技术领域 本发明属于生物制药工业领域，特别涉及一种生产基因工程 酵母疫苗的方法。
背景技术
目前全世界尚无基因工程重组的酵母疫苗问世，酵母疫苗是新型的用基 因工程技术构建的用于治疗或预防疾病的疫苗。自1996年以来，基因工程 药物产业化技术日趋成熟，实验室规模的基因产品制备已不能满足基因药物 产业化大规模生产的需要，因此迫切需要开发基因药物的大规模生产制造方 法。
本发明提供了一种可实现酵母疫苗从实验室小试到工业化生产的生产 方法，为酵母疫苗产业化提供可行的操作方法。
发明内容 本发明是一种生产重组酵母疫苗的方法，包括以下生产步 骤：
1.酵母疫苗系统的构建：应用基因工程技术构建酵母杂交疫苗载体，将病原体 抗原基因和细胞因子基因分别克隆酵母质粒上，经酵母质粒转化、杂交后筛 选出含有独立表达目的基因的疫苗产品作为种子疫苗冻存保种；
2.疫苗种子放大培养：取冻存种子液加入到氨基酸缺陷型选择性酵母培养基中 培养酵母；
3.疫苗原液的制备：取种子放大培养产物接种到较大体积氨基酸缺陷型选择性 酵母培养基中放大培养酵母；在培养基中可根据质粒中的启动子特性加入诱 导剂诱导目的基因表达，培养至所需浓度时终止，然后用无菌注射用水离心 洗涤菌体并稀释菌液至指定终浓度，4℃保存备用；
4.疫苗热灭活：取疫苗原液，于加热的水浴中静置所需时间，期间不断混匀， 到所定时间时即为疫苗半成品；
5.半成品的冻干：包括疫苗的冻干方法，冻干赋形剂选用不同浓度的甘露糖或 其它赋形剂成份。
6.本发明采取以上生产工艺，具有以下优点：
1)酵母安全性好，生产效率高，成本低；
2)生产工艺简便、周期短，可控性和可操作性强；
3)充分保证了产品的生物活性，质量可控；
4)酵母载体本身是免疫佐剂，简化了疫苗产品制剂配方。
以下结合附图和实施例对本发明的操作过程进行详细的描述：
附图说明
图1举例说明本发明用于生产艾滋病疫苗的载体构建过程
图2本发明生产工艺流程图
图3疫苗半成品活性检测结果图
图4疫苗半成品无菌性结果图
采用本发明方法的实施例
以下举例说明本发明的具体实施例，但本发明的应用并不限于此，用 同样方式同样性质组分生产不同疾病疫苗均属于本发明之范畴。
(一)杂交酵母艾滋病疫苗载体系统的构建
应用基因工程技术构建双酵母杂交疫苗载体，将HIV-1 p55 gag抗原基 因和细胞因子h IL-2分别克隆到异性的单倍体酵母质粒上，酵母表达质粒来 源于修饰改造pYEX-BX使之易于克隆目的基因和适于杂交酵母的转化，酵 母原种为Saccharomyces cerevisiae衍生出的W303-1a和α，HIV-1 p55 gag 基因片断来源于用PCR扩增的HIV-1 HXB2 gag片断，h IL-2基因来源于用 PCR扩增的人血液IL-2片断。单倍体酵母质粒经双杂交后筛选出含有独立 表达HIV-1 gag、h IL-2的疫苗产品；
(二)种子放大培养
由工作种子库中取出冻存的甘油菌0.5ml，将冻存种子液加入10mlYNB双 缺培养基中，30℃±0.5，300rpm±20振荡摇床，震摇18hrs±2，检测种子原液 OD600值使其达到10AU±1/mL。
(三)疫苗原液的生产
取10AU±1/mL种子放大培养产物4ml±0.5加入100mlYNB亮氨酸、尿 嘧啶双缺培养基中，50μL CuSO4，30℃±0.5，300rpm±20震摇18hrs±2。用 50ml离心管收集菌体，4,000g离心10min。用无菌注射用纯水洗涤菌体两次。 用无菌注射用纯水稀释菌液至疫苗原液OD600值需达到7AU±1/mL，4℃保存 备用。
(四)疫苗热灭活
取出疫苗原液，以无菌注射用水调整菌液OD600值需达到16AU±1/mL， 放置于70℃的水浴中静置50分钟，每十分钟重新混匀一次，即为疫苗半成品， 该产品为白色或微红色悬液，静置沉淀后上清清澈无色透明，4℃保存备用。经 以下检测：
1.疫苗半成品的活性检测：检测半成品中的存活的酵母量情况，取半成品 100μL 1.6×107酵母细胞，涂布YPD平板，30℃培养箱培养48小时，计数平 板单克隆计数。实验见30℃平板培养48小时后，平板上未发现有任何可见克隆， 即1.6×107细胞中可见克隆数≤1，说明半成品中不存在活性的酵母，结果见表 1和附图3
表1 疫苗半成品的酵母活性检测 平板编号 样品名称 克隆数(个) 1样品 2阳性对照 3阴性对照 HYV-gag 100μL DH5α 100μL 灭菌注射用水100μL 0 ＞1×109 0
2.疫苗半成品的无菌性检测：检测成品中的微生物感染特别是大肠 杆菌的感染情况，取半成品100μL 1.6×107细胞，涂布LB平板，37 ℃培养箱培养16小时，计数平板单克隆数量。实验见在37℃平板培养16 小时后，平板上未发现有任何可见克隆，即1.6×107细胞中可见克隆数≤ 1，说明半成品中不存在微生物感染情况，结果见表2和图4
表2 疫苗半成品的无菌性检测 平板编号 样品名称 克隆数(个) 1样品 2阳性对照 3阴性对照 HYV-gag 100μL AKY 1100μL 注射用水100μL 0 ＞1×109 0
(五)冻干：经无菌性和热灭活后酵母活性检测合格的半成品以5.0 ％甘露醇调整菌液OD600值达到10AU±1/mL，以0.8ml每支，自动化 无菌分装。以下冻干曲线冻干样品：室温25℃→-40℃，6小时→-20 ℃，4小时→-10℃，2小时(干燥抽真空)→0℃，2小时→10℃， 2小时→25℃，4小时→充氮压塞压盖，即为杂交酵母艾滋病疫苗的 成品，经各项质量检测均符合标准。
此生产工艺生产的杂交酵母艾滋病疫苗可有效表达HIV-1 gag蛋白和 h IL-2，HIV-1 gag蛋白表达量大于1000ng/AU，h IL-2表达量大于10ng/ AU，原液和成品各项质量检测指标符合标准，疫苗生产工艺路线简单、 操作周期短，并能充分保证表达目的基因的生物活性和稳定性，具有较高 的生产效率。
本发明是一个创新性的酵母疫苗生产工艺，不仅可用于艾滋病疫苗 的生产，还可用于该酵母疫苗载体系统生产的其它多种传染性和非传染性 疾病的疫苗。