一种具有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物及其制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102133233 A (43)申请公布日 2011.07.27 CN 102133233 A *CN102133233A* (21)申请号 201110051121.5 (22)申请日 2011.03.03 A61K 35/64(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 湖南中医药大学 地址 410208 湖南省吉首市人民南路 120 号 吉首大学生物系 (72)发明人 田雪飞 周青 廖兴华 孙婧 艾小佳 (74)专利代理机构 北京神州华茂知识产权代理 有限公司 11358 代理人 吴照幸 (54) 发明名称 一种具有抗肿瘤活性的蜈蚣。

2、提取物及其制备 方法 (57) 摘要 本发明涉及一种从中药蜈蚣中分析出抗肿瘤 活性的提取物。 该提取物是通过将蜈蚣低温粉碎， 低温酶解， 分离冻干， sephadex G-25凝胶柱分离， 所制得的活性组分， 其主要有效成分水溶性小分 子活性肽。 经MTT法检测， 该提取物具有较好的抗 肿瘤活性。该提取物避免了使用蜈蚣原药材所带 来的， 大分子蛋白质类药物的临床应用存在一定 致敏性、 产业化不容易质控的缺点， 具有小分子活 性肽类药物生产效率高， 节省工序， 便于质控等优 点。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 。

3、页 附图 1 页 CN 102133236 A1/1 页 2 1. 一种抗肿瘤提取物的制备方法， 包括下述步骤 ： 将蜈蚣原药材低温粉碎成微粉 ； 蜈蚣粉加入超纯水， 混匀得混悬液， 加入胰蛋白酶低温酶解， 反复提取， 离心， 收集上 清液 ； 上清液经过丙酮沉淀后离心， 所得沉淀经过超纯水溶解后， 再使用预冷的丙酮和石 油醚沉淀后离心， 取沉淀超纯水溶解， -20冻存后冻干成粉末 ； 冻干粉末使用超纯水溶解， sephadex G-25 凝胶柱分离， 分离条件为 0.1m/LPBS 洗 脱， 流速 0.5ml/min ； 将各组分进行收集、 浓缩冻干， 然后经 MTT 检查进行抗肿瘤活性的测。

4、定， 其中 110min-140min 时的洗脱曲线峰所对应的组分为抗肿瘤的蜈蚣提取物。 2. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 特征在于包括以下步骤 ： 蜈蚣微粉的制备 ： 将蜈蚣低温粉碎成粒径为 1-75m 的微粉， 常温下干燥瓶中保存 备用 ； 低温酶解 ： 蜈蚣粉加入 5 倍重量的超纯水， 混匀得混悬液， 加入胰蛋白酶使得终浓度 为 0.5， 调节 PH 值为 7.0， 4低温条件下水解， 反复提取 5 次， 每次 60 分钟， 3000g 离心 5 分钟后收集上清液 ； 分离冻干 ： 上清液两倍体积丙酮沉淀后 5000g 离心， 取沉淀超纯水溶解， 加入两倍体 积预冷的丙酮和石油醚。

5、等体积混合液， 沉淀后 5000g 离心， 取沉淀超纯水溶解， -20冻存 后冻干成粉末 ； 纯化 ： 冻干粉超纯水溶解， sephadex G-25 凝胶柱分离， 分离条件为 0.1m/LPBS 洗脱， 流速 0.5ml/min ； 将各组分进行收集、 浓缩冻干后再次进行抗肿瘤活性测定， 最终得到一种抗肿瘤蜈 蚣提取物。 3. 一种具有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物， 其特征在于是通过权利要求 1 或 2 所述的制备 方法提取的。 4. 权利要求 3 所述的具有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物， 其特征在于该提取物的主要有效 成分是小分子活性肽组分， 其分子量范围在 1000-5000Da。 5. 权利要求 。

6、4 所述的具有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物， 其特征在于该提取物的主要有效 成分是小分子活性肽组分， 其分子量范围在 1500-3000Da 范围。 6. 根据权利要求 1 或 2 所述的制备方法， 其中特征在于抗肿瘤活性测定所采用的方法 是 MTT 法， 检测蜈蚣小分子活性肽组分的 MTT 法采用的肿瘤细胞株如下 ： 人肝癌 HepG2 细 胞、 人肝癌 MHCC97-H 细胞、 人肺癌 A549 细胞、 人前列腺 PC-3 细胞、 人乳腺癌 MCF-7 细胞和 / 或人结肠癌 SW480 细胞。 权 利 要 求 书 CN 102133233 A CN 102133236 A1/6 页 3 一种具。

