本发明涉及药物尤其是多肽药物的新的给药方法即经眼给 药方法，本发明进一步涉及一种适于经眼给药的药物组合物及其 制备方法，所述药物组合物含有具有全身性作用的多肽药物(尤 其是含有胰岛素)和一种或多种吸收增强剂，它有助于分子量较 大的多肽药物的全身性吸收。
对于药物治疗，传统上多采用口服或注射给药方法，然而有 些药物，却不能简单地通过这些方法给药，例如：许多药物特别是 多肽类药物，在胃肠道易被消化酶破坏，因此不能口服，由于肠粘 膜对亲水性药物的渗透性较低，所以许多药物难以由胃肠道吸 收，这类药物必须通过非胃肠途径如注射给药。
但是注射可引起疼痛，并且必需在无菌条件下进行，以预防 爱滋病和其他疾病的传染，况且一些药物，如多肽药物例如胰岛 素的皮下注射会有明显的个体，有吸收差异(Galloway，等人， Diabetes Care，4：366-376(1981))，此外一些慢性病，如糖尿病 需反复注射，这样会引起许多副作用，如疤痕、刺激性和局部肿 块，患者经常不能保持严格的治疗疗程，进而导致一些并发症，如 糖尿病性白内障和视网膜性疾患，往往多发生在那些不能完成医 嘱治疗计划的糖尿病患者。
药物也可采用滴鼻剂、鼻喷剂或吸入剂的方式通过鼻腔给药 吸收，但药物达到鼻粘膜的量，以及最终吸收进入全身的量却比 理想的少，研究人员已采用促吸收剂，以增加鼻粘膜的吸收(Hirai 等人，International J.Pharmaeutic’s，9：173-184(1981)； Monkhouse等人，Aust.J.Pharm.，48：570-595(1967)；Moses等 人，Proceedings of Land O′lake，86(1986))。但是采用这些方法 很难使药物持续扩散，而且鼻腔给药的量也难以控制，医药学家 们正试采用一个附有计量剂量的机械喷雾泵，以达到药物均衡的 释放，可是这样投放的药物，在鼻中隔的分布参差不齐，并且很少 分布在鼻侧壁上(Mygind等人，Rhinology，Vol X VI，78-88 (1978)。
其他给药方法有例如经口腔、阴道、直肠和气管给药，但由于 人们的习惯和不方便，没有一种能被广泛接受。
还有一种简单方便而又几乎没有痛苦的给药方法，这就是经 眼给药。目前经眼给药一般是用来治疗眼睛本身的疾患，而不是 为了减轻其它器官系统的疾患。
眼睛有许多独一无二的解剖学上的特点，它受到血-眼屏障 的物理性保护(Bito等人，Exp.Eye Res.Suppl.，229-243 (1977)。角膜的中间层是亲水性的，并位于内皮和上皮两个类脂 层中间，许多生物膜都具有方向相反的结构，即类脂层在中间，而 两边的皮层是亲水性的，鼻泪管具有吸收性的粘膜，可吸收来自 眼睛的泪液和其他物质，所以许多滴眼药，尤其是其中的小分子 药物，可经由鼻泪管吸收，进入全身循环而很少进入眼睛本身。例 如用于治疗眼疾的肾上腺素，当滴入眼睛时，大部分肾上腺素可 经过鼻泪管及结膜吸收进入全身循环，而产生α和β类肾上腺 素的副作用(McClune，Pro-drug as Novel Drug Delivery Systems ACS Symposium Series 14，Higuchi等人，Ed.，Amer. Chem.Soc，Washington DC，224-235，(1975)。
对于某些特殊药物，例如，不能经口服给药的多肽药物，如果 能经眼给药，那将必定是大有用途的。对此，本领域的研究人员进 行过许多尝试，但一般都无效，如脑啡肽在兔子眼角膜的吸收已 有研究，但几乎100％的脑啡肽存在于角膜上皮，由肽酶作用变成 水解形式(Lee等人，J.Ocular Pharmacol 2：235-352(1986))。
Christie等人研究了胰岛素经兔眼的给药，经结膜吸收后会 产生各种不同的作用(Christie等人，J.Clin.Invest.，10： 787-793(1931))。在下文本发明人进行的单独胰岛素给药的对 照实验中，也将进一步证实，单独胰岛素经兔眼给药，虽然对血药 浓度有些影响，但并不明显或显著，这样，Christie等人的给药方 法就不能用于人，或者说当用于人时就不能产生有效的药理效 果，这是因为当兔子体重与人相比时，按比例它的眼睛比人眼睛 大得多，所以足够的药物可以通过兔的眼睛被吸收而产生一些全 身性反应，换句说话，人的眼睛与人的体重相比是很小的，一般不 能容纳能够产生所需效果所需的药液容量。否则为了避免使用大 体积的药液，只能采用高浓度的药液，利用其高的渗透压差来增 加药物吸收，但这样会破坏眼睛的表面张力，而引起不适当的眼 睛刺激性。
