103354749A* 1/1 页 2 1. 雷帕霉素制剂， 基于总重量为 100 重量份的重组高密度脂蛋白， 所述雷帕霉素制剂 包含 0.1-10 重量份的雷帕霉素， 其中， 所述重组高密度脂蛋白包含载脂蛋白突变体 V156K， 所述载脂蛋白突变体 V156K。

4、 由载脂蛋白 （apoA-I） 第 156 位的氨基酸被赖氨酸取代而制备。 2. 如权利要求 1 所述的雷帕霉素制剂， 其中， 所述重组高密度脂蛋白包含载脂蛋白突 变体 V156K、 磷脂、 胆固醇和胆酸钠。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的雷帕霉素制剂， 其中， 所述重组高密度脂蛋白包含如下摩 尔比的载脂蛋白突变体 V156K、 磷脂、 胆固醇和胆酸钠 ： 载脂蛋白突变体 V156K: 磷脂 : 胆固 醇 : 胆酸钠为 90-100:1-10:0.1-2.0:120-180。 4.如权利要求1或2所述的雷帕霉素制剂， 其中， 基于总重量为100重量份的载脂蛋白 突变体 V156K， 所述。

5、雷帕霉素的量为 0.1-20 重量份。 5.如权利要求1或2所述的雷帕霉素制剂， 其中， 所述雷帕霉素制剂防止老化或改善动 脉硬化。 6. 雷帕霉素制剂的制备方法， 所述方法包括 ： 制备载脂蛋白突变体 V156K， 所述载脂蛋白突变体 V156K 由载脂蛋白 （apoA-I） 第 156 位的氨基酸被赖氨酸取代而制备 ； 将所述载脂蛋白突变体 V156K 与磷脂、 胆固醇和胆酸钠混合， 以制备重组高密度脂蛋 白 ； 以及 将雷帕霉素添加至所述重组高密度脂蛋白。 权 利 要 求 书 CN 103354749 A 2 1/5 页 3 使用含有载脂蛋白 A-I 及其突变体的重组高密度脂蛋白的 雷帕。

6、霉素制剂 技术领域 0001 本发明涉及包含重组高密度脂蛋白的雷帕霉素 (rapamycin) 制剂， 所述重组高密 度脂蛋白包含载脂蛋白A-I及其突变体V156K， 以改善雷帕霉素的溶解度和医疗用途(如抑 制老化和抑制动脉硬化 )。 背景技术 0002 雷帕霉素的分子量为 913.6Da， 是一种 31 元环的大环内酯类化合物， 其化学式为 C51H79NO13。由于哌啶甲酸酯 (pipecolate) 酰胺键附近的空间位阻作用， 雷帕霉素在溶液中 以 4 1 的比例形成结构上的反式异构体与顺式异构体 ( 在氯仿溶液中 )。雷帕霉素几乎 不溶于水、 脂肪烃和二乙醚， 但溶于醇、 卤代烃和二甲。

7、亚砜。在 37的温度下， 在血浆、 低 pH 值和中性pH值的缓冲溶液中， 处于溶液状态的雷帕霉素是不稳定的， 并且以小于10小时的 半衰期分解。 0003 特别地， 雷帕霉素具有多种生物活性， 例如抗真菌活性、 抗癌活性和免疫抑制活 性 ； 而且， 雷帕霉素还被报道为寿命延长药物。 此外， 雷帕霉素被用作医疗装置(例如支架) 的涂布剂。 0004 然而， 雷帕霉素具有低生物利用度和溶解度。为了克服该缺点， 已合成了许多 雷帕霉素衍生物 ： 羧酸酯类 (PCT WO92/05179) ； 氨基甲酸酯类 (US5,118,678) ； 碳酸酯 类 (US5,260,300) ； 酰胺酯类 (US。

8、5,118,678) ； 含氟酯类 (US5,100,883) ； 缩醛 (acetal) (US5,151,413) ； 硅 醚 类 (silyl ethers)(US5,120,842) ； 二 环 衍 生 物 (US5,120,725) ； 雷帕霉素二聚体 (US5,120,727) ； 以及 O- 芳香基、 O- 烷基、 O- 烯基和 O- 炔基衍生物 (US5,258,389) ； 以及多种雷帕霉素药物前体 (US5,672,605、 US5,583,139、 US5,527,907、 US5,457,111、 US5,955,100、 US6,146,658 和 US5,935,9。