7、有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于一种蜈蚣提取物， 具体涉及一种具有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物及其制 备方法。 背景技术 0002 蜈蚣为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣的干燥体。主产湖北荆州、 宜昌、 孝感、 郧阳等地市 及老河口、 襄樊、 荆门、 枣阳等地。性温， 味辛， 有毒。归肝、 脾、 肺经。具有息风镇痉、 攻毒散 结、 通络止痛之功能。 用于小儿惊风、 抽搐痉挛、 中风口眼歪斜、 半身不遂、 破伤风症、 风湿顽 痹、 疮疡、 瘰疬、 毒蛇咬伤。 本草纲目 记载， 蜈蚣可用于丹毒瘤肿、 小儿撮口、 小儿急惊、 天 吊惊风、 破伤风、 口眼歪斜口内麻木、 蝮蛇螫伤、 。

8、天蛇头疮、 瘰疬溃疮、 耳出脓、 小儿秃疮、 痔 疮疼痛、 腹在如箕、 脚吐转筋。 0003 经对现有技术的文献检索发现 ： 周永芹， 韩莉 MTT 法、 流式细胞术实验表明中药蜈 蚣乙醚、 乙醇提取物在体外对宫颈癌 Caski 细胞的生长有明显地抑制作用， 机制与影响癌 细胞的 DNA 合成， 阻止瘤细胞的分裂增殖， 并促进其凋亡有关。呈现一定的量效和时效相关 性(周永芹， 韩莉.蜈蚣提取物对官颈癌Caski细胞增殖的抑制效应.中国组织工程研究与 临床康复， 2007.11(34) ： 6805-6807)。焦波等用精原细胞法， 对蜈蚣的不同溶剂 ( 石油醚、 乙醇、 水、 碱 ) 提取物进。

9、行抗肿瘤活性成分的筛选， 表明蜈蚣的水提取物和醇提取物均能使 小鼠睾丸第 7 相精细管精原细胞显著减少或消失， 提示有一定的抗肿瘤作用。蜈蚣总碱性 蛋白对人口腔上皮细胞鳞癌 (KB 细胞 ) 和人结肠癌细胞 (HCT 细胞 ) 有明显的抑制作用。 其水提取物对肉瘤 (S-180) 及小鼠肝癌 (H22) 有明显的抑制活性， 抑瘤率分别为 24.88 和 41.10 ； 对小鼠肝癌瘤体的抑制率为 26， 对人体子宫颈癌细胞 TC-26 抑制率在 90 以上 ( 焦波， 篓红祥， 王东兴， 等 . 蜈蚣提取物对小鼠精原细胞的作用 J. 山东医科大学学 报， 1999， 37(4) ： 358)。曾。

10、红等从少棘蜈蚣中提取出八种抗肿瘤活性成分， 结果表明它们对 人 NCI-H23 肺癌细胞、 UO-31 肾癌细胞、 KM-12 结肠癌细胞、 BEL-7402 肝癌细胞和 SK-OV-3 卵巢癌细胞的生长有抑制作用 ( 曾红， 张国刚， 程巨龙 . 蜈蚣中抗癌活性成分的提取 . 湖北 中医杂志， 2004， 20(5) ： 57)。李厚伟等研究发现少棘蜈蚣提取物在体外对 HepG2 细胞的生 长有明显地抑制作用， 机制与降低细胞内DNA含量， 细胞内钙超载有关(李厚伟， 张妍， 许超 千， 等 . 中药 HB 对喉癌 HepG2 细胞的抑制作用及其机制研究 . 哈尔滨医科大学学报， 2001，。

