技术领域
本发明涉及中医药研究开发利用领域，具体涉及一种用治疗阿尔采末氏病(Alzheimer’s disease，AD)的中药，可以明显改善AD所致的学习记忆障碍。
背景技术
随着人类平均寿命的逐年增加，阿尔采末病(Alzheimer’s disease，AD)已经成为威胁人类晚年生活质量的主要疾病之一，AD是中枢神经系统的进行性神经退行性疾病，主要临床表现为进行性认知功能障碍和记忆力衰退，性格和行为改变，生活自理能力下降等。AD特征性病理病变是在大脑皮层和海马区域出现老年斑(senile plaque，SP)和神经元纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)，此外，还有神经元颗粒空泡变性(granulovacuolar degeneration，GD)、平野细胞(hirano body，HB)、神经元突触异常、星形细胞增生样反应等，AD的发生与β淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)及其前体淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)、tau蛋白、载脂蛋白E(ApoE)、早老素(presenilin，PS)等关系密切，其中Aβ是SP的主要物质，在发病过程中起着极为重要的作用，它的沉积可能是所有因素导致AD的共同途径，体内外研究表明Aβ的毒性作用主要表现在破坏细胞膜的完整性、扰乱细胞内环境的稳定及诱导细胞发生凋亡等方面。
关于AD治疗方面，包括：①抑制Aβ的产生(提高α-分泌酶活性、抑制β-分泌酶和γ-分泌酶活性)促进其降解(如胰岛素降解酶IDE)；②抑制神经细胞的凋亡(保护线粒体功能、抑制细胞内钙超载、氧化应激和自由基释放)；③抑制神经胶质细胞激活后促炎因子上升导致的炎症损伤；④维持胆碱能神经系统功能；⑤其他：降脂治疗、雌激素替代治疗、神经生长因子治疗、改善脑循环和能量代谢、免疫治疗、基因治疗、免疫治疗、神经干细胞技术、RNA干扰技术等。
PC12是细胞源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞株，用神经生长因子(NGF)诱导后可长出突起，具有神经细胞特性，均质性好，而且容易培养和传代且细胞特性稳定，是一种较为理想的神经细胞模型。Aβ对体外培养及在体的神经细胞均有神经毒性作用，因此越来越多的学者都将Aβ作为研究AD的关键。采用Aβ诱导PC12细胞凋亡可建立AD模型具有代表性，且实验条件易于控制，是体外进行AD研究的理想模型。
根据文献检索的结果，我们知道有大量文献报道中药复方可以延缓AD发生和改善AD的作用。但是组方药物较多，一般至少为5味以上，多的高达数10味中药，且多为自买和自煎为主，品质难以保证。
根据文献检索的结果，我们知道有大量文献报道中药复方的可以改善动物的学习记忆障碍。但是组方药物较多，一般至少为5味以上，多的高达数10味中药，且多为自买和自煎为主，品质难以保证。
发明人先前经研究得出的中药复方(自定义代号Q0409)，由补肾、益气、安神、醒脑功效的7味中药组成(补肾：苁蓉，巴戟天，干地黄；益气：人参；安神：茯神，远志；醒脑：石菖蒲)。经研究证明具有明显改善动物学习记忆障碍的作用。但是同样具有药物较多，品质难以保证的缺点。
发明人经过实验研究证明上述中药Q0409的筛选方(由人参和远志组成)具有明显改善药物所致的动物学习记忆障碍的作用。
发明内容
本发明的目的是对中药Q0409的筛选方进行研究，提供一种用于治疗阿尔采末氏病的中药单体组方。
本发明用于治疗阿尔采末氏病的中药单体组方，由以下配比的有效成分组成：
人参皂甙Rg1 1.0～50mol、人参皂甙Re 1.0～50mol、人参皂甙Rb11.0～50mol；远志皂苷元Pre-Se 1.0～50mol。
上述组方的优选配比为：
