以人FKBP51蛋白为靶点的先导化合物及筛选方法与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610300719.6 (22)申请日 2016.04.26 (71)申请人 兰州大学 地址 730030 甘肃省兰州市城关区天水南 路222号 (72)发明人 王志平 何永兴 武丹 (51)Int.Cl. A61K 31/5377(2006.01) C07D 317/66(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C40B 30/04(2006.01) C40B 30/06(2006.01) C40B 30/10(2006.01) (54)发明名称 以人F。

2、KBP51蛋白为靶点的先导化合物及筛 选方法与应用 (57)摘要 本发明提供了一种以人FKBP51蛋白为靶点 的先导化合物及筛选方法与应用， 属于生化制药 技术领域。 本发明将FKBP51的FK1结构域作为受 体， 选取其FK506结合口袋， 利用Glide程序进行 分子对接， 从150多万个化合物中虚拟筛选得到 了150个小分子化合物， 进行荧光淬灭实验验证 了这些化合物与FK1的结合作用， 研究了靶蛋白 与对接效应强的化合物结合特性， 选取LNCaP和 DU145两种细胞验证了筛得的小分子化合物抗前 列腺癌细胞活性， 同时对FKBP51与小分子先导化 合物形成的复合物进行了结构生物学研究，。

3、 本发 明还建立了CRPC的细胞模型和小鼠模型， 评估了 先导化合物对CRPC的有效性， 在分子水平上阐明 了先导化合物与靶蛋白的作用机制和规律， 为治 疗普通前列腺癌及CRPC的新药研发提供基础。 权利要求书2页 说明书7页 附图3页 CN 105963301 A 2016.09.28 CN 105963301 A 1.式(I)结构的以人FKBP51蛋白为靶点的先导化合物在制备抗前列腺癌肿瘤药物中的 用途， 2.权利要求1中以人FKBP51蛋白为靶点的先导化合物在制备治疗去势抵抗性前列腺癌 药物中的应用。 3.权利要求1中所述先导化合物的筛选方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)高通量。

4、虚拟筛选 利用薛定谔程序包进行高通量虚拟筛选， 从蛋白质结构数据库PDB下载FKBP51的FK1结 构域的晶体结构(PDB code： 305R)， 对结构进行优化、 加电荷与氢原子， 选取其FK506结合口 袋， 利用分子对接程序Glide， 从Chemdiv公司所提供的的150多万个化合物中进行高通量虚 拟筛选， 利用QikProp计算所筛选的小分子先导化合物的物化性质， 如脂水分配系数 QPlogPo/w， 按照利宾斯基规则(Lipinski srule)筛选出对接得分最好的前150个小分子先 导化合物， 并从Chemdiv公司购买小分子先导化合物； (2)荧光淬灭实验 FKBP51的F。

5、K1结构域只含有一个色氨酸且恰好位于FK506结合口袋， 由于Trp在蛋白质 中有很强的自发荧光， 而且其发射光谱的强度与波长受到周围化学微环境的影响， 因此可 以通过监测Trp发射光谱的淬灭程度来测量FK1与小分子先导化合物的结合强弱， 将纯化好 的FK1蛋白浓度设定在10 M， 小分子先导化合物终浓度100 M， 反应体系100 L， 利用Thermo 公司的Varioskan Flash多功能酶标仪以96孔板格式测量小分子先导化合物对FK1的Trp荧 光的淬灭程度， 激发波长设为295nm， 发射波长设为335nm， 每种小分子先导化合物平行做三 次， 以雷帕霉素作为对照， 对于荧光淬灭。

6、程度高于雷帕霉素或与其相当的小分子先导化合 物， 利用PerkinElmer公司LS55荧光分光光度计进一步测量其解离常数Kd， FK1的浓度设为 10 M， 小分子先导化合物的浓度在0-100 M之间设置梯度， 每个小分子先导化合物平行做三 次， 对所得数据利用Prism程序进行非线性拟合， 求得解离常数Kd； (3)蛋白的表达与纯化 全基因合成FKBP51的FK1结构域(19-126)并克隆到pET28b载体中， 用大肠杆菌菌株 BL21(DE3)或Rosseta(DE3)进行表达， 用镍柱纯化进行粗纯化， 然后用阴离子或阳离子交换 柱纯化， 最后用分子筛superdex75柱纯化， 同时。