11、 35(4) ： 261)。 0004 现有技术中， 提取蜈蚣蛋白或多肽类成分， 采用将蜈蚣粉碎水提后， 通过硫酸铵沉 淀法沉淀蛋白， 然后通过例子交换色谱进行第一步分离， 分离后的组分进行活性测定， 再对 抗肿瘤组分进行疏水色谱分离， 将各组分透析、 浓缩、 冻干后再次进行抗肿瘤活性测定。该 发明是通过两部色谱技术从蜈蚣中提取抗肿瘤活性蛋白， 并通过 SDS-PAGE 电泳分析分子 量为 20kDa( 中国专利 ： CN101747423)， 但该技术所提取的蛋白分子量较大。或采用仿生酶 解法提取蜈蚣有效部位， 酶解完成后于 85恒温水浴 30min 作用灭活， 收集上清干燥得蜈 蚣酶解物，。

12、 以 APTT 法、 纤维蛋白原平板法为考察指标， 对公布了提取的有效部位在抗凝血 说 明 书 CN 102133233 A CN 102133236 A2/6 页 4 和溶栓的药物中的应用 ( 中国专利 ： CN101862349)， 所工艺所提取的蜈蚣酶解物未进行进 一步的纯化分离， 未进行抗肿瘤活性检测。 或从蜈蚣毒素中提取抗肿瘤多肽， 并用质谱法测 定分子量为1296.05Da。 该发明证明其抗肿瘤活性是通过作用于人脐静脉内皮细胞来实现， 从抑制血管内皮细胞生长角度阐述该多肽的抗肿瘤活性， 该发明并未就多肽对肿瘤细胞的 增殖抑制作用进行考察 ( 中国专利 ： CN101899095)。。

13、 发明内容 0005 本发明的目的在于从传统中药蜈蚣中提取出一种具有抗肿瘤活性的提取物， 该提 取物的主要有效成分是水溶性小分子活性肽。鉴于动物类蛋白在人体经过酶解成小分子 肽后吸收入血方能发挥药理效应， 同时鉴于传统酶解方法， 包括仿生酶解方法的高温灭活 消化酶的过程可使小分子肽失去活性， 本发明采用低温条件下酶解提取蜈蚣蛋白的方法， 将蜈蚣蛋白酶解后， 经丙酮沉淀， sephadex G-25 纯化后获制备成具有活性的小分子肽组 分， 分子量范围为1000-5000Da ； 更优选地， 分子量范围为1500-3000Da。 本发明所提供的蜈 蚣抗肿瘤活性的小分子活性肽组分外观为淡白色粉末，。

14、 经测试具有抗肿瘤作用， 对人肝癌 HepG2 细胞、 人肝癌 MHCC97-H 细胞、 人肺癌 A549 细胞、 人前列腺 PC-3 细胞、 人乳腺癌 MCF-7 细胞、 人结肠癌 SW480 细胞的增殖和生长具有抑制作用， 并呈现明显的量效关系。 0006 本发明的蜈蚣抗肿瘤提取物， 是通过包括下述步骤的方法提取的 ： 0007 将蜈蚣原药材低温粉碎成微粉 ； 0008 蜈蚣粉加入超纯水， 混匀得混悬液， 加入胰蛋白酶低温酶解， 反复提取， 离心， 收 集上清液 ； 0009 上清液经过丙酮沉淀后离心， 所得沉淀经过超纯水溶解后， 再使用预冷的丙酮 和石油醚沉淀后离心， 取沉淀超纯水溶解，。

15、 -20冻存后冻干成粉末 ； 0010 冻干粉末使用超纯水溶解， sephadex G-25 凝胶柱分离， 分离条件为 0.1m/LPBS 洗脱， 流速 0.5ml/min ； 0011 将各组分进行收集、 浓缩冻干， 然后经 MTT 检查进行抗肿瘤活性的测定， 其中 110min-140min 时的洗脱曲线峰所对应的组分为抗肿瘤的蜈蚣提取物。 0012 本发明所述的具有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物， 其主要有效成分是小分子活性肽组 分， 其分子量范围在为 1000-5000Da， 更优选地， 分子量范围为 1500-3000Da。 0013 本发明所述的抗肿瘤活性测定所采用的方法是 MTT 法， 。