9、95)。 0005 然而， 基于提高雷帕霉素溶解度而对具有改善的生物利用度的药物所进行的开发 仍然受到限制。因此， 需要对改善雷帕霉素溶解度的药物进行开发。 发明内容 0006 技术问题 0007 本发明的发明人针对改善雷帕霉素的溶解度进行了研究， 并发现通过使用重组高 密度脂蛋白 ( 含有载脂蛋白突变体 V156K) 包封雷帕霉素时， 雷帕霉素的溶解度得以改善 ； 并且其医疗用途 ( 如抑制老化和抑制动脉硬化 ) 得以改善， 从而完成了本发明。 0008 本发明提供了一种用于改善雷帕霉素溶解度及其医疗用途 ( 如抑制老化和抑制 动脉硬化 ) 的新型雷帕霉素制剂， 并提供了制备所述雷帕霉素制剂。

10、的方法。 0009 技术方案 0010 根据本发明实施方式所述的雷帕霉素制剂基于总重量为 100 重量份的重组高密 度脂蛋白， 包含 0.1-10 重量份的雷帕霉素， 其中， 所述重组高密度脂蛋白包含载脂蛋白突 说 明 书 CN 103354749 A 3 2/5 页 4 变体 V156K， 所述载脂蛋白突变体 V156K 由载脂蛋白 (apoA-I) 第 156 位的氨基酸被赖氨酸 取代而制备。 0011 有益效果 0012 根据本发明的雷帕霉素制剂是通过使用重组高密度脂蛋白 ( 包含载脂蛋白突变 体 V156K) 包封雷帕霉素而制备的。由于该包封作用， 具有低溶解度和生物利用度的雷帕霉 素。

11、的溶解度得以改善， 并且其老化抑制作用和动脉硬化抑制作用也得以改善。 附图说明 0013 图1A显示了重组高密度脂蛋白在非变性(native)状态下的电泳结果 ； 图1B显示 了重组高密度脂蛋白粒子中 apoA-I 分子的数量。 0014 图 2 显示了根据本发明实施方式所述的雷帕霉素制剂的还原作用。 0015 图 3 是显示根据本发明实施方式所述的雷帕霉素制剂的 LDL 抗氧化作用的图。 0016 图4显示了反映出根据本发明实施方式所述的雷帕霉素制剂的LDL抗氧化作用的 琼脂糖电泳结果。 0017 图 5 显示了根据本发明实施方式所述的雷帕霉素制剂的 CETP 抑制作用。 0018 图 6 。

12、和图 7 显示了根据本发明实施方式所述的雷帕霉素制剂的抗老化作用。 具体实施方式 0019 根据本发明实施方式所述的雷帕霉素制剂基于总重量为 100 重量份的重组高密 度脂蛋白， 包含 0.1-10 重量份的雷帕霉素， 其中， 所述重组高密度脂蛋白包含载脂蛋白突 变体 V156K， 所述载脂蛋白突变体 V156K 由载脂蛋白 (apoA-I) 第 156 位的氨基酸被赖氨酸 取代而制备。 0020 在这点上， 当雷帕霉素的量超过上限时， 会使雷帕霉素过量包含于雷帕霉素制剂 中， 其溶解度可能很低、 并且雷帕霉素可能沉淀。 然而， 当以非常小的量包含雷帕霉素时， 雷 帕霉素含量可能不足、 并且雷。

13、帕霉素的作用可能很小。 0021 重 组 高 密 度 脂 蛋 白 可 包 含 如 下 摩 尔 比 的 载 脂 蛋 白 突 变 体 V156K、 磷 脂、 胆 固 醇 和 胆 酸 钠 ： 载 脂 蛋 白 突 变 体 V156K 磷 脂 胆 固 醇 胆 酸 钠 为 90-100 1-10 0.1-2.0 120-180。 0022 在这点上， 当载脂蛋白突变体 V156K 的量在此含量范围之外时， 蛋白质可能会沉 淀 ； 当磷脂和胆固醇的量在这些范围之外时， 可能会发生高密度脂蛋白形成障碍 ； 当胆酸 钠的量在此范围之外时， 可能会发生脂蛋白形成障碍。 0023 基于总重量为 100 重量份的载脂。

14、蛋白突变体 V156K， 雷帕霉素的量可以为 0.1-20 重量份。 在这点上， 当雷帕霉素的量超过上限并被过量包含时， 可能会发生蛋白质沉淀和脂 蛋白形成障碍 ； 当雷帕霉素的量很小时， 雷帕霉素含量可能不足、 并且雷帕霉素的作用可能 会降低。 0024 根据本发明实施方式所述的雷帕霉素制剂有利于提高具有低溶解度和生物利用 度的雷帕霉素的溶解度。特别地， 根据本发明实施方式所述的雷帕霉素制剂有利于改善雷 帕霉素的老化抑制作用和动脉硬化抑制作用。 0025 雷帕霉素制剂可以制备为口服给药制剂， 例如， 片剂、 糖锭剂 (troches)、 锭剂 说 明 书 CN 103354749 A 4 3。