7、构建不带Histag的FKBP51-FK1， 利用等电点 大于8的性质， 使用阳离子交换柱SPFF进行粗纯化， 再用分子筛superdex75柱纯化， 纯化好 的蛋白浓缩到40mg/mL后分装， 用液氮速冻后置于-80冰箱保存； (4)表面等离子共振(SPR)实验 利用SPR技术定量测定FK1与小分子化合物之间相互作用的强弱， 用氨基偶联法将FK1 偶联到CM5芯片上进行测定， 以NaOH或HCl或EDTA为芯片再生条件， 选取最优的再生条件进 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 105963301 A 2 行循环测定； (5)细胞及生化实验 利用MTT/MTS实验(Promega)测定。

8、小分子化合物对前列腺癌细胞LNCaP、 PC3及DU145的 生长抑制作用； 对于能够较强抑制LNCaP， 但对PC3和DU145基本不抑制的小分子先导化合 物， 继续以下几种方法验证其对AR信号通路的抑制： 抽提细胞的总mRNA， 用荧光定量RT- PCR技术检测筛选的小分子化合物对FKBP51、 FKBP52、 AR及AR下游调控基因如PSA、 hK2、 TMPRSS2的转录水平的影响； 用AR及PSA的特异性抗体， 通过Western blot技术检测筛选 的小分子化合物对AR及下游基因PSA在翻译水平的影响； 用慢病毒转染构建稳转ARELuc 和ARE-EGFP的LNCaP细胞系， 分。

9、别用Luciferase酶活报告系统以及荧光显微镜定量研究筛 选的小分子化合物对AR转录活性的抑制作用； 共慢病毒转染构建稳转CRPC剪切子AR-V7 及AR-NTD的DU145细胞系， 即DU145-V7和DU145-NTD， 用荧光定量RT-PCR技术及Western blot技术检测筛选的小分子化合物对AR活性的抑制； (6)蛋白的结晶与结构解析 对FKBP51的FK1蛋白与筛得的小分子先导化合物共结晶， 筛选各种结晶条件， 获得高衍 射质量的晶体， 利用同步辐射光源收集X射线晶体衍射数据， 使用分子置换法解析FK1与小 分子先导化合物复合物的晶体结构； (7)结构分析与分子动力学模拟 。

10、软件分析FK1与小分子先导化合物复合物的晶体结构， 使用Amber14的GPU版本进行 FK1-小分子先导化合物复合物的分子动力学模拟， 用mmpbsa方法计算小分子先导化合物与 FK1结合的自由能， 利用Ambertools软件包中的程序分析构象变化及蛋白与小分子先导化 合物的相互作用模式， Amber14的GPU版本使用Nvidia公司的GTX970显卡进行计算， 通过以 上的结构分析， 总结FK1与小分子先导化合物的作用规律， 为先导化合物的进一步改造提供 指导； (8)CRPC动物实验 具体CRPC动物模型建立： 将5-9周的雄性免疫缺陷小鼠分成两组， 其中一组为实验组进 行去雄， 恢。

11、复5天后将LNCaP细胞(1106个)皮下注射于完整或去雄的免疫缺陷小鼠(BALB/ C-nunu)， 实时观察肿瘤大小生长， 并且每周2-3次用数字卡尺称量小鼠体重和肿瘤体积 (宽2长/2)， 以平均肿瘤体积作为参考， 肿瘤生长8周并且肿瘤大小达到1cm3即为成功建立 的移植瘤模型； 在CRPC动物模型的基础上， 再分为不同的给药组， 化疗药物组： 多西他赛， 卡 巴多赛； 抑制雄激素合成药物组： 阿比特龙组； 与雄激素竞争性抑制AR活性药物恩杂鲁胺； 以及小分子先导化合物组， 每组7只小鼠， 连续28天给药1， 10， 或者50mg/kg的药物， 并设空 白对照， 通过测量肿瘤大小的变化，。

