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肝素修饰的阿霉素脂质体制剂及其制备方法.pdf

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文档编号：8174663

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1、(10)申请公布号 CN 103720658 A (43)申请公布日 2014.04.16 CN 103720658 A (21)申请号 201410005857.2 (22)申请日 2014.01.07 A61K 9/127(2006.01) A61K 9/19(2006.01) A61K 47/28(2006.01) A61K 47/24(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (71)申请人中国药科大学地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大。

2、道 639 号 (72)发明人柯学陈艺韩苗苗胡丹蓉鞠明珠 (54) 发明名称肝素修饰的阿霉素脂质体制剂及其制备方法 (57) 摘要本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种肝素修饰的阿霉素脂质体 (Hep-DOX-Lip) 制剂，其特征是由阿霉素 1 份、肝素 1 4 份、大豆卵磷脂 530份、胆固醇0.54份、阳离子材料0.5份，本发明还公开了这种肝素修饰的阿霉素脂质体的制备方法。本发明用肝素修饰阿霉素脂质体，具有类似 PEG 化的效果，可显著提高阿霉素脂质体的稳定性，延长药物的体内半衰期，提高药物的生物利用度，同时可显著降低化疗药物的毒副作用，。

3、提高患者的顺应性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 9 页附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书9页附图3页 (10)申请公布号 CN 103720658 A CN 103720658 A 1/1 页 2 1. 一种肝素修饰的阿霉素脂质体，其特征是含下列组分及重量比：。 2. 权利要求 1 的肝素修饰的阿霉素脂质体制剂，其特征是各组分的重量比为：。 3. 权利要求 1 或 2 的肝素修饰的阿霉素脂质体制剂，其中肝素选普通肝素、达肝素钠、依诺肝素、纳肝素钙、帕肝素钠、汀肝素钠中的一种或几。

4、种。 4. 权利要求 1 或 2 的肝素修饰的阿霉素脂质体制剂，其中阳离子材料选氯化三甲基 -2， 3- 二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基 -2， 3- 二油酰氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基 -2， 3- 二油烯氧基丙基 -2-(2- 精胺甲酰氨基 ) 乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基双十八烷基铵、 N-(2- 精胺甲酰基 )-N ， N - 双十八烷基甘氨酰胺、 1， 2- 二油酰 -3- 琥珀酰 -sn- 甘油胆碱酯、 3-N-(N ， N - 二甲基胺乙基 ) 胺基甲酰基胆固醇、脂质多聚 -L- 赖氨酸、硬脂胺中的一种。

5、或几种。 5. 权利要求 1 或 2 的肝素修饰的阿霉素脂质体制剂，还含有冻干保护剂。 6. 权利要求 5 的肝素修饰的阿霉素脂质体制剂，其中冻干保护剂选自蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇中的一种或几种。权利要求书 CN 103720658 A 2 1/9 页 3 肝素修饰的阿霉素脂质体制剂及其制备方法技术领域 0001 本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种肝素修饰的阿霉素脂质体 (Hep-DOX-Lip) 制剂，本发明还公开了这种 Hep-DOX-Lip 制剂的制备方法。背景技术 0002 肝素 (heparin，。

6、Hep) 是一种酸性的粘多糖，被证明可以安全、广泛、有效的预防癌症并发的静脉血栓。研究者们还兴奋地发现辅助使用肝素进行治疗，可显著延长恶性肿瘤患者的寿命。因此，肝素不仅是一种临床可用的抗血栓药，肝素的其它生物活性使其具有更广泛的应用价值。例如：大量动物实验证实，肝素可以通过抑制选择素介导的细胞间黏附从而抑制肿瘤细胞的转移。肝素也可以促进组织因子旁路途径抑制物 (Tissue Factor Pathway Inhibitor， TFPI) 的释放并干预肿瘤组织血管新生。 0003 不仅如此，肝素还可以代替 PEG 作为药物载体的亲水性修饰材料。一般的纳米药物载体在体。

7、内循环的时候，会很快被肝脏脾脏的巨噬细胞所吞噬，从而丧失疗效。为了降低对载体的吞噬，阻碍血浆蛋白对纳米粒子的吸附，延长纳米粒子在血液中的循环时间，以进一步提高靶向效果，人们进行了大量的研究。结果发现，用亲水性聚合物材料修饰可使给药载体取得满意的长循环效果(亦被称之为隐形效果)。亲水性材料PEG常用于载体修饰，以达到长循环的目的。但是， PEG 修饰的载体在体内中也存有诸多弊端和一些不能忽视的问题，如静脉重复注射 PEG 化脂质体可加速血液清除 (accelerated blood clearance， ABC)，这种 ABC 现象是指间隔几天向同一动物重复注。

8、射 PEG 化脂质体时，第 2 次注射的 PEG 化脂质体在血液循环中被迅速清除，肝脾分布显著增加，从而大大限制了其临床应用。肝素是一种天然的粘多糖，带大量负电荷呈强酸性，并极溶于水。Byung Cheol Shin 等人发现，肝素作为亲水性修饰材料，具有类 PEG 化的作用，修饰后的载体表现出更为出色的长循环效果和血清稳定性。 0004 本发明选择的模型药物为阿霉素 (Doxorubicin， DOX)。DOX 最早是 1969 年从松链丝菌浅灰色变株(Str.Peucetius var caesius)中提取分离到的，为橙红色结晶粉末，别名多柔比星、羟柔。

9、红霉素、 14- 羟正定霉素，熔点 204-205，分子量为 579.98。其结构中带有羟基，呈弱碱性。由于其自身脂溶性较强而难溶于水，常将其制备成盐酸阿霉素，以增加其水溶解度。阿霉素具有很强的抗癌活性，被广泛用于治疗黑色素瘤、急性白血病、非何杰金氏淋巴瘤、肉瘤、多发性骨髓瘤及乳腺癌，肝癌、胃癌、小细胞型肺癌、宫颈癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤。但是，阿霉素在发挥治疗作用的同时，也会产生很多毒副作用如呕吐、恶心、脱发、骨髓抑制及胃肠道毒性等常见不良反应。除此之外，由于阿霉素类化合物与心肌的亲和力明显高于其他组织，并能产生半醌代谢物损害心肌细。

10、胞，因而导致严重的剂量依赖性心脏毒性，表现为各种心率失常，甚至是不可逆的心肌损伤及充血性心力衰竭。这些毒副作用使其临床应用受到极大的限制。近年来，大量文献报道指出纳米载体包裹阿霉素，能大大降低阿霉素的毒副作用，提高药物治疗的靶向性。阿霉素脂质体更成为了该领域的研究热点，目前已有多种阿霉素脂质体制剂上市销售。说明书 CN 103720658 A 3 2/9 页 4 0005 本发明是在构建阿霉素阳离子脂质体 (DOX-Lip) 的基础上，通过静电吸附的方式结合带大量负电荷的肝素。本发明用肝素修饰阿霉素脂质体，发现具有类似 PEG 化的效果。SD 大鼠体内药。

