技术领域
本发明属于具有光动力活性的光敏剂技术领域，涉及一种水溶性竹红菌 素二氧化钛纳米粒的制备方法。
背景技术
光动力疗法(photodynamic therapy，简称PDT)是近年来发展起来的一 种新型肿瘤临床疗法，被公认为临床上除化疗、放射性治疗和手术之外的 第四种治疗癌症的方法。与传统的肿瘤治疗技术相比，光动力疗法具有特 异性杀伤肿瘤细胞、毒副作用低、手术后并发症少、可与放射疗法和化学 疗法同时使用、以及可多次使用等独特的优点。尤其对于那些属于癌症晚 期和由于年龄、体质等原因不适合使用传统治疗技术的病人，光动力疗法 仍然是一种理想的治疗手段，因此该治疗方法在美国、日本、加拿大和一 些欧洲的国家已经被正式批准在临床治疗领域中进行应用，如在支气管癌、 肺癌、胃癌、膀胱癌等的临床治疗。但是相对于疗法而言，光动力药物的 发展严重滞后，因此，高效、低毒的光敏剂仍是人们大力寻求的目标。
竹红菌素是从生长在我国云南箭竹上的一种寄生真菌-竹红菌 (Hypocrella bambusae(B.et Br)Sacc.)中提取的天然光敏剂，属于3，10-二 羟基-4，9-苝醌衍生物，有竹红菌甲素(Hypocrellin A，简称HA，如结构I所 示)和竹红菌乙素(Hypocrellin B，简称HB，如结构II所示)两种主要成分， 均具有光敏产生各种活性氧的能力。在当地，作为一种流传的偏方，民间 应用竹红菌素来治疗胃病、关节炎和皮肤病等。目前，我国一些医院已经 在临床上用竹红菌素光疗法治疗某些皮肤病(如外阴白色病变、白癫病、 牛皮癣等)。1980年万象仪在《科学通报》1980年第25期1148页，罗子 华等人在《云南医药》1980年第一期20页上报道竹红菌素光疗法治疗外阴 白色病变和疤痕疙瘩。从那以来，竹红菌素开始受到研究工作者的关注。 经过十多年来对竹红菌素的结构、光化学、光物理、光生物、药理学等各 方面的广泛系统的研究，研究工作者发现与目前已经商品化的光敏剂(如 血卟啉类衍生物)相比，它与具有易得、易纯化、化学修饰性好、三重态 量子产率高、单重态氧量子产率高、光毒性高、体内代谢快等优点，并且 该光敏剂还具有杀灭HIV病毒(Photochemistry & Photobiology，1997，65 (2)：352-354)、抗单纯性疱疹类型I病毒和Sindbis病毒的活性。另外，加 拿大学者经过系统动物毒性实验宣布竹红菌素几乎没有暗毒性(Photochem Photobiol，1997，65(4)：714-722)！因此竹红菌素被公认为是一种极有应用前 景的光疗药物，在光动力抗艾滋病毒、治疗肿瘤和微血管类疾病等方面有 广泛的潜在应用价值。
但是，作为抗癌光疗药物而言，由于天然的竹红菌素均属于亲脂性化合 物，在水溶液中溶解度很低，当其被注射人体内后，容易在血液中发生自 发聚集，从而形成毛细血管栓塞，使其不便于制成药剂，难以直接给药， 因此，开展竹红菌素临床前期的应用基础研究，解决其血液中的有效传输 等问题，成为推动竹红菌素在光动力疗法领域中的临床应用进程的关键。 目前研究者主要通过如下两个途径来克服竹红菌素水溶性差的缺陷：
(1)结构修饰合成出水溶性的竹红菌素衍生物。竹红菌素分子结构中的 芳环、酚羟基、醌羰基、七元环和甲氧基等均是可以发生取代的位置，研 究人员希望通过化学修饰在上述位置上引入具有水溶性的基团来改善竹红 菌素的水溶性，并已合成了一系列的竹红菌素衍生物，包括溴代的竹红菌 素、磺化的竹红菌素、糖苷修饰的竹红菌素、环糊精修饰的竹红菌素、氨 基酸修饰的竹红菌素，以及金属配合物等(科学通报，2000， 45(19)：2019-2033)。在此过程中，我们也合成出了一些具有水溶性的竹红菌 素衍生物，如硫醇类化合物修饰的衍生物、酪氨酸修饰的衍生物和镧系金 属配合物等(Chem.Comm.