因此，需要一种能增强药物例如多肽药物经眼吸收的适用方 法。
本发明人经潜心研究，成功地发现了一种增加多肽药物经眼 吸收的适用方法。本发明人发现了一组吸收增强剂，它能有效地 增加多肽药物经眼(经鼻泪管和结膜)吸收进入全身性循环中，产 生足够的血药浓度，进而发挥其全身性作用。这种给药方法简单 方便，又没有痛苦，而且与静脉注射相比，药物血药浓度可以持续 较长时间。另外通过眼睛给药，剂量可以控制得较好，因为药物通 过鼻泪管和结膜吸收的量是相当的恒定。
因此，本发明的第一方面涉及一种多肽经眼给药的新方法， 该方法包括将治疗有效量的多肽药物与一种或多种有效量的吸 收增强剂一起经眼给药。
本发明另一方面涉及适于经眼给药的新的多肽药物组合物， 该药物组合物在其药学上可接受的载体或赋形剂中含有全身性 作用活性的多肽药物及一种或多种有效量的吸收增强剂。本发明 组合物与泪液基本上等渗。
本发明的另一方面涉及所述药物组合物的制备方法，包括将 所述多肽药物与有效量的所述吸收增强剂和药学上可接受的载 体或赋形剂一起混合。
本发明的再一方面涉及多肽药物经眼给药的药物剂型，其中 含有活性多肽和一种或多种吸收增强剂。
本发明新的经眼给药方法中，多肽药物可以与吸收增强剂同 时使用，即以混合物(或组合物)的形式使用；也可将吸收增强剂 紧接在多肽药物给药之前或之后使用，这些给药方法均包括在本 发明范围内。同时，本发明也涉及一种药剂盒，包括多个(至少两 个)包装物，其中一个包装物含有多肽药物和任意含有药学上可 接受的载体或赋形剂，另一个包装物含有吸收增强剂和任意含有 药学上可接受的载体或赋形剂，以及任意的含有药学上可接受的 载体或赋形剂的包装物，和任意的含有其它辅助性成分的包装 物，这在下文将进一步叙述；这种药剂盒将本发明药物组合物的 各组成成分分装在独立的包装物中，在使用时可顺序依次给药， 或者临时混合使用。
本发明中，“全身性作用的多肽”是指经眼给药后，经过全身 性循环，作用于远离眼睛部位的多肽及多肽类药物，在作用时间 内，应维持它的生物活性。
“多肽和多肽药物”是指任何通过肽键结合的多聚氨基酸(两 个或更多)，包括蛋白质、寡肽、蛋白碎片、类似物、突变蛋白、融合 蛋白等，也包括糖蛋白、脂蛋白、磷酸蛋白、金属蛋白、核蛋白以及 偶合蛋白等。
术语“吸收增强剂”是指一类可增加多肽药物经眼鼻泪管及 结膜吸收，进入全身性循环的物质，具有代表性的吸收增强剂包 括天然和合成的表面活性剂，如阳离子型、阴离子型和非离子型 表面活性剂和两性表面活性剂、胆酸及其取代的衍生物(包括 盐)、螯合剂、甾酸微素钠、及其衍生物，这些化合物下面将充分讨 论。
“多肽酶抑制剂”是指一种可以抑制多肽酶活性的化合物。
本发明所述的组合物与“泪液基本上等渗”，也就是说药液的 渗透压与泪液的渗透压相接近，一般的说，药液的张力等于0.9％ 氯化钠溶液的张力，它就是等渗的，但是药液的张力相当于0.5％ ～1.8％氯化钠溶液的张力时，眼睛仍然是可耐受的，这将用于本 发明。
“治疗有效量”是指可引起机体对所用药物产生最小反应足 够的多肽药物的量，这个量可因年龄、治疗状况、体质和疾病的严 重程度而变化，这些因素可由主治医生决定，但是许多药物的治 疗有效量是已知的，或者可以采用常识得到，但多肽的用量一般 小于5mg。
吸收增强剂的“有效量”是指可以增加药物经鼻泪管及结膜 有效吸收，使血药浓度达到有效的治疗浓度，而不明显改变泪液 张力的量。本发明有关多肽药物的血药浓度，取决于(1)投放药物 的浓度；和(2)药物通过眼结膜和鼻泪管吸收的量，大分子量的多 肽比小分子量的多肽难以吸收，所以大分子量的多肽必须采用大 剂量给药，以达到适当的血药浓度，但是多肽药物浓度若高于 10％(W/V)，往往会形成严重的高渗，不适用经眼给药，使用上述 的吸收增强剂，可增加大分子量的多肽的吸收，而不明显改变眼 环境的等渗性。吸收增强剂的量不应太高和引起眼刺激性，吸收 增强剂的有效量，取决于所有的吸收增强剂和所用的多肽药物， 本发明采用的吸收增强剂浓度为0.01～5％(W/V)，优选为0.1 ～2％(W/V)，最优选0.25～2％(W/V)。
