技术领域
本发明涉及一种可以从杜仲中分离的物质—车叶草苷的新用途，特别是在制备治疗类 风湿性关节炎药物中的应用。
背景技术
车叶草苷(asperuloside)其化学结构式如下。
车叶草苷可以从杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)、猪殃殃(Tender Bedstraw)等 植物中分离，车叶草苷也可以从其他植物中分离。车叶草苷作为一种已经有的物质，尽管 有确切的分子式和结构式，但其研究的活跃性不高，作为单体在制备治疗类风湿性关节炎 药物中的应用还没有见报道。
RA是Rheumatoid arthritis的简称。
RA是一种以关节滑膜炎为特征的慢性自身免疫性疾病，目前仍无治疗良策。RA的早期 病变主要在滑膜，由于感染或创伤等因素的刺激，滑膜细胞迅速增殖，合成多种细胞因子， 如白细胞介素1β(IL-1β)，肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)等。各种细 胞因子联合介导RA炎症和组织损伤，其中以TNF-α的作用较为突出，TNF-α是能够引起 肿瘤组织出血坏死、并具有多方面的细胞因子。在活动性RA中，TNF-α参与三种主要病理 过程：(1)激活血管内皮细胞，增强内皮细胞黏附分子的表达，在关节炎时，血液中的白 细胞正是通过与黏附分子互相作用被汇集到关节腔的。(2)刺激结缔组织细胞和多形核细 胞产生前列腺素等小分子炎症介质。(3)通过刺激滑膜细胞、软骨细胞和破骨细胞，减少 糖蛋白合成，增加蛋白降解，并产生胶原酶和其他中性蛋白酶，释放骨钙等，从而导致骨 和软骨的破坏及骨关节运动障碍。因此通过抑制TNF-α的产生，从而阻止滑膜成纤维细胞 的过度增殖是RA治疗的可取途径之一。
另外IL-1β的作用也较为突出，几乎各种有核细胞都能产生IL-1β，但大多数细胞在 正常时并不合成IL-1β，只在激活后才被诱导合成IL-1β和IL-1β前体蛋白。脂多糖(LPS) 是最有效的IL-1β诱导剂，能快速诱导多种细胞表达IL-1β。IL-1β能刺激滑膜成纤维 细胞和毛细血管内皮细胞高度增殖，构成RA特征性血管翳；刺激软骨细胞和破骨细胞产 生前列腺素(PGE2)以及胶原酶等多种蛋白水解酶；激活中性粒细胞，释放溶酶体酶、自由基 等炎性递质，引起关节软骨、骨质等组织破坏，导致关节炎粘连以及后期关节畸形。因此通 过抑制IL-1β的产生；从而阻止滑膜成纤维细胞的过度增殖是RA治疗的可取途径之一。
发明内容
本发明的目的在于提供车叶草苷的新用途，车叶草苷在制备治疗类风湿性关节炎药物 中的应用。
车叶草苷的获得：
首先用杜仲叶(Eucommia ulmoids Oliv.)药材重量5倍的乙醇将药材回流提取3次， 每次1小时；然后将提取液离心或过滤，滤液在55℃减压浓缩至浓度为0.5g生药/ml，过 滤，取上清液；将上清液拌入硅胶，进行硅胶柱层析，用乙酸乙酯、丙酮、甲醇分别洗脱， 收集丙酮洗脱液，减压浓缩至干；取丙酮提取物用乙醇溶解，拌入3倍量的硅胶，干燥后 用硅胶柱色谱分离，硅胶色谱柱分离的洗脱溶剂为等比例重量的氯仿∶甲醇∶水混合液， 洗脱流速为500毫升/小时。薄层色谱检查，合并相同部分，再重结晶得到车叶草苷，车叶 草苷的得率是0.86％。
或者，首先用杜仲叶(Eucommia ulmoids Oliv.)药材重量5倍的乙醇将药材回流提 取3次，每次1小时；然后将提取液离心或过滤，滤液在55℃减压浓缩至浓度为0.5g生药 /ml，过滤，取上清液；将上清液进行大孔树脂柱层析，用含乙醇重量百分比60％的乙醇、 水系统洗脱，收集60％乙醇洗脱液，减压浓缩至干；取乙醇提取物用甲醇溶解，拌入3倍量 的硅胶，干燥后用硅胶柱色谱分离，硅胶色谱柱分离的洗脱溶剂为等比例重量的氯仿∶甲 醇混合液，洗脱流速为500毫升/小时。薄层色谱检查，合并相同部分，再进行一次凝胶柱 色谱纯化，等比例重量的甲醇、水混合液洗脱，得到车叶草苷，车叶草苷的得率是0.29％。
车叶草苷还可以采用其他方法获得。
在类风湿性关节炎药物领域，有很多文献报道药物成分对对滑膜细胞分泌TNF-α，PGE2和IL-1β的影响，用动物实验的数据来考察药物治疗RA的效果。这些文献有：[1]鞠大 宏，贾红伟，吴皓，等，鹿瓜多肽注射液对C II诱导的免疫性关节炎大鼠血清TNF-α、 IL-6以及C II抗体活性的影响，中国中医基础医学杂志，2003，9(11)：17。[2]何金华， 梁清华，张花先，等，痹肿消汤对实验性关节炎大鼠血浆TNF-α的影响，湖南医科大学学 报，2002，27(5)：524。[3]黄清春，张声鹏，徐秋英，复方丹参对II型胶原蛋白诱导大 鼠模型滑膜细胞分泌及肿瘤坏死因子的影响，现代康复，2001，5(10)：54-55。[4]郑治 钢，细胞因子及其检测方法和临床意义，陕西医学检验，2001，16(2)：59。[5]周军，方 素萍，齐云，等，葛根汤对佐剂性关节炎大鼠关节液炎症介质的影响，中国实验方剂学杂 志，2001，7(3)：29。[6]马骥，卢秉久，朱晓明，等，通痹颗粒治疗类风湿性关节炎的药效 学研究，中医药学刊，2001，19(6)：734。[7]朱江，谢文利，晋玉章，等，栀子对类风 湿性关节炎大鼠血清IL-1β和TNF α的影响，中成药，2005，27(7)：801。[8]黄清春， 张声鹏，黄伟毅，等，复方丹参注射液对CIA大鼠滑膜细胞IL-1βmRNA表达的影响，安 徽中医学院学报，2002，21(5).-39-41。
