一种金蝉花提取物及其在制备神经保护和抗衰老药物中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103800386 A (43)申请公布日 2014.05.21 CN 103800386 A (21)申请号 201410046249.6 (22)申请日 2014.02.10 A61K 36/068(2006.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A61P 25/28(2006.01) (71)申请人 江苏大学 地址 212013 江苏省镇江市学府路 301 号 (72)发明人 欧阳臻 张魏琬麒 赵明 王吉标 尚磊 王璠 汪愿 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 卢亚丽 (54) 发明名称。

2、 一种金蝉花提取物及其在制备神经保护和抗 衰老药物中的应用 (57) 摘要 本发明涉及一种金蝉花提取物及其在制备神 经保护和抗衰老药物中的应用。所述提取物为金 蝉花醇提水溶性部位 ； 按照下述方法获得 ： 金蝉 花粉碎过筛， 用乙醇回流提取， 乙醇提取物用水分 散， 依次用石油醚， 乙酸乙酯， 正丁醇分级萃取， 减 压浓缩回收溶剂， 冷冻干燥分别得到石油醚部位， 乙酸乙酯部位， 正丁醇部位， 水部位， 取水部位浓 缩 ； 过 AB-8 大孔吸附树脂， 先用水洗至近无色， 再 用 80% 乙醇洗脱 ； 收集乙醇洗脱液， 浓缩， 冷冻干 燥得水溶性部位(JCHH2O)。 该提取物可明显抑制谷 氨酸。

3、诱导的 PC12 细胞的衰老损伤， 能降低细胞内 的氧自由基水平， 并且在清除 DPPH和超氧阴离 子 (O2-) 自由基实验中表现出较好的体外抗氧化 活性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103800386 A CN 103800386 A 1/1 页 2 1. 一种金蝉花提取物， 具有神经保护和抗衰老活性， 为金蝉花 60% 一 80% 乙醇提取物 的水部位 ； 其特征在于所述金蝉花 60% 一 80% 乙醇提取物的水部位按照下述方法获得 ： 干 。

4、燥金蝉花药材， 粉碎过药典 2 号筛， 粉末加入 10 一 15 倍的 60% 一 80% 乙醇回流提取， 并过 滤回收乙醇 ； 金蝉花乙醇提取物用水分散， 依次用 0.51.5 倍石油醚， 乙酸乙酯， 正丁醇分 级萃取， 共萃取 35 次， 合并， 减压浓缩回收溶剂， 冷冻干燥分别得到石油醚部位， 乙酸乙酯 部位， 正丁醇部位， 水部位 ； 水部位浓缩至原体积的1/40一1/10 ； 过AB-8大孔吸附树脂， 先 用水洗至近无色， 再用 1BV 一 10BV 80%(v/v) 乙醇洗脱 ； 流速为 10 一 100mL/min ； 收集 80% 乙醇洗脱液， 浓缩， 冷冻干燥得水溶性部位， 。

5、即金蝉花 60% 一 80% 乙醇提取物的水部位。 2. 权利要求 1 所述金蝉花提取物在制备神经保护和抗衰老药物中的用途。 3. 一种以金蝉花制备的神经保护和抗衰老药物， 其特征在于该药物含有治疗有效量的 权利要求 1 所述的金蝉花提取物。 4. 一种药物制剂， 其特征在于含有有效剂量的权利要求 1 所述金蝉花提取物和一种或 多种药学上可接受的药物赋形剂， 或可与金蝉花提取物组方的其他药物。 权 利 要 求 书 CN 103800386 A 2 1/5 页 3 一种金蝉花提取物及其在制备神经保护和抗衰老药物中的 应用 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 具体涉及从中药材金蝉花中制备。

