一种接骨七厘片的制备方法及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103860802 A (43)申请公布日 2014.06.18 CN 103860802 A (21)申请号 201410092172.6 (22)申请日 2014.03.14 A61K 36/889(2006.01) A61K 36/896(2006.01) A61K 9/28(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 33/22(2006.01) A61K 33/34(2006.01) A61K 35/64(2006.01) (71)申请人 严白双 地址 211200 江苏省南京市溧水区永阳镇荣 昌花园 27 栋 105 室 (72)发。

2、明人 严白双 (54) 发明名称 一种接骨七厘片的制备方法及应用 (57) 摘要 本发明提供一种接骨七厘片的制备方法， 由炒乳香 100g、 炒没药 100g、 当归 150g、 土鳖虫 250g、 烫骨碎补 150g、 硼砂 100g、 血竭 150g、 煅自 然铜 100g、 酒炒大黄 100g 作为原料药制成， 采用 微波提取方法制备而成， 使得含量有很大提高， 用 量减少， 本发明还提供了接骨七厘片在制备抑制 人结肠癌 HT29 细胞增殖药物中的应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页。

3、 说明书4页 (10)申请公布号 CN 103860802 A CN 103860802 A 1/1 页 2 1. 一种接骨七厘片的制备方法， 其特征在于接骨七厘片由炒乳香 100g、 炒没药 100g、 当归 150g、 土鳖虫 250g、 烫骨碎补 150g、 硼砂 100g、 血竭 150g、 煅自然铜 100g、 酒炒大黄 100g 作为原料药组成， 制备方法由下列步骤组成 ： 取上述药材， 粉碎， 加入 2L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率为400-600W， 萃取2次， 每次4-8分钟， 合并萃 取液， 浓缩， 加到 D101 大孔吸附树脂柱上， 5。

4、0% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回 收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 1000 片， 包衣， 每片重 0.3g。 2. 根据权利要求 1 所述一种接骨七厘片的制备方法， 其特征在于所述制备方法中微波 萃取功率为 500W， 每次萃取 6 分钟。 3. 一种接骨七厘片在制备抑制人结肠癌 HT29 细胞增殖药物中的应用， 其特征在于接 骨七厘片由炒乳香 100g、 炒没药 100g、 当归 150g、 土鳖虫 250g、 烫骨碎补 150g、 硼砂 100g、 血竭 150g、 煅自然铜 100g、 酒炒大黄 100。

5、g 作为原料药组成， 制备方法由下列步骤组成 ： 取上述药材， 粉碎， 加入 2L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率为 400-600W， 萃取2次， 每次4-8分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到D101大孔吸附树脂柱上， 50%乙 醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 1000 片， 包衣， 每片重 0.3g。 4. 根据权利要求 3 所述一种接骨七厘片在制备抑制人结肠癌 HT29 细胞增殖药物中的 应用， 其特征在于接骨七厘片的制备方法中所述微波萃取功率为 。

6、500W， 每次萃取 6 分钟。 权 利 要 求 书 CN 103860802 A 2 1/4 页 3 一种接骨七厘片的制备方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及中药制剂技术领域， 具体涉及一种接骨七厘片的制备方法及应用。 背景技术 0002 接骨七厘片记载于部颁标准 （WS3-B-0620-91） ， 处方为炒乳香 100g、 炒没药 100g、 当归 150g、 土鳖虫 250g、 烫骨碎补 150g、 硼砂 100g、 血竭 150g、 煅自然铜 100g、 酒炒大黄 100g， 以上九味， 粉碎成细粉， 过筛， 混匀， 加辅料适量， 混匀， 制粒， 压片， 包糖衣， 即得。 能活 。

7、血化瘀， 接骨止痛。用于跌打损伤， 续筋接骨， 血瘀疼痛。 0003 现有技术中， 尚未有接骨七厘片在提取制备方面采用微波技术的报道， 而采用打 粉和水煎煮的方法， 工艺粗糙、 落后， 杂质多， 导致患者用量过大， 不方便服用， 严重影响了 本品在临床上应用。 发明内容 0004 发明目的 ： 为了解决上述问题， 本发明的目的在于提供一种接骨七厘片的制备方 法。 0005 本发明的另一个目的在于提供一种接骨七厘片在制备抑制人结肠癌 HT29 细胞增 殖药物中的应用。 0006 技术方案 ： 本发明的目的是通过如下的方案实现的 ： 一种接骨七厘片的制备方法， 接骨七厘片由炒乳香 100g、 炒没。

