技术领域：
本发明涉及治疗性多肽乙肝疫苗及其制备方法，具体而言，是一种可用于 治疗仪型肝炎病毒感染的人工合成的多肽，多肽序列是从乙肝型病毒基因序列 中筛选出来的，具有显著的激活体液免疫和细胞免疫的活性。
背景技术：
乙型肝炎是危害我国人民健康最严重的传染病之一。我国现有约1.2亿名 乙肝表面抗原(HBsAg)携带者，不仅成为传染源，部分人还可发展成慢性肝炎， 肝硬化，甚至肝癌。预防性乙肝疫苗在世界及我国均已证明可有效地预防乙肝， 但是对乙肝患者无治疗作用。今年来在国内外相继有研究小组发现了可以用于 治疗乙肝的治疗型疫苗，例如，我国科研人员闻玉梅发现抗原-抗体免疫原性复 合物(Immunogenic Complex简称IC)可以有效地在部分鸭中清除病毒及病毒 抗原，由此认为发展成为供人体应用的治疗性疫苗是有可能的。另外，有学者 研究核酸疫苗(DNA Vaccine)在转基因鼠中的疗效。20世纪90年代中期以来， 美国学者研究了病毒核心抗原合成肽交联佐剂构建成治疗性疫苗，在转基因鼠 中有较好的治疗效果。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种治疗性多肽乙肝疫苗，其为具有高效免疫原性 的并可以激发高效细胞免疫的多肽。
本发明的另一目的在于提供一种治疗性多肽乙肝疫苗的制备方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种治疗性多肽乙肝疫苗，其特殊之处在于：所述的治疗性多肽乙肝疫苗 为多肽链，其两个多肽链的氨基酸序列分别为：
HBVSP：LFILLLCLIFLLVLL(15个氨基酸残基)
HBVCP：QLFHLCLIISCSCP(14个氨基酸残基)
上述的治疗性多肽乙肝疫苗的多肽纯度为95％-99.99％。
一种治疗性多肽乙肝疫苗的制备方法，其多肽乙肝疫苗采用Fmoc固相法合 成线性多肽疫苗。
上述的每条抗原肽的Fmoc法固相合成与标记的具体步骤如(1)-(9)：
(1)、第一个氨基酸与树脂的连接；
(2)、第一个氨基酸与树脂的偶联率测定；
(3)、Fmoc基团的脱保护；
(4)、第二个氨基酸的偶联反应：第二个氨基酸的连接采用原位活化法；
(5)、肽链的延伸反应：重复步骤(3)、(4)，直至偶联得到所需多肽链；
(6)、肽链N端标记异硫氰酸荧光素(FITC)；
(7)、肽链的侧链去保护及从树脂上的切割，得到合成抗原肽粗品；
(8)、合成抗原肽的脱盐；
(9)、HPLC纯化抗原肽；
(10)、将两条多肽溶于医学蒸馏水中，制成疫苗溶液。
本发明相对于现有技术，其优点如下：对HBV S区和C区抗原蛋白的氨基酸 序列进行了分析，进行抗原表位预测分析，找到多处具有免疫原活性的单表位 多肽序列，并合成了相应的多肽，通过免疫原性试验，从中筛选到两条可以使 转基因鼠产生较强的细胞免疫和体液免疫的多肽链，这两个多肽链的氨基酸序 列分别为：HBVSP：LFILLLCLIFLLVLL(15个氨基酸残基)，HBVCP：QLFHLCLIISCSCP (14个氨基酸残基)，其多肽纯度应大于95％以上。
具体实施方式：
本发明对HBV S区和C区抗原蛋白的氨基酸序列进行了分析，进行抗原表位 预测分析，找到多处具有免疫原活性的单表位多肽序列，并合成了相应的多肽， 通过免疫原性试验，从中筛选到两条可以使转基因鼠产生较强的细胞免疫和体 液免疫的多肽链，这两个多肽链的氨基酸序列分别为：
HBVSP：LFILLLCLIFLLVLL(15个氨基酸残基)
HBVCP：QLFHLCLIISCSCP(14个氨基酸残基)
多肽纯度为95％-99.99％。
上述的治疗性多肽乙肝疫苗的制备方法具体步骤如下：