人参皂甙Rg1 3.0mol、人参皂甙Re 6.0mol、人参皂甙Rb1 12.0mol；远志皂苷元Pre-Se 14.8mol。
可采用常规加工方法，制成上述中药单体为主的注射剂、口服液、胶囊、片剂、提取物再混合等剂型。
发明人采用NGF诱导PC12细胞分化+Aβ诱导凋亡的模型，进行以下观察：
1.建立NGF诱导PC12细胞分化+Aβ诱导凋亡的模型
2.MTT法检测中药单体组方对PC12细胞活力的影响
3.中药单体组方NGF诱导PC12细胞Aβ损伤模型作用机制的研究
a.细胞凋亡检测：采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术，证实本发明中药单体组方能抑制NGF诱导分化后的Aβ25-35损伤所致的PC12细胞凋亡率；
b.细胞线粒体膜电位变化：采用DiOC6(3)染色流式细胞术，证实本发明中药单体组方抑制NGF诱导分化后的Aβ25-35损伤所致的PC12细胞线粒体膜电位降低；
c.细胞线粒体质量检测(心磷脂含量变化)：采用NAO染色流式细胞术，证实本发明中药单体组方抑制NGF诱导分化后的Aβ25-35所致PC12细胞的损伤，维持线粒体质量(NAO染色流式细胞术)；
d.细胞形态学变化，凋亡细胞核的Hochest染色结果，证实本发明中药单体组方抑制NGF诱导分化后的Aβ25-35所致PC12细胞的凋亡，发挥神经细胞保护作用。
可见，本发明的中药单体组方可用于治疗阿尔采末氏病。
附图说明
图1～图3为PC12细胞凋亡的Hochest染色的照片(×400)。其中，
图1：蓝色荧光下(激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右)NGF培养组的正常的PC12细胞，细胞核荧光染色均匀，未见凋亡时致密浓染高荧光的细胞核。
图2：蓝色荧光下NGF+Aβ组的PC12细胞，细胞核荧光染色明显不均匀，可见到凋亡时因细胞核固缩引起的致密浓染的高荧光细胞核
图3：蓝色荧光下中药单体组方+NGF+Aβ组的PC12细胞，细胞核荧光染色均匀，未见凋亡时致密浓染高荧光的细胞核。
具体实施方式
实施例1
1.建立NGF诱导PC12细胞分化+Aβ诱导凋亡的模型
表1 NGF诱导PC12分化+Aβ损伤后细胞活力
Aβ(μmol/L) n MTT法测定细胞活力(ΔOD) 0 10 20 40 80 100 12 12 12 12 12 12 1.19±0.14 0.71±0.05* 0.56±0.10* 0.37±0.09* 0.35±0.06* 0.29±0.06*
*P＜0.001，vs Aβ＝0μmol/L
由表1可以看出，随着Aβ在培养基中浓度的增加，MMT法测定的PC12细胞活力明显下降，Aβ10～100μmol/L的各组细胞活力均小于不加Aβ的各组，差异有显著性(P＜0.001)。若正常细胞对照组(Aβ为0μmol/L)细胞活力为100％，培养基中Aβ为10μmol/L时，细胞活力降低至约60％左右，20μmol/L降为约47％，40μmol/L为31％，80μmol/L为29％，100μmol/L为24％。因此，选定细胞活力在60％的Aβ浓度作为后续研究中诱导PC12细胞损伤的Aβ的浓度。
2.MTT法检测中药单体组方对PC12细胞活力的影响
a.单体药物单独使用时最佳药物浓度筛选
由表2可以看出，Aβ阳性组(即人参皂甙均为0μmol/L)，MTT法测定的其细胞活力均低于Aβ阴性组(P＜0.05)，说明PC12细胞分化后Aβ损伤模型复制成功。Rg1作用于对PC12细胞分化后Aβ损伤模型，MMT法测定的细胞活力最高的两组为1.21±0.15(Rg1：3.0μmol/L)、1.15±0.19μmol/L(Rg1：6.0μmol/L)；Rb1组细胞活力最高的两组为0.99±0.16(Rb1：12.0μmol/L)、1.35±0.15μmol/L(Rb1：24.0μmol/L)；Re组细胞活力最高的两组为1.53±0.13(Re：3.0μmol/L)、1.31±0.21μmol/L(Rb1：6.0μmol/L)，以上各组的细胞活力最高的两组均高于单纯Aβ损伤的PC12细胞组(P＜0.05)。因此，确定人参皂甙2个浓度作为正交分析的药物的2个水平，具体如下：Rg1为3.0μmol/L、6.0μmol/L，Rb1为12.0μmol/L、24.0μmol/L，Re为3.0μmol/L、6.0μmol/L。
