技术领域：
本发明涉及一种治疗肝炎的中药提取物、片剂及其制备方法技术领域，属于中药技术领域。
背景技术：
肝炎是临床常见病、多发病。我国是世界肝炎大国，全球肝炎患者80％集中在我国。据血清流行病学调查，甲型肝炎病毒感染流行率为80.9％，乙型肝炎病毒感染流行率达57.6％，乙肝表面抗原(HBsAg)阳性率为9.75％，约1.2亿人。丙型肝炎病毒感染率为32％，丁型和戊型肝炎亦有流行。由于肝炎特别是慢性肝炎传播途径复杂、病程长，易于反复和慢性化，与肝硬化和肝癌密切相关。每年因肝病死亡约30万人。因此，肝炎特别是病毒性肝炎的防治一直是我国传染病工作者肩负的重大使命，也一直是新药研究开发的难点和热点。
发明内容：
为了更好的服务于肝炎患者，克服注射给药方式的不便和可能的安全性问题，进一步提高制剂质量水平和安全有效性，本发明人经过反复研究采用现代制剂技术，通过工艺筛选、优化和剂型的改革研制出口服的抗肝炎药物，从而完成了本发明。
本发明目的是提供一种更为有效的口服抗肝炎中药提取物及其制备方法。
本发明的另一个目的是提供一种抗肝炎中药片剂及其制备方法。
本发明药物由下列重量配比的原料药制成：茵陈5～25kg、栀子2～10kg、黄芩0.5～5kg、大黄1～5kg、黄连1～5kg和黄柏1～5kg。
为了达到更好的疗效，原料药的重量比也可为茵陈5.56kg、栀子3.70kg、黄芩1.85kg、大黄1.85kg、黄连1.85kg和黄柏1.85kg。
本发明的中药提取物是由上述重量配比的茵陈、栀子、黄芩和大黄的有效部位与黄连和黄柏的有效部位组成。
本发明的中药片剂包含活性成分和\或药学上可接受的片剂辅料，其中所述的活性成分由上述重量配比的茵陈、栀子、黄芩和大黄制得的有效部位与黄连和黄柏制得的有效部位按3.5∶1的重量比组成。所述的片剂辅料可选用羧甲基淀粉钠，按活性成分和羧甲基淀粉钠质量比3∶1的比例加入羧甲基淀粉钠，并加入片剂总重量0.3％的硬脂酸镁作为润滑剂。
本发明中药提取物和片剂对肝炎患者具有清热、解毒、利湿、退黄，用于湿热毒邪内蕴所致急性、迁延性、慢性肝炎、重症肝炎和肝硬化黄疸以及胆道感染、胆石症等的作用。
本发明中药提取物的制备方法如下：
称取上述重量比的原料药茵陈、栀子、黄芩、大黄、黄连和黄柏，将这6味原料药分为2组，其中茵陈、栀子、黄芩和大黄为一组，而黄连和黄柏为另一组；
一、茵栀芩黄有效部位(茵陈、栀子、黄芩、大黄)
(1)取茵陈、栀子、黄芩、大黄，加水6～12倍，浸泡0.5～3小时后，将茵陈和栀子加入水中进行煎煮，煮沸后加入黄芩，等煎煮液微沸后再加入大黄，开始计算煎煮时间，0.5～2小时后优选1小时，将煎煮液滤出保留，往器皿中加水继续煎煮2次，每次0.5～2小时优选1小时，合并滤出的煎煮液，减压浓缩至80℃下相对密度为1.05～1.10，得到药材与药液的质量体积比为1∶2～3(W/V)，浓度为0.3～0.5克生药/毫升的清膏，将清膏放置过夜，离心过滤，分 别收集沉淀和滤液；
(2)将步骤(1)所得的滤液加入已预处理好的D101大孔吸附树脂柱，选取径高比为1∶5～1∶9优选1∶7；药材∶树脂为1∶2～1∶4优选1∶3，控制流速为每小时2～3倍树脂床体积，待过柱液流尽后，水洗，以Molish反应呈阴性为水洗判定终点；然后用浓度为50％～90％的乙醇优选70％的乙醇洗脱，由于大黄蒽醌遇碱变红色因此以洗脱液中加浓氨水不变红色为醇洗脱判定终点，收集醇洗液，本步骤中水洗体积为树脂床体积量的10倍，70％醇洗体积约为树脂床体积量的10倍；
(3)将步骤(1)中所得的沉淀以6倍量(W/V)95％乙醇回流1小时，滤过，滤液与步骤(2)中的树脂醇洗液合并，减压回收乙醇，浓缩至80℃下相对密度为1.25～1.30，然后70℃真空干燥，粉碎，过100目筛，即得茵栀芩黄有效部位。
二、黄连黄柏有效部位
(1)取黄连、黄柏，以浓度为85％～95％的乙醇优选90％的乙醇回流1-5次，合并醇提液，放置过夜，吸取上清液，减压回收至无醇味，放置过夜，离心滤过，分别收集滤液和沉淀；
(2)水洗沉淀，至水洗液澄明，沉淀备用，收集水洗液；
(3)将步骤(1)所得的滤液和步骤(2)所得的水洗液合并，以浓盐酸调pH至1～4，放置过夜，析出沉淀，沉淀水洗至pH近中性；
(4)将步骤(2)和步骤(3)所得的沉淀合并，60-80℃下真空干燥，粉碎，过50-200目筛，即得黄连黄柏有效部位(总生物碱)。
合并以上步骤得到的茵陈、栀子、黄芩、大黄有效部位和黄连、黄柏有效部位即得本发明的中药提取物。
本发明的中药提取物可以加入制备不同剂型所需的各种常规辅料，如崩解剂、润滑剂、粘合剂等按照常规的中药制剂方法和辅料用量制备成任何一种常用口服剂型，如丸剂、散剂、片剂、胶囊剂等。