16、检测蜈蚣小分子活性肽组 分的MTT法采用的肿瘤细胞株如下 ： 人肝癌HepG2细胞、 人肝癌MHCC97-H细胞、 人肺癌A549 细胞、 人前列腺 PC-3 细胞、 人乳腺癌 MCF-7 细胞和 / 或人结肠癌 SW480 细胞。 0014 优选地， 本发明所述的具有抗肿瘤活性的蜈蚣提取物， 是采用包括下述步骤的方 法提取的 ： 0015 蜈蚣微粉的制备 ： 将蜈蚣低温粉碎成微粉 ( 粒径为 1-75m)， 常温下干燥瓶中 保存备用。可以通过 BFM-6 型贝利微粉机进行粉碎。 0016 低温酶解 ： 蜈蚣粉加入超纯水 (1 5)， 混匀得混悬液， 加入胰蛋白酶 ( 终浓度 为 0.5 )，。

17、 调节 PH 值为 7.0， 4低温条件下水解， 反复提取 5 次， 每次 60 分钟， 3000g 离心 5 分钟后收集上清液 ； 0017 分离冻干 ： 上清液两倍体积丙酮沉淀后 5000g 离心， 取沉淀超纯水溶解， 加入两 说 明 书 CN 102133233 A CN 102133236 A3/6 页 5 倍体积预冷的丙酮和石油醚 (1 1) 沉淀后 5000g 离心， 取沉淀超纯水溶解， -20冻存后 冻干成粉末 ； 0018 纯化 ： 冻干粉超纯水溶解， sephadex G-25 凝胶柱分离， 分离条件为 0.1m/LPBS 洗脱， 流速 0.5ml/min ； 0019 将各。

18、组分进行收集、 浓缩冻干后再次进行抗肿瘤活性测定， 最终得到本发明所 提供的抗肿瘤小分子活性肽组分。 0020 2) 采用 MTT 法， 检测蜈蚣小分子活性肽组分的抗肿瘤活性 ： 0021 肿瘤细胞株 ： 人肝癌HepG2细胞、 人肝癌MHCC97-H细胞、 人肺癌A549细胞、 人前 列腺 PC-3 细胞、 人乳腺癌 MCF-7 细胞、 人结肠癌 SW480 细胞。 0022 接种细胞 ： 取对数生长期的细胞， 消化制成单细胞悬液， 调整细胞浓度为 5104 个 /ml， 每孔 200l 细胞悬液， 接种于 96 孔培养板中。 0023 培养细胞 ： 在37、 5CO2及饱和湿度的培养箱中培。

19、养24h至贴壁， 分为实验组 和对照组。 0024 药物干预 ： 吸去培养液， 根据预实验结果设置起始浓度， 以 1 2 的浓度倍比稀 释， 实验组分别加入不同浓度药液160g/ml， 80g/ml， 40g/ml， 20g/ml， 10g/ml。 同 时设置阴性对照组只加完全培养基， 调零孔加入相应浓度的药物工作液和完全培养基 ( 无 细胞 )， 实验组和对照组每个浓度均设 5 个重复孔。 0025 呈色 ： 在 37、 5 CO2 及饱和湿度条件下培养 48h 后， 每孔加入 5mg/mlMTT 工 作液 20l， 孵育 4h， 去上清， 加入 DMSO150l/ 孔， 旋涡振荡器振荡 1。

20、0min 充分溶解结晶。 0026 比色 ： 酶标仪 492nm 波长测定每孔的吸光光度值 (OD)， 记录结果。 0027 增殖抑制率计算公式 ： 细胞增殖抑制率 ( 对照组 OD 值 - 药物组 OD 值 )/ 对照 组 OD 值 100。药物组、 对照组 OD 值均减去调零孔 OD 值校正。 0028 有益效果 0029 由于大分子蛋白质类药物的临床应用存在一定致敏性， 而且大分子量蛋白类药物 研发对产业化的要求较高， 因此开发小分子活性肽类药物具有提高生产效率， 节省工序， 便 于质控等优点。虽然仿生酶解法等方法可成功从动物类中药中提取小分子肽， 但后续的蛋 白酶 80以上灭活步骤可使。