11、动学实验证明， Hep-DOX-Lip 能显著延长阿霉素的体内半衰期，提高阿霉素的体内生物利用度，同时降低了阿霉素的毒副作用。小鼠尾静脉急性毒性实验结果证明 Hep-DOX-Lip 的安全性大大提高，表明制剂可降低化疗药物的毒副作用，提高患者的顺应性。发明内容 0006 本发明公开了一种临床适用的肝素修饰阿霉素脂质体 (Hep-DOX-Lip) 及其注射用冻干粉，该 Hep-DOX-Lip 冻干粉在加入注射用生理盐水后能重新分散。 0007 本发明的 Hep-DOX-Lip 制剂，含下列组分及重量比： 0008 阿霉素 1 0009 肝素 1 4 0010 大豆卵磷脂。

12、5 30 0011 胆固醇 0.5 4 0012 阳离子材料 0.5 0013 本发明的 Hep-DOX-Lip 制剂，各组分优选的重量比为： 0014 阿霉素 1 0015 肝素 4 0016 大豆卵磷脂 10 20 0017 胆固醇 0.8 2 0018 阳离子材料 0.5 0019 本发明，首先构建了阿霉素阳离子脂质体(DOX-Lip)。其中，阿霉素、大豆卵磷脂和胆固醇三者的配比直接影响到阳离子脂质体的质量。 0020 本发明所涉及的比例均为重量比。 0021 当胆固醇取一个固定值，大豆卵磷脂取不同的重量时， DOX-Lip 的平均粒径和包封率也不同。结果见表 1。 0。

13、022 表 1 ：药物和大豆卵磷脂的比例对脂质体粒径和包封率的影响 (n=3) 0023 说明书 CN 103720658 A 4 3/9 页 5 0024 从表可以看出，当阿霉素和大豆卵磷脂重量比小于 1 5 时，粒径较大，包封率很低；当药物：磷脂重量比大于 1 ： 30 时，脂质体溶液的透光性下降，粒径逐渐增大，放置越久越不稳定；当药物和大豆卵磷脂重量比在 1 5 30 范围内，包封率较高，粒径符合要求；当阿霉素和磷脂重量比在11020范围内，粒径较小，制剂稳定，且包封率大于95，因此本发明中药物大豆卵磷脂的比例优选为 1 10 20。。

14、0025 当大豆卵磷脂取一个固定值，胆固醇取不同的重量时， DOX-Lip 的平均粒径和包封率也不同。结果见表 2。 0026 表 2 ：药物和胆固醇的比例对脂质体粒径和包封率的影响 (n=3) 0027 0028 从表中可以看出，药物和胆固醇的重量比小于10.5时，粒径较大，包封率很低；当药物和胆固醇的重量比大于 1 4 时，包封率较低，且放置片刻即絮凝，当药物和胆固醇的重量比例在 1 0.5 4 范围内，粒径和包封率均较好，且比例在 1 0.8 2 范围内，粒径和包封率最佳，因此本发明中药物胆固醇的比例优选在 1 0.8 2。 0029 本发明在构建 DOX。

15、-Lip 的基础上，通过静电吸附的方式结合带大量负电荷的肝素。当 1mL 的阳离子脂质体同 1mL 的肝素 ( 药物：肝素 =1 2 18) 孵育 30min 后，超滤法分离游离肝素，再通过甲苯胺蓝法测定吸附在脂质体上的肝素含量，绘制肝素吸附曲线。结果见图 1。 0030 从图中可以看出，随着孵育肝素浓度的提高，肝素的结合量也随之升高。当结合 4 份肝素后达到饱和，肝素结合量大于 4 份时 DOX-Lip 不再结合肝素。因此本发明中药物和肝素的比例在 1 1 4，且最大结合比例为 1 4。肝素结合量越多，缓释效果越明显，因此优选药物和肝素的比例也为 1 4。。

16、0031 本发明用肝素修饰阿霉素脂质体，不仅具有类似 PEG 化的效果，可显著提高 DOX-Lip 的稳定性，延长药物的体内半衰期，提高药物的生物利用度，同时可显著降低化疗药物的毒副作用，提高患者的顺应性。 0032 一、大鼠体内药动学实验研究 0033 体内动力研究结果显示， Hep-DOX-Lip 显著延长阿霉素在 SD 大鼠体内的半衰期，生物利用度大大提高。 0034 实验方法：大鼠 9 只，分成 3 组，每组 3 只，用乙醚麻醉后称重。分别尾静脉注射 DOX 溶液、 DOX-Lip 以及 Hep-DOX-Lip，给药剂量为 3.5mg kg。给药后分别于。

17、0.5、 1、 2、说明书 CN 103720658 A 5 4/9 页 6 3、 4、 6、 8、 12、 24、 36、 48h 用肝素化的毛细管于眼后静脉丛取血 2mL。装于肝素化的离心管。 6000r min，离心 5min 分离血浆。取血浆样品 0.3mL，加入 30L 甲醇和 30L 内标溶液，混合均匀。加入氯仿 - 甲醇 (4 1)2.0mL，涡旋 5min， 3000r min 离心 10min。定量吸取下层氯仿层通空气流挥干溶剂，残留物加人甲醇 120L 溶解， ( 涡旋 1min，离心 3000r min， 5min)，取上清液 20L 进样分析。血药。

18、浓度数据采用药动学 Win Nonlin 软件 ( 中国药科大学 ) 进行药动学模型拟合，计算药动学参数，根据 AIC 最小原则确定房室模型。 0035 实验结果：大鼠静脉注射给药后，血药浓度 - 时间曲线见图 2。利用药动学软件 Win-Nonlin 进行拟合发现大鼠体内的药动学行为符合非房室模型，具体结果见表 3。阿霉素水溶液组 2h 内即快速的从大鼠体内代谢消失，这是由于阿霉素的半衰期非常的短 (T1 2=0.18h)。相反通过脂质体包载药物能明显的延长脂质体的体内半衰期。并且Hep-DOX-Lip 组的生物半衰期为 DOX-Lip 组的 2.5 倍。 0036 表。

19、 3 阿霉素在 SD 大鼠体内的药动学参数 (n=3) 0037 0038 二、小鼠尾静脉急性毒性实验 0039 为了保证 Hep-DOX-Lip 的临床安全性，我们从药理学研究的角度出发，通过小鼠尾静脉急性毒性实验对 Hep-DOX-Lip 给药系统进行安全性评价，为临床应用的安全性提供依据。 0040 实验方法：考察 DOX 溶液、 DOX-Lip 以及 Hep-DOX-Lip 三组制剂的急性毒性。根据预试， DOX 溶液组致死剂量范围在22.41 38.03mg/kg 之间。按 (r 相邻剂量组之间的比值； Dm= 最大剂量； Dn= 最小剂量； n= 预分组数。