，2003：1372-1373；Chem.Comm.， 2003：2370-2371)。然而研究结果表明这些衍生物的水溶性虽然得到明显改 善，但是这类衍生物不是导致其活性氧量子产率降低，就是增加其在血液 中传输的困难，同时通过化学修饰获得的水溶性竹红菌素衍生物在体内细 胞的摄取率也比较低，这些原因导致竹红菌素强的光动力活性受到显著的 抑制，这表明通过化学修饰的途径不能达到在不降低竹红菌素强光动力活 性的基础上，促进其在血液中有效传输的目的。
(2)构建竹红菌素水溶性的药物载体。目前使用的载体包括脂质体、天 然生物蛋白(药用明胶阿拉伯胶、人血清蛋白、牛血清蛋白、酪蛋白)、多 糖类生物大分子(海藻酸钠、壳聚糖)、可生物降解的高分子聚合物(聚丙 烯酰胺、聚甲基丙烯酸烷烃酯、聚氰基丙烯酸烷烃酯)和脂肪乳等，这些 载体在助溶剂和分散剂存在下对脂溶性的竹红菌素进行包封，可以制成适 合于静脉注射的竹红菌素纳米粒子。中国科学院化学所的赵井泉研究员在 该领域已经进行了大量的研究工作，并取得了重要的进展(中国专利，公 开号：CN1565433A)。但是利用上述的载体来包裹竹红菌素，虽然使得肿 瘤细胞吸收的药物效果比游离的药物好，却仍然存在缺陷，如该类药物载 体的制备工艺要求高、所制得的产品长期稳定性低等。特别是由于这类传 统的药物载体是基于药物在体内缓慢释放的原理构建的，并不适合应用于 光动力药物。这是因为光动力疗法主要是通过光照光敏药物产生活性氧损 伤肿瘤组织的途径来治疗肿瘤，在此过程中不考虑光敏药物本身是否对肿 瘤组织存在损伤的作用，因此该疗法并不需要从载体中释放出光敏药物， 只需有能让活性氧进行扩散的小通道即可。而利用上述传统的药物载体来 包封竹红菌素，当其被注射入人体后，从载体内释放竹红菌素在血液中同 样会发生不同程度上的自发聚集，导致毛细血管形成栓塞，从而不可避免 地产生光毒副作用。因此寻找具有很好的水溶性和稳定性，以及能够不释 放药物的载体成为从事光动力疗法领域研究的人们追求的目标。
具有核壳结构的纳米陶瓷类材料(如纳米二氧化硅)是一种新型的药物 载体，特别适合应用来包裹光动力疗法领域中的光敏剂，相关的研究越来越 受到从事药物载体研究的工作者关注(J.Am.Chem.Soc.，2003， 125：7860-7865)。与先前的药物载体相比，该载体具有制备方法简单，对环 境和温度要求低，水溶液中稳定等优点。另外，由于纳米陶瓷类材料具有硬 性的核壳结构，这使得被注射到人体内的竹红菌素始终只能存在其壳内，不 会被释放出来，可以避免所包埋的药物被释放，从而达到在血液中有效传输 的目的(Journal of Materials Chemistry，2004，14：487-493)。与此同时，由于该 纳米材料表面上存在许多微孔，其直径能允许光敏竹红菌素产生的各种活性 氧物种通过扩散作用从壳内到达肿瘤组织。总之，由于上述的优势，目前具 有核壳结构的纳米陶瓷类材料(如二氧化硅)在光动力疗法研究领域中已经 开始得到广泛的关注。
纳米二氧化钛虽然属于纳米陶瓷材料，但是有关其作为药物载体的研究 尚未见报道，本专利基于上述纳米陶瓷类材料的优点，考虑将具有核壳结 构的纳米二氧化钛引入到竹红菌素的应用研究中，制备出具有临床应用前 景的水溶性竹红菌素二氧化钛纳米粒，从而进一步推动竹红菌素的实用化 进程。
发明内容
本发明的目的在于克服竹红菌素由于水溶性差而不便于制成药剂的缺 点，而提供了一种水溶性竹红菌素二氧化钛纳米粒的制备方法。即，本申请 将提供水溶性竹红菌素二氧化钛纳米粒的制备方法，该方法制备的纳米粒可 以达到使竹红菌素在血液中有效传输和降低其光毒副作用的目的。