本发明的中药片剂活性成分中的茵栀芩黄有效部位和黄连黄柏有效部位的制备过程与中药提取物中茵栀芩黄有效部位和黄连黄柏有效部位的制备过程相同，不同之处在于：在片剂的制备过程中将制得的茵陈、栀子、黄芩、大黄有效部位和黄连、黄柏有效部位按3.5∶1的比例混合均匀得到本发明的活性成分，将所得的活性成分和羧甲基淀粉钠按质量比3∶1的比例，加入羧甲基淀粉钠作为崩解剂和赋型剂，其中2/3量在制粒时加入，1/3量在压片时加入，具体步骤如下：
(1)制粒：按照活性成分和羧甲基淀粉钠按质量比3∶1的比例称取活性成分和羧甲基淀粉钠，并将羧甲基淀粉钠分成两分，一份为1/3量备用，另一份为2/3量加入到活性成分中，以浓度为70％～80％的乙醇为湿润剂制粒，制得的颗粒于60℃下干燥；
(2)压片：取干燥颗粒，加入备用的1/3量的羧甲基淀粉钠和片剂总重量0.3％的硬脂酸镁，以1～10kN压力下压成片剂。
本发明的中药提取物和片剂具有以下作用：
1、利胆作用 可增加正常大鼠的胆汁分泌量，并使口服ANIT诱导的胆管损伤大鼠胆汁分泌增加，表明正肝清黄片具有明显的利胆作用。
2、退黄作用 可抑制口服ANIT导致肝损伤大鼠的血清胆红素、胆固醇、胆酸的升高。显示其显著的退黄作用。
3、保肝降酶作用 可抑制多次注射CCl4引起的大鼠血清转氨酶的升高、总蛋白和白蛋白降低，减少肝胶原蛋白含量；对一次性ip四 氯化碳(CCl4)、D-半乳糖胺(D-GalN)所致小鼠血清谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)的升高亦有较强的抑制作用，组织学检查，对分别由CCl4、D-GalN引起的动物肝损伤，正肝清黄片具有一定的保护作用。
4、对免疫系统的影响 对BCG(卡介苗)加LPS(脂多糖)诱导的小鼠免疫性肝损伤有明显的保护作用；可明显增强环磷酰氨(Cy)处理小鼠低下的腹腔巨噬细胞吞噬功能、溶血素抗体生成反应以及Con A诱导的淋巴细胞增殖反应，并能增强正常小鼠Con A诱导的淋巴细胞增殖反应表明正肝清黄片具有较好的饿增强机体免疫能力的作用。
5、抗肝炎病毒作用 可抑制2.2.15细胞HBsAg、HBeAg的复制和表达，对细胞培养上清和细胞内DNA复制有抑制作用；对感染鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的鸭血清中DHBVDNA升高有较好的抑制作用。正肝清黄片对乙肝病毒具有一定的抑制作用。
具体实施方式：
以下通过药效学试验来进一步阐述本发明的有益效果。
实验材料：
1、受试药物：本发明的中药提取物片剂(下称“正肝清黄片”)，解放军第302医院提供，批号010620。
2、阳性对照药：优思弗，德国福克大药厂，99J15043L01联苯双酯，北京协和药厂，批号：010309，盐酸左旋咪唑，湖南洞庭药业股份有限公司产，批号010832。拉米夫啶，英国葛兰素威康有限公司B022306。
3、试剂：谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)测定试剂盒，为北京北化康泰临床试剂有限公司产品。总胆红素(TBil)、胆固醇(CHE)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)测定试剂盒，均为北京中生生物工程高技术公司产品。胆汁酸测定试剂盒为德国Human公司产品。其它 试剂均为市售分析纯。环磷酰胺(Cy)粉针剂，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号01060821。D-半乳糖胺(D-GalN)，α-萘异硫氰酸酯(ANIT)分析纯，中国人民解放军防化学院提供。卡介苗(BCG)，北京生物制品研究所生产，批号010910。脂多糖(LPS)，Sigma公司产品，批号L2688。植物血凝素(PHA)，Sigma公司产品，批号L8754。Eagles MEM干粉、G-418(Geneticin)、酵母t-RNA、蛋白酶K，美国GIBCO公司产品；胎牛血清，美国Hyclone Lab公司产品；L-谷氨酰胺，京科化学试剂公司进口分装；HBsAg、HBeAg固相放免测定盒，中国同位素公司北方免疫试剂研究所；卡那霉素，华北制药厂产品；聚乙二醇，瑞典Fluka产品；d-32p-dCTP，北京亚辉生物医学工程公司产品。
4、动物：Wistar大鼠，体重190-210g，昆明种小鼠，体重18-22g，均雌雄各半，由军事医学科学院动物中心提供，动物合格证号分别为军医动字第BDW98012和军医动字第BDW95001号。1日龄北京鸭，80-100g，由北京医科院药植所动物饲养场提供。动物实验条件：贰级标准，合格证号：军医动字第B98006。
5、鸭乙型肝炎病毒(DHBV-DNA)强阳性血清，采自上海感染乙肝病毒麻鸭，-70℃保存。
6、2.2.15细胞 为克隆转染乙肝病毒HBVDNA的人肝癌细胞(HepG2)，美国Mount Sinai医学中心构建，中国医学科学院医药生物技术所病毒室传代培养。