6、具有神经保护和抗衰 老活性的部位及在制备神经保护和抗衰老药物方面的应用。 背景技术 0002 随着我国人口老龄化加剧， 神经退行性疾病的发病率日益增高， 衰老与神经退行 性疾病的研究已成为神经科学的热点。 人体的衰老， 往往会导致加快神经细胞数目的减少， 从而产生一些以阿尔茨海默病 （Alzheimer s Disease， AD） 为代表的神经退行性疾病。目 前， 神经退行性疾病， 病因不明， 而且尚无有效的治疗措施， 仅有少数几个药物可用于治疗 神经退行性疾病。 0003 金蝉花为麦角菌科真菌大蝉草 （Cordyceps cicadae Shing）及其寄主山蝉 （Cicada flamm。

7、ata Dist） 若虫形成的干燥复合体， 其性味甘寒， 与冬虫夏草的无性型同属， 功效相近。甄权所著 药性论 云 ：“其蜕壳， 头上有一角， 如冠状， 谓之蝉花， 最佳。味甘寒， 无毒。主小儿天吊， 惊痫瘈， 夜啼心悸。 证类本草 ：“蝉花能解痉、 散风热” 。 本草图经 曾 有记载 ：“今蜀中有一种蝉， 其蜕壳上有一角， 如花冠状， 谓之蝉花。 西人有赍至都下者， 医工 云， 入药最奇” 。 本草纲目 中亦记载 ：“蝉花可治疗惊痫， 夜啼心悸， 功同蝉蜕” 。现代药理 研究表明， 金蝉花为传统的补益中药， 具有明显的抗衰老、 免疫调节、 改善肾功能、 抗肿瘤等 药理活性。 近年来研究发现，。

8、 金蝉花中主要含有多糖、 腺苷、 虫草酸、 氨基酸、 多球壳菌素、 麦 角甾醇等多种化学成分。 0004 蝉花水煎剂能明显延长实验小鼠的游泳时间， 明显提高常压缺氧状态下的存活时 间及在高温下的存活时间， 表明蝉花水煎剂有抗应激、 抗疲劳的作用 ； 机体处在不良环境 下， 蝉花水煎剂能促进内环境保持相对稳定， 从而增强了机体对有害刺激的抵抗力。 蝉花水 煎剂高剂量组对雄性果蝇能显著地延长寿命， 表明其有一定的抗衰老作用 （王砚， 等 . 蝉花 药理作用的初步探讨 J. 浙江中医杂志， 2001， 36(5):219-220） 。 0005 鉴于蝉花和名贵中药冬虫夏草的无性型同属真菌 ( 虫草属。

9、 )， 且蝉拟青霉有免疫 等多种药理作用， 并具有毒性小、 易培养等优点， 有希望作为冬虫夏草的代用品， 但对其相 应的活性功能成分尚未十分明确， 大多的药理实验仅停留在原药材或粗提物的基础上， 尚 无金蝉花提取物进一步精制至活性部位并用于制备神经保护和抗衰老药物的报道。 0006 为了测试和评估本发明金蝉花活性部位的神经保护和抗衰老方面的应用潜力， 已 使用本领域技术人员所熟悉的方法测试药材各部位的生物活性。 这些已知的测试方法包括 谷氨酸损伤神经细胞 PC12 衰老模型， 抗氧化模型等。结果表明选定的金蝉花醇提水溶性部 位活性部位具有较好的神经保护和抗衰老的活性。 发明内容 0007 本发。

10、明的目的是提供金蝉花具有神经保护和抗衰老活性应用潜力的有效部位。 说 明 书 CN 103800386 A 3 2/5 页 4 0008 金蝉花提取物的各部位经过反复多次的神经保护和抗衰老活性筛选， 确认金蝉花 60% 一 80% 乙醇提取物的水溶性部位具有可明显抑制谷氨酸诱导的 PC12 细胞的衰老损伤， 阻止细胞 LDH 释放， 提高细胞的存活率， 能降低细胞内的氧自由基水平， 提高谷胱甘肽还原 酶 （GSH-Px） 和超氧化物歧化酶 （SOD） 活性， 显示出良好的神经保护和抗衰老活性， 并且在 清除 DPPH和超氧阴离子 (O2-) 自由基实验中表现出较好的体外抗氧化活性， 表明金蝉花。