本发明中治疗活性物质是多肽类药物，包括具有临床药理活 性的所有多肽类药物。它们一般都有市售，可以买到，或者也可利 用遗传工程技术制备，或者从生物体内提纯，所述制备和提纯方 法是本领域普通技术人员熟知的。表1列举了一些多肽和它们的 分子量，本发明对于下列这些多肽的全身性吸收，是特别有用的， 如胰岛素、蛙皮素(bombasin)、心钠素、促黑色细胞激素、脉管活 化肠多肽、β-和γ-脂肪酸释放激素、促甲状腺释放激素、促黄 体生成释放激素、催产素、抗利尿激素、加压素、生长激素释放因 子、促性腺素释放激素、生长激素、生长激素释放抑制因子、促胰 液素、降钙素等，肽类止痛药，包括但不限于脑啡肽，如亮啡肽、甲 啡肽、内啡肽如蛋内啡肽、亮内啡肽、α-新内啡肽、β-新内啡 肽、强啡肽A和强啡肽B、血糖素(胰高血糖素)、伴刀豆球蛋白、 核糖核酸酶、溶菌酶和促肾上腺皮质激素等等，任何多肽在体内 具有生物活性者，皆可使用本发明方法以投药。 表1 本发明使用的多肽实例 多肽 分子量 使甲状腺激素释放激素(TRH) 亮内啡肽 蛋内啡肽 生长激素 催产素 抗利尿激素 加压素 α-新内啡肽 β-新内啡肽 促黄体激素释放激素(LHRH) 强啡肽A 强啡肽B 生长激素释放抑制因子 肠促胰液肽 降钙素 胰高血糖素 促肾上腺皮质激素(ACTH) 生长激素释放因子 胰岛素 伴刀豆球蛋白 核糖核酸酶 溶菌酶 360 600 600 800 1,000 1,000 1,000 1,100 1,100 1,200 1,400 1,400 1,650 3,000 3,400 3,500 4,500 4,800 6,000 12,000 13,000 15,000
多肽使用的量应根据多肽的种类，患者的状况、年龄、体重等 而变化，这个剂量很容易测定的，通常组合物中多肽的浓度不应 超过10％(W/V)，否则眼睛环境的等渗性会被严重破坏，给药体 积最好为50ul以下，多肽的量一般小于5mg(50ul，10％溶液)。
本发明的适当的吸收增强剂包括所有可增加多肽药物经眼 (鼻泪管和结膜)吸收的物质，它们一般是具有表面活性特性的物 质，适当的吸收增强剂可以是单一的，也可以是复合的表面活性 剂，吸收增强剂可以是具有表面活性特征的天然和合成的阳离子 型、阴离子型、非离子型表面活性剂和两性表面活性剂，螯合剂， 胆酸及其衍生物和盐、梭链孢酸及其衍生物和盐等等，例如包括 皂草苷类化合物(Saponins)、聚氧乙烯、脂肪酸聚氧乙烯缩合物和 聚氧乙烯烷基醚，如聚氧乙烯4-、9-、10-、和23-月桂基醚、 聚氧乙烯10-和20-乙酰基醚、聚氧乙烯10-和20-硬脂基醚、 脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯单 月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐类如聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂 酸酯，十烷双胺(decamethonium)、溴化十烷双铵、溴化十二烷基 三甲基铵，螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸二钠、 胆汁盐类及胆汁酸类如胆酸、脱氧胆酸、甘胆酸(glycocholic acid)、脱氧甘胆酸(glycodeoxycholic acid)、牛磺胆酸、脱氧牛磺 胆酸(taurodeoxycholic acid)、胆酸钠、甘胆酸钠、甘胆酸盐、脱氧 胆酸钠、牛磺胆酸钠、脱氧甘胆酸钠、脱氧牛磺胆酸钠、鹅(脱氧) 胆酸、和urosdeoxycholic acid；梭链孢酸(fusidic acid)及其衍生 物、甘草酸、甘草酸铵(ammonium glycyrrhizide)等等。低浓度大 分子的多肽药物不易经眼吸收，但本发明所述吸收增强剂能大幅 度地增加其经眼吸收，尤其是有利于分子量大于2000的多肽的 经眼吸收，使之能达到有效的血药浓度，而不影响泪液的等渗性。 本发明吸收增强剂同样也可大大增加小分子多肽药物的经眼吸 收数量，因而可大为降低其给药量，降低药品成本。本发明上述吸 收增强剂都是已知的化合物，可以从药物或试剂公司买到。本发 明优选的吸收增强剂是甘胆酸盐类。