12、 称取瘤重， 计算抑瘤率， 比较动物存活天数， 及小动物活 体荧光成像系统， 评估小分子先导化合物对CRPC小鼠的肿瘤的影响， 观察结束后， 处死动 物， 取移植瘤组织， CRPC模型小鼠加药后与未加药以及PCa小鼠进行AR靶向基因PSA和下游 相关基因如TMPRSS2表达做对比； 药物作用后仍发生转移性的CRPC小鼠与未用药发生癌转 移CRPC小鼠以及PCa小鼠成活率进行比较。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 105963301 A 3 以人FKBP51蛋白为靶点的先导化合物及筛选方法与应用 技术领域 0001 本发明属于生化制药技术领域， 具体地涉及一种以人FKBP51蛋白为靶点。

13、的具有抗 前列腺癌活性的先导化合物及筛选方法和在制备抗去势抵抗性前列腺癌药物中的应用。 背景技术 0002 雄激素受体(androgen receptor， AR)被认为在前列腺癌的发生、 发展和转移中起 到关键作用。 因此， 雄激素撤除疗法(androgen deprivation therapy)成为治疗晚期前列 腺癌的最常用和有效的方法。 但是在治疗的两到三年内， 大部分晚期前列腺癌就会发展成 去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。 对于CRPC目前缺乏有效治疗手段， 成为前列腺癌治疗中最为 棘手的问题。 在雄激素撤除环境下， AR的再激活存在多种途径， 主要包括病灶部位雄激素的 合成、 AR。

14、的基因突变、 倍增和可变剪切以及AR共调节因子的信号转导异常等。 Chang等人研 究发现在CRPC中二氢睾酮的合成可以不依赖的睾酮， 而以肾上腺雄甾酮作为前体。 约有 25的CRPC存在AR基因的倍增导致的表达上调， 使其对低浓度的雄激素敏感。 而AR的突变 往往会导致其配体结合区域(ligand binding domain， LBD)与抗雄激素结合能力下降， 甚 至使抗雄激素由拮抗作用转为激动作用(如AR的F876L突变体)。 同时， AR的可变剪切通常可 导致其表达产物缺乏LBD区域， 但仍具有转录活性而激活下游靶基因。 此外， AR的共调节因 子如SRC-1和SRC-2等都可使AR与。

15、雄激素的结合能力增强或使其转录活性不依赖于雄激素。 因此， 如何抑制或阻断AR在雄激素撤除环境下的激活成为治疗CRPC的关键。 0003 免疫亲和蛋白FKBP51和FKBP52作为协同分子伴侣(cochaperone)， 与 Hsp90一起 帮助AR的正确折叠， 为AR发挥功能所必需， 通过抑制FKBP51/FKBP52可以达到降低AR、 AR突 变体及可变剪切产物的转录活性的效果。 FKBP51与FKBP52有70的序列相似性， 且都具有 顺脯氨酸异构酶活性(PPIase)。 二者结构非常类似， 都包括N端的FK506结合结构域， 这个结 构域具有PPIase活性， 通常被称为FK1结构域。。

16、 邻接FK1结构域的是FK2结构域， 它与FK1结构 域约有19的序列相似度， 与FK1的折叠类型相似， 但是由于缺少关键活性残基， 不具有顺 脯氨酸异构酶活性， 也不能结合FK506。 C端是TRP(tetratricopeptide repeat)结构域， 它 介导FKBP51、 FKBP52与Hsp90的C端相互作用。 FKBP51在大多数细胞中是抑制类固醇受体的 信号转导而FKBP52能够促进类固醇受体的信号转导。 TRP结构域因为与Hsp90相互作用， 对 FKBP51和FKBP52发挥功能不可或缺。 FK1结构域的PPIase活性虽然对于类固醇受体的调节 没有影响， 但是FK1的F。