8、药 100g、 当归 150g、 土鳖 虫 250g、 烫骨碎补 150g、 硼砂 100g、 血竭 150g、 煅自然铜 100g、 酒炒大黄 100g 作为原料药 组成， 制备方法由下列步骤组成 ： 取上述药材， 粉碎， 加入2L的70%乙醇， 投入微波萃取装置 中进行微波萃取， 萃取功率为 400-600W， 萃取 2 次， 每次 4-8 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 D101大孔吸附树脂柱上， 50%乙醇洗脱， 收集5倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干 燥， 得微波提取物， 加入淀粉， 70%乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成1000片， 包衣， 每片重0.3g。 00。

9、07 上述一种接骨七厘片的制备方法， 所述制备方法中微波萃取功率为 500W， 每次萃 取 6 分钟。 0008 一种接骨七厘片在制备抑制人结肠癌 HT29 细胞增殖药物中的应用， 接骨七厘片 由炒乳香100g、 炒没药100g、 当归150g、 土鳖虫250g、 烫骨碎补150g、 硼砂100g、 血竭150g、 煅自然铜 100g、 酒炒大黄 100g 作为原料药组成， 制备方法由下列步骤组成 ： 取上述药材， 粉 碎， 加入 2L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率为 400-600W， 萃取 2 次， 每次4-8分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到D101大孔。

10、吸附树脂柱上， 50%乙醇洗脱， 收集5倍 量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干 燥， 压片， 制成 1000 片， 包衣， 每片重 0.3g。 0009 上述一种接骨七厘片在制备抑制人结肠癌 HT29 细胞增殖药物中的应用， 接骨七 厘片的制备方法中所述微波萃取功率为 500W， 每次萃取 6 分钟。 0010 现有技术中， 接骨七厘片每片 0.3g， 每次 5 片， 一日 2 次， 采用本发明制备成的 接 说 明 书 CN 103860802 A 3 2/4 页 4 骨七厘片每片0.3g， 但含有的药材量是原来的2倍， 因此每。

11、次仅需3片， 一日服用2次， 在具 有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。 具体实施方式 0011 以下通过实施例形式， 对本发明的上述内容再作进一步的详细说明， 但不应将此 理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例， 凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。 0012 实施例 1 取炒乳香 100g、 炒没药 100g、 当归 150g、 土鳖虫 250g、 烫骨碎补 150g、 硼砂 100g、 血竭 150g、 煅自然铜 100g、 酒炒大黄 100g， 粉碎， 加入 2L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行 微波萃取， 萃取功率 400W， 萃取 2 次， 每。

12、次 4 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 D101 大孔吸附树 脂柱上， 50% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取 物， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 1000 片， 包衣， 每片重 0.3g 实施例 2 取炒乳香 100g、 炒没药 100g、 当归 150g、 土鳖虫 250g、 烫骨碎补 150g、 硼砂 100g、 血竭 150g、 煅自然铜 100g、 酒炒大黄 100g， 粉碎， 加入 2L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行 微波萃取， 萃取功率 500W， 萃取 2 次， 每次 5 分钟， 合。

13、并萃取液， 浓缩， 加到 D101 大孔吸附树 脂柱上， 50% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取 物， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 1000 片， 包衣， 每片重 0.3g 实施例 3 取炒乳香 100g、 炒没药 100g、 当归 150g、 土鳖虫 250g、 烫骨碎补 150g、 硼砂 100g、 血竭 150g、 煅自然铜 100g、 酒炒大黄 100g， 粉碎， 加入 2L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行 微波萃取， 萃取功率 600W， 萃取 2 次， 每次 8 分钟， 合并萃取液， 浓缩，。

14、 加到 D101 大孔吸附树 脂柱上， 50% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取 物， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 1000 片， 包衣， 每片重 0.3g 实施例 4 ： 接骨七厘片抑制人结肠癌 HT29 细胞增殖的实验研究资料 1 实验材料 1.1 实验用细胞株 ： 人结肠癌 HT29 细胞， 南京医科大学实验动物中心实验室细胞库， DMEM + 10% FBS 常规培养。 0013 1.2 实验药物 研究药物 ： 本发明 接骨七厘片 ： 按实施例 2 方法制备。 0014 药液储液 ： 称取 100mg 接骨七。

15、厘片， 溶于 5 ml 无水乙醇中， 0.2m 滤器过滤， 500l doff 管分装， -20 存储， 同时 0.2m 滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。 0015 1.3 实验试剂 DMEM（GIBCO 公司 Cat. No.12100-061 Lot. No.758137） ； 胎牛血清 （浙江天杭生物 科技有限公司Lot. No.100419） ； NaHCO3 （上海久亿化学试剂有限公司 Cat. No.11810-033 Lot. No. 1088387） ； Trypsin（AMRESCO 公司 批号 ： 2010/04） ； EDTA（AMRESCO 公司 批 号 ： 2009/。