15、/5 页 5 (lozenge)、 水性或油性混悬剂、 散剂 (prepared powder) 或颗粒剂、 乳剂、 硬胶囊剂或软 胶囊剂、 糖浆或酏剂 (elixirs)。为了制备片剂和胶囊剂， 可以使用粘合剂， 如乳糖、 蔗糖 (sacarose)、 山梨糖醇、 甘露醇、 淀粉、 支链淀粉 (amilopectin)、 纤维素或明胶 ； 赋形剂， 如 磷酸二钙 ； 崩解剂， 如玉米粉或红薯粉 ； 以及润滑剂， 如硬脂酸镁、 硬脂酸钙、 硬脂富马酸钠 或聚乙二醇蜡。除了这些材料之外， 胶囊剂还可包含液态载体， 如脂肪油。 0026 此外， 雷帕霉素制剂可以为非口服给药制剂。非口服给药可以是通。

16、过脸颊、 肛门、 阴道、 结膜或鼻内组织进行的静脉给药、 动脉内给药、 肌内给药、 经皮给药、 肺内给药、 皮下 给药、 皮内给药或鞘内给药 ； 或者， 非口服给药可以通过接种或移植入例如癌组织中而进 行。非口服给药制剂可以依照如下方式制备 ： 将重组高密度脂蛋白与稳定剂或缓冲液在水 中混合， 以制备得到溶液或悬浮液 ； 然后， 将混合物制备为安瓿单位剂型或小瓶单位剂型。 0027 此外， 在一般情况下， 基于每 1kg 成年患者的体重， 雷帕霉素制剂用于医疗用途 (如抑制老化或抑制动脉硬化)的剂量可以为15-45mg/天、 或45-80mg/天 ； 并且， 基于医师 或药剂师的判断， 所述剂。

17、量可以给予一次或多次、 优选以预定的时间间隔每天给予 2-3 次。 0028 此外， 本发明提供雷帕霉素制剂的制备方法， 其中， 所述方法包括 ： 将载脂蛋白 (apoA-I)第156位的氨基酸用赖氨酸取代， 以制备载脂蛋白突变体V156K ； 将所述载脂蛋白 突变体 V156K 与磷脂、 胆固醇和胆酸钠混合， 以制备重组高密度脂蛋白 ； 以及将雷帕霉素添 加至所述重组高密度脂蛋白。 0029 实施例 0030 在下文中， 本发明的实施方式将通过以下实施例详细描述。本文描述的实施例仅 为说明目的而提供。 0031 实施例 1 包含雷帕霉素的重组 HDL(rHDL) 的制备 0032 1.WT 。

18、apoA-I 和 V156K-apoA-I 的制备 0033 在大肠杆菌表达系统中使用 pET30a(+) 表达载体和 BL21(DE3) 宿主表达 WT apoA-I(SEQ ID NO ： 1) 和 V156K-apoA-I(SEQ ID NO ： 2)。随后， 根据已知方法 (European Journal of Clinical Investigation， 36 ： 875-882， 2006)将所得产物经Ni2+柱色谱纯化， 直至纯度水平达到至少 95以上。 0034 2. 包含雷帕霉素的 rHDL 的制备 0035 使 用 胆 酸 钠 透 析 制 备 包 含 雷 帕 霉 素 的。

19、 重 组 高 密 度 脂 蛋 白 ( 重 构 的 (reconstituted)高密度脂蛋白)(rHDL)(J Lipid Res， 46 ： 589-596， 2005)。 在这点上， 棕榈 酰油酰磷脂酰胆碱 (pamitoyloleoyl phosphatidylcholine， POPC) 胆固醇 WT apoA-I 和 V156K-apoA-I 中的任一种 apoA-I 胆酸钠的初始摩尔比为 95 5 1 150。将不同 浓度的雷帕霉素溶于该rHDL中， 由此确定当1mL rHDL中含有0.1mg雷帕霉素和1mg apoA-I 时， 雷帕霉素的溶解度最优。 0036 0.09mg/mL。