11、 的提取物具有良好的抗氧化作用， 具有抗衰老的潜力。 0009 因此， 本发明的第一个方面涉及提供金蝉花醇提水溶性部位及其制备方法 ： 金蝉 花 60% 一 80% 乙醇提取物的水溶性部位制备方法， 按照下述步骤进行 ： 干燥金蝉花药材， 粉 碎过药典 2 号筛， 粉末加入 10 一 15 倍的 60% 一 80% 乙醇回流提取， 并过滤回收乙醇。金蝉 花乙醇提取物用水分散， 依次用 0.5 1.5 倍石油醚， 乙酸乙酯， 正丁醇分级萃取， 共萃取 3 5 次， 合并， 减压浓缩回收溶剂， 冷冻干燥分别得到石油醚部位， 乙酸乙酯部位， 正丁醇 部位， 水部位， 水部位浓缩至原体积的 1/40 。

12、一 1/10 ； 过 AB-8 大孔吸附树脂， 先用水洗至近 无色， 再用 1BV 一 10BV80%(v/v) 乙醇洗脱 ； 流速为 10 一 100mL/min ； 收集 80% 乙醇洗脱液， 浓缩， 冷冻干燥得水溶性部位 (JCHH2O)。 0010 本发明第二个方面涉及对所述金蝉花醇提水溶性部位用于制备神经保护和抗衰 老药物的用途。 0011 为了检测本发明所得的神经保护和抗衰老活性组分的性能， 将本发明所得的神经 保护和抗衰老活性组分按照配制成50200g/ml药液， 用于大鼠肾上腺嗜铬细胞的PC12 细胞处理， 分别观察样品在不同剂量下对谷氨酸诱导的 PC12 细胞衰老的保护作用。。

13、结果表 明金蝉花醇提水部位具有显著的神经保护和抗衰老活性， 可用于制备治疗神经退行性疾病 等疾病的辅助药物 ； 同时在体外模型中具有显著的抗氧化活性， 表明金蝉花活性部位在制 备抗衰老药物方面具有良好的潜力。 0012 本发明第三个方面涉及提供金蝉花活性部位与药学上可接受的辅料组成的药物 组合物。 0013 金蝉花活性部位可单独或几种部位组合， 再进一步与辅料组合， 剂型包括 ： 片剂、 胶囊剂、 丸剂、 颗粒剂、 混悬剂、 滴丸、 口服液体制剂等。 0014 本发明所述的载体或赋形剂包括药剂学常规应用的载体和赋形剂， 例如溶剂、 崩 解剂、 矫味剂、 防腐剂、 着色剂、 粘合剂等。 0015。

14、 下面的实施例和药理活性实验是对本发明的进一步详细说明， 以下所列举的实施 例不以任何方式构成限制。 具体实施方式 0016 实施例 1 金蝉花 80% 乙醇提取物的水溶性部位 (JCHH2O) 制备 ： 0017 取粉碎过药典2号筛干燥金蝉花粉末80g， 加入10倍的80%乙醇回流提取， 并过滤 回收乙醇。 金蝉花乙醇提取物用水分散， 依次用等体积石油醚， 乙酸乙酯， 正丁醇分级萃取， 共萃取 3 次， 合并， 减压浓缩回收溶剂， 分别得到石油醚部位， 乙酸乙酯部位， 正丁醇部位， 水部位， 水部位浓缩， 过 AB-8 大孔吸附树脂， 先用水洗至近无色， 再用 3BV80%(v/v) 乙醇洗。