一、多肽的固相合成
本研究采用Fmoc固相法合成线性多肽疫苗。
1.材料和设备
1.1主要试剂和材料
Fmoc-氨基酸、2-氯三苯甲基树脂(2-Chlorotrityl chloride resin树脂)、 1-羟基-苯并-三氮唑(HOBt)、N，N二异丙基乙胺(DIEA)、1-氧-3-双二甲胺羰基 苯并三氮唑四氟化硼盐(TBTU)、二环己基碳二亚胺(DCC)、三氟乙酸(TFA)购自 上海吉尔生化公司，乙二硫醇(EDT)、二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、茚 三酮、哌啶、甲醇、无水乙醇、异丙醇等为国产分析纯试剂。
1.2实验仪器设备 制备型HPLC仪 Water公司 台式冻干机 军事医学科学院四环仪器厂 DU-640蛋白与核酸定量分析仪 Beckman公司 酶标读数仪(Sunrise Remote Control-Reader) 奥地利TECAN公司 78-1型磁力搅拌器 杭州仪表电机厂 PHS-25型精密pH计 上海雷磁仪器厂 Millipore纯水仪 Millipore公司 Wallac Victor2(1420multilabel counter)荧光偏振检测仪 美国PerkinElmer Life Sciences公司 384微孔板 MJ Research公司
1.3主要试剂配制
(1)DMF：分析纯DMF，加千分之一茚三酮负压重蒸，去溜头溜尾。
(2)脱保护(DEBLOCK)试剂：分析纯哌啶，常压重蒸，去溜头溜尾，配 置成25％的DMF溶液。
(3)茚三酮显色剂：5％茚三酮无水乙醇溶液、80％苯酚和KCN(2ml 0.001 M KCN，98ml哌啶)。
(4)切割试剂：将TFA、硫代苯甲醚、水、苯酚和EDT按照82.5∶5∶5∶5∶2.5 的体积比混匀。
(5)PBS(pH 7.4)：0.2g KH2PO4，2.9g NaHPO4·12H2O，8.0g NaCl，0.2 g KCl，去离子水补充至1000ml，调节pH为7.4。
(6)ELISA包被缓冲液(pH 9.60.05mol/L Na2CO3-NaHCO3)：1.59g Na2CO3， 2.93g NaHCO3，去离子水补充至1000ml。
(7)ELISA洗涤液：含0.05％Tween20的PBS。
(8)ELISA抗体稀释液：含0.2％BSA的PBS。
(9)ELISA底物缓冲液：1.84g Na2HPO4，0.47g柠檬酸，去离子水补充至 100ml。
(10)TMB显色液：0.5ml TMB(10mg/5ml无水乙醇)，10ml底物缓冲 液，32μl 0.75％H2O2。
(11)ELISA终止液：2mol/L的H2SO4。
2.方法
2.1抗原肽的Fmoc法固相合成与标记
按照多肽疫苗的序列从羧端向氨端依次合成。
(1)第一个氨基酸与树脂的连接
将2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂1g置于干燥洁净的肽合成柱中， 加入8ml DCM，溶胀5min，真空吸弃溶剂。分别取2mmol Fmoc氨基酸和5mmol DIEA，溶于8ml DCM，并加入于树脂中，室温轻轻摇动反应60min。真空吸弃 溶剂。用10ml DMF洗涤树脂2次，每次2min。加入10ml DCM/甲醇/DIEA (80∶15∶5)，轻轻摇动反应10min，真空吸弃溶剂。重复一次。用10ml DMF洗 涤树脂3次，每次2min。真空吸弃溶剂，N2吹干。
(2)第一个氨基酸与树脂的偶联率测定