21、大量小分子肽可能失去活性。因此， 本发明采用低温酶解的方 法， 能在提取过程中最大限度保证小分子肽的活性， 经sephadex G-25凝胶柱分离后可获得 纯化的高活性小分子肽组分， 可有效解决以上问题。 通过抗肿瘤活性的检测， 证明以该方法 提取的蜈蚣小分子活性肽组分具有抗肿瘤活性。 附图说明 0030 附图 1 ： 蜈蚣酶解提取物经 Sephadex G-25 分子筛分离纯化后的洗脱曲线图。 具体实施方式 0031 实施例 1 0032 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分的提取 ： 称取蜈蚣微粉 4g， 加入 5 倍体积的超纯水， 初混合后振荡混匀器中混匀制成混悬液。 向混悬液中加入胰蛋白酶使终浓。

22、度为0.5， 调节 PH值7.0， 保持温度4低温条件下水解， 反复提取5次， 每次60分钟， 过滤， 合并各次滤液， 说 明 书 CN 102133233 A CN 102133236 A4/6 页 6 3000g 离心 5 分钟后收集上清液。取其上清液， 4下 5000 转离心 10 分钟。取其上清液， 加入两倍体积预冷的丙酮 ( 此过程在冰上进行 )， 振摇， 4下 5000g 离心 10 分钟。取其沉 淀， 用水溶解， 加入两倍体积预冷的丙酮(此过程在冰上进行)振摇， 4下5000g离心10分 钟。 取其沉淀， 用水溶解， 加入两倍体积预冷的丙酮和石油醚(11)， 振摇， 4下5000。

23、g离 心 10 分钟。取其沉淀， 用水溶解， -20冻存， 最后冻干成粉末。称取冻干粉 100mg， 2mlPBS 溶解并过滤， 上样于填装好的sephadex G-25凝胶层析柱， 0.1m/L PBS洗脱， 流速为0.5ml/ min， 得到 3 个洗脱组分。洗脱组分丙酮沉淀两次， 取其沉淀， 超纯水溶解， -20冻存， 最后 冻干成粉末。各洗脱组分进行抗肿瘤活性检测， 第二个峰为本发明所公布的蜈蚣抗肿瘤小 分子活性肽组分。 0033 实施例 2 ： 0034 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分的人肝癌 HepG2 细胞的增殖抑制作用 ： 取对数生长 期的人肝癌 HepG2 细胞， 消化制成单细胞。

24、悬液， 调整细胞浓度为 5104个 /ml， 每孔 200l 细胞悬液， 接种于96孔培养板中。 37、 5CO2及饱和湿度的培养箱中培养24h至贴壁， 分 为实验组和对照组。 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为160g/ml， 80g/ml， 40g/ml， 20g/ml， 10g/ml 五个梯度药物浓度， 同时设置阴性对照组只加完全培养基， 调零孔加入 相应浓度的药物工作液和完全培养基， 实验组和对照组每个浓度均设 5 个重复孔。37、 5 CO2 及饱和湿度条件下培养 48h 后， 每孔加入 5mg/ml MTT 工作液 20l， 孵育 4h， 去上 清， 加入 DMSO 150l/ 孔，。

25、 旋涡振荡器振荡 10min 充分溶解结晶。酶标仪 492nm 波长测定 每孔的吸光光度值 (OD)， 记录结果。增殖抑制率计算公式 ： 细胞增殖抑制率 ( 对照组 OD 值 - 药物组 OD 值 )/ 对照组 OD 值 100。药物组、 对照组 OD 值均减去调零孔 OD 值校正。 0035 结果 0036 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为 160g/ml， 80g/ml， 40g/ml， 20g/ml， 10g/ml 五个梯度药物浓度干预后， 增殖抑制率分别为 83.1， 64.2， 41.3， 21.4， 18.3 ； 0037 试验结果表明 ： 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分能抑制人肝癌 。

26、HepG2 细胞增殖， 并 呈现明显量效关系。 0038 实施例 3 ： 0039 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分的人肝癌 MHCC97-H 细胞的增殖抑制作用 ： 取对数 生长期的人肝癌MHCC97-H细胞， 消化制成单细胞悬液， 调整细胞浓度为5104个/ml， 每孔 200l 细胞悬液， 接种于 96 孔培养板中。37、 5 CO2及饱和湿度的培养箱中培养 24h 至 贴壁， 分为实验组和对照组。蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为 160g/ml， 80g/ml， 40g/ml， 20g/ml， 10g/ml 五个梯度药物浓度， 同时设置阴性对照组只加完全培养基， 调零孔加入相应浓度的药物工作。