17、K506结合口袋却对FKBP51的功能至关重要， 有非常显著的药理学效 应。 对FKBP51而言， 它可以作为前列腺癌发展过程中的肿瘤标志物， 表达水平与癌细胞的格 里森分级(Gleason grade)成正相关。 已有两个研究小组报道了在前列腺癌细胞中， FKBP51 促进AR的活性并且提高AR与雄激素结合的能力， 进而使AR所调控的下游基因的表达上调， 导致前列腺癌细胞增殖。 此外， FKBP51的表达也受到AR的正调控， 促进CRPC的形成。 研究还 证实FKBP51的抑制剂FK506可以显著的抑制雄激素依赖的癌细胞生长， 这种抑制作用依赖 于AR。 对FKBP51基因敲除小鼠的研究进一。

18、步表明， 特异性的阻断或抑制FKBP51的功能不会 产生潜在的副作用。 此外， 对已经进入临床一期试验FKBP家族的广谱抑制剂FK1706(所抑制 说 明 书 1/7 页 4 CN 105963301 A 4 的靶点包括FKBP51和FKBP52)的毒理学研究结果表明， 即使长时间的抑制FKBP51与FKBP52 的活性不会对人体造成非常严重的后果。 由此可见， FKBP51、 FKBP52是CRPC治疗的非常有前 景的药物靶点。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种以人FKBP51蛋白为靶点的先导化合物及其筛选方法和 在制备抗去势抵抗性前列腺癌药物中的应用。 0005 为了实现上述目的。

19、， 本发明采用的技术方案如下： 0006 一种以人FKBP51蛋白为靶点的先导化合物， 具有式(I)的化学结构： 0007 0008 本发明还提供了所述的以人FKBP51蛋白为靶点的先导化合物的筛选方法， 包括以 下步骤： 0009 (1)高通量虚拟筛选 0010 利用薛定谔程序包进行高通量虚拟筛选， 从蛋白质结构数据库PDB下载FKBP51的 FK1结构域的晶体结构(PDB code： 305R)， 对结构进行优化、 加电荷与氢原子， 选取其FK506 结合口袋， 利用分子对接程序Glide， 从Chemdiv公司所提供的的150多万个化合物中进行高 通量虚拟筛选， 利用QikProp计算所。

20、筛选的小分子先导化合物的物化性质， 如脂水分配系数 QPlogPo/w， 按照利宾斯基规则(Lipinski srule)筛选出对接得分最好的前150个小分子先 导化合物， 并从Chemdiv公司购买小分子先导化合物； 0011 (2)荧光淬灭实验 0012 FKBP51的FK1结构域只含有一个色氨酸且恰好位于FK506结合口袋， 由于Trp在蛋 白质中有很强的自发荧光， 而且其发射光谱的强度与波长受到周围化学微环境的影响， 因 此可以通过监测Trp发射光谱的淬灭程度来测量FK1与小分 子先导化合物的结合强弱， 将 纯化好的FK1蛋白浓度设定在10 M， 小分子先导化合物终浓度100 M， 反。

21、应体系100 L， 利用 Thermo公司的Varioskan Flash多功能酶标仪以96孔板格式测量小分子先导化合物对FK1 的Trp荧光的淬灭程度， 激发波长设为295nm， 发射波长设为335nm， 每种小分子先导化合物 平行做三次， 以雷帕霉素作为对照， 对于荧光淬灭程度高于雷帕霉素或与其相当的小分子 先导化合物， 利用PerkinElmer公司LS55荧光分光光度计进一步测量其解离常数Kd， FK1的 浓度设为10 M， 小分子先导化合物的浓度在0-100 M之间设置梯度， 每个小分子先导化合物 平行做三次， 对所得数据利用Prism程序进行非线性拟合， 求得解离常数Kd； 001。