药物组合物中吸收增强剂的浓度应为足以增加多肽药物经 鼻泪管粘膜及结膜吸收的最小量，或者说是如上文所述的增加吸 收的有效量，以避免使用高浓度的药物，否则将可能引起对眼睛 的刺激性。为了降低药物组合物成本，可以适当增加吸收增强剂 的用量，使得在使用较低浓度多肽药物时仍能够达到有效的血药 浓度。本发明的吸收增强剂在药物组合物中的浓度一般为0.01％ ～5％(W/V)，最好为0.25％～2％。本发明特别指出使用多种低 浓度的吸收增强剂，得以产生与使用一种较高浓度吸收增强剂相 当的促吸收效果，而不发生或大为降低发生副作用的可能性。当 使用多种吸收增强剂时，吸收增强剂的使用量可成倍数地降低。
本发明药物组合物中还含有药学上可接受的任何载体或赋 形剂，这种载体或赋形剂与药物组合物的活性成份应该是相容 的，所有眼科药剂中适用的载体或赋形剂在本发明中都应是适用 的。例如：眼科所用合适的赋形剂是无菌等渗溶液，如等渗氯化钠 溶液或硼酸溶液，这些眼科赋形剂，含氯化钠或硼酸以及氯化苄 烷铵和无菌蒸馏水或纯水，也常用磷酸缓冲液，pH7.4，其他可用 的赋形剂包括硝酸苯汞、硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸钠及磷酸单钠 等。组合物还可包含一些辅助性物质，包括抗微生物药物如氯丁 醇、Parabans和有机汞化合物，pH调节剂如氢氧化钠、盐酸或硫 酸，和一些增稠剂，如甲基纤维素，上述这些辅助剂原料有市售， 是可以很容易得到的。组合物中还可含有多肽酶抑制剂，以维持 多肽的生物活性，具有代表性的多肽酶抑制剂有：Leu-Leu、 bestain、D，L-thiorphan、嘌罗霉素、卡托普利、杆菌肽、苯甲基磺 酰基氟化物、Leupectin、胃酶抑素A和抑肽酶等，它们也是已知 的药物或试剂，是可以买到的，抑制剂的浓度取决于所用多肽酶 抑制剂的种类和所用多肽药物的种类，本领域普通技术人员可根 据具体情况判定。最终的药液应是无菌，基本不含外来物质的， pH应是药物稳定的最佳pH，一般pH在5～8之间最好，pH应尽 量接近泪液的pH，也就是pH7.4。
本发明药物组合物可配制成各种适于经眼给药的药物剂型。 例如溶液、悬浮液、油膏、胶体或眼用药物输送装置，后者是将药 物浸透在固体载体中而制得，例如是亲水性隐形镜片、可溶性眼 植入物、巩膜缔结物等。如使用这种载体，则无需上述赋形剂。有 大量的多聚物，可采用作为眼科药物载体形式，Saettone等人在 J.Pharm.Pharmacol.36：229-234，(1984)中以及Park等人在 Recent Advance in Drug Delivery Systems，Anderson等人 Ed.Plenum Press，163-183(1984)中描述了一些作此用途的多 聚物，该两篇文献的相关内容并入本文作为参考。通常药物的释 放，受多聚物生物崩解或溶解和渗透性的影响，该制剂应按处方 配制，使多肽药物以一定速率释放，而不明显改变泪液的张力。
在本发明的一个具体实施方案中，也采用一些基质释放剂 型，这种剂型的详细内容由Ueno等人在Controlled Drug Delivery，Vol II，Clinical Application’s，Bruck Ed.CRC Press Inc.，Florida，89-109(1983)中做过详细的叙述，该文献相关内 容并入本文作为参考，其中的剂型包括亲水性的隐形眼镜片，浸 透或吸收所需药物，以及可以崩解或溶解的剂型，植入眼睛后不 需再取出，这些可以溶解的植入物，可由一些生物崩解物质所组 成，它们包括以下一些物质，但绝非仅限于此，这些物质是聚(乙 烯基醇)、聚丙烯酰胺，丙烯酸乙酯和乙烯基吡咯烷(啉)酮的聚合 物和共聚物，以及和多肽或多糖类交叉结合的多聚物，如甲壳质。
本发明还引用了胶囊型输送系统的剂型，Ueno等人(1983) (文献同上)对此已有叙述，采用多聚体膜以控制药物的释放，这 种技术特别适用于亲水性药物的释放，亲水型药物可经由Ueno 等(文献同上)描述的硅胶技术以投用。
眼药膏包含基质，该基质由白色的凡士林和矿物油组成，通 常还包含脱水羊毛脂，聚乙二醇-矿物油也很好，与其他物质一 样，是一种对眼睛没有刺激性，并促使药物扩散进入眼睛的液体， 而在贮存情况下，仍能在相当长时间内保留活性。如用悬浮液，颗 粒的大小应在10μm以下，以减少对眼的刺激性，再者给患者的 使用量应少于50μl，最好是25μl或更少，以避免从眼睛中溢出。