7、仪器：BS-224型生化分析测定仪，北京生化仪器厂。Hervester96型96孔板细胞收集仪，美国TOMTE公司生产。MicroBetu Trilux1450型微量液内仪，Perkin Elmer公司生产。
实验方法与结果：
一、正肝清黄片利胆作用的实验研究
1、正肝清黄片对正常大鼠的利胆实验：取Wistar大鼠，按体重随机分为5组，每组10只，正常对照组、优思弗组0.135g/kg·日、正肝清黄片高、中、低(0.576g、0.288g、0.144g/kg·日)三个剂量组。自给药第6天开始，分别在24、48、72、96、120小时五个时间段，采用复合麻醉(氯胺酮∶地西泮＝1∶1)麻醉大鼠，分离总胆管，插入胆汁收集管，收集4小时胆汁。计算每个时间段、每只动物、每100g体重胆汁流量。
表1正肝清黄片对正常大鼠胆汁排泄的影响(n＝10)
与正常对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05
2、正肝清黄片对ANIT肝损伤大鼠的利胆实验 取Wistar大鼠，按体重随机分为6组，每组10只，正常对照组、肝损伤模型组、优思弗组0.135g/kg·日、正肝清黄片高、中、低(0.576g、0.288g、0.144g/kg·日)三个剂量组。自给药后第6天开始，除正常对照组外，其它各组用4％ANIT油剂1.75ml/kg灌胃，造成大鼠胆汁淤积模型，分别在造模型后24、48、72、96、120小时五个时间段，采用复合麻醉(氯胺酮∶地西泮＝1∶1)麻醉大鼠，分离总胆管，插入胆汁收集管，收集4小时胆汁。计算每个时间段、每只动物、每100g体重胆汁流量。
表2正肝清黄片对ANIT肝损伤大鼠胆汁分泌的影响(n＝10)
与正常对照组比较#P＜0.05 ##P＜0.01 与模型照组比较*P＜0.05 **P＜0.01
表1、2结果表明，正肝清黄片可使正常大鼠、ANIT肝损伤大鼠胆汁分泌增加，提示正肝清黄片具有利胆作用。
二、正肝清黄片的退黄实验：取Wistar大鼠，按体重随机分为6组，每组10只，正常对照组、肝损伤模型组、优思弗组0.135g/kg·日、正肝清黄片高、中、低(0.576g、0.288g、0.144g/kg·日)三个剂量组。自给药后第6天开始，除正常对照组外，其它各组用4％ANIT油剂1.75ml/kg灌胃，造成大鼠胆汁淤积模型，分别在造型后24、48、72、96、120小时五个时间段，取大鼠股动脉血。测定总胆红素(TBil)、胆固醇(CHE)、胆酸值，并取肝组织作病理学检查。
表3正肝清黄片剂对大鼠血清中胆红素的影响(n＝10)
与正常对照组比较#P＜0.05 ##P＜0.01 与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01
表4正肝清黄片剂对大鼠血清中胆固醇的影响(n＝10)
与正常对照组比较#P＜0.05 ##P＜0.01 与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01
表5正肝清黄片剂对大鼠血清中胆酸的影响(n＝10)
与正常对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01 与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01
三.正肝清黄片的保肝降酶实验
1、对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的影响：取Wistar大鼠，按体重随机分为6组，每组20只，正常对照组、肝损伤模型组、联苯双酯组、正肝清黄片高、中、低(0.576g、0.288g、0.144g/kg·日/kg)三个剂量组。除正常对照组外，各组动物腹腔注射10％CCl4植物油0.5ml/100g体重，每周两次，共12周，正常对照组ip生理盐水。造模同时每日ig给药一次，(1ml/100g体重，正常对照组ig同体积的蒸馏水)。实验结束前，动物禁食12小时，将动物摘眼球采血，以3000转/分离心10分钟，分离血清，测定GPT、GOT、TP、ALB，采血后将动物处死，取肝组织作羟脯氨酸测定，计算肝胶原蛋白含量(结果见表6、7)。
表6正肝清黄片对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的影响
与正常组比较*p＜0.05 **p＜0.01 与模型组比较*p＜0.05 **p＜0.01
表7.正肝清黄片对大鼠肝胶原蛋白含量的影响(X±SD)
与模型组比较，*p＜0.05 **p＜0.01
表6、7结果表明，正肝清黄片可抑制多次注射CCl4引起的大鼠 血清转氨酶的升高、总蛋白和白蛋白降低，减少肝胶原蛋白含量。