20、 ) 公式求得 r=1.112。因此将 50 只雄性小白鼠 (20+2g)，随机分为 5 组，每组 10 只。以静脉注射的方式给药， 5 个剂量组分别为 34.21mg kg、 30.78mg/kg、 27.69mg/kg、 24.91mg/kg、 22.41mg/kg。相同的，可以得到 DOX-Lip 组的 5 个剂量组分别为 39.49mg/kg、 36.21mg/kg、 33.21mg/kg、 30.45mg/kg、 27.92mg kg。Hep-DOX-Lip 组的 5 个剂量组分别为 41.96mg/kg、 38.52mg/kg、 35.36mg kg、 32.46mg k。

21、g、 29.80mg/kg。小鼠单次尾静脉给药，注射速度约为 0.5mL min。给药后立即观察动物的行为、状态及死亡时间，并观察饲养 21 天，记录各组动物症状及死亡情况，采用 Bliss 法计算 LD50及其 95可信限。 0041 实验结果：阿霉素组小鼠于第 2 天开始出现死亡，死亡主要分布在 3 5 天；动物呈现行走不稳、静卧、呼吸急促，最后死亡，尸体解剖经肉眼观察除心脏呈苍白色并处于松弛状态外其它主要脏器无异常变化。两个脂质体组小鼠均于第 4 天开始出现死亡，死亡都主要集中在第 5 8 天；动物呈现行走不稳、静卧呼吸急促，最后死亡，尸体。

22、解剖经肉眼观说明书 CN 103720658 A 6 5/9 页 7 察除心脏呈苍白色并处于松弛状态外其它主要脏器无异常变化。DOX 溶液、 DOX-Lip 以及 Hep-DOX-Lip 三组的 LD50依次分别为 26.36、 33.71、 37.41mg/kg。因此， Hep-DOX-Lip 的 LD50 为游离 DOX 的 1.42 倍，为 DOX-Lip 组的 1.11 倍，说明 Hep-DOX-Lip 的安全性更高。具体实验结果见表 4。 0042 表 4 小鼠急性毒性实验结果 0043 本发明的 Hep-DOX-Lip 还可添加冻干保护剂制备成冻干制剂。试验发现不同的冻。

23、干保护剂对 Hep-DOX-Lip 的质量影响也不同，先制备本发明的 Hep-DOX-Lip，然后在其中添加不同的冻干保护剂，冷冻干燥，复溶，结果见表 5 ： 0044 表 5 冻干保护剂对 Hep-DOX-Lip 粒径和包封率的影响 (n=3) 0045 0046 “+” 普通 “+” 良好 “+” 非常好说明书 CN 103720658 A 7 6/9 页 8 0047 从表 5 中可以看出，在各种常见的冻干保护剂中，蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇的效果较好，脂质体的各项指标均满足要求；而海藻糖、山梨醇作为冻干保护剂，虽然其外观合格，但包封率有较显。

24、著降低且其对脂质体粒径的控制欠佳。因此作为 Hep-DOX-Lip 的冻干保护剂优选蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇的中的一种或几种。 0048 本发明的 Hep-DOX-Lip 的制备方法包括：将大豆卵磷脂、胆固醇、阳离子材料溶于有机溶剂，减压蒸发去除有机溶剂，硫酸铵梯度法载入处方量的阿霉素形成 DOX-Lip 混悬液。所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醚、乙醇、丙酮中的一种或几种。优选二氯甲烷、氯仿、甲醇。将制备的 DOX-Lip 同肝素溶液孵育 30min 后，超滤除去游离的肝素，即得 Hep-DOX-Lip 混悬液。制备成冻干粉针剂时，将冻。

25、干保护剂溶解于脂质体混悬液中，冷冻干燥即可。 0049 本发明的 Hep-DOX-Lip，不仅包封率大于 95，粒径在 100nm 200nm，又有很好的稳定性。本发明的特点是，所提供的 Hep-DOX-Lip 的制备方法简单，易于工业化大生产；肝素亲水性良好，可以代替 PEG 延长药物载体在体内的生物半衰期，提高抗肿瘤药物的生物利用度；并且实验还证实 Hep-DOX-Lip 制剂是一种安全、可靠的静脉注射制剂，相比于 DOX-Lip 更加安全。附图说明 0050 图 1 是本发明的肝素吸附曲线 0051 图 2 是本发明的大鼠静脉注射后阿霉素血药浓度 - 。

26、时间图 0052 图 3 是本发明的 Hep-DOX-Lip 的透射电镜和原子力显微镜照片 0053 图 4 是本发明的 Hep-DOX-Lip 对 B16F10 黑色素瘤细胞株的细胞毒性评价结果 0054 图 5 是本发明的 Hep-DOX-Lip 对 B16F10 黑色素瘤转移和生长的抑制效果具体实施方式 0055 实施例 1 0056 分别称取处方量的大豆卵磷脂 10mg、胆固醇 1mg、双十八烷基二甲基溴化铵 0.5mg 置于茄形瓶中，加入适量二氯甲烷，超声使之完全溶解；旋转减压蒸发除去有机溶剂，在瓶壁上形成干燥均匀的脂质薄膜。加入 300mmol L 的硫酸铵溶液。

27、1mL 洗膜， 37下水合 1h，形成脂质体初乳液。探头超声(200W， 100次)，即得空白脂质体。取上述空白脂质体以10 的蔗糖溶液为介质透析 3h( 每 1h 换一次透析液 ) 后，加入阿霉素溶液 (1mg mL)， 60水浴孵育 30min，即得 DOX-Lip。取 DOX-Lip 溶液与等体积的依诺肝素溶液 (4mg mL) 孵育 30min， 25。超滤法去除游离的肝素，即得 Hep-DOX-Lip 混悬液。再将上述溶液中加入适量蔗糖，无菌过滤后 ( 膜滤器孔径 0.2m)，将续滤液分装于西林瓶中，冷冻干燥即可。 0057 成品性状：本品为红色细腻、疏。

28、松不塌陷粘连的固态。 0058 复水分散性：本品在注射用溶剂如生理盐水中轻微震荡， 10s 内即可迅速形成均一、稳定、透光性好的红色混悬液。 0059 粒径测定：取本品适量用采用激光粒度分析仪测定粒径，平均粒径为 137.9nm，多分散系数为 0.214。 0060 形态学观察：取适量脂质体混悬液，用 1磷钨酸负染，滴至专用铜网上，自然挥说明书 CN 103720658 A 8 7/9 页 9 干后用透射电子显微镜观察脂质体形态并拍摄照片。进一步，用原子力显微镜观察脂质体的空间形态。通过透射电子显微镜和原子力显微镜技术研究了脂质体的形态 ( 图 3)。观。

29、察发现 Hep-DOX-Lip 周围被毛茸茸的东西包裹着 ( 图 3B)，而 DOX-Lip 的外围光滑 ( 图 3A)，表明肝素存在于修饰的阿霉素脂质体表面。使用原子力显微镜技术观察Hep-DOX-Lip的3D 形态 ( 图 3C)，脂质体成近球体，边缘光滑。通过透射电子显微镜和原子力显微镜观测到的粒径值与激光粒度分析仪的测量值相似，大约在 100-200nm 的范围内。 0061 将冻干脂质体在4环境贮存3个月后，阿霉素含量为97.8，加入注射级生理盐水复溶后得到的脂质体包封率为 93.1，粒径为 156.4nm。 0062 实施例 2 0063 分别称取处方量的大。