如上文所述，本发明的各种有效成分可以制成组合物的形 式。本发明各种成分也可分装成各包装物，组成一种药剂盒。在这 种药剂盒包括多个包装物，其中第一包装物含有如上文所详述的 多肽组分例如胰岛素和任意含有如上文所详述的赋形剂，第二包 装物中含有如上文所详述的吸收增强剂例如0.25％SPE-109和 0.25％SPE-103和任意含有如上文所详述的赋形剂，另外还任 意包括含有赋形剂的第三包装物，在上述包装物中(尤其是在第 一包装物中)可任意含有如上文所述的多肽酶抑制剂和其它添加 剂。这些包装物，最好都是按比例剂量装入的安瓿瓶，以便于患者 使用时临时配制成与泪液基本等渗并且pH值适当(例如 pH＝7.4)的混合物。患者可以将各包装物的成分混合使用，也可 紧接着先后使用。
通常给药的方式和次数取决于缓释、控释剂型、普通剂型及 其组成处方而定，以维持适当的血药浓度，一般均需遵医嘱，例如 滴眼液或眼药膏可每日分2～4次给药，每次5～50μl，其药物含 量应能维持治疗有效的血药浓度；对于植入物制剂例如眼用膜 剂，可每日植入一次或数日植入一次等，这期间膜剂中各有效成 份持续释放，进入泪液，其中的吸收增强剂增加多肽药物经鼻泪 管和结膜吸收，维持有效的血药浓度，而起到治疗作用。
下面通过附图和药理学实验对本发明吸收增强剂增加多肽 药物经眼吸收的作用进行进一步说明。在下述的药效学实验部 分，虽然只是以部分具体多肽药物作为具体实例，来证明本发明 人发现的一组吸收增强剂对多肽药物经眼吸收的增强作用，但应 当理解，本发明吸收增强剂的效用不仅限于这些多肽药物，而是 对经肽键连接的所有多肽药物均具有增强其经眼吸收的作用。在 下文及附图中，一些符号意义如下：SPE-109代表聚氧乙烯9- 月桂基醚，SPE-103代表聚氧乙烯20-硬脂基醚，Ins代表胰岛 素，eye表示滴眼用药。
图1表示的是不含吸收增强剂的胰岛素(1％和5％)滴眼液 以及含有吸收增强剂的胰岛素(0.25％)对糖尿病兔的血糖水平 的影响。每一数值点是6次数值的平均值，线条代表均值标准误 差(SEM)。星号是指处理组与对照组数值间的统计学偏差 (Statistical difference)，其中1个星号表示p＜0.05，2个星号表 示p＜0.01。
图2表示的是不含吸收增强剂的1％胰岛素和含有 0.5％SPE-103或0.5％SPE-109的1％胰岛素对糖尿病兔的 血糖水平的影响。每一数值点是6次数值的平均值，线条代表 SEM。星号是指处理组和对照组数值间的统计学偏差，其中1个 星号表示p＜0.05，2个星号表示p＜0.01，3个星号表示 p＜0.001。
图3表示的是在连续性地每日两次滴眼给药，共给药3个月 后，胰岛素(加SPE-103)经眼途径的全身性吸收作用及其对血 葡萄浓度的影响。每一数值点是5次实验结果的平均值，而线条 代表SEM。血胰岛素浓度＝●，血葡萄糖含量＝○。
图4表示的是在连续性地每日两次滴眼给药，共给药3个月 后，胰岛素(加SPE-109)经眼途径的全身性吸收作用及其对血葡 萄糖浓度的影响。每一数值点是5次实验结果的平均值，而线条 代表SEM。血胰岛素浓度＝●，血葡萄糖含量＝○。
图5表示的是不同浓度的皂草苷对1％胰岛素溶液的吸收作 用的影响。每一数值点是6次数值的平均值，而线条代表SEM。
图6表示的是2％皂草苷对1％胰岛素溶液的吸收作用和对 血葡萄糖浓度的影响。每一数值点是6次数值的平均值，而线条 代表SEM。
图7说明0.5％皂草苷对1％胰岛素溶液的吸收作用和对血 葡萄糖浓度的影响。每一数值点是6次数值的平均值，而线条代 表SEM。
图8说明1％胰岛素对血葡萄糖浓度的影响。每一数值点是 6次的数值的平均值，而线条代表SEM。
图9表示的是1％皂草苷对1％胰岛素溶液的吸收以及对血 葡萄糖浓度的影响。每一数值点是6次数值的平均值，而线条代 表SEM。
图10表示的是用含有或不含吸收增强剂的1％蛋内啡肽 (Met-Enk)滴眼液滴眼所获得的Met-Enk全身性吸收作用，线 条代表均值标准误差(SEM)。
图11表示的是用含有吸收增强剂的0.3％Met-Enk滴眼 液滴眼所获得的Met-Enk全身性吸收作用，线条代表SEM。
图12表示的是用含有或不含吸收增强剂的1％Leu-Enk滴 眼液滴眼所获得的Leu-Enk全身性吸收作用，线条代表SEM。
图13表示的是用含有或不含吸收增强剂的0.3％亮内啡肽 (Leu-Enk)滴眼液滴眼所获得的Leu-Enk全身性吸收作用，线 条代表SEM。