2、对D-GalN所致小鼠急性肝损伤的影响：取健康小鼠60只随机分为六组，即正常对照组、D-GalN(800mg/kg)模型组、联苯双酯组0.029g/kg、正肝清黄片(0.832、0.416、0.208g/kg)三个剂量组，每组10只。每日ig给药2次，对照组及模型组给与相同容积的蒸馏水，给药7次后，除正常对照组外，小鼠ip D-GalN 0.2ml/10g，造模后20小时，小鼠眶静脉采血，测血清GPT、GOT值(表8)。
表8.正肝清黄片对D-GalN致小鼠急性肝损伤的影响(X±SD)
与正常对照组比较，#p＜0.05 ##p＜0.01 与模型组比较，*p＜0.05 **p＜0.01
表8结果表明，各给药组小鼠血清GPT、GOT值均低于模型对照组，正肝清黄片高、中剂量组与模型组比较有显著性差异，说明正肝清黄片对D-GalN所致小鼠急性肝损伤具有一定的治疗作用。
3、对CCl4所致小鼠急性肝损伤的影响：取健康小鼠60只随机分为六组，即正常对照组、CCl4(0.02ml/kg)模型组、联苯双酯组0.029g/kg、正肝清黄片(0.832、0.416、0.208g/kg)三个剂量组，每组10只。每日ig给药2次，对照组及模型组给与相同容积的蒸馏水，连续给药7次药后，除正常对照组外，小鼠ip 0.1％CCl4 0.2ml/10g，造模后40小时，小鼠眶静脉采血，测血清GPT、GOT值(见表9)。
表9.正肝清黄片对CC14致小鼠急性肝损伤的影响(X±SD)
与正常对照组比较，#p＜0.05 ##p＜0.01 与模型组比较，*p＜0.05 **p＜0.01
表9结果表明，各给药组大鼠血清GPT、GOT值均低于模型对照组， 正肝清黄片高、中剂量组与模型组比较有显著性差异，说明正肝清黄片对CCl4所致小鼠急性肝损伤具有较好的治疗作用。
四、正肝清黄片片对小鼠免疫功能的影响
1、对免疫性肝损伤的影响：健康小鼠60只，随机分为六组，正常对照组、模型组、联苯双酯组(0.029g/kg)、正肝清黄片(0.832g/kg、0.416g、0.208g)三个剂量组，每组10只，小鼠ig给药2次/日，共10天。给药前除正常对照组外，每鼠尾静脉注射BCG 5×107U/只，10天后每鼠再尾静脉注射LPS 7.5μg攻击，12小时后眼球后静脉丛取血测血清GPT、GOT。结果见表10。
表10.正肝清黄片片对小鼠免疫性肝损伤的影响(X±SD)
与对照组比较##p＜0.01 与模型组比较，*p＜0.05 **p＜0.01
结果表明，正肝清黄片对BCG+LPS所致免疫性肝损伤小鼠血清转氨酶的升高有明显的抑制作用，与模型组比较有显著性差异。
2、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响：鸡红细胞吞噬法。取健康雄性小鼠，随机分为六组，正常对照组、环磷酰胺(Cy)模型组、Cy+阳性对照药左旋米唑组(0.04g/kg)、Cy+正肝清黄片(0.832、0.416、0.208g/kg)三个剂量组，每组10只，灌胃给药(ig)，每次0.2ml/只，每天1次，连续一周，正常对照组和Cy模型组给予等量蒸馏水。于第4天和第5天ig受试药物1h后腹腔注射(ip)Cy15mg/kg，1次/天，正常对照组同法给蒸馏水。所有动物给药第6天时，腹腔注射5％淀粉生理盐水溶液，1mL/鼠，以刺激腹腔巨噬细胞的聚集和活化。实验前45分钟，腹腔注射5％鸡红细胞悬液0.4mL/鼠，断脊处死小鼠，腹腔注入生理盐水1mL/鼠，轻揉腹部，打开腹 腔，取腹腔液约0.2mL滴于干净的玻片上，置37℃孵温3 0分钟后取出玻片，用生理盐水漂洗，去除未贴片细胞，晾干后用1∶1丙酮-甲醇液固定5分钟，姬姆萨-瑞氏混合液染色5分钟，水洗晾干，油镜下计数每100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和吞噬鸡红细胞的总数，并按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。
表11正肝清黄片对Cy处理小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(X±SD)
与正常对照组比较##p＜0.01 与Cy模型组比较**p＜0.01，
由表11结果可见，Cy模型小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数较正常对照组明显降低，给予正肝清黄片高、中、低三个剂量及阳性对照药佐旋咪唑均使吞噬百分率和吞噬指数明显升高，提示正肝清黄片对Cy所致小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的降低具有明显的改善作用。