表2 人参皂甙Rg1、Rb1、Re对Aβ(10μmol/L)损伤模型细胞活力的影响(MTT法，
*P＜0.05，vs人参皂甙＝0μmol/L
由表3可以看出，Aβ阳性组(即远志皂苷元为0μmol/L)，MTT法测定的其细胞活力(0.89±0.14)低于Aβ阴性组(1.04±0.18，P＜0.05)，说明PC12细胞分化后Aβ损伤模型复制成功。而加入远志皂苷元Pre-Se的各组细胞活力均高于Aβ阳性组，其中远志皂苷元Pre-Se作用于对PC12细胞分化后Aβ损伤模型，细胞活力最高的两组为1.13±0.20(Pre-Se：14.8μmol/L)、1.14±0.23μmol/L(Pre-Se：29.6μmol/L)。因此，确定远志皂苷元的2个浓度作为正交分析的药物的2个水平，分别为14.8μmol/L和29.6μmol/L。
表3 远志皂苷元对Aβ损伤模型细胞活力的影响(MTT法，
远志皂苷元(Pre-Se) 的浓度(μmol/L) nMTT法测定细胞活力(ΔOD) Aβ阴性组 0 3.7 7.4 14.8 29.6 12 12 12 12 12 121.04±0.18*0.89±0.141.09±0.20*1.10±0.23*1.13±0.20*1.14±0.23*
*P＜0.05，vs Aβ阳性组(即远志皂苷元＝0μmol/L)
b.单体组方的正交分析
见表4为单体组方对PC12细胞分化后Aβ损伤模型作用的正交实验结果，此结果用于后面一系列正交分析，根据正交实验的结果最终确定中药单体组方的各个药物的最佳浓度(以药物的正的贡献率为准)。
表4单体组方对NGF诱导PC12细胞分化后Aβ损伤模型作用的正交实验结果
L8(24)正交表
注：根据前一个实验结果确定。
Rg1：(1＝3.0μmol/L，2＝6.0μmol/L)； Rb1：(1＝12.0μmol/L，2＝24.0μmol/L)；Re：(1＝3.0μmol/L，2＝6.0μmol/L)；Pre-Se：(1＝14.8μmol/L，2＝29.6μmol/L)。
2.2.1单体组方对PC12细胞分化后Aβ损伤模型作用正交结果的方差分析表
表5单体组方对PC12细胞分化后Aβ损伤模型作用正交实验结果的方差分析
表5为单体组方对PC12细胞分化后Aβ损伤模型作用正交实验结果的方差分析，此结果提示结果的变异来源于分组之间(P＜0.00001)，而不是来源于次间(每批次实验的差别，P＞0.05)。说明此正交实验正确有效，通过了正交实验设计标准的检验。
2.2.2单体组方对PC12细胞分化后Aβ损伤模型作用正交结果的析因分析
表6 单体组方对PC12细胞分化后Aβ损伤模型作用正交结果的析因分析
注：小剂量＝1，大剂量＝-1
表7单体组方对PC12细胞分化后Aβ损伤模型作用析因分析结果的方差分析
此两表(表6、表7)为单体组方对PC12细胞分化后Aβ损伤模型作用正交实验结果的析因分析。由表中可以看出，在析因分析的方差分析中，Re的P＝0.0034＜0.01，其贡献率值为0.9202，说明Re药在实验中是主因素，具有重要作用。因为本实验要求的结果应为药物的正的贡献率为准，即细胞活力(MTT法)越高，说明药物作用越好，可以有效减轻Aβ导致的细胞损伤，所以根据结果可知：在本实验中Re大剂量为佳，而其余药物(Rg1、Rb1、Pre-Se)以小剂量为宜。