30、豆卵磷脂 15mg、胆固醇 2mg、硬脂胺 0.5mg 置于茄形瓶中，加入适量氯仿，超声使之完全溶解；旋转减压蒸发除去有机溶剂，在瓶壁上形成干燥均匀的脂质薄膜。加入 300mmol L 的硫酸铵溶液 1mL 洗膜， 37下水合 1h，形成脂质体初乳液。探头超声 (200W， 100 次 )，即得空白脂质体。取上述空白脂质体以 10的葡萄糖溶液为介质透析 3h( 每 1h 换一次透析液 ) 后，加入阿霉素溶液 (1mg mL)， 60水浴孵育 30min，即得 DOX-Lip。取 DOX-Lip 溶液与等体积的普通肝素溶液 (4mg mL) 孵育 30min， 25。

31、。超滤法去除游离的肝素，即得 Hep-DOX-Lip 混悬液。再将上述溶液中加入适量葡萄糖，无菌过滤后 ( 膜滤器孔径 0.2m)，将续滤液分装于西林瓶中，冷冻干燥即可。 0064 将冻干脂质体在4环境贮存3个月后，阿霉素含量为95.8，加入注射级生理盐水复溶后得到的脂质体包封率为 90.1，粒径为 171.4nm。 0065 实施例 3 0066 分别称取处方量的大豆卵磷脂 20mg、胆固醇 1.5mg、溴化三甲基十六烷基铵 0.5mg 置于茄形瓶中，加入适量甲醇，超声使之完全溶解；旋转减压蒸发除去有机溶剂，在瓶壁上形成干燥均匀的脂质薄膜。加入 300mmo。

32、l L 的硫酸铵溶液 1mL 洗膜， 37下水合 1h，形成脂质体初乳液。探头超声 (200W， 100 次 )，即得空白脂质体。取上述空白脂质体以 10 的乳糖溶液为介质透析 3h( 每 1h 换一次透析液 ) 后，加入阿霉素溶液 (1mg mL)， 60水浴孵育 30min，即得 DOX-Lip。取 DOX-Lip 溶液与等体积的达肝素钠溶液 (4mg mL) 孵育 30min， 25。超滤法去除游离的肝素，即得 Hep-DOX-Lip 混悬液。再将上述溶液中加入适量乳糖，无菌过滤后 ( 膜滤器孔径 0.2m)，将续滤液分装于西林瓶中，冷冻干燥即可。 0067 将冻干。

33、脂质体在4环境贮存3个月后，阿霉素含量为97.1，加入注射级生理盐水复溶后得到的脂质体包封率为 93.1，粒径为 168.2nm。 0068 实施例 4 0069 MTT法考察Hep-DOX-Lip制剂对B16F10小鼠恶性黑色素瘤细胞的体外毒性。对实施实例 1 的产品进行体外细胞实验研究。 0070 MTT 全称为 3-(4， 5- 二甲基噻唑 -2)-2， 5- 二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 (Formazan) 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。然后通过二甲基亚砜 (DMS。

34、O) 溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在特定波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内， MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。 0071 制剂组： Hep-DOX-Lip 组说明书 CN 103720658 A 9 8/9 页 10 0072 对照组： DOX 溶液组、 DOX-Lip 组 0073 空白载体组：空白未修饰脂质体组 (Lip)、空白肝素修饰脂质体组 (Hep-Lip) 0074 实验方法 0075 取对数生长期的 B16F10 细胞以 1104个孔接种于 96 孔板中，完全培养基 37 培养 24h，移去培养液，用 PBS 清洗。

35、两次。用 DMEM 培养基稀释 Lip、 Hep-Lip、 DOX 溶液、 DOX-Lip 和 Hep-DOX-Lip 至 0.005 3.397g mL。孵育 48h 后，弃去孵育液，用 PBS 洗涤一次。取 25.L 四甲基偶氮唑蓝 (MTT， 5mg mL) 加入各孔内， 37孵育 4h，弃去上清液，加入 100L DMSO 溶解甲瓒结晶，用酶标仪于 570nm 测定吸光值 (ODsample)。并以相同方法测定对照组 ( 无样品 ) 的吸光值，记为 ODcontrol。并根据结果计算各制剂对 B16F10 细胞的半数抑制浓度 IC50。实验结果 0076 如图4A。

36、，实验首先通过MTT法评价空白载体的安全性。空白载体Lip和Hep-Lip在设定的浓度范围内均无细胞毒性。这确保制备的脂质体可以作为安全的抗肿瘤药物载体。通过体外 MTT 法还研究了载有阿霉素的制剂对 B16F10 细胞的抑制活性 ( 图 4B)。IC50是评价药物或制剂细胞毒性的一个重要指标，根据改良寇氏公式计算各制剂对 B16F10 细胞的 IC50值。对应于 DOX 溶液、 DOX-Lip 和 Hep-DOX-Lip 相应的 IC50值分别为 0.070、 0.076 和 0.091gmL。 DOX-Lip的细胞毒性与游离的DOX溶液相近，而略高于Hep-DOX-Lip。。

37、这是由于 DOX-Lip 表面的带正电荷，更容易被 B16F10 细胞摄取。但是，纳米粒带有强烈的正电荷也面临被网状内皮系统识别和调理素结合的风险，最终导致纳米在体内快速的清除。值得注意的是， Hep-DOX-Lip 在 3.397g mL 时抑制了大于 90时的细胞生长。这说明即使只有几微克每毫升， Hep-DOX-Lip 仍可以很好地抑制 B16F10 细胞的生长。 0077 实施例 5 0078 考察 Hep-DOX-Lip 对 B16F10 黑色素瘤细胞在 C57BL 6 小鼠体内转移和生长的抑制效果，对实施实例 1 的产品进行体内抗肿瘤转移初步药效学实验研究。 00。

38、79 制剂组： Hep-DOX-Lip 组 0080 对照组： DOX 溶液组、 Hep 溶液组、 DOX-Lip 组、 Hep-Lip 组 0081 实验方法 0082 通过尾部静脉给小鼠(C57BL6)接种B16F10肿瘤细胞(3105个， 100LPBS)。每组 10 只小鼠。在注射肿瘤细胞之前 20min，分别给每组小鼠尾静脉注射生理盐水、 DOX 溶液组、 Hep 溶液、 DOX-Lip、 Hep-Lip 和 Hep-DOX-Lip。之后每隔三天再次尾静脉给相同的药物，并在 11 天后处死一半的小鼠， 21 天后处死剩余小鼠。将取得的肺称重，之后浸入石蜡中，切片厚。