22、3 (3)蛋白的表达与纯化 0014 全基因合成FKBP51的FK1结构域(19-126)并克隆到pET28b载体中， 用大肠杆菌菌 株BL21(DE3)或Rosseta(DE3)进行表达， 用镍柱纯化进行粗纯化， 然后用阴离子或阳离子交 说 明 书 2/7 页 5 CN 105963301 A 5 换柱纯化， 最后用分子筛superdex75柱纯化， 同时构建不带Histag的FKBP51-FK1， 利用等电 点大于8的性质， 使用阳离子交换柱SPFF进行粗纯化， 再用分子筛superdex75柱纯化， 纯化 好的蛋白浓缩到40mg/mL后分装， 用液氮速冻后置于-80冰箱保存； 0015 。

23、(4)表面等离子共振(SPR)实验 0016 利用SPR技术定量测定FK1与小分子化合物之间相互作用的强弱， 用氨基偶联法将 FK1偶联到CM5芯片上进行测定， 以NaOH或HCl或EDTA为芯片再生条件， 选取最优的再生条件 进行循环测定； 0017 (5)细胞及生化实验 0018 利用MTT/MTS实验(Promega)测定小分子化合物对前列腺癌细胞LNCaP、 PC3及 DU145的生长抑制作用； 对于能够较强抑制LNCaP， 但对PC3和DU145基本 不抑制的小分子先 导化合物， 继续以下几种方法验证其对AR信号通路的抑制： 抽提细胞的总mRNA， 用荧光定 量RT-PCR技术检测筛。

24、选的小分子化合物对FKBP51、 FKBP52、 AR及AR下游调控基因如PSA、 hK2、 TMPRSS2的转录水平的影响； 用AR及PSA的特异性抗体， 通过Western blot技术检测 筛选的小分子化合物对AR及下游基因PSA在翻译水平的影响； 用慢病毒转染构建稳转 ARELuc和ARE-EGFP的LNCaP细胞系， 分别用Luciferase酶活报告系统以及荧光显微镜定量 研究筛选的小分子化合物对AR转录活性的抑制作用； 共慢病毒转染构建稳转CRPC剪切子 AR-V7及AR-NTD的DU145细胞系， 即DU145-V7和DU145-NTD， 用荧光定量RT-PCR技术及 West。

25、ern blot技术检测筛选的小分子化合物对AR活性的抑制； 0019 (6)蛋白的结晶与结构解析 0020 对FKBP51的FK1蛋白与筛得的小分子先导化合物共结晶， 筛选各种结晶条件， 获得 高衍射质量的晶体， 利用同步辐射光源收集X射线晶体衍射数据， 使用分子置换法解析FK1 与小分子先导化合物复合物的晶体结构； 0021 (7)结构分析与分子动力学模拟 0022 软件分析FK1与小分子先导化合物复合物的晶体结构， 使用Amber14的GPU版本进 行FK1-小分子先导化合物复合物的分子动力学模拟， 用mmpbsa方法计算小分子先导化合物 与FK1结合的自由能， 利用Ambertools。

26、软件包中的程序分析构象变化及蛋白与小分子先导 化合物的相互作用模式， Amber14的GPU版本使用Nvidia公司的GTX970显卡进行计算， 通过 以上的结构分析， 总结FK1与小分子先导化合物的作用规律， 为先导化合物的进一步改造提 供指导； 0023 (8)CRPC动物实验 0024 具体CRPC动物模型建立： 将5-9周的雄性免疫缺陷小鼠分成两组， 其中一 组为实 验组进行去雄， 恢复5天后将LNCaP细胞(1106个)皮下注射于完整或去雄的免疫缺陷小鼠 (BALB/C-nunu)， 实时观察肿瘤大小生长， 并且每周2-3次用数字卡尺称量小鼠体重和肿瘤 体积(宽2长/2)， 以平均肿。

27、瘤体积作为参考， 肿瘤生长8周并且肿瘤大小达到1cm3即为成功 建立的移植瘤模型； 在CRPC动物模型的基础上， 再分为不同的给药组， 化疗药物组： 多西他 赛， 卡巴多赛； 抑制雄激素合成药物组： 阿比特龙组； 与雄激素竞争性抑制AR活性药物恩杂 鲁胺； 以及小分子先导化合物组， 每组7只小鼠， 连续28天给药1， 10， 或者50mg/kg的药物， 并 设空白对照， 通过测量肿瘤大小的变化， 称取瘤重， 计算抑瘤率， 比较动物存活天数， 及小动 物活体荧光成像系统， 评估小分子先导化合物对CRPC小鼠的肿瘤的影响， 观察结束后， 处死 说 明 书 3/7 页 6 CN 105963301 。