因此，此中药单体组方各个药物的配伍及最佳浓度为：Rg1(1＝3.0μmol/L)，Rb1(1＝12.0μmol/L)，Re(2＝6.0μmol/L)，Pre-Se(1＝14.8μmol/L)。
c.单体组方正交分析结果的验证
采用正交分析得到的中药单体组方最佳配伍和浓度，观察其对PC12细胞分化后Aβ损伤模型的影响，由表8可知：最佳浓度单体+Aβ组细胞活力(1.13±0.18)明显高于模型组Aβ组(0.71±0.19，P＜0.001)，而最佳浓度单体组方的相反组方+Aβ组(0.73±0.21)则与模型组Aβ组差异无显著性(P＞005)。
表8验证中药单体组方的最佳浓度(MTT法，
组别 n MTT法测定细胞活力 (ΔOD) 空白对照组(control) 模型组(Aβ) 单体组方最佳浓度+Aβ组 单体组方最佳浓度的相反 组方+Aβ组 24 24 24 24 1.07±0.12△△ 0.71±0.19* 1.13±0.18 △△ 0.73±0.21*
*P＜0.05，vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.001，vs Aβ group
注：单体组方最佳浓度：Rg1(1＝3.0μmol/L)，Rb1(1＝12.0μmol/L)，
Re(2＝6.0μmol/L)，Pre-Se(1＝14.8μmol/L)。
单体组方最佳浓度的相反组方：Rg1(1＝6.0μmol/L)，Rb1(1＝24.0μmol/L)，
Re(2＝3.0μmol/L)，Pre-Se(1＝29.6μmol/L)。
3.中药单体组方NGF诱导PC12细胞Aβ损伤模型作用机制的研究
a.细胞凋亡检测：采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术
表9 中药单体组方对Aβ诱导PC12细胞凋亡率的影响(，n＝5)
组别 细胞凋亡率(％)
NGF培养组(contol) NGF+Aβ组 中药单体组方+NGF+Aβ组 4.94±4.61△△ 34.86±6.83** 13.56±4.44△
**P＜0.001，vs control；△P＜0.01，△△P＜0.001，vs NGF+Aβ组
采用Annexin V/PI双染流式细胞术，观察中药单体组方对Aβ诱导PC12细胞凋亡率的影响。结果见表9，NGF+Aβ组(阳性对照组)的细胞凋亡率为(34.86±6.83)％，明显高于NGF培养组(阴性对照组)的(4.94±4.61)％，差异有显著性(P＜0.001)，说明Aβ诱导PC12细胞发生了凋亡；中药单体组方+NGF+Aβ组(药物治疗对照组)的细胞凋亡率为(13.56±4.44)％，明显低于NGF+Aβ组，差异有显著性(P＜0.01)，提示中药单体组方可以抑制Aβ诱导PC12细胞凋亡，降低其凋亡率。
b.细胞线粒体膜电位变化：DiOC6(3)染色流式细胞术
采用DIOC6(3)染色流式细胞术，流式细胞仪检测各组PC12细胞荧光激发的强度，观察中药单体组方对正常和凋亡的PC12细胞线粒体膜电位的影响，平均荧光强度越高，线粒体膜电位越高。结果见表10，NGF+Aβ组(阳性对照组)的平均荧光强度为7851.8±232.5，明显低于NGF培养组(阴性对照组)的9732.3±347.8，差异有显著性(P＜0.01)，说明Aβ诱导PC12细胞发生了凋亡后，其细胞线粒体膜电位明显降低；中药单体组方+NGF+Aβ组(药物治疗对照组)的平均荧光强度为9031.3±499.4，明显高于NGF+Aβ组，差异有显著性(P＜0.01)，提示中药单体组方可以抑制Aβ诱导PC12细胞凋亡导致的线粒体膜电位明显降低。
表10中药单体组方对Aβ诱导PC12细胞线粒体膜电位的影响(n＝4)
组别 平均荧光强度 NGF培养组(contol) NGF+Aβ组 中药单体组方 +NGF+Aβ组 9732.3±347.8△ 7851.8±232.5* 9031.3±499.4△
*P＜0.01，vs control；△P＜0.01，vs NGF+Aβ组