39、度 5m，并用苏木伊红 (H&E) 染色法染色。光学显微镜下观察病理变化。取 10 个视野计数转移灶的平均个数 (40， n=10)，具体结果见图 5。 0083 实验结果 0084 为了研究 Hep-DOX-Lip 抑制肿瘤转移的能力，本实验选用了 B16F10 小鼠黑色素瘤转移模型，并进行了生理学 H&E 组织切片染色，取 10 个视野计数转移灶的平均个数 ( 图 5A)。DOX 溶液组表现出一定的治疗效果，通过脂质体的包载这种抑制作用进一步提高。在第 11 天，相比于 DOX 溶液组 (P0.001vs.Hep-DOX-Lip 组 ) 或者 DOX-Lip 组 (P0.。

40、01vs. Hep-DOX-Lip 组 )， Hep-DOX-Lip 组能更显著的抑制转移灶的生成。在 21 天，也观察到相似说明书 CN 103720658 A 10 9/9 页 11 的趋势。Hep 溶液和 Hep-Lip 两组的表现略有不同，在 11 天时候两组的表现出较好的抑制效果，但是在 21 天的时候这种抑制效果明显减弱，小鼠的肺部出现了明显的转移灶。并且 Hep-Lip 组的治疗效果略好于 Hep 溶液组。 0085 早期的研究结果证明，对于转移瘤模型，肺的重量正比于转移灶的生成数量。因此，肺的肿瘤也可作为评价转移瘤生成效果的指标 ( 见图 5B)。在治疗结束后，各组小鼠肺重量的平均值排序为 Hep-DOX-Lip 组 DOX-Lip 组 DOX 溶液组 Hep-Lip 组 Hep 溶液组生理盐水组。总而言之，上述结果证明： Hep-DOX-Lip 组中小鼠的肺重量增长最缓慢，黑色素瘤难于在次级组织器官着床生长。说明书 CN 103720658 A 11 1/3 页 12 图 1 图 2 说明书附图 CN 103720658 A 12 2/3 页 13 图 3 图 4 说明书附图 CN 103720658 A 13 3/3 页 14 图 5 说明书附图 CN 103720658 A 14 。

摘要
申请专利号：	CN201410005857.2	申请日：	20140107
公开号：	CN103720658A	公开日：	20140416
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	A61K9/127,A61K9/19,A61K47/28,A61K47/24,A61K47/36,A61K31/704,A61P35/00,A61P35/02	主分类号：	A61K9/127,A61K9/19,A61K47/28,A61K47/24,A61K47/36,A61K31/704,A61P35/00,A61P35/02
申请人：	中国药科大学
发明人：	柯学,陈艺,韩苗苗,胡丹蓉,鞠明珠
地址：	211198 江苏省南京市江宁区龙眠大道639号
优先权：	CN201410005857A
专利代理机构：		代理人：
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内容摘要

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种肝素修饰的阿霉素脂质体(Hep-DOX-Lip)制剂，其特征是由阿霉素1份、肝素1～4份、大豆卵磷脂5～30份、胆固醇0.5～4份、阳离子材料0.5份，本发明还公开了这种肝素修饰的阿霉素脂质体的制备方法。本发明用肝素修饰阿霉素脂质体，具有类似PEG化的效果，可显著提高阿霉素脂质体的稳定性，延长药物的体内半衰期，提高药物的生物利用度，同时可显著降低化疗药物的毒副作用，提高患者的顺应性。

权利要求书

1.一种肝素修饰的阿霉素脂质体，其特征是含下列组分及重量比：。 2.权利要求1的肝素修饰的阿霉素脂质体制剂，其特征是各组分的重量比为：。 3.权利要求1或2的肝素修饰的阿霉素脂质体制剂，其中肝素选普通肝素、达肝素钠、依诺肝素、纳肝素钙、帕肝素钠、汀肝素钠中的一种或几种。 4.权利要求1或2的肝素修饰的阿霉素脂质体制剂，其中阳离子材料选氯化三甲基-2，3-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基-2，3-二油酰氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基-2，3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基双十八烷基铵、N-(2-精胺甲酰基)-N’，N’-双十八烷基甘氨酰胺、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、脂质多聚-L-赖氨酸、硬脂胺中的一种或几种。 5.权利要求1或2的肝素修饰的阿霉素脂质体制剂，还含有冻干保护剂。 6.权利要求5的肝素修饰的阿霉素脂质体制剂，其中冻干保护剂选自蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇中的一种或几种。

说明书

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种肝素修饰的阿霉素脂质体(Hep-DOX-Lip) 制剂，本发明还公开了这种Hep-DOX-Lip制剂的制备方法。

背景技术

肝素(heparin，Hep)是一种酸性的粘多糖，被证明可以安全、广泛、有效的预防癌症并发的静脉血栓。研究者们还兴奋地发现辅助使用肝素进行治疗，可显著延长恶性肿瘤患者的寿命。因此，肝素不仅是一种临床可用的抗血栓药，肝素的其它生物活性使其具有更广泛的应用价值。例如：大量动物实验证实，肝素可以通过抑制选择素介导的细胞间黏附从而抑制肿瘤细胞的转移。肝素也可以促进组织因子旁路途径抑制物(Tissue Factor Pathway Inhibitor，TFPI)的释放并干预肿瘤组织血管新生。

不仅如此，肝素还可以代替PEG作为药物载体的亲水性修饰材料。一般的纳米药物载体在体内循环的时候，会很快被肝脏脾脏的巨噬细胞所吞噬，从而丧失疗效。为了降低对载体的吞噬，阻碍血浆蛋白对纳米粒子的吸附，延长纳米粒子在血液中的循环时间，以进一步提高靶向效果，人们进行了大量的研究。结果发现，用亲水性聚合物材料修饰可使给药载体取得满意的长循环效果(亦被称之为隐形效果)。亲水性材料PEG常用于载体修饰，以达到长循环的目的。但是，PEG修饰的载体在体内中也存有诸多弊端和一些不能忽视的问题，如静脉重复注射PEG化脂质体可加速血液清除(accelerated blood clearance，ABC)，这种ABC 现象是指间隔几天向同一动物重复注射PEG化脂质体时，第2次注射的PEG化脂质体在血液循环中被迅速清除，肝脾分布显著增加，从而大大限制了其临床应用。肝素是一种天然的粘多糖，带大量负电荷呈强酸性，并极溶于水。Byung Cheol Shin等人发现，肝素作为亲水性修饰材料，具有类PEG化的作用，修饰后的载体表现出更为出色的长循环效果和血清稳定性。

本发明选择的模型药物为阿霉素(Doxorubicin，DOX)。DOX最早是1969年从松链丝菌浅灰色变株(Str.Peucetius var caesius)中提取分离到的，为橙红色结晶粉末，别名多柔比星、羟柔红霉素、14-羟正定霉素，熔点204-205℃，分子量为579.98。其结构中带有羟基，呈弱碱性。由于其自身脂溶性较强而难溶于水，常将其制备成盐酸阿霉素，以增加其水溶解度。阿霉素具有很强的抗癌活性，被广泛用于治疗黑色素瘤、急性白血病、非何杰金氏淋巴瘤、肉瘤、多发性骨髓瘤及乳腺癌，肝癌、胃癌、小细胞型肺癌、宫颈癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤。但是，阿霉素在发挥治疗作用的同时，也会产生很多毒副作用如呕吐、恶心、脱发、骨髓抑制及胃肠道毒性等常见不良反应。除此之外，由于阿霉素类化合物与心肌的亲和力明显高于其他组织，并能产生半醌代谢物损害心肌细胞，因而导致严重的剂量依赖性心脏毒性，表现为各种心率失常，甚至是不可逆的心肌损伤及充血性心力衰竭。这些毒副作用使其临床应用受到极大的限制。近年来，大量文献报道指出纳米载体包裹阿霉素，能大大降低阿霉素的毒副作用，提高药物治疗的靶向性。阿霉素脂质体更成为了该领域的研究热点，目前已有多种阿霉素脂质体制剂上市销售。