本发明通过有机钛类化合物水解产生的具有核壳结构的纳米二氧化钛 对竹红菌素进行包封，制备出适合静脉注射的粒径小于150nm的水溶性竹红 菌素二氧化钛纳米粒，该纳米粒可以达到使竹红菌素在血液中有效传输和降 低其光毒副作用的目的。本发明对推动竹红菌素的实用化进程具有理论和实 用双重意义。
本发明的技术方案是：水溶性竹红菌素二氧化钛纳米粒的制备方法，步 骤如下：
有机钛类化合物在乙醇、醋酸和蒸馏水存在的条件下水解；
缓慢滴加竹红菌素的乙醇溶液，搅拌；
反应结束后加入二次蒸馏水，并调节溶液的pH值至7.0；
透析除去乙醇和反应中产生的小分子化合物；
冷冻干燥得水溶性竹红菌素二氧化钛纳米粒。
其中有机钛类化合物与醋酸的质量比为1∶2～6；本申请推荐的质量比 为1∶4；
有机钛类化合物与乙醇和蒸馏水的质量比为1∶10～20∶1～3。
本发明中所涉及的竹红菌素包括竹红菌甲素、竹红菌乙素以及两种母体 的衍生物。
本发明中所涉及的有机钛类化合物包括钛酸四乙酯、钛酸四正丙酯、四 异丙氧基钛、钛酸四正丁酯、聚钛酸丁酯等易发生水解反应的有机钛类化合 物。
更具体和更优化地说，本发明的操作步骤是：
实验体系中依次加入有机钛类化合物，乙醇，醋酸，二次蒸馏水，然后 在磁力搅拌的下，缓慢滴加竹红菌素的乙醇溶液，加完后在室温下继续搅拌 24小时。反应结束后加入二次蒸馏水，并利用氢氧化钠调节溶液的pH值至 7.0，透析除去乙醇和反应中产生的小分子化合物，冷冻干燥得水溶性竹红 菌甲素二氧化钛纳米粒。
本发明所制得的水溶性竹红菌素二氧化钛纳米粒具有如下的优点：
1.制备方法简单、易操作和稳定性高，同时其纳米粒的直径小于150nm， 有利于竹红菌素类注射针剂的制备和保存；
2.与单独存在的竹红菌素相比，该纳米粒不但水溶性高和分散性好， 而且在体内不会释放出竹红菌素，因此可以促进竹红菌素在血液中的有效传 输，同时消除其单独使用时产生的光毒副作用；
3.该纳米粒光敏产生单重态氧(1O2)和超氧阴离子(O2-)等活性氧的 能力也得到不同程度的增强。离体癌细胞实验结果表明，该类纳米粒子的暗 毒性低，光毒性高。
附图说明
图1为本发明中竹红菌甲素被纳米二氧化钛包裹前后的紫外光谱比较 图；竹红菌甲素在三种情况下的吸收光谱：a甲醇/水溶液，b吸附在纳米二 氧化钛表面，c纳米二氧化硅包裹。[HA]＝7.3×10-6mol/L.；
图2为本发明中竹红菌甲素被纳米二氧化钛包裹前后的荧光光谱比较 图；竹红菌甲素在三种情况下的荧光光谱：a乙醇/水溶液，b吸附在纳米二 氧化钛表面，c纳米二氧化硅包裹。[HA]＝7.3×10-6mol/L，λex＝480nm.；
图3为本发明中制备的水溶性竹红菌甲素二氧化钛纳米粒的透射电镜 图。
具体实施方式
实施例1，
通过钛酸四乙酯的水解制备水溶性竹红菌甲素二氧化钛纳米粒，反应体 系及条件如下：
实验体系中依次加入钛酸四乙酯1mL，乙醇15mL，醋酸4mL，二次蒸 馏水2mL，然后在磁力搅拌的条件下，缓慢滴加竹红菌甲素的乙醇溶液 (0.4mM/L)，加完后在室温下继续搅拌24小时。反应结束后加入二次蒸馏 水40mL，并利用氢氧化钠调节溶液的pH值至7.0，透析除去乙醇和反应中 产生的一些小分子化合物，冷冻干燥得水溶性竹红菌甲素二氧化钛纳米粒。
实施例2，
通过钛酸四正丁酯的水解制备水溶性竹红菌甲素二氧化钛纳米粒，反应 体系及条件如下：
实验体系中依次加入钛酸四正丁酯1.5mL，乙醇15mL，醋酸4mL，二 次蒸馏水2mL，然后在磁力搅拌的条件下，缓慢滴加竹红菌甲素的乙醇溶 液(0.4mM/L)，加完后在室温下继续搅拌24小时。反应结束后加入二次蒸 馏水40mL，并利用氢氧化钠调节溶液的pH值至7.0，透析除去乙醇和反应 中产生的一些小分子化合物， 冷冻干燥得水溶性竹红菌甲素二氧化钛纳米 粒。
水溶性竹红菌甲素纳米二氧化钛纳米粒的表征：