28、A 6 动物， 取移植瘤组织， CRPC模型小鼠加药后与未加药以及PCa小鼠进行AR靶向基因PSA和下 游相关基因如TMPRSS2表达做对比； 药物作用后仍发生转移性的CRPC小鼠与未用药发生癌 转移CRPC小鼠以及PCa小鼠成活率进行比较。 0025 本发明还提供了式I先导化合物在制备治疗去势抵抗性前列腺癌的药物中的用 途。 0026 本发明的有益技术效果： (1)已知的对于FKBP51的药物发现的主要思路是基于 FK506与雷帕霉素的分子改造， 但是， 基于FK506和雷帕霉素设计出的FKBP51的抑制剂往往 与FKBP12的结合能力更强， 因此所得到的化合物可能会有很强的脱靶效应， 本发。

29、明首次以 FKBP51蛋白为靶点， 高通量虚拟筛选抗前列腺癌的新型先导化合物， 并在分子水平、 细胞水 平与动物个体水平验证这些先导化合物的有效性； (2)虽然CRPC显现出对雄激素撤除的抵 抗性， 但它的进展通常仍依赖于AR， FKBP51、 FKBP52作为协同分子伴侣， 为AR激活所必需， 通 过建立CRPC的细胞模型与小鼠模型， 本发明首次研究了筛选得到的先导化合物对CRPC的作 用效果和机制； (3)通过解析靶蛋白与先导化合物结合的晶体结构， 分析靶蛋白与先导化合 物的结合模式， 总结结合规律， 并通过分子动力学模拟方法， 研究先导化合物对FKBP51的构 象的影响， 为今后的药物结。

30、构改造提供了基础。 附图说明 0027 图1为FKBP51的结构。 (A)FKBP51蛋白的结构域组成； (B)FKBP51的FK1结构域与 FK506的相互作用方式。 0028 图2为FKBP51与小分子化合物的相互作用。 (A)用阳离子交换纯化获得的FKBP51的 FK1结构域， FK1的分子量约为14KDa； (B)购买的150种小分子化合物对FK1的荧光淬灭实验， 红色为正对照雷帕霉素(a)， 绿色为不含小分子化合物的buffer(b)。 0029 图3为FKBP51蛋白分子筛(FPLC)纯化结果。 (A)用HiLoad 16/60Superdex75柱子凝 胶过滤纯化获得的FKBP5。

31、1蛋白； (B)15SDS-PAGE的FKBP51电泳图。 0030 图4位小分子化合物对两种前列腺癌细胞LNCaP和DU145的生长抑制作用。 上图为 小分子化合物对LNCaP细胞的生长抑制曲线， 下图为小分子先导化合物对DU145的生长抑制 曲线。 0031 图5为小分子先导化合物与FK1的共结晶体。 0032 图6为小分子先导化合物筛选的技术路线图。 0033 图7为小分子先导化合物对CRPC的作用及机理的技术路线图。 具体实施方式 0034 下面结合具体实施例与附图说明对本发明作进一步阐述， 但本发明并不限于以下 实施例。 0035 实施例1 0036 先导化合物的化学结构： 说 明 。

32、书 4/7 页 7 CN 105963301 A 7 0037 0038 1、 具有式(I)化学结构的先导化合物的高通量虚拟筛选方法 0039 利用薛定谔程序包进行， 从蛋白质结构数据库PDB下载FKBP51的FK1结构域的晶体 结构(PDB code： 305R)， 使用Prime， QSite， Liasion and MacroModel等程序对结构进行优 化、 加电荷与氢原子， 选取其FK506结合口袋， 利用分子对接程序Glide， 从Chemdiv公司所提 供的的150多万个化合物中进行高通量虚拟筛选， 筛选在4核CPU的服务器上进行， 每天大约 可以筛选10万个化合物， 利用Qi。