取本发明方法获得的车叶草苷，按文献[3]提供的方法进行模型制备、药物分组、大鼠 滑膜细胞培养及上清液的制备。
按文献[3]提供的方法考察药物成分对对滑膜细胞分泌TNF-α，PGE2的影响。按文献 [8]提供的方法考察药物成分对对滑膜细胞分泌IL-1β的影响。
车叶草苷大剂量组(20mg/kg.d)；车叶草苷小剂量组(10mg/kg.d)与正常对照、氯化钠 组的实验数据如下：
表1滑膜细胞培养上清液中TNF-α的含量(x±s，ng/ml) 组别 TNF-α 正常对照 氯化钠 车叶草苷大剂量组(20mg/kg.d) 车叶草苷小剂量组(10mg/kg.d) 0.35±0.052 0.71±0.136* 0.42±0.036*△ 0.45±0.025
与正常对照组比较，P＜0.05；与氯化钠组比较，△P＜0.05
表2滑膜细胞培养上清液中IL-1β含量(x±s，ng/ml) 组别 IL-1β 正常对照 氯化钠 车叶草苷大剂量组(20mg/kg.d) 车叶草苷小剂量组(10mg/kg.d) 0.15±0.043 0.46±0.155* 0.21±0.056*△ 0.25±0.016*△
与正常对照组比较，P＜0.05；与氯化钠组比较，△P＜0.05
表3滑膜细胞培养上清液中PGE2的含量(x±s，ng/ml) 组别 PGE2 正常对照 氯化钠 车叶草苷大剂量组(20mg/kg.d) 车叶草苷小剂量组(10mg/kg.d) 8.21±1.32 33.51±15.12* 12.30±1.46*△ 15.71±0.34*△
与正常对照组比较，P＜0.05；与氯化钠组比较，△P＜0.05
本发明采用文献1、2、3、4、5、6、7、8提供的方法考察车叶草苷成分对对滑膜细胞 分泌TNF-α，PGE2、IL-1β的影响。也有类似趋势。
本发明以大鼠为人类RA动物模型，采用滑膜细胞原代培养的方法，观察了车叶草苷对 滑膜细胞分泌TNF-α，PGE2和IL-1β的影响，结果表明，大剂量组、小剂量组均能显著下 调TNF-α，PGE2和IL-1β的含量，与空白组存在显著性差异，不能恢复至空白组水平，且 三组间无显著性差异，这表明车叶草苷能抑制TNF-α的产生，减少IL-1β的产生，从而减 少PGE2等炎症介质产生，达到减轻致骨和软骨的破坏恢复关节活动功能，发挥治疗RA效 果。
具体实施方式
实施例1、首先用杜仲叶(Eucommia ulmoids Oliv.)药材重量5倍的乙醇将药材回流 提取3次，每次1小时；然后将提取液离心或过滤，滤液在55℃减压浓缩至浓度为0.5g生 药/ml，过滤，取上清液；将上清液拌入硅胶，进行硅胶柱层析，用乙酸乙酯、丙酮、甲醇 分别洗脱，收集丙酮洗脱液，减压浓缩至干；取丙酮提取物用乙醇溶解，拌入3倍量的硅 胶，干燥后用硅胶柱色谱分离，硅胶色谱柱分离的洗脱溶剂为等比例重量的氯仿∶甲醇∶ 水混合液，洗脱流速为500毫升/小时。薄层色谱检查，合并相同部分，再重结晶得到车叶 草苷，车叶草苷的得率是0.86％。
实施例2、首先用杜仲叶(Eucommia ulmoids Oliv.)药材重量5倍的乙醇将药材回流 提取3次，每次1小时；然后将提取液离心或过滤，滤液在55℃减压浓缩至浓度为0.5g生 药/ml，过滤，取上清液；将上清液进行大孔树脂柱层析，用含乙醇重量百分比60％的乙醇、 水系统洗脱，收集60％乙醇洗脱液，减压浓缩至干；取乙醇提取物用甲醇溶解，拌入3倍量 的硅胶，干燥后用硅胶柱色谱分离，硅胶色谱柱分离的洗脱溶剂为等比例重量的氯仿∶甲 醇混合液，洗脱流速为500毫升/小时。薄层色谱检查，合并相同部分，再进行一次凝胶柱 色谱纯化，等比例重量的甲醇、水混合液洗脱，得到车叶草苷，车叶草苷的得率是0.29％。
实施例3、取按实施例1的方法获得的车叶草苷200克，低取代羟丙纤维素20克，PEG 6000 20克，微晶纤维素210克，PVP 50克，乳糖440克，硬脂酸镁60克分别粉碎均匀 后，混合压制成1000片。
治疗方法：类风湿病人每天服用两次，每次1-2片。疗程7-21天。
实施例4、取按实施例2的方法获得的车叶草苷100克，低取代羟丙纤维素20克，交 联聚乙烯吡咯烷酮30克，微晶纤维素100克，蔗糖650克，硬脂酸镁50克分别粉碎均匀后， 混合压制成1000片。
治疗方法：类风湿病人每天服用两次，每次2-4片。疗程7-21天。