c.细胞线粒体质量检测(心磷脂含量变化)：NAO染色流式细胞术
表11中药单体组方对Aβ诱导PC12细胞线粒体质量的影响(，n＝4)
组别高荧光强度的细胞比例(％)平均荧光强度NGF培养组(contol)NGF+Aβ组中药单体组方+NGF+Aβ组84.10±5.19△61.46±6.88*76.83±7.04△13795.0±612.3△8861.6±588.5**11394.7±902.8△
*P＜0.05，**P＜0.01，vs control；△P＜0.05，vs NGF+Aβ组
采用NAO染色流式细胞术，流式细胞仪检测各组PC12细胞荧光激发的强度，观察中药单体组方对正常和凋亡的PC12细胞线粒体质量的影响，高荧光强度P3区的细胞比例越多，平均荧光强度越高，线粒体质量越好。结果见表11，NGF+Aβ组(阳性对照组)的高荧光强度的细胞比例为(61.46±6.88)％，平均荧光强度为8861.6±588.5，明显低于NGF培养组(阴性对照组)的高荧光强度的细胞比例为(84.10±5.19)％，平均荧光强度为13795.0±612.3，差异有显著性(P＜0.05)，说明Aβ诱导PC12细胞发生了凋亡后，其细胞线粒体心磷脂含量降低，线粒体质量较差；中药单体组方+NGF+Aβ组(药物治疗对照组)的高荧光强度的细胞比例为(76.83±7.04)％，平均荧光强度为11394.7±902.8，明显高于NGF+Aβ组，差异有显著性(P＜0.05)，提示中药单体组方可以抑制Aβ诱导PC12细胞凋亡导致的心磷脂含量降低，维持线粒体粒体质量及其正常功能。
d.中药单体组方NGF诱导PC12细胞Aβ损伤模型作用机制的研究
(细胞形态学变化：凋亡细胞核的Hochest染色结果)
1.Aβ损伤神经细胞模型：将PC12细胞用0.125％胰酶消化下来，进行细胞计数，调整细胞浓度为2.0-2.5×105cells/mL，吸取约180μL单细胞悬液加入96孔板，CO2培养箱中培养24h；每孔加入10μg/L NGF溶液10μL，继续培养24h；96孔中均先加入1000μmol/L Aβ25-35溶液20μL，然后立即加入不同浓度的中药单体溶液，继续培养24h。
2.①NGF培养组(阴性对照组，结果见图1)：加入10μg/L NGF溶液(培养液中的NGF的终浓度为50ng/L)，继续在CO2培养箱中培养48h；
②NGF+Aβ组(阳性对照组，结果见图2)：加入相应剂量的10μg/L NGF溶液(培养基NGF的终浓度为50ng/L)，继续在CO2培养箱中培养24h；加入相应剂量的1000μmol/L Aβ溶液(培养基Aβ的终浓度为10μmol/L)，继续在CO2培养箱中培养24h。
③中药单体组方+NGF+Aβ组(药物治疗对照组，结果见图3)：加入相应剂量的10μg/L NGF溶液(培养基NGF的终浓度为50ng/L)，继续在CO2培养箱中培养24h；加入相应剂量的1000μmol/L Aβ溶液(培养基Aβ的终浓度为10μmol/L)，然后立即加入最佳浓度的中药单体组方(人参皂甙Rg13.0mol/L、人参皂甙Re 6.0mol/L、人参皂甙Rb1 12.0mol/L；远志皂苷元Pre-Se14.8mol/L)溶液，继续在CO2培养箱中培养24h。
从图1可见，蓝色荧光下NGF培养组的正常的PC12细胞，细胞核荧光染色均匀，未见凋亡时致密浓染高荧光的细胞核。
从图2可见，蓝色荧光下NGF+Aβ组的PC12细胞，细胞核荧光染色明显不均匀，可见到凋亡时因细胞核固缩引起的致密浓染的高荧光细胞核。
从图3可见，蓝色荧光下中药单体组方+NGF+Aβ组的PC12细胞，细胞核荧光染色均匀，未见凋亡时致密浓染高荧光的细胞核。
4、实施例1的结果小结
本研究结果证实：中药Q0409筛选方的单体组方可以有效拮抗Aβ对神经细胞的损伤，提高细胞活力、抑制细胞凋亡，其作用机制与保护线粒体的质量和功能，发挥神经细胞保护作用有关。