33、kProp计算所筛选的小分子先导化合物的物化性质如脂水 分配系数QPlogPo/w等， 按照利宾斯基规则(Lipinski s rule)筛选出docking-score最好 的前150个小分子先导化合物。 利宾斯基规则包括： 化合物的分子量小于500Da； 化合物 结构中的氢键给体(包括羟基、 氨基等)的数量不超过5个； 化合物中氢键受体的数量不超 过10个； 化合物的脂水分配系数的对数值(logP)在-2到5之间。 符合利宾斯基规则的化合 物有更好的药代动力学特性， 在代谢过程中有更好的生物利用度， 易于成为口服药。 小分子 先导化合物在Chemdiv公司购买。 0040 2、 荧光淬灭实。

34、验 0041 FKBP51的FK1结构域只含有一个色氨酸且恰好位于FK506结合口袋， 由于Trp在蛋 白质中有很强的自发荧光， 而且其发射光谱的强度与波长受到周围化学微环境的影响， 因 此可以通过监测Trp发射光谱的淬灭程度来测量FK1与小分 子先导化合物的结合强弱， 将 纯化好的FK1蛋白浓度设定在10 M， 小分子先导化合物终浓度100 M， 反应体系100 L， 利用 Thermo公司的Varioskan Flash多功能酶标仪以96孔板格式测量小分子先导化合物对FK1 的Trp荧光的淬灭程度， 激发波长设为295nm， 发射波长设为335nm， 每种小分子先导化合物 平行做三次， 以。

35、雷帕霉素作为对照， 对于荧光淬灭程度高于雷帕霉素或与其相当的小分子 先导化合物， 利用PerkinElmer公司LS55荧光分光光度计进一步测量其解离常数Kd， FK1的 浓度设为10 M， 小分子先导化合物的浓度在0-100 M之间设置梯度， 每个小分子先导化合物 平行做三次， 0042 对所得数据利用Prism程序进行非线性拟合， 求得解离常数Kd。 0043 解离常数Kd 26.6 标准差 3.1 0044 3、 蛋白的表达与纯化 0045 全基因合成FKBP51的FK1结构域(19-126)并分别克隆到pET28b载体中， 用大肠杆 菌菌株BL21(DE3)或Rosseta(DE3)进。

36、行表达， 用镍柱纯化进行粗纯化， 然后用阴离子或阳离 子交换柱纯化， 最后用分子筛superdex75柱纯化。 同时构建不带Histag的FKBP51-FK1， 利用 等电点较高(大于8)的性质， 使用阳离子交换柱SPFF进行粗纯化， 再用分子筛superdex75柱 说 明 书 5/7 页 8 CN 105963301 A 8 纯化， 纯化好的蛋白浓缩到40mg/mL后分装， 用液氮速冻后置于-80冰箱保存。 0046 4、 表面等离子共振(SPR)实验 0047 我们利用SPR技术更精确的定量FK1与小分子化合物之间相互作用的强弱。 用氨基 偶联法将FK1偶联到CM5芯片或利用FK1上的H。

37、istag将其偶联到NTA芯片上， 最后选取响应较 好的芯片进行测定， 选择各种不同的芯片再生条件， 如NaOH、 HCl、 EDTA等， 最后选取最优的 再生条件。 0048 5、 细胞及生化实验 0049 利用MTT/MTS实验(Promega)测定小分子化合物对前列腺癌细胞LNCaP、 PC3及 DU145的生长抑制作用。 对于能够较强抑制LNCaP， 但对PC3和DU145基本不抑制的小分子先 导化合物， 继续以下几种方法验证其对AR信号通路的抑制： 抽提细胞的总mRNA， 用荧光定 量RT-PCR技术检测筛选的小分子化合物对FKBP51、 FKBP52、 AR及AR下游调控基因如PS。