图14表示的是降钙素经眼吸收进入全身性循环的吸收作 用，每一数值点是4次结果值的均值，线条代表SEM。
图15表示经静脉内注射降钙素与局部经眼滴入含有或不含 吸收增强剂的降钙素滴眼液(0.05％)所获得的血液降钙素浓度 的比较，每一数值点是4次结果值的均值，线条代表SEM。
图16表示经静脉内注射降钙素与局部经眼滴入含有吸收增 强剂的降钙素滴眼液(0.15％)所获得的血液降钙素浓度的比较， 每一数值点是4次结果值的均值，线条代表SEM。
图17表示经静脉内注射降钙素与局部经眼滴入含有或不含 吸收增强剂的降钙素滴眼液(0.5％)所获得的血液降钙素浓度的 比较，每一数值点是4次结果值的均值，线条代表SEM。
图18表示的是吸收增强剂对0.33μg/kg催产素经眼全身 性吸收的影响，线条代表SEM。
图19表示的是吸收增强剂对1μg/kg催产素经眼全身性吸 收的影响，线条代表SEM。
图20表示的是吸收增强剂对0.5u/kg加压素经眼全身性吸 收的影响，线条代表SEM。
图21表示的是吸收增强剂对1.5u/kg加压素经眼全身性吸 收的影响，线条代表SEM。
药理学实验
吸收增强剂促进胰岛素经眼给药的全身性吸收
A.材料和方法：
材料：胰岛素(26.1 IU/mg)，SPE-103，和SPE-109皆购 自Sigma公司(St.Louis，MO)，滴眼液用无菌磷酸盐缓冲液配制， 用氢氧化钠调节pH。
实验动物：新西兰白兔、雌性、体重2.0～3.0kg，采用苯巴比 妥钠(30 mg/kg)静脉注射麻醉，实验过程中用苯巴比妥钠1mg/ kg/hr维持麻醉，股动脉插入聚乙烯管(PE-90)采集血样，并用 肝素生理溶液(50u/ml)抗凝。左眼滴入50μl胰岛素溶液，给药 后从股动脉于0、10、20、30、60、90、120分钟，每隔1小时取血，直 到5小时，血样经离心后，冻存用于放射免疫性测定，胰岛素用 RIA方法测定，血糖浓度取新鲜全血用糖试纸和Glucoscan 2000 Meter测定(Lifescan，Mountain View，CA)，实验结束时，用过量 的苯巴比妥钠将兔麻醉致死。
胰岛素之RIA：放射性免疫实验试剂盒(RIA Kit)购自 Pharmacia Diagnostic(Uppsala，Sweden)，用于测定血浆胰岛素， 血浆(100μl)加入50μl125I标记胰岛素，于室温放置2小时，然 后加入含第二种抗体的试剂，于室温再放置30分钟后，以1500g 离心10分钟，轻轻倾出上清液，将试管倒立在吸水纸上，样品的 放射性用Packardγ-计数器(Parkard Instrument，Downers Grove，IL)测定，根据标准曲线计算血胰岛素浓度。
四氧嘧啶性糖尿病兔：新西兰白兔、雌性、体重2.2～2.6kg， 用100mg/kg的四氧嘧啶静脉注射，注射后24小时内给予兔子 1％的葡萄糖溶液，以防止低血糖性休克，注射四氧嘧啶后三天， 血糖升高至319±27mg％，兔子注射四氧嘧啶后一周进行实验， 滴药前禁食3小时。
B.结果：
50μl 0.5％和1％的胰岛素溶液滴眼后30分钟，血糖和血 中胰岛素的浓度均达峰值(表2)，但胰岛素浓度(27μU/ml)却不 足以改变血糖浓度。
当0.25％、0.5％和1％胰岛素溶液中加入0.5％的 SPE-103，滴眼后30分钟，血胰岛素浓度明显增高至169、239和 269μU/ml(表3)，因此滴眼后60分钟，血糖明显下降，从113、 115和123mg％降至71、72和61mg％(表4)，这些结果表明，吸收 增强剂SPE-103可明显增加胰岛素吸收，有效地降低血糖，减少 胰岛素的用量。
吸收增强剂SPE-109，对眼睛没有刺激性，当0.25％，0.5％ 和1％胰岛素溶液中加入0.5％SPE-109，滴眼后60分钟，血胰 岛素浓度达峰值，分别为245、249和324μU/m(表5)，滴眼后 90分钟，血糖从101、106和134mg％降至65、67和70mg％(表 6)，这些结果表明，SPE-109对于促进胰岛素经眼吸收，降低血 糖的作用与SPE-103相当或略强一些。 