16、10） ； Penicillin G Sodium Salt（AMRESCO 公司 批号 ： 2010242） ； Streptomycin Sulfate（AMRESCO 公司 批号 ： 2010382） ； 无水乙醇 （南京化学试剂有限公司 批号 ： 说 明 书 CN 103860802 A 4 3/4 页 5 080310182） ； MTT(Biosharp 批号 ： 0793);PBS（实验室自配） ； 1.4 实验器材 莱卡倒置显微镜 （德国 Leica 型号 ： DM1L） ； 可见 - 紫外光微孔板检测仪 （美国 MD 公司 型号 ： SPECTRA MAX 190） ； CO。

17、2 培养箱 （FORMA 型号 ： 3111） ； 超净台 （苏净集团安泰公司制 造 型号 ： SW-CJ-ZFD） ； 纯水仪 （美国 Spring 公司 型号 ： S/N 020579） ； 精密移液器 （法国吉 尔森公司 型号 ： P2） ； 电子天平 （德国赛多利斯有限公司 型号 ： BT323S） ； 全自动高压灭菌锅 （日本 SANYO 公司 型号 ： MLS-3020） ； 台式电热鼓风干燥箱 （上海精密实验设备公司 型号 ： DHG9123A） ； 冰箱 （西门子公司 型号 ： KG18V21TI） ； 液氮罐 （CBS 型号 ： 2001） ； 低速离心机 （上 海安亭科学仪。

18、器厂 型号 ： KA-1000） ； 0.2m 滤器 （MILLIPORE 型号 ： SLGP033RB） ； 10cm 培 养皿 (NEST 公司 )、 96 孔培养板 （NEST 公司） ； 细胞计数板 ； 离心管、 移液管、 Tips 若干。 0016 2 实验方法 1） 人结肠癌 HT29 细胞用 DMEM + 10% FBS 于 37、 5% CO2 进行常规培养 （10 cm 培养 皿） ， 当细胞生长至对数期时， 收集细胞， 弃去培养液， PBS 轻洗 3 遍， 加入 3 ml 0.25% 胰蛋 白酶 -0.04% EDTA ， 37 消化 2 min 后， 向其中加入 5 ml。

19、 完全培养基中和反应， 吹打细胞 后将其转入离心管中， 1000 rpm 离心 5 min， 调整细胞悬液浓度 3104 个 /ml。 0017 2） 将细胞种入 96 孔培养板中， 每孔加入细胞悬液 180l， 培养板放入细胞培养 箱中 （37 ， 5% CO2） 常规培养。 0018 3） 根据细胞生长情况， 一般长至 50%-70%， 加入 接骨七厘片溶液， 继续培养 24h。 4） 24h 后加入 20l MTT 溶液 （5 mg/ml， 即 0.5%MTT） ， 继续培养 4h。 5） 4h 后扣板法倒去 上清， 用吸水纸轻轻拍干， 每孔加入 200l 二甲基亚砜， 置摇床上低速振荡。

20、 10min， 使结晶 物充分溶解。在酶联免疫检测仪 490nm 处测量各孔的吸光值。 6） 同时设置本底 （不加细 胞， 只加培养液） ， 对照孔 （细胞、 相同浓度的药物溶解介质、 培养液、 MTT、 二甲基亚砜） ， 每组 设定 6 个复孔。 7） 结果以药物对细胞的抑制率表示 ： 细胞增值抑制率 （%） =（对照孔 OD 值 - 给药孔 OD 值） / 对照孔 OD 值 100%。实验重 复 3 次。 0019 3 统计处理 采用 Microsoft Excel 2003 软件中的相关分析和 Student t 检验， 数据以 mean S.D. 表示。 0020 4 实验结果 MTT。

21、 法实验后统计结果显示， 与对照组比较， 当剂量达到 5mg/ml 时， 对人结肠癌 HT29 细胞增殖抑制有差异 （P0.05） ， 剂量在 10mg/ml 时该差异具有显著性 （P0.01） ， 当剂量达 到 15-20 mg/ml 时有极显著性差异 （P0.001） 。 0021 表 1 接骨七厘片对人结肠癌 HT29 细胞增殖抑制影响研究 (XSD) 说 明 书 CN 103860802 A 5 4/4 页 6 5 实验结论 接骨七厘片可以抑制人结肠癌 HT29 细胞增殖， 减少人结肠癌 HT29 细胞的细胞生长数 目， 该作用呈剂量依赖性。 说 明 书 CN 103860802 A 6 。