3、对小鼠溶血素抗体生成的影响：取健康雄性小鼠，按体重随机分为六组，正常对照组、环磷酰胺(Cy)模型组、Cy+阳性对照药左旋咪唑组、Cy+正肝清黄片(0.832、0.416、0.208g/kg)三个剂量组，每组10只。每日ig给药1次(正常对照组ig等体积的蒸馏水)，连续7天，药后第五天，每鼠ip 3∶5(V/V)稀释的绵羊红细胞(SRBC)悬液0.2ml/只进行免疫，一小时后，除正常对照组外，各组小鼠ip环磷酰胺15mg/kg体重(0.2ml/20g)，次日再以同剂量注射一次。免疫四天后，摘除小鼠眼球取血，分离血清，用生理盐水将血清稀释200倍， 取1ml稀释血清加入10％0.5ml SRBC，置冰浴中，每管加入1ml以生理盐水1∶10稀释过的豚鼠血清，随即移至37℃恒温水浴中，保温10分钟，即放入冰浴以终止反应，用2000r/min离心10min，取上清1ml，加3ml都氏液混匀，放置10分钟后，以对照管为空白对照，用分光光度计在540nm下测定各样品的吸收度(OD)值。另取SRBC稀释液0.125ml，加都氏液2ml，置10分钟后测定OD值(540nm)，该OD值(540nm)为SRBC半数溶血时吸收度值。按下列公式计算每样品的半数溶血值(HC50)。
血清溶血素反应体系
表12正肝清黄片对Cy处理小鼠溶血素抗体生成的影响
##P＜0.01，与正常对照组比较；**P＜0.01，与Cy模型组比较
结果见表12，正肝清黄片能明显增加Cy模型小鼠血清溶血素含量，对Cy所致免疫反应抑制有较强的拮抗作用。
4、对小鼠淋巴细胞增殖反应的影响：取健康雌性小鼠，按体重随机分为六组，正常对照组、Cy模型组、Cy+阳性对照药左旋咪唑组、Cy+正肝清黄片(0.832、0.416、0.208g/kg)三个剂量组，每组10只。每日ig给药1次(正常对照组和Cy模型组ig等体积的蒸馏水)，连续7天。药后第五天，除正常对照组外，各组小鼠ip环磷酰胺15mg/kg 体重(0.2ml/20g)，次日再以同剂量注射一次。第8天取小鼠脾脏制备脾细胞悬液，染料排斥法鉴定细胞存活率在95％以上。用甲基3H～胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法测定正肝清黄片对小鼠Con A诱导的淋巴细胞增殖反应的影响。
3H-TdR掺入法：将脾细胞浓度调整为5×106/ml，向Costar 96孔板加入脾细胞悬液100μl/孔，然后加入1640液100μl/孔(检测脾细胞自发增殖反应)或1μg/ml的Con A 100μl/孔(检测Con A诱导的脾细胞自发增殖反应)，设10个复孔，置37℃、饱和湿度和5％CO2培养箱中培养7 2h，在终止培养前16h加入10μCi/ml的3H-TdR20μl(7.4KBq)/孔。用美国TOMTE公司生产的Hervester 96型96孔板细胞收集仪收集样品于滤膜上，干燥后加闪烁液用Perkin Elmer公司MicroBetu Trilux 1450型微量液内仪测定每孔放射性(cpm)。结果以平均10复孔平均cpm值表示。
表13正肝清黄片对Cy处理小鼠脾细胞增殖反应的影响
##P＜0.01，与正常对照组比较；**P＜0.01，与Cy模型组比较
5、体外对小鼠淋巴细胞增殖反应的影响：取3只健康成年雌性小鼠脾脏，常规方法制备单细胞悬液，用20％小牛血清的1640液稀释细胞至5×106/ml，于96孔细胞培养板每孔加细胞悬液100μl，Con A(1.0ug/ml)50μl，不同浓度的药物50μl，对照孔加等体积的1640液，每样品均设6个复孔，置37℃、饱和湿度和5％CO2孵温箱中培养56h，然后每孔加10μCi/ml的3H-TdR 20μl，继续培养16h。用美国TOMTE公司生产的Hervester 96型96孔板细胞收集仪 收集样品于滤膜上，干燥后加闪烁液用Perkin Elmer公司MicroBetuTrilux 1450型微量液内仪测定每孔放射性(cpm)。结果以平均6复孔平均cpm值表示。
表14正肝清黄片体外对小鼠脾细胞增殖反应的影响(n＝6)
与对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01，
结果如表14所示，正肝清黄片体外在0.5-50.0ug/ml剂量范围内可增加脾细胞3H-TdR掺入值，提示正肝清黄片体外对小鼠淋巴细胞增殖反应具有增强作用。