精确称取2mg干燥的Fmoc氨基酸-树脂置于比色杯中，加入3ml 20％哌 啶/DMF，轻轻摇动反应10min，用20％哌啶/DMF作为空白对照调零，紫外分 光光度计测定样品的290nm光吸收值。重复测定2次，取平均值。偶联率通过 以下公式计算：
偶联率(mmol/g)＝(Abs样品)/(样品重量mg×1.75)
(3)Fmoc基团的脱保护
向树脂中加入10ml脱保护(DEBLOCK)试剂，混匀，室温轻轻摇动反应5 min。弃溶剂，用10ml DMF洗涤树脂3次，每次2min。用6ml异丙醇洗涤树 脂3次，每次5min。用6ml己烷洗涤树脂3次，每次5min。真空吸弃溶剂。 取少量树脂样品，用茚三酮显色法(Kaiser法)快速测定树脂上的游离氨基含量： 将树脂2ml用乙醇洗涤3次，分别加入2滴5％茚三酮、80％苯酚和KCN(2ml 0.001M KCN：98ml哌啶)，充分混匀，120℃加热4～6min。判断Fmoc基团的 去保护反应程度。
(4)第二个氨基酸的偶联反应
第二个氨基酸的连接采用原位活化法，取2mmol的Fmoc氨基酸、4.0mmol 的TBTU和4.0mmol的HOBT，加入最少量的DMF溶解后加入5mmol的DIEA，充 分混匀后，加于脱Fmoc基团的树脂中。室温轻轻摇动反应60min。真空吸弃溶 剂。用5ml甲醇洗涤树脂3次，每次5min。用10ml DMF洗涤树脂3次，每 次2min。真空吸弃溶剂。取少量树脂样品进行茚三酮显色分析。测定偶联率。
(5)肽链的延伸反应
用10ml DEBLOCK试剂脱去上一个氨基酸N端的Fmoc保护基团，10ml DMF 洗涤树脂3次，真空吸弃溶剂。取少量树脂样品进行茚三酮显色分析。按照(3) 方法偶联下一个氨基酸。重复进行Fmoc保护基团脱保护和氨基酸偶联反应，直 至偶联得到所需多肽链。
(6)肽链N端标记异硫氰酸荧光素(FITC)
合成好全部氨基酸序列的树脂，脱去氨基酸N端的Fmoc保护基团，用10ml 异丙醇洗涤树脂3次，每次5min。取1.38g FITC，1.6g TBTU和0.76ml DIEA， 混合后加于肽—树脂中，室温轻轻摇动反应60min。真空吸弃溶剂。用5ml甲 醇洗涤树脂3次，每次5min。用10ml DMF洗涤树脂3次，每次2min。真空 吸弃溶剂。
(7)肽链的侧链去保护及从树脂上的切割
将已合成好全部氨基酸序列的树脂，用10ml DMF洗涤后再用6ml异丙醇 洗涤树脂3次，每次5min。用6ml己烷洗涤树脂3次，每次5min。真空吸 弃溶剂后N2吹干，放入裂解容器中。1g树脂加入25ml切割试剂，室温切割反 应2h，不时摇动混匀，反应后的混合液经玻璃滤器过滤树脂，收集切割反应混 合液，用TFA洗涤树脂3次。将反应混合液转移于一圆底烧瓶中，用等体积预 冷的乙醚洗涤4次，收集沉淀。干燥后即得到合成抗原肽粗品。
(8)合成抗原肽的脱盐
将抗原肽粗品加蒸馏水溶解。称取Amersham G-25凝胶15g，溶胀后装柱， 装好后的柱子先用50ml蒸馏水平衡，平衡好后，每次上样3-5ml，用蒸馏水进 行洗脱，紫外分光光度仪检测220nm处紫外吸收，按峰收集抗原肽。
(9)HPLC纯化抗原肽
使用waters公司的waters4000制备型HPLC高效色谱仪分离纯化抗原肽。 色谱柱为径向加压色谱柱(25×100，15μm，DELTA PAK C18填料)，洗脱系统 为：A液：5％乙腈溶液(含0.1％TFA)；B液：95％乙腈溶液(含0.08％TFA)。手 动进样，每次进样1ml，流速4ml/min，线性梯度，45min内，B液从5％升到 50％，然后5min内升到95％B液做最后洗脱。215nm处检测紫外吸收，按峰收 集组分，用于质谱检测。将分子量检测正确的组分收集，真空冻干，成为需要 的纯品。