27、液和完全培养基， 实验组和对照组每个浓度均设 5 个重复 孔。37、 5 CO2 及饱和湿度条件下培养 48h 后， 每孔加入 5mg/ml MTT 工作液 20l， 孵育 4h， 去上清， 加入 DMSO 150l/ 孔， 旋涡振荡器振荡 10min 充分溶解结晶。酶标仪 492nm 波 长测定每孔的吸光光度值 (OD)， 记录结果。增殖抑制率计算公式 ： 细胞增殖抑制率 ( 对 照组 OD 值 - 药物组 OD 值 )/ 对照组 OD 值 100。药物组、 对照组 OD 值均减去调零孔 OD 值校正。 0040 结果 说 明 书 CN 102133233 A CN 102133236 A5。

28、/6 页 7 0041 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为 160g/ml， 80g/ml， 40g/ml， 20g/ml， 10g/ml 五个梯度药物浓度干预后， 增殖抑制率分别为 94.1， 84.2， 61.8， 36.4， 30.1 ； 0042 试验结果表明 ： 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分能显著抑制人肝癌 MHCC97-H 细胞 增殖， 并呈现明显量效关系。 0043 实施例 4 ： 0044 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分的人肺癌 A549 细胞的增殖抑制作用 ： 取对数生长 期的人肺癌 A549 细胞， 消化制成单细胞悬液， 调整细胞浓度为 5104个 /ml， 每孔 200l 细胞悬。

29、液， 接种于96孔培养板中。 37、 5CO2及饱和湿度的培养箱中培养24h至贴壁， 分 为实验组和对照组。 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为160g/ml， 80g/ml， 40g/ml， 20g/ml， 10g/ml 五个梯度药物浓度， 同时设置阴性对照组只加完全培养基， 调零孔加入 相应浓度的药物工作液和完全培养基， 实验组和对照组每个浓度均设 5 个重复孔。37、 5 CO2 及饱和湿度条件下培养 48h 后， 每孔加入 5mg/ml MTT 工作液 20l， 孵育 4h， 去上 清， 加入 DMSO 150l/ 孔， 旋涡振荡器振荡 10min 充分溶解结晶。酶标仪 492nm 波长。

30、测定 每孔的吸光光度值 (OD)， 记录结果。增殖抑制率计算公式 ： 细胞增殖抑制率 ( 对照组 OD 值 - 药物组 OD 值 )/ 对照组 OD 值 100。药物组、 对照组 OD 值均减去调零孔 OD 值校正。 0045 结果 0046 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为 160g/ml， 80g/ml， 40g/ml， 20g/ml， 10g/ml 五个梯度药物浓度干预后， 增殖抑制率分别为 70.0， 53.3， 32.6， 11.8， 8.2 ； 0047 试验结果表明 ： 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分能抑制人肺癌 A549 细胞增殖， 并呈 现明显量效关系。 0048 实施例 5 ：。

31、 0049 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分的人前列腺 PC-3 细胞的增殖抑制作用 ： 取对数 生长期的人前列腺 PC-3 细胞， 消化制成单细胞悬液， 调整细胞浓度为 5104个 /ml， 每孔 200l 细胞悬液， 接种于 96 孔培养板中。37、 5 CO2及饱和湿度的培养箱中培养 24h 至 贴壁， 分为实验组和对照组。蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为 160g/ml， 80g/ml， 40g/ml， 20g/ml， 10g/ml 五个梯度药物浓度， 同时设置阴性对照组只加完全培养基， 调零孔加入相应浓度的药物工作液和完全培养基， 实验组和对照组每个浓度均设 5 个重复 孔。37、 5 C。

32、O2 及饱和湿度条件下培养 48h 后， 每孔加入 5mg/ml MTT 工作液 20l， 孵育 4h， 去上清， 加入 DMSO 150l/ 孔， 旋涡振荡器振荡 10min 充分溶解结晶。酶标仪 492nm 波 长测定每孔的吸光光度值 (OD)， 记录结果。增殖抑制率计算公式 ： 细胞增殖抑制率 ( 对 照组 OD 值 - 药物组 OD 值 )/ 对照组 OD 值 100。药物组、 对照组 OD 值均减去调零孔 OD 值校正。 0050 结果 0051 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为 160g/ml， 80g/ml， 40g/ml， 20g/ml， 10g/ml 五个梯度药物浓度干预后，。