6、对小鼠循环免疫复合物(CIC)水平的影响：聚乙二醇(PEG)直接沉淀法。取健康雌性小鼠，按体重随机分为六组，正常对照组、环磷酰氨(Cy)模型组、Cy+阳性对照药左旋咪唑组、Cy+正肝清黄片(0.832、0.416、0.208g/kg)三个剂量组，每组10只。每日ig给药1次(正常对照组和Cy模型组ig等体积的蒸馏水)，连续7天。药后第五天，除正常对照组外，各组小鼠ip环磷酰胺15mg/kg体重(0.2ml/20g)，次日再以同剂量注射一次。第8天摘除小鼠眼球取血，分离血清，加样于96孔板，每样品设对照孔和实验孔，对照孔为0.1mol/L pH 8.4的硼酸液200μl+小鼠血清22μl，实验孔为7.5％PEG 200μl+小鼠血清22μl，室温放置1h，用多孔扫描分光光度计Multiskan Mce/340 MK II测定OD值(450nm)。结果以实验孔OD值-对照孔OD值表示。
表15正肝清黄片对Cy处理小鼠循环免疫复合物水平的影响
##P＜0.01，与正常对照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01，与Cy模型组比较
结果如表15所示，Cy模型小鼠循环免疫复合物水平较正常对照组升高，给予正肝清黄片高、低二个剂量及阳性对照药佐旋咪唑均使循环免疫复合物水平降低，提示正肝清黄片对Cy所致小鼠循环免疫复合物水平升高具有一定的改善作用。
表16正肝清黄片体外对小鼠脾细胞增殖反应的影响
与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，
结果：正肝清黄片在0.028-0.832g/ml剂量范围内可明显增强Cy处理小鼠低下的腹腔巨噬细胞吞噬功能、溶血素抗体生成反应以及Con A诱导的淋巴细胞增殖反应，表明正肝清黄片对Cy所致免疫功能低下具有明显改善作用。另外，正肝清黄片体外在0.5-50.0ug/ml剂量范围内亦能增强小鼠Con A诱导的淋巴细胞增殖反应。
五、正肝清黄片抗乙肝病毒实验
1、在鸭体内对鸭乙型肝炎病毒的影响：1日龄北京鸭，经腿胫静脉注射上海麻鸭DHBV-DNA阳性鸭血清，每只0.3ml，感染后7天取血，分离血清，检测血清中DHBVDNA含量。雏鸭血清经检测DHBV呈阳性后，将鸭随机分为5组，病毒对照组、拉米夫啶组(50mg/kg)、正肝清黄片(8、4、2g/kg)三个剂量组，每组6只。灌胃给药，1.5ml/ 只，每天2次。对照组给予同体积生理盐水，连续给药10天。分别与药物治疗后5天(T5)、10天(T10)和停药后3天(P3)自鸭胫静脉取血，分离血清，按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32P标记DHBVDNA探针，并作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，酶标仪测定OD值(滤光片为490nm)，计算血清DHBV-DNA光密度，以杂交斑点OD值作为标本DHBV-DNA水平值。结果见表17，表18。
表17.正肝清黄片在鸭体内对鸭乙型肝炎病毒DHBV-DNA的影响
统计处理：给药后不同时间(T5、T10、P3)OD值与同组给药前(T0)OD值比较(配对t检验)。
*p＜0.05，**p＜0.01，***p1＜0.001。
表18.正肝清黄治疗组与病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA水平抑制比较
统计处理：给药治疗组HDV-DNA抑制率与病毒对照组同时间的DHBV-DNA抑制率比较(成组t检验)。
*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
三批实验结果表明，正肝清黄8.0g/kg一天2次10天对感染鸭乙型肝炎病毒感染的鸭血清中DHBVDNA水平的一直效果有显著性作用，无毒性反应；4.0g/kg组在第二批和第三批试验中给药第5天，第十天具有一定的抑制作用。阳性药拉米夫啶口服对DHBVDNA的抑制作用极显著。以上实验结果表明：正肝清黄对鸭乙型肝炎病毒感染鸭具有较好的治疗作用。
2、在2.2.15细胞内对乙型肝炎病毒表面抗原、e抗原的抑制作用：药物正肝清黄片用培养基配制成含生药10mg/L溶液，以2倍稀释至5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156.3mg/ml加入96孔细胞培养板，每浓度4孔，每4天换同浓度药液，设无药细胞对照组。以观察细胞病变为指标，8天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制百分率。按Reed Meuench法计算TC50，TC0，见表19。
(A＝log＞50％抑制百分率 B＝log＜50％药物浓度 C＝log稀释倍数)
表19正肝清黄在2.2.15细胞培养中对细胞的毒性
表19表明，正肝清黄片对2.2.15细胞产生50％抑制作用浓度为 1.2mg/ml，无毒性浓度为0.6mg/ml，提示正肝清黄片对2.2.15细胞的药效浓度应选择0.6mg/ml，并在此浓度以下2倍稀释试验药液。