本发明是在构建阿霉素阳离子脂质体(DOX-Lip)的基础上，通过静电吸附的方式结合带大量负电荷的肝素。本发明用肝素修饰阿霉素脂质体，发现具有类似PEG化的效果。SD 大鼠体内药动学实验证明，Hep-DOX-Lip能显著延长阿霉素的体内半衰期，提高阿霉素的体内生物利用度，同时降低了阿霉素的毒副作用。小鼠尾静脉急性毒性实验结果证明 Hep-DOX-Lip的安全性大大提高，表明制剂可降低化疗药物的毒副作用，提高患者的顺应性。

发明内容

本发明公开了一种临床适用的肝素修饰阿霉素脂质体(Hep-DOX-Lip)及其注射用冻干粉，该Hep-DOX-Lip冻干粉在加入注射用生理盐水后能重新分散。

本发明的Hep-DOX-Lip制剂，含下列组分及重量比：

阿霉素 1

肝素 1～4

大豆卵磷脂 5～30

胆固醇 0.5～4

阳离子材料 0.5

本发明的Hep-DOX-Lip制剂，各组分优选的重量比为：

阿霉素 1

肝素 4

大豆卵磷脂 10～20

胆固醇 0.8～2

阳离子材料 0.5

本发明，首先构建了阿霉素阳离子脂质体(DOX-Lip)。其中，阿霉素、大豆卵磷脂和胆固醇三者的配比直接影响到阳离子脂质体的质量。

本发明所涉及的比例均为重量比。

当胆固醇取一个固定值，大豆卵磷脂取不同的重量时，DOX-Lip的平均粒径和包封率也不同。结果见表1。

表1：药物和大豆卵磷脂的比例对脂质体粒径和包封率的影响(n=3)

从表可以看出，当阿霉素和大豆卵磷脂重量比小于1∶5时，粒径较大，包封率很低；当药物：磷脂重量比大于1：30时，脂质体溶液的透光性下降，粒径逐渐增大，放置越久越不稳定；当药物和大豆卵磷脂重量比在1∶5～30范围内，包封率较高，粒径符合要求；当阿霉素和磷脂重量比在1∶10～20范围内，粒径较小，制剂稳定，且包封率大于95％，因此本发明中药物／大豆卵磷脂的比例优选为1∶10～20。

当大豆卵磷脂取一个固定值，胆固醇取不同的重量时，DOX-Lip的平均粒径和包封率也不同。结果见表2。

表2：药物和胆固醇的比例对脂质体粒径和包封率的影响(n=3)

从表中可以看出，药物和胆固醇的重量比小于1∶0.5时，粒径较大，包封率很低；当药物和胆固醇的重量比大于1∶4时，包封率较低，且放置片刻即絮凝，当药物和胆固醇的重量比例在1∶0.5～4范围内，粒径和包封率均较好，且比例在1∶0.8～2范围内，粒径和包封率最佳，因此本发明中药物／胆固醇的比例优选在1∶0.8～2。

本发明在构建DOX-Lip的基础上，通过静电吸附的方式结合带大量负电荷的肝素。当1mL的阳离子脂质体同1mL的肝素(药物：肝素=1∶2～18)孵育30min后，超滤法分离游离肝素，再通过甲苯胺蓝法测定吸附在脂质体上的肝素含量，绘制肝素吸附曲线。结果见图 1。

从图中可以看出，随着孵育肝素浓度的提高，肝素的结合量也随之升高。当结合4 份肝素后达到饱和，肝素结合量大于4份时DOX-Lip不再结合肝素。因此本发明中药物和肝素的比例在1∶1～4，且最大结合比例为1∶4。肝素结合量越多，缓释效果越明显，因此优选药物和肝素的比例也为1∶4。

本发明用肝素修饰阿霉素脂质体，不仅具有类似PEG化的效果，可显著提高DOX-Lip 的稳定性，延长药物的体内半衰期，提高药物的生物利用度，同时可显著降低化疗药物的毒副作用，提高患者的顺应性。

一、大鼠体内药动学实验研究

体内动力研究结果显示，Hep-DOX-Lip显著延长阿霉素在SD大鼠体内的半衰期，生物利用度大大提高。

实验方法：大鼠9只，分成3组，每组3只，用乙醚麻醉后称重。分别尾静脉注射 DOX溶液、DOX-Lip以及Hep-DOX-Lip，给药剂量为3.5mg／kg。给药后分别于0.5、1、2、 3、4、6、8、12、24、36、48h用肝素化的毛细管于眼后静脉丛取血2mL。装于肝素化的离心管。6000r／min，离心5min分离血浆。取血浆样品0.3mL，加入30μL甲醇和30μL内标溶液，混合均匀。加入氯仿-甲醇(4∶1)2.0mL，涡旋5min，3000r／min离心10min。定量吸取下层氯仿层通空气流挥干溶剂，残留物加人甲醇120μL溶解，(涡旋1min，离心3000 r／min，5min)，取上清液20μL进样分析。血药浓度数据采用药动学Win Nonlin软件(中国药科大学)进行药动学模型拟合，计算药动学参数，根据AIC最小原则确定房室模型。

实验结果：大鼠静脉注射给药后，血药浓度-时间曲线见图2。利用药动学软件 Win-Nonlin进行拟合发现大鼠体内的药动学行为符合非房室模型，具体结果见表3。阿霉素水溶液组2h内即快速的从大鼠体内代谢消失，这是由于阿霉素的半衰期非常的短(T1／2=0.18 h)。相反通过脂质体包载药物能明显的延长脂质体的体内半衰期。并且Hep-DOX-Lip组的生物半衰期为DOX-Lip组的2.5倍。

表3阿霉素在SD大鼠体内的药动学参数(n=3)

二、小鼠尾静脉急性毒性实验

为了保证Hep-DOX-Lip的临床安全性，我们从药理学研究的角度出发，通过小鼠尾静脉急性毒性实验对Hep-DOX-Lip给药系统进行安全性评价，为临床应用的安全性提供依据。