15、 脱 ； 收集 80% 乙醇洗脱液， 浓缩， 冷冻干燥得 JCHH2O4.24g。 0018 实施例 2JCHH2O对谷氨酸诱导的 PC12 细胞衰老的保护作用 说 明 书 CN 103800386 A 4 3/5 页 5 0019 （1） MTT 法、 LDH 法测定细胞活力 ： 0020 取对数生长期 PC12 细胞 ( 由江苏大学医学院提供 )， 以 2104/ 孔接种于 96 孔培 养板， 200l/L。在 37、 5%CO2条件下培养过夜后， 将细胞分为对照组、 模型组、 药物处理 组。即对照组 ( 不含 Glu 的完全培养基 ) ； 模型组 ( 完全培养基 +Glu) ； 药物处理。

16、组 ( 完全 培养基 +JCHH2O+Glu， 浓度分别为 200g/mL， 100g/mL， 、 50g/mL， 用培养液稀释。)JCHH2O 预处理 1h 后加 Glu 孵育 24h 每组设 4 个平行孔。培养 24h 后， 每孔加 5g/L MTT20l， 继续 培养4h后终止培养， 小心吸取孔内上清液， 做LDH实验。 每孔加入DMSO150L， 使结晶充分 溶解， 用酶联免疫仪在波长 570nm 处读取吸光度 (OD)。取 4 孔 OD 值的均数按公式计算细胞 存活率结果见表 1。细胞存活率 %= 实验组 OD/ 对照组 OD100%。数据表明， JCHH2O具有保 护 Glu 诱导。

17、 PC12 细胞的损伤作用。 0021 收集培养液， 按试剂盒说明书测定乳酸脱氢酶 (LDH) （购买于南京建成生物工程研 究所） 的活性结果见表 2。LDH 的释放抑制率按下式计算 ： LDH 抑制率 (%)=（LDH模型组-LDH给 药组） /(LDH模型组-LDH正常组)100%。数据表明， JCHH2O具有抑制 Glu 诱导 PC12 细胞 LDH 释放 效果。 0022 表 1MTT 测定 JCHH2O对 Glu 诱导 PC12 细胞生存率的影响 0023 0024 a*P0.01av 正常组， b*P0.01,b*P0.05av 模型组 0025 表 2LDH 测定 JCHH2O对。

18、 Glu 诱导 PC12 细胞 LDH 抑制率的影响 0026 0027 a*P0.01av 正常组， b*P0.01,b*P0.05av 模型组 0028 （2） 细胞内 ROS 水平、 GSH-Px 和 SOD 活力的测定 ： 0029 取对数生长期 PC12 细胞， 消化、 计数， 以 4104/mL 的密度接种于 24 孔培养板中， 在 37、 5%CO2条件下培养过夜后， 按分组要求给以不同处理因素， 每组设 3 个平行孔。继 续培养 24h 后吸去培养基， 轻轻用 PBS 洗一次， 加入无血清培养基稀释的 DCFH-DA 溶液， 使 其终浓度为 10M， 37下负载探针 30min。

19、， PBS 洗两次， 胰酶消化， 收集细胞， 混匀后加入黑 板透明底 96 孔培养板中， 每孔 100 微升， 每组设三个复孔， 荧光酶标仪测定 DCF 荧光强度， 说 明 书 CN 103800386 A 5 4/5 页 6 最后对每组细胞计数， 根据荧光强度及细胞密度计算每组细胞的 DCF 荧光强度 /104Cells。 结果见表 3。数据表明， JCHH2O能够抑制 Glu 诱导 PC12 细胞 ROS 生成量。 0030 取对数生长期细胞， 消化、 计数， 以 4104/mL 的密度接种于 24 孔培养板中， 在 37、 5%CO2条件下培养过夜后， 按分组要求给以不同处理因素， 每组。