以每毫升10万个2.2.15细胞接种24孔培养板，每孔1ml，37℃5％CO2培养24小时，加无毒浓度以下2倍稀释试验药液，5个稀释度分别为4、2、1、0.5、0.25mg/ml，每浓度3孔，37℃ 5％CO2培养，收集第8天含药培养液，-20℃冰冻保存。参照固相放射免疫测定盒说明书测定，用γ计数仪测定每孔cpm值。实验设HBsAg、HBeAg阳性和阴性对照。见表20、21。
表20正肝清黄片在2.2.15细胞中对HBsAg的影响(二批实验结果)
与细胞对照比较，**p＜0.01 *p＜0.05
表21正肝清黄片在2.2.15细胞中对HBeAg的影响(三批实验结果)
与细胞对照比较，**p＜0.01 *p＜0.05
3、正肝清黄和拉米夫定对2.2.15细胞培养上清液HBV-DNA的抑制作用
3.1、正肝清黄在2.2.15细胞培养上清液中HBV-DNA斑点杂交：取2.2.15细胞每毫升100万个接种24孔细胞培养板，每孔1ml，接种后24小时加入药物，每4天换原浓度药液培养，加药后培养第8天收取上清液，经聚乙二醇沉淀、蛋白酶K裂解、苯酚∶氯仿∶异戊醇抽提、无水乙醇沉淀核酸等步骤，真空抽干，重溶于TE缓冲液中作样品。取20ul(DNA含量25ug)，经变性、中和，并以20X SSC缓冲液对倍稀释至1∶8倍稀释于硝酸纤维素膜上，并经干烤、预杂交、杂交、洗膜、放射自显影等步骤。以常规方法冲洗X光片。扫描仪扫描光片，用gel-pro软件测定密度，计算抑制率及IC50。见表22。
表22.正肝清黄在2.2.15细胞培养上清液中对HBV-DNA的作用
第一批实验HBV-DNA斑点密度值/抑制率％：
第二批实验HBV-DNA斑点相对密度值/抑制率％
3.2、正肝清黄在2.2.15细胞内对HBV-DNA的Southern Blot抑制作用：取2.2.15细胞加药后培养8天，吸除培养液收取细胞，细 胞经裂解液裂解，等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇抽提2次，加无水乙醇沉淀核酸，真空抽干，重溶于20ul TE缓冲液中，加入DNA样品缓冲液，将样品加于琼脂糖胶上电泳。电泳后依次经变性、中和、转膜后。同斑点杂交膜一同进行烤膜、杂交、暴光。扫描仪扫描光片，以gel-pro凝胶分析软件分析相对密度，计算抑制率及IC50。实验结果见表23。
表23.正肝清黄在2.2.15细胞内HBV-DNA Southern Blot的抑制数据
实验表明：正肝清黄的半数中毒浓度(TC50)为1200μg/ml。最大无毒浓度药液(600μg/ml)。加入2.2.15细胞培养8天，明显抑制HBsAg和HBeAg的分泌，IC50为400.95±26.1μg/ml和542.6±76.5，选择指数为2.99和2.21。对细胞内的HBV-DNA Southern Blot的IC50为215.96±8.88μg/ml，选择指数为5.56。对细胞培养上清和细胞内的HBV-DNA斑点杂交和Southern Blot的IC50分别为142.24±13.04和156.98±80.50μg/ml，选择指数分别为8.42和7.64。结果提示：正肝清黄在2，2，15细胞培养内对乙型肝炎病毒有抑制作用。
以下通过具体的实施例来说明本发明药物的制备过程：
实施例1：本发明中茵陈、栀子、大黄和黄芩有效部位与黄连和黄柏有效部位的制备：
实施例1-1：
取茵陈5.56kg、栀子3.70kg、黄芩1.85kg、大黄1.85kg、黄连1.85kg和黄柏1.85kg，备用；
一、茵陈、栀子、大黄和黄芩有效部位制备
取茵陈、栀子、大黄和黄芩加6倍水浸泡1小时后，将茵陈和栀子加入水中进行煎煮，煮沸后加入黄芩，等煎煮液微沸后再加入大黄，开始计算煎煮时间，1小时后，将煎煮液滤出保留，往器皿中加水继续煎煮2次，每次1小时，合并滤出的煎煮液，减压浓缩至相对密度为1.05，放置过夜，离心过滤，分别收集沉淀和滤液；
将滤液加入已预处理好的D101大孔吸附树脂柱，选择径高比为1∶5，药材与树脂之比为1∶2，流速为每小时2倍树脂柱体积，上柱液流尽后，水洗，以Molish反应呈阴性为判定终点；再以50％乙醇洗脱，至洗脱液中加浓氨水不变红色为止，收集醇洗液；
将沉淀以6倍量(W/V)的95％乙醇回流1小时，过滤，将滤液与树脂醇洗液合并，减压回收乙醇，浓缩至80℃下相对密度为1.25，70℃真空干燥，粉碎，过100目筛，得到有效部位，备用；
二、黄连和黄柏有效部位制备：
取黄连和黄柏，以85％乙醇回流2次，合并醇提液，放置过夜，离心滤过，保留滤液，水洗沉淀至水洗液澄明，沉淀备用；
将滤液和水洗液合并，用浓盐酸调节pH至pH＝1，静置过夜，析出沉淀，水洗沉淀至中性；
合并2次所得沉淀，60℃真空干燥，粉碎，过70目筛，得到总生物碱即黄连和黄柏有效部位。
实施例1-2：
取茵陈15kg、栀子10kg、黄芩5kg、大黄5kg、黄连10kg和黄柏10kg，备用；