33、 增殖抑制率分别为 77.4， 56.3， 41.8， 26.0， 19.7 ； 0052 试验结果表明 ： 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分能抑制人前列腺 PC-3 细胞增殖， 并 说 明 书 CN 102133233 A CN 102133236 A6/6 页 8 呈现明显量效关系。 0053 实施例 6 ： 0054 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分的人乳腺癌 MCF-7 细胞的增殖抑制作用 ： 取对数 生长期的人乳腺癌 MCF-7 细胞， 消化制成单细胞悬液， 调整细胞浓度为 5104个 /ml， 每孔 200l 细胞悬液， 接种于 96 孔培养板中。37、 5 CO2及饱和湿度的培养箱中培养 2。

34、4h 至 贴壁， 分为实验组和对照组。蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为 160g/ml， 80g/ml， 40g/ml， 20g/ml， 10g/ml 五个梯度药物浓度， 同时设置阴性对照组只加完全培养基， 调零孔加入相应浓度的药物工作液和完全培养基， 实验组和对照组每个浓度均设 5 个重复 孔。37、 5 CO2 及饱和湿度条件下培养 48h 后， 每孔加入 5mg/ml MTT 工作液 20l， 孵育 4h， 去上清， 加入 DMSO 150l/ 孔， 旋涡振荡器振荡 10min 充分溶解结晶。酶标仪 492nm 波 长测定每孔的吸光光度值 (OD)， 记录结果。增殖抑制率计算公式 ： 细。

35、胞增殖抑制率 ( 对 照组 OD 值 - 药物组 OD 值 )/ 对照组 OD 值 100。药物组、 对照组 OD 值均减去调零孔 OD 值校正。 0055 结果 0056 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为 160g/ml， 80g/ml， 40g/ml， 20g/ml， 10g/ml 五个梯度药物浓度干预后， 增殖抑制率分别为 52.3， 38.1， 12.1， 9.3， 7.5 ； 0057 试验结果表明 ： 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分对人乳腺癌 MCF-7 细胞增殖具有一 定抑制作用， 并呈现明显量效关系。 0058 实施例 7 ： 0059 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分的人结肠癌 SW4。

36、80 细胞的增殖抑制作用 ： 取对数 生长期的人结肠癌 SW480 细胞， 消化制成单细胞悬液， 调整细胞浓度为 5104个 /ml， 每孔 200l 细胞悬液， 接种于 96 孔培养板中。37、 5 CO2及饱和湿度的培养箱中培养 24h 至 贴壁， 分为实验组和对照组。蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为 160g/ml， 80g/ml， 40g/ml， 20g/ml， 10g/ml 五个梯度药物浓度， 同时设置阴性对照组只加完全培养基， 调零孔加入相应浓度的药物工作液和完全培养基， 实验组和对照组每个浓度均设 5 个重复 孔。37、 5 CO2 及饱和湿度条件下培养 48h 后， 每孔加入 。

37、5mg/ml MTT 工作液 20l， 孵育 4h， 去上清， 加入 DMSO 150l/ 孔， 旋涡振荡器振荡 10min 充分溶解结晶。酶标仪 492nm 波 长测定每孔的吸光光度值 (OD)， 记录结果。增殖抑制率计算公式 ： 细胞增殖抑制率 ( 对 照组 OD 值 - 药物组 OD 值 )/ 对照组 OD 值 100。药物组、 对照组 OD 值均减去调零孔 OD 值校正。 0060 结果 0061 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分设置为 160g/ml， 80g/ml， 40g/ml， 20g/ml， 10g/ml 五个梯度药物浓度干预后， 增殖抑制率分别为 70.5， 52.6， 33.8， 16.5， 14.3 ； 0062 试验结果表明 ： 蜈蚣抗肿瘤小分子活性肽组分能抑制人结肠癌 SW480 细胞增殖， 并呈现明显量效关系。 说 明 书 CN 102133233 A CN 102133236 A1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102133233 A 。