本发明实例中光化学性质以紫外光谱、荧光光谱表征。纳米粒的形貌以 电子显微镜观测。
光谱测定结果
比较二氧化钛纳米粒包裹竹红菌甲素与等浓度单独存在的竹红菌甲素 在水溶液的紫外可见吸收光谱和荧光光谱可以发现，包裹后竹红菌甲素不但 特征吸收峰位发生明显红移，而且其吸光强度也出现了显著的增强。另外， 包裹后的竹红菌甲素荧光发射峰峰位同样发生红移，同时强度降低。
竹红菌素二氧化钛纳米粒的电镜观察
透射电镜观察纳米粒大小及形貌，透射电镜照片显示通过钛酸四丁酯水 解制得的水溶性竹红菌素二氧化钛纳米粒的平均粒径为130nm。
实施例3，
通过钛酸四乙酯的水解制备水溶性竹红菌乙素二氧化钛纳米粒，反应体
系及条件如下：
实验体系中依次加入钛酸四乙酯1mL，乙醇15mL，醋酸4mL，二次蒸 馏水2mL，然后在磁力搅拌的条件下，缓慢滴加竹红菌乙素的乙醇溶液 (0.4mM/L)，加完后在室温下继续搅拌24小时。反应结束后加入二次蒸馏 水40mL，并利用氢氧化钠调节溶液的pH值至7.0，透析除去乙醇和反应中 产生的一些小分子化合物，冷冻干燥得水溶性竹红菌乙素二氧化钛纳米粒。
实施例4，
通过钛酸四正丁酯的水解制备水溶性竹红菌乙素二氧化钛纳米粒，反应 体系及条件如下：
实验体系中依次加入钛酸四正丁酯1.5mL，乙醇15mL，醋酸4mL，二 次蒸馏水2mL，然后在磁力搅拌的条件下，缓慢滴加竹红菌乙素的乙醇溶液 (0.4mM/L)，加完后在室温下继续搅拌24小时。反应结束后加入二次蒸馏 水40mL，并利用氢氧化钠调节溶液的pH值至7.0，透析除去乙醇和反应中 产生的一些小分子化合物，冷冻干燥得水溶性竹红菌乙素二氧化钛纳米粒。
实施例5，与实施例1基本相同，但所述的竹红菌甲素改用竹红菌甲素 的衍生物(可以是：竹红菌甲素卤代衍生物、竹红菌甲素糖基化衍生物、竹 红菌甲素硫代衍生物、竹红菌甲素氨基酸衍生物、竹红菌甲素氨基衍生物)。
实施例6，与实施例2基本相同，但所述的竹红菌甲素改用竹红菌甲素 的衍生物(可以是：竹红菌甲素卤代衍生物、竹红菌甲素糖基化衍生物、竹 红菌甲素硫代衍生物、竹红菌甲素氨基酸衍生物、竹红菌甲素氨基衍生物)。
实施例7，与实施例3基本相同，但所述的竹红菌甲素改用竹红菌乙素 的衍生物(竹红菌乙素卤代衍生物、竹红菌乙素糖基化衍生物、竹红菌乙素 硫代衍生物、竹红菌乙素氨基酸衍生物、竹红菌乙素氨基衍生物)。
实施例8，与实施例4基本相同，但所述的竹红菌甲素改用竹红菌乙素 的衍生物(竹红菌乙素卤代衍生物、竹红菌乙素糖基化衍生物、竹红菌乙素 硫代衍生物、竹红菌乙素氨基酸衍生物、竹红菌乙素氨基衍生物)。
实施例9，与实施例1基本相同，但所述的有机钛类化合物为钛酸四正 丙酯，该钛酸四正丙酯与醋酸的质量比为1∶2；钛酸四正丙酯与乙醇和蒸 馏水的质量比为1∶10∶1。
实施例10，与实施例1基本相同，但所述的有机钛类化合物为四异丙氧 基钛，该四异丙氧基钛与醋酸的质量比为1∶6；该四异丙氧基钛与乙醇和 蒸馏水的质量比为1∶20∶3。
实施例11，与实施例1基本相同，但所述的有机钛类化合物为聚钛酸丁 酯，该聚钛酸丁酯与醋酸的质量比为1∶5；该聚钛酸丁酯与乙醇和蒸馏水 的质量比为1∶15∶2。
实施例12，与实施例3基本相同，但所述的有机钛类化合物为钛酸四正 丙酯，该钛酸四正丙酯与醋酸的质量比为1∶2；钛酸四正丙酯与乙醇和蒸 馏水的质量比为1∶10∶1。
实施例13，与实施例3基本相同，但所述的有机钛类化合物为四异丙氧 基钛，该四异丙氧基钛与醋酸的质量比为1∶6；该四异丙氧基钛与乙醇和 蒸馏水的质量比为1∶20∶3。
实施例14，与实施例3基本相同，但所述的有机钛类化合物为聚钛酸丁 酯，该聚钛酸丁酯与醋酸的质量比为1∶5；该聚钛酸丁酯与乙醇和蒸馏水 的质量比为1∶15∶2。