20、雷帕霉素很好地溶解于包含WT apoA-I和V156K-apoA-I中的任一种的 rHDL 中 (1mg/mL 蛋白质 )。 0037 3. 包含雷帕霉素的 rHDL 的表征 0038 根据相同发明人先前发表的论文 (J Lipid Res， 46 ： 589-596， 2005)， 使用 8-25 的聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳(PAGGE， Pharmacia Phast系统)鉴定粒度分布， 并与参比球蛋 白进行比较。 说 明 书 CN 103354749 A 5 4/5 页 6 0039 其结果是， 如图 1 所示， 包含雷帕霉素的 V156K-rHDL 的主要条带显示其粒径为约 略大于包含雷。

21、帕霉素的 WT-rHDL(WT-rapa-rHDL) 的粒径此外， 不含雷帕霉 素的 V156K-rHDL 的粒径为约此外， 与 WT-rapa-rHDL 相比， V156K-rHDL 显示出表示粒 径为约的大条带。因此， 确认 V156K-rHDL 具有更好的雷帕霉素包封能力。 0040 使用双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯 (BS3) 交联对雷帕霉素存在下每 rHDL 粒子中 apoA-I分子的数量进行分析(J Lipid Res， 46 ： 589-596， 2005)。 在这点上， 使用SDS-PAGE， 在 8-25梯度凝胶上分析与 BS3 交联所得的反应产物。 0041 其结果是， 对于包。

22、含雷帕霉素的 rHDL， 每个粒子包含四个 apoA-I 分子 ； 而对于不 含雷帕霉素的 rHDL， 每个粒子包含两个或三个 apoA-I 分子。基于该结果， 确认需要更多的 apoA-I 分子以溶解雷帕霉素。 0042 实施例 2 抗氧化活性检测 0043 1. 铁离子还原能力检测 0044 使用由 Benzie 和 Strain 公开的方法 (Anal Biochem， 239 ： 70-6， 1996) 测定血浆 的铁离子还原能力(FRAP)。 即， 通过将25mL0.2M的乙酸盐缓冲液(pH3.6)、 2.5mL10mM的2， 4， 6-三吡啶-s-三嗪(TPTZ)和2.5mL20m。

23、M的FeCl3 6H2O混合制备FRAP试剂。 通过测量由 二价铁离子产生而导致的吸光度增加来测定 rHDL 的抗氧化活性。将制备得到的 FRAP 试剂 (300L) 与等量的稀释 rHDL(2mg/ml， 10L) 混合， 然后使用 DU800 分光光度计 (Beckman Coulter)， 在 25的温度下， 以 10 分钟的间隔， 每 20 秒在 593nm 的波长处测量它们的吸光 度。在这点上， 所使用的 DU800 分光光度计包含 MultiTemp III 热循环装置。 0045 其结果是， 如图 2 所示， 不含雷帕霉素的 V156K-rHDL 和 WT-rHDL 的抗氧化活性。

24、增 加四倍 ； 而 V156K-rapa-rHDL 和 WT-rapa-rHDL 的铁离子还原能力分别增加十倍和六倍。 0046 2. 铜介导的 LDL 氧化抑制活性检测 0047 针对铜介导的 LDL 氧化的抗氧化活性通过如下方式进行检测 ： 在 10M CuSO4存 在的情况下， 使 300gLDL 与相应的包含雷帕霉素的 rHDL( 终浓度 10g/mL) 反应 2 小 时。在反应过程中， 使用 DU800 分光光度计， 由温度为 24.5、 波长为 234nm 时的吸光度而 测量所形成的共轭二烯的量。在这点上， 所使用的 DU800 分光光度计包括 MultiTemp III 热循环装。

25、置。共轭二烯水平表示为 A234与 A280的比， 这是在考虑分子吸光系数 (molecular absorption coefficient)(apoA-I280 1.13M-1cm-1) 的情况下通过使用分光光度计测量 的。 0048 其结果是， 如图 3 所示， 直至 80 分钟的反应时间中， 所有 rHDL 显示了出色的氧 化抑制活性 ； 直至 150 分钟的反应时间中， 无论雷帕霉素存在与否， V156K-rHDL 显示出比 WT-rHDL 更好的氧化抑制活性。 0049 反应结束后， 通过琼脂糖凝胶电泳比较 LDL 的氧化水平。其结果是， 如图 4 所示， 以浓度依赖性的方式， 经。

26、rHDL处理的LDL显示出低迁移率， 由此显示良好的抗氧化作用， 并 表明 V156K-rapa-rHDL 的抗氧化作用增强。即使在相同浓度下， 当溶于 rHDL 中时， 可以获 得比只用雷帕霉素处理时更好的抗氧化作用。 0050 实施例 3 胆固醇酯转运蛋白 (CETP) 分析 0051 根据由 Cho 等人公开的方法 (Biochim Biophys Acta， 1391 ： 133-44， 1998)， 通 过使用微量的 3H- 胆固醇油酸酯 (TRK886， 3.5Ci/mg apoA-I ； GE Healthcare)， 合 说 明 书 CN 103354749 A 6 5/5 页。