实验方法：考察DOX溶液、DOX-Lip以及Hep-DOX-Lip三组制剂的急性毒性。根据预试，DOX溶液组致死剂量范围在22.41～38.03mg/kg之间。按(r＝相邻剂量组之间的比值；Dm=最大剂量；Dn=最小剂量；n=预分组数)公式求得r=1.112。因此将 50只雄性小白鼠(20+2g)，随机分为5组，每组10只。以静脉注射的方式给药，5个剂量组分别为34.21mg／kg、30.78mg/kg、27.69mg/kg、24.91mg/kg、22.41mg/kg。相同的，可以得到DOX-Lip组的5个剂量组分别为39.49mg/kg、36.21mg/kg、33.21mg/kg、30.45mg/kg、 27.92mg／kg。Hep-DOX-Lip组的5个剂量组分别为41.96mg/kg、38.52mg/kg、35.36mg／kg、 32.46mg／kg、29.80mg/kg。小鼠单次尾静脉给药，注射速度约为0.5mL／min。给药后立即观察动物的行为、状态及死亡时间，并观察饲养21天，记录各组动物症状及死亡情况，采用 Bliss法计算LD50及其95％可信限。

实验结果：阿霉素组小鼠于第2天开始出现死亡，死亡主要分布在3～5天；动物呈现行走不稳、静卧、呼吸急促，最后死亡，尸体解剖经肉眼观察除心脏呈苍白色并处于松弛状态外其它主要脏器无异常变化。两个脂质体组小鼠均于第4天开始出现死亡，死亡都主要集中在第5～8天；动物呈现行走不稳、静卧呼吸急促，最后死亡，尸体解剖经肉眼观察除心脏呈苍白色并处于松弛状态外其它主要脏器无异常变化。DOX溶液、DOX-Lip以及 Hep-DOX-Lip三组的LD50依次分别为26.36、33.71、37.41mg/kg。因此，Hep-DOX-Lip的 LD50为游离DOX的1.42倍，为DOX-Lip组的1.11倍，说明Hep-DOX-Lip的安全性更高。具体实验结果见表4。

表4小鼠急性毒性实验结果

本发明的Hep-DOX-Lip还可添加冻干保护剂制备成冻干制剂。试验发现不同的冻干保护剂对Hep-DOX-Lip的质量影响也不同，先制备本发明的Hep-DOX-Lip，然后在其中添加不同的冻干保护剂，冷冻干燥，复溶，结果见表5：

表5冻干保护剂对Hep-DOX-Lip粒径和包封率的影响(n=3)

“+”普通“++”良好“+++”非常好

从表5中可以看出，在各种常见的冻干保护剂中，蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇的效果较好，脂质体的各项指标均满足要求；而海藻糖、山梨醇作为冻干保护剂，虽然其外观合格，但包封率有较显著降低且其对脂质体粒径的控制欠佳。因此作为Hep-DOX-Lip的冻干保护剂优选蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇的中的一种或几种。

本发明的Hep-DOX-Lip的制备方法包括：将大豆卵磷脂、胆固醇、阳离子材料溶于有机溶剂，减压蒸发去除有机溶剂，硫酸铵梯度法载入处方量的阿霉素形成DOX-Lip混悬液。所述有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醚、乙醇、丙酮中的一种或几种。优选二氯甲烷、氯仿、甲醇。将制备的DOX-Lip同肝素溶液孵育30min后，超滤除去游离的肝素，即得Hep-DOX-Lip混悬液。制备成冻干粉针剂时，将冻干保护剂溶解于脂质体混悬液中，冷冻干燥即可。

本发明的Hep-DOX-Lip，不仅包封率大于95％，粒径在100nm～200nm，又有很好的稳定性。本发明的特点是，所提供的Hep-DOX-Lip的制备方法简单，易于工业化大生产；肝素亲水性良好，可以代替PEG延长药物载体在体内的生物半衰期，提高抗肿瘤药物的生物利用度；并且实验还证实Hep-DOX-Lip制剂是一种安全、可靠的静脉注射制剂，相比于 DOX-Lip更加安全。

附图说明

图1是本发明的肝素吸附曲线

图2是本发明的大鼠静脉注射后阿霉素血药浓度-时间图

图3是本发明的Hep-DOX-Lip的透射电镜和原子力显微镜照片

图4是本发明的Hep-DOX-Lip对B16F10黑色素瘤细胞株的细胞毒性评价结果

图5是本发明的Hep-DOX-Lip对B16F10黑色素瘤转移和生长的抑制效果

具体实施方式

实施例1

分别称取处方量的大豆卵磷脂10mg、胆固醇1mg、双十八烷基二甲基溴化铵0.5mg 置于茄形瓶中，加入适量二氯甲烷，超声使之完全溶解；旋转减压蒸发除去有机溶剂，在瓶壁上形成干燥均匀的脂质薄膜。加入300mmol／L的硫酸铵溶液1mL洗膜，37℃下水合1h，形成脂质体初乳液。探头超声(200W，100次)，即得空白脂质体。取上述空白脂质体以10％的蔗糖溶液为介质透析3h(每1h换一次透析液)后，加入阿霉素溶液(1mg／mL)，60℃ 水浴孵育30min，即得DOX-Lip。取DOX-Lip溶液与等体积的依诺肝素溶液(4mg／mL)孵育30min，25℃。超滤法去除游离的肝素，即得Hep-DOX-Lip混悬液。再将上述溶液中加入适量蔗糖，无菌过滤后(膜滤器孔径0.2μm)，将续滤液分装于西林瓶中，冷冻干燥即可。

成品性状：本品为红色细腻、疏松不塌陷粘连的固态。

复水分散性：本品在注射用溶剂如生理盐水中轻微震荡，10s内即可迅速形成均一、稳定、透光性好的红色混悬液。

粒径测定：取本品适量用采用激光粒度分析仪测定粒径，平均粒径为137.9nm，多分散系数为0.214。

形态学观察：取适量脂质体混悬液，用1％磷钨酸负染，滴至专用铜网上，自然挥干后用透射电子显微镜观察脂质体形态并拍摄照片。进一步，用原子力显微镜观察脂质体的空间形态。通过透射电子显微镜和原子力显微镜技术研究了脂质体的形态(图3)。观察发现 Hep-DOX-Lip周围被毛茸茸的东西包裹着(图3B)，而DOX-Lip的外围光滑(图3A)，表明肝素存在于修饰的阿霉素脂质体表面。使用原子力显微镜技术观察Hep-DOX-Lip的3D形态 (图3C)，脂质体成近球体，边缘光滑。通过透射电子显微镜和原子力显微镜观测到的粒径值与激光粒度分析仪的测量值相似，大约在100-200nm的范围内。

将冻干脂质体在4℃环境贮存3个月后，阿霉素含量为97.8％，加入注射级生理盐水复溶后得到的脂质体包封率为93.1％，粒径为156.4nm。

实施例2

分别称取处方量的大豆卵磷脂15mg、胆固醇2mg、硬脂胺0.5mg置于茄形瓶中，加入适量氯仿，超声使之完全溶解；旋转减压蒸发除去有机溶剂，在瓶壁上形成干燥均匀的脂质薄膜。加入300mmol／L的硫酸铵溶液1mL洗膜，37℃下水合1h，形成脂质体初乳液。探头超声(200W，100次)，即得空白脂质体。取上述空白脂质体以10％的葡萄糖溶液为介质透析3h(每1h换一次透析液)后，加入阿霉素溶液(1mg／mL)，60℃水浴孵育30min，即得DOX-Lip。取DOX-Lip溶液与等体积的普通肝素溶液(4mg／mL)孵育30min，25℃。超滤法去除游离的肝素，即得Hep-DOX-Lip混悬液。再将上述溶液中加入适量葡萄糖，无菌过滤后(膜滤器孔径0.2μm)，将续滤液分装于西林瓶中，冷冻干燥即可。