表2 对兔经眼给予不含吸收增强剂的胰岛素后的血浆胰岛素浓度 时间 (分钟) 0.5％胰岛素 1％胰岛素 胰岛素(μU/ml) 葡萄糖(mg％) 胰岛素(μU/ml) 葡萄糖(mg％) 0 10 20 30 60 90 120 180 240 300 12.5±1.5a 14.5±1.3 16.3±1.6 26.6±3.3 25.3±3.5 19.8±2.2 15.6±1.3 16.2±1.4 12.1±1.4 10.2±0.8 121.5±6.8 119.5±5.3 125.8±4.2 119.5±5.3 96.6±5.3 101.0±5.0 111.1±6.0 118.7±6.7 115.0±9.0 119.0±5.0 17.5±0.3 21.2±0.8 22.3±1.9 27.2±1.9 27.3±3.4 23.8±1.8 22.2±2.0 21.7±1.3 13.0±1.5 12.1±1.5 112.7±2.1 103.7±3.2 106.7±4.9 105.7±3.5 96.57±4.3 101.3±6.5 104.8±6.5 104.3±6.6 108.2±5.7 112.5±4.7 a.均值±SEM(n＝6) 表3 对兔经眼给予胰岛素和0.5％SPE-103后的血浆胰岛素浓度 时间 (分钟) 血浆胰岛素(μU/ml) 0.25％Ins＋0.5％ SPE-103 (n＝8) 0.5％Ins＋0.5％ SPE-103 (n＝8) 1％Ins＋0.5％ SPE-103 (n＝7) 0 10 20 30 60 90 120 180 240 300 10.1±1.3a 91.0±5.8 156.7±13.6 168.5±8.0 119.2±8.9 68.5±4.7 39.9±4.2 26.8±3.5 14.8±2.1 11.5±1.5 19.3±1.2 105.7±7.3 193.7±9.6 239.4±6.3 191.9±9.2 112.1±6.3 70.7±6.0 43.0±4.0 24.2±1.3 18.1±1.3 16.0±2.0 123±25.7 230.4±25.0 269.8±23.9 222.6±28.9 152.8±16.9 106.0±14.0 63.9±8.1 48.7±7.1 29.3±4.8 a.均值±SEM 表4 对兔经眼给予胰岛素和0.5％SPE-103后的血浆胰岛素浓度 时间 (分钟) 葡萄糖(mg％) 0.25％Ins＋0.5％ SPE-103 0.5％Ins＋0.5％ SPE-103 1％Ins＋0.5％ SPE-103 0 10 20 30 60 90 120 180 240 300 112.5±4.4a 110.0±2.8 100.0±4.3 86.8±5.1 71.3±2.5 57.0±1.9 70.3±2.3 80.3±3.1 92.0±4.5 104.3±5.2 115.3±2.5 106.5±3.5 100.5±4.1 89.4±3.2 72.0±2.5 75.0±2.7 82.9±3.7 81.5±4.9 85.9±4.2 95.9±4.3 123.3±2.7 114.1±2.2 100.9±3.9 85.1±4.4 60.8±9.0 63.9±3.5 76.8±3.6 82.3±3.0 90.9±4.0 97.3±4.8 a.均值±SEM(n＝8) 表5 对兔经眼给予胰岛素和0.5％SPE-109后的血浆胰岛素浓度 时间 (分钟) 血浆胰岛素(μU/ml) 0.25％Ins＋0.5％ SPE-109 0.5％Ins＋0.5％ SPE-109 1％Ins＋0.5％ SPE-109 0 10 20 30 60 90 120 180 240 300 9.7±1.2a 38.7±7.5 143.8±17.1 212.3±20.0 245.4±21.6 219.8±17.8 170.5±31.0 68.7±15.1 34.7±6.5 15.4±2.9 16.4±1.9 31.0±5.8 74.9±9.9 147.0±12.3 249.3±14.7 246.0±9.4 219.2±10.2 123.4±6.3 85.1±8.1 53.5±6.4 19.3±1.9 37.9±5.9 168.5±19.3 251.8±23.1 323.6±17.9 320.6±16.3 307.5±23.4 263.9±26.8 201.0±32.5 147.9±23.8 a.均值±SEM(n＝7) 注：在各表和附图中，Ins代表胰岛素。 