27、 7 成包含 apoA-I 的 rHDL 和胆固醇油酸酯。为了促使其与 CE 受体分离， 使用 CNBr 活化的 Sepharose4B 树脂 (Amersham Biosciences) 固定 rHDL。在 300L 反应混合物中进行 CE 转移反应。所述反应混合物包含作为胆固醇酯转运蛋白 (CETP) 供体源的放射性同位素标 记的 3H-CE-rHDL- 琼脂糖 (0.05mL) 以及作为胆固醇酯 (CE) 受体源的人 LDL(0.05L， 0.25mg/mL)。在 37的温度下反应后， 将反应产物在 4的温度下离心 (10,000g)3 分钟以 终止反应。将上清液 (150L) 进行闪烁。

28、计数以计算由 rHDL 转移至 LDL 的 3H-CE 的百分 比。 0052 其结果是， 如图 5 所示， 雷帕霉素本身没有显示出适当的 CETP 抑制活性 ； V156K-rapa-rHDL(3.5M 蛋白 ) 在 10M 雷帕霉素下显示出 29的 CETP 抑制活性 ； WT-rapa-rHDL(3.5M 蛋白 ) 没有显示出适当的 CETP 抑制活性。 0053 实施例 4 细胞老化抑制分析 0054 在 100mm 培 养 皿 中， 以 1105个 细 胞 的 浓 度， 使 用 Dulbecco s modified Eagle s Medium(DMEM) 培养基， 在 5 CO2。

29、浸润的培养箱中培养原代人皮肤成纤维细胞 (HDF)。 当传代培养至汇合度为80-90时， 将细胞用胰蛋白酶进行处理， 并根据相同发明人 的在先文献(J.Gerontol.A.Biol.Sci.Med.Sci.2010 ； 65(6) ： 600-610)监测群体倍增(PD) 数。在实验中， 对 6 代细胞 (PD 24) 进行传代培养以制备足够数量的细胞。 0055 根据已知方法(Proc Natl Acad Sci USA92(1995)9363-9367)， 通过比较与细胞老 化相关的半乳糖苷酶 (SA-gal) 的活性以评价老化水平。即， 使细胞在 3的多聚甲醛 中 ( 溶解于 PBS 。

30、中 ) 固定 5 分钟， 用 PBS 洗涤三次， 并在 37的温度下于 SA-gal 染色 溶液 (40mM 柠檬酸 / 磷酸盐 pH6.0、 5mM 亚铁氰化钾、 5mM 铁氰化钾、 150mM NaCl、 2mMMgCl2 和 1mg/mL5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚基 -X- 半乳糖苷酶 ) 中培养 16 小时。在相衬显微镜下， 计 算染成蓝色的老化细胞的百分比。染色后， 通过使用计算机辅助的形态测量仪， 利用 Image Proplus 软件 ( 版本 4.5.1.22 ； Media Cybernetics， Bethesda， MD， USA)， 由随机选取的相 同细胞的数目。

31、量化细胞尺寸。 0056 其结果是， 如图 6 和图 7 所示， 在相同传代数的情况下， 当与 V156K-rHDL 相比较 时， WT-rHDL 处理组显示出更多的 SA-gal 阳性细胞。在 17 代时， WT-rHDL 和 V156K-rHDL 分别显示出 70和 49的 SA-gal 阳性细胞。然而， 在终浓度为 1M 的雷帕霉素存在 的情况下， WT-rapa-rHDL 和 V156-rapa-rHDL 分别显示出 52和 29的染色细胞。与雷帕 霉素单独处理组相比， V156K-rapa-rHDL 处理组显示出少得多的 SA-gal 染色细胞数量。 因此， 可以预期 V156K 和。

32、雷帕霉素的协同抗老化作用。 0057 序列表自由文字 0058 SEQ ID NO ： 1 表示野生型 apoA-I 的氨基酸序列。 0059 SEQ ID NO ： 2 表示 V156K-apoA-I 的氨基酸序列。 说 明 书 CN 103354749 A 7 1/2 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103354749 A 8 2/2 页 9 序 列 表 CN 103354749 A 9 1/3 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103354749 A 10 2/3 页 11 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103354749 A 11 3/3 页 12 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103354749 A 12 。