20、设 3 个平行孔。继续 培养 24h 后吸去培养基， 用 PBS 漂洗 2 次， 留少许 PBS， 用细胞刮轻轻刮下细胞， 收集到离心 管中， 1500rpm 离心 5min， 500l PBS 悬浮细胞于 eppendorf 管中， 细胞裂解液裂解细胞 ； 12000rpm 离心 6min， 取上清液， 依试剂盒说明书进行各步骤反应 ； 用酶标仪分别测定各组 细胞。结果见表 4。 0031 表 3DCFH 探针法测定 JCHH2O对 Glu 诱导 PC12 细胞 ROS 生成的影响 0032 0033 a*P0.01av 正常组， b*P0.01,b*P0.05av 模型组 0034 表 4。

21、 分光光度法测定金蝉花提取物对 Glu 诱导 PC12 细胞 GSH-Px 和 SOD 活力 0035 0036 a*P0.01av 正常组， b*P0.01,b*P0.05av 模型组 0037 实施例 3JCHH2O体外抗氧化活性测定 ： 0038 （1） DPPH自由基清除能力的测定 ： 0039 lmL 不同浓度的金蝉花提取物溶液中加入 1.0mL200mol/DPPH的乙醇溶液， 再 加入 2.0mL80% 乙醇后混合均匀， 黑暗处放置 30min 后， 用紫外分光光度计在 517nm 处测定 吸光值 A样品， 同时测定 1.0mL DPPH的乙醇溶液与 3.omL 乙醇溶液混合液的。

22、吸光值 A空白和 3mL 乙醇与 1.0mL 样品混合液的吸光值 A对照， 清除率公式 ： DPPH 清除率 =A空白-(A样品-A对 照)/A空白100%。数据表明， JCHH2O具有清除 DPPH能力。结果见表 5 0040 （2） 超氧阴离子 (O2-) 自由基清除能力的测定 ： 0041 lmL 不同浓度的金蝉花提取物溶液中， 加 3mlTris-HCl(PH8.2)， 25水浴 20min 后， 加 100L10mmol/L 邻苯三酚， 精确反应 4min， 滴入 100L6mol/LHCl 终止反应， 在 325nm 处测定吸光度 A 样品， 以去离子水代替样品浓液， 其他同上， 。

23、于 325nm 处测定吸光度 A 说 明 书 CN 103800386 A 6 5/5 页 7 空白。超氧阴离子 (O2-) 清除率按式计算。O2-清除率 =(A空白-A样品)/A空白100%。数 据表明， JCHH2O部位能够清除 O2-能力。结果见表 6。 0042 表 5JCHH2O部位清除 DPPH自由基能力实验 0043 0044 表 6JCHH2O部位清除 O2-自由基能力实验 0045 0046 实施例 4 滴丸的制备 0047 分别称取 400g 聚乙二醇 4000， 在水浴上熔化， 再加入 JCHH2O450g 冻干粉末， 搅拌 均匀， 倾入保温管中， 调节恒温装置， 使药液。

24、在 8090下滴入冷却过的液体石蜡中 （温 度 4） ， 滴完后， 将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油， 再加入少量滑石粉， 混匀， 得 JCHH2O滴丸 1000 粒。 0048 实施例 5 胶囊剂的制备 0049 JCHH2O冻干粉末 1000g， 与药用淀粉 500g 混合均匀， 烘干， 按每粒 0.45g 制成胶囊。 0050 实施例 6 片剂的制备 0051 JCHH2O冻干粉末 1000g， 淀粉 500g， 混合均匀， 用适量乙醇制粒， 经整粒机整粒， 压 片， 每片 0.35g。 0052 实施例 7 颗粒剂的制备 0053 JCHH2O冻干粉末 1500g， 淀粉 1000g， 糖粉 400g， 混合均匀， 用适量乙醇制粒， 干燥、 整粒、 分装即得。 0054 实施例 8 注射液的制备 0055 100gJCHH2O冻干粉末 , 加入 2500mL 水 , 加热至 80 , 加入 2%(V/V) 苯甲醇 , 混 合均匀后过 0.22m 滤膜 , 得到的澄明液灌封于 2mL 安瓶中 , 蒸汽灭菌 3Omin, 备用。 说 明 书 CN 103800386 A 7 。