将冻干脂质体在4℃环境贮存3个月后，阿霉素含量为95.8％，加入注射级生理盐水复溶后得到的脂质体包封率为90.1％，粒径为171.4nm。

实施例3

分别称取处方量的大豆卵磷脂20mg、胆固醇1.5mg、溴化三甲基十六烷基铵0.5mg 置于茄形瓶中，加入适量甲醇，超声使之完全溶解；旋转减压蒸发除去有机溶剂，在瓶壁上形成干燥均匀的脂质薄膜。加入300mmol／L的硫酸铵溶液1mL洗膜，37℃下水合1h，形成脂质体初乳液。探头超声(200W，100次)，即得空白脂质体。取上述空白脂质体以10％的乳糖溶液为介质透析3h(每1h换一次透析液)后，加入阿霉素溶液(1mg／mL)，60℃水浴孵育30min，即得DOX-Lip。取DOX-Lip溶液与等体积的达肝素钠溶液(4mg／mL)孵育 30min，25℃。超滤法去除游离的肝素，即得Hep-DOX-Lip混悬液。再将上述溶液中加入适量乳糖，无菌过滤后(膜滤器孔径0.2μm)，将续滤液分装于西林瓶中，冷冻干燥即可。

将冻干脂质体在4℃环境贮存3个月后，阿霉素含量为97.1％，加入注射级生理盐水复溶后得到的脂质体包封率为93.1％，粒径为168.2nm。

实施例4

MTT法考察Hep-DOX-Lip制剂对B16F10小鼠恶性黑色素瘤细胞的体外毒性。对实施实例1的产品进行体外细胞实验研究。

MTT全称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。然后通过二甲基亚砜(DMSO)溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在特定波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

制剂组：Hep-DOX-Lip组

对照组：DOX溶液组、DOX-Lip组

空白载体组：空白未修饰脂质体组(Lip)、空白肝素修饰脂质体组(Hep-Lip)

实验方法

取对数生长期的B16F10细胞以1×104个／孔接种于96孔板中，完全培养基37℃培养 24h，移去培养液，用PBS清洗两次。用DMEM培养基稀释Lip、Hep-Lip、DOX溶液、DOX-Lip 和Hep-DOX-Lip至0.005～3.397μg／mL。孵育48h后，弃去孵育液，用PBS洗涤一次。取 25μ.L四甲基偶氮唑蓝(MTT，5mg／mL)加入各孔内，37℃孵育4h，弃去上清液，加入100 μL DMSO溶解甲瓒结晶，用酶标仪于570nm测定吸光值(ODsample)。并以相同方法测定对照组(无样品)的吸光值，记为ODcontrol。并根据结果计算各制剂对B16F10细胞的半数抑制浓度IC50。

实验结果

如图4A，实验首先通过MTT法评价空白载体的安全性。空白载体Lip和Hep-Lip在设定的浓度范围内均无细胞毒性。这确保制备的脂质体可以作为安全的抗肿瘤药物载体。通过体外MTT法还研究了载有阿霉素的制剂对B16F10细胞的抑制活性(图4B)。IC50是评价药物或制剂细胞毒性的一个重要指标，根据改良寇氏公式计算各制剂对B16F10细胞的IC50值。对应于DOX溶液、DOX-Lip和Hep-DOX-Lip相应的IC50值分别为0.070、0.076和0.091 μg／mL。DOX-Lip的细胞毒性与游离的DOX溶液相近，而略高于Hep-DOX-Lip。这是由于 DOX-Lip表面的带正电荷，更容易被B16F10细胞摄取。但是，纳米粒带有强烈的正电荷也面临被网状内皮系统识别和调理素结合的风险，最终导致纳米在体内快速的清除。值得注意的是，Hep-DOX-Lip在3.397μg／mL时抑制了大于90％时的细胞生长。这说明即使只有几微克每毫升，Hep-DOX-Lip仍可以很好地抑制B16F10细胞的生长。

实施例5

考察Hep-DOX-Lip对B16F10黑色素瘤细胞在C57BL／6小鼠体内转移和生长的抑制效果，对实施实例1的产品进行体内抗肿瘤转移初步药效学实验研究。

制剂组：Hep-DOX-Lip组

对照组：DOX溶液组、Hep溶液组、DOX-Lip组、Hep-Lip组

实验方法

通过尾部静脉给小鼠(C57BL／6)接种B16F10肿瘤细胞(3×105个，100μLPBS)。每组10只小鼠。在注射肿瘤细胞之前20min，分别给每组小鼠尾静脉注射生理盐水、DOX溶液组、Hep溶液、DOX-Lip、Hep-Lip和Hep-DOX-Lip。之后每隔三天再次尾静脉给相同的药物，并在11天后处死一半的小鼠，21天后处死剩余小鼠。将取得的肺称重，之后浸入石蜡中，切片厚度5μm，并用苏木伊红(H&E)染色法染色。光学显微镜下观察病理变化。取 10个视野计数转移灶的平均个数(×40，n=10)，具体结果见图5。

实验结果

为了研究Hep-DOX-Lip抑制肿瘤转移的能力，本实验选用了B16F10小鼠黑色素瘤转移模型，并进行了生理学H&E组织切片染色，取10个视野计数转移灶的平均个数(图5A)。 DOX溶液组表现出一定的治疗效果，通过脂质体的包载这种抑制作用进一步提高。在第11 天，相比于DOX溶液组(P<0.001vs.Hep-DOX-Lip组)或者DOX-Lip组(P<0.01vs. Hep-DOX-Lip组)，Hep-DOX-Lip组能更显著的抑制转移灶的生成。在21天，也观察到相似的趋势。Hep溶液和Hep-Lip两组的表现略有不同，在11天时候两组的表现出较好的抑制效果，但是在21天的时候这种抑制效果明显减弱，小鼠的肺部出现了明显的转移灶。并且 Hep-Lip组的治疗效果略好于Hep溶液组。

早期的研究结果证明，对于转移瘤模型，肺的重量正比于转移灶的生成数量。因此，肺的肿瘤也可作为评价转移瘤生成效果的指标(见图5B)。在治疗结束后，各组小鼠肺重量的平均值排序为Hep-DOX-Lip组<DOX-Lip组<DOX溶液组<Hep-Lip组<Hep溶液组< 生理盐水组。总而言之，上述结果证明：Hep-DOX-Lip组中小鼠的肺重量增长最缓慢，黑色素瘤难于在次级组织器官着床生长。