38、A、 hK2、 TMPRSS2等的转录水平的影响； 用AR及PSA的特异性抗体， 通过Western blot技术检 测筛选的小分子化合物对AR及下游基因PSA在翻译水平的影响； 用慢病毒转染构建稳转 ARELuc和ARE-EGFP的LNCaP细胞系， 分别用Luciferase酶活报告系统以及荧光显微镜定量 研究筛选的小分子化合物对AR转录活性的抑制作用； 共慢病毒转染构建稳转CRPC剪切子 AR-V7及AR-NTD的DU145细胞系， 即DU145-V7和DU145-NTD， 用荧光定量RT-PCR技术及 Western blot技术检测筛选的小分子化合物对AR活性的抑制。 0050 6、。

39、 蛋白的结晶与结构解析 0051 我们对FKBP51/FKBP52的FK1蛋白尝试与筛得的小分子先导化合物共结晶， 筛选各 种结晶条件(如Hampton公司的ScreenI&ScreenII， SaltRX， Index， PEGion和MiTeGen公司的 JBScreen Classic等条件)， 尝试并改进各种沉淀剂、 缓冲剂和添加剂， 以获得高衍射质量 的晶体。 利用同步辐射光源收集X射线晶体衍射数据， 利用HKL2000， CCP4及Phenix等软件， 使用分子置换法解析FK1与小分子先导化合物复合物的晶体结构。 0052 7、 结构分析与分子动力学模拟 0053 使用Pymol、。

40、 Ligplot等软件分析FK1与小分子先导化合物复合物的晶体结构， 使用 Amber14的GPU版本进行FK1-小分子先导化合物复合物的分子动力学模拟， 用mmpbsa方法计 算小分子先导化合物与FK1结合的自由能， 利 用Ambertools软件包中的程序分析构象变 化， 蛋白与小分子先导化合物的相互作用模式等， Amber14的GPU版本(即CUDA版本)使用 Nvidia公司的GTX970显卡进行计算， 经过我们的前期测试， 发现其计算能力相当于64核的 计算机集群。 通过以上的结构分析， 总结FK1与小分子先导化合物的作用规律， 为先导化合 物的进一步改造提供指导。 0054 8、 。

41、CRPC动物实验 0055 具体CRPC动物模型建立： 将5-9周的雄性免疫缺陷小鼠分成两组， 其中一组为实验 组进行去雄， 恢复5天后将LNCaP细胞(1106个)皮下注射于完整或去雄的免疫缺陷小鼠 (BALB/C-nunu)， 实时观察肿瘤大小生长， 并且每周2-3次用数字卡尺称量小鼠体重和肿瘤 体积(宽2长/2)， 以平均肿瘤体积作为参考。 肿瘤生长8周左右并且肿瘤大小达到1cm3即 为成功建立的移植瘤模型。 在CRPC动物模型的基础上， 再分为不同的给药组。 化疗药物组： 多西他赛， 卡巴多赛； 抑制雄激素合成药物组： 阿比特龙组； 与雄激素竞争性抑制AR活性药 物恩杂鲁胺； 以及小分。

42、子先导化合物组， 每组7只小鼠， 连续28天给药1， 10， 或者50mg/kg的 说 明 书 6/7 页 9 CN 105963301 A 9 药物， 并设空白对照， 通过测量肿瘤大小的变化， 称取瘤重， 计算抑瘤率， 比较动物存活天 数， 及小动物活体荧光成像系统， 评估小分子先导化合物对CRPC小鼠的肿瘤的影响， 观察结 束后， 处死动物， 取移植瘤组织， CRPC模型小鼠加药后与未加药以及PCa小鼠进行AR靶向基 因PSA和下游相关基因如TMPRSS2表达做对比； 药物作用后仍发生转移性的CRPC小鼠与未用 药发生癌转移CRPC小鼠以及PCa小鼠成活率进行比较。 说 明 书 7/7 页 10 CN 105963301 A 10 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 11 CN 105963301 A 11 图3 图4 图5 说 明 书 附 图 2/3 页 12 CN 105963301 A 12 图6 图7 说 明 书 附 图 3/3 页 13 CN 105963301 A 13 。