一、茵陈、栀子、大黄和黄芩有效部位制备
取茵陈、栀子、大黄和黄芩加9倍水浸泡2小时后，将茵陈和栀子加入水中进行煎煮，煮沸后加入黄芩，等煎煮液微沸后再加入大黄，开始计算煎煮时间，2小时后，将煎煮液滤出保留，往器皿中加水继续煎煮2次，每次2小时，合并滤出的煎煮液，减压浓缩至相对密度为1.08，放置过夜，离心过滤，分别收集沉淀和滤液；
将滤液加入已预处理好的D101大孔吸附树脂柱，选择径高比为1∶7，药材与树脂之比为1∶3，流速为每小时3倍树脂柱体积，上柱液流尽后，水洗，以Molish反应呈阴性为判定终点；再以70％乙醇洗脱，至洗脱液中加浓氨水不变红色为止，收集醇洗液；
将沉淀以6倍量(W/V)的95％乙醇回流1小时，过滤，将滤液与树脂醇洗液合并，减压回收乙醇，浓缩至80℃下相对密度为1.28，70℃真空干燥，粉碎，过100目筛，得到有效部位，备用；
二、黄连和黄柏有效部位制备：
取黄连和黄柏，以90％乙醇回流3次，合并醇提液，放置过夜，离心滤过，保留滤液，水洗沉淀至水洗液澄明，沉淀备用；
将滤液和水洗液合并，用浓盐酸调节pH至pH＝3，静置过夜，析出沉淀，水洗沉淀至中性；
合并2次所得沉淀，70℃真空干燥，粉碎，过100目筛，得到总生物碱即黄连和黄柏有效部位。
实施例1-3：
取茵陈25kg、栀子10kg、黄芩5kg、大黄5kg、黄连5kg和黄柏 5kg，备用；
一、茵陈、栀子、大黄和黄芩有效部位制备
取茵陈、栀子、大黄和黄芩加12倍水浸泡3小时后，将茵陈和栀子加入水中进行煎煮，煮沸后加入黄芩，等煎煮液微沸后再加入大黄，开始计算煎煮时间，2小时后，将煎煮液滤出保留，往器皿中加水继续煎煮2次，每次2小时，合并滤出的煎煮液，减压浓缩至相对密度为1.10，放置过夜，离心过滤，分别收集沉淀和滤液；
将滤液加入已预处理好的D101大孔吸附树脂柱，选择径高比为1∶9，药材与树脂之比为1∶4，流速为每小时3倍树脂柱体积，上柱液流尽后，水洗，以Molish反应呈阴性为判定终点；再以90％乙醇洗脱，至洗脱液中加浓氨水不变红色为止，收集醇洗液；
将沉淀以6倍量(W/V)的95％乙醇回流1小时，过滤，将滤液与树脂醇洗液合并，减压回收乙醇，浓缩至80℃下相对密度为1.30，70℃真空干燥，粉碎，过100目筛，得到有效部位，备用；
二、黄连和黄柏有效部位制备：
取黄连和黄柏，以95％乙醇回流5次，合并醇提液，放置过夜，离心滤过，保留滤液，水洗沉淀至水洗液澄明，沉淀备用；
将滤液和水洗液合并，用浓盐酸调节pH至pH＝4，静置过夜，析出沉淀，水洗沉淀至中性；
合并2次所得沉淀，80℃真空干燥，粉碎，过200目筛，得到总生物碱即黄连和黄柏有效部位。
实施例2：本发明中药提取物的制备：
将实施例1中制得的茵陈、栀子、黄芩、大黄有效部位和黄连、黄柏有效部位混匀即得本发明的中药提取物。
实施例3：本发明中药提取物胶囊剂的制备：
取实施例1中制备的中药提取物，装入明胶硬胶囊，制得本发明药物胶囊剂。
实施例4：本发明中药提取物颗粒剂得制备：
取实施例1中制备的中药提取物，粉碎成细粉，加入乙醇作黏合剂，加入淀粉作填充物，压制成颗粒剂。
实施例5：本发明中药片剂活性成分的制备：
取实施例1制得的茵陈、栀子、黄芩、大黄有效部位和黄连、黄柏有效部位按3.5∶1的比例混合均匀即得本发明的活性成分。
实施例6：本发明中药片剂的制备：
实施例6-1
(1)制粒：按照活性成分和羧甲基淀粉钠按质量比3∶1的比例称取实施例5制得的活性成分和羧甲基淀粉钠，并将羧甲基淀粉钠分成两分，一份为1/3量备用，另一份为2/3量加入到活性成分中，以浓度为70％的乙醇为湿润剂制粒，制得的颗粒于60℃下干燥；
(2)压片：取干燥颗粒，加入备用的1/3量的羧甲基淀粉钠和片剂总重量0.3％的硬脂酸镁，以3kN压力下压成片剂。
实施例6-2
(1)制粒：按照活性成分和羧甲基淀粉钠按质量比3∶1的比例称取活性成分和羧甲基淀粉钠，并将羧甲基淀粉钠分成两分，一份为1/3量备用，另一份为2/3量加入到活性成分中，以浓度为75％的乙醇为湿润剂制粒，制得的颗粒于60℃下干燥；
(2)压片：取干燥颗粒，加入备用的1/3量的羧甲基淀粉钠和片剂总重量0.3％的硬脂酸镁，以5kN压力下压成片剂。
实施例6-3
(1)制粒：按照活性成分和羧甲基淀粉钠按质量比3∶1的比例 称取活性成分和羧甲基淀粉钠，并将羧甲基淀粉钠分成两分，一份为1/3量备用，另一份为2/3量加入到活性成分中，以浓度为80％的乙醇为湿润剂制粒，制得的颗粒于60℃下干燥；
(2)压片：取干燥颗粒，加入备用的1/3量的羧甲基淀粉钠和片剂总重量0.3％的硬脂酸镁，以7kN压力下压成片剂。
以上所述仅为举例性，而非为限制性者。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于本发明的申请专利范围中。