(10)、将两条多肽溶于医学蒸馏水中，制成疫苗溶液。
使用常规方法，将两条多肽溶于医学蒸馏水中，制成50ug-5ug/ml的疫苗 溶液，分装于安瓿中，每支1ml。
3.结果
采用标准的Fmoc保护策略固相化学合成方法，比色法测定第一个氨基酸的 偶联率均大于90％，Fmoc脱保护的效率均可达到98％以上。合成得到线性肽， 经三氟乙酸切割，凝胶过滤除盐及制备HPLC纯化得到纯度为95％-99.99％的抗原 肽。纯化后肽的总收率在15～30％之间。质谱测定的分子量与预期相符。
二、多肽疫苗治疗作用
为了验证多肽疫苗治疗作用，下面列举实验说明：
1、实验目的：观察所选的多肽疫苗可否刺激模型动物机体产生体液免疫应答和 细胞免疫应答。
2.实验方法
2.1基因疫苗的免疫接种
选用4～6周龄Balb/C小白鼠分为实验组与对照组。HBVSP实验组(n＝ 10)和HBVCP誓言组(n＝10)分别注射多肽疫苗，每只每次100μg多肽疫苗， 用1ml的OT注射器(25号针头)行双后肢多点肌肉注射，第2周及第4周各 追加免疫一次。对照组(n＝10)按实验组的方法注射生理盐水，第6周后处死 小鼠，去眼球采血，分离血清-20℃保存，无菌取脾脏。
2.2体液免疫功能测定
将HBVSP多肽和HBVCP多肽按1μg·ml-1分别包被于酶标板，1％BSA封 闭后4℃备用。将小鼠血清用样本稀释液按1∶20比例稀释，每孔100μl；加于 上述酶标板中，37℃30min；加羊抗小鼠IgG(购于武汉博士德公司)100μl (1∶15000)，37℃，30min；PBS洗涤，加入底物，37℃，10min，终止反应后， 用酶标仪测定A值。
2.3细胞免疫功能的测定
无菌取脾后，用100目钢网研磨，低渗破坏红细胞，调细胞浓度到5× 106·ml-1，放于24孔培养板内(每孔1ml)，再加入ConA(终浓度为20μg·ml -1)，37℃，5％CO2培养48h，经2000r·min-1离心20min收集上清液，即 为白细胞介素2(IL-2)及γ干扰素(IFNγ)的粗品，-20℃保存待测。
2.3.1IL-2的测定
IL-2活性以刺激指数表示：
2.3.2IFNγ的测定
采用病变抑制法测定IFNγ，IFNγ活性以U·ml-1表示。
3结果
体液免疫功能的检测结果：用HBVSP和HBVCP多肽分别包被ELISA板，分别检 测相应免疫小鼠血清抗-HBs IgG，抗-HBc IgG。结果HBVSP和HBVCP组的抗HBsIgG (A＝1.23±0.22)的，抗-HBc IgG(A＝1.31±0.19)的水平明显高于 对照组(A＝0.13±0.02)(P＜0.01)。
细胞免疫功能的测定(1)IL-2测定：计算IL-2刺激指数，发现HBVSP和 HBVCP组明显高于对照组(P＜0.01)(附表)。(2)IFNγ的测定：采用病变抑 制法测定IFNγ水平，发现HBVSP和HBVCP组明显高于对照组(P＜0.05)(附 表)
附表 小鼠IL-2刺激指数和IFNγ水平的比较 组别 n IL-2 IFNγ(U/ml) 对照组 10 53.5±29.3 257.3±179.4 HBVSP组 10 199.7±31.8 1321±673.2 HBVCP组 10 203.5±36.7 1427±688.5
结论：HBVSP多肽疫苗和HBVCP多肽疫苗能诱导机体产生强烈的细胞及体 液免疫应答。用HBVSP多肽疫苗和HBVCP多肽疫苗疫苗小鼠后，均可在小鼠血清中 检测到抗-HBsIgG和抗-HBcIgG，并发现有明显的脾细胞增殖现象，小鼠的CTL 活性明显增强，多肽疫苗诱导特异性细胞的能力明显优于传统的疫苗，这为HBV 的防治开辟了一种新的途径。