表6 对兔经眼给予胰岛素和0.5％SPE-109后的血液中的葡萄糖浓度 时间 (分钟) 葡萄糖(mg％) 0.25％Ins＋0.5％ SPE-109 (n＝8) 0.5％Ins＋0.5％ SPE-109 (n＝7) 1％Ins＋0.5％ SPE-109 (n＝7) 0 10 20 30 60 90 120 180 240 300 101.0±1.7a 99.7±1.7 94.0±1.8 83.6±1.9 62.5±2.1 64.9±2.5 66.1±3.1 70.5±2.5 77.8±2.0 85.8±2.1 115.7±4.7 114.6±5.1 108.7±6.1 96.3±4.1 66.6±3.5 67.7±2.9 69.4±3.6 71.8±5.2 71.6±4.9 77.0±3.7 139.9±4.8 131.7±5.8 124.7±6.6 114.3±4.9 79.1±4.6 39.9±3.2 69.9±2.0 74.1±2.5 88.4±6.0 91.4±5.4 a.均值±SEM. 表7 在12小时实验结束时，残留在各种眼组织中的胰岛素的量 胰岛素残留在各组织中的残留量(ng/组织) 组织 0.125％胰岛素(n＝4) 1％胰岛素(n＝6) 6％胰岛素(n＝6) 量 滴入的百分数(％) 量 滴入的百分数(％) 量 滴入的百分数(％) 角膜 虹膜 睫状体 晶状体 视网膜 脉络膜 合计 6.34±1.56 0.74±0.27 0.82±0.25 2.95±0.95 2.18±0.63 3.40±1.11 0.0171±0.0050 0.0024±0.0009 0.0026±0.0008 0.0094±0.0030 0.0070±0.0020 0.0109±0.0036 24.68±4.72 3.59±1.11 3.98±2.94 11.12±4.84 8.52±4.54 19.09±16.05 0.0099±0.0019 0.0014±0.0004 0.0016±0.0012 0.0045±0.0019 0.0034±0.0018 0.0076±0.0060 130.94±24.0 18.88±3.23 24.13±4.45 36.80±5.66 48.76±9.99 94.39±26.03 0.0105±0.0019 0.0015±0.0003 0.0019±0.0004 0.0029±0.0005 0.0039±0.0008 0.0076±0.0021 15.43ng 0.0494％ 70.98ng 0.0284％ 353.89ng 0.0283％
将不含吸收增强剂的1％和5％胰岛素溶液，滴入糖尿病兔 子的眼睛，其血糖值没有明显改变(图1)，但0.25％胰岛素溶液 加0.5％SPE-103或SPE-109滴眼后，血糖可明显降低(图1)， 1％胰岛素加0.5％SPE-103或SPE-109，血糖从331mg％和 324mg％降至153mg％和157mg％(图2)，这些结果显然可以说 明，0.25％、0.5％和1％的胰岛素加0.5％SPE-103或 SPE-109滴眼，不但可以降低正常兔子的血糖，同样也可使糖尿 病兔子的血糖降低。
表7列举了12小时实验结束时，各种眼组织中胰岛素的量。 从表7可以看出，胰岛素滴入眼睛的量仅为给药总量的0.028～ 0.049％左右而已。
这项研究证明，眼鼻泪管系统对于胰岛素吸收，进入全身循 环是可行的，经这一途径投用胰岛素，可以降低正常兔子和由四 氧嘧啶引起的糖尿病兔子的血糖，增加吸收增强剂SPE-103或 SPE-109可以明显改善经眼投用胰岛素的全身性吸收，采用 0.5％SPE-103或SPE-109，可使血中胰岛素浓度比没有吸收 增强剂组的血胰岛素浓度增加7倍以上，并且血糖浓度降低明显 且可持续较长时间。
多肽药物长期经眼给药之全身性吸收和安全性研究：
A.材料和方法：
材料：猪胰岛素、牛血清白蛋白(BSA，fraction A.RIA grade)、胰岛素放射免疫性试剂盒(RIA Kit)购自Pharmacia Diagnostic(Uppsalh，Sweden)。
实验动物：新西兰白兔，雌性，体重2.0～3.0kg，每天双眼分 别滴入50μl)0.25％胰岛素加0.5％SPE-103或SPE-109溶 液，每天于09：00和16：00点钟滴眼持续3个月，每周二上午取 血用糖试纸和Glucoscan 2000 Meter(Lifescan，Mountain View， CA)测定血糖3个月。实验结束时，动物用40mg/kg氯胺酮和 5mg/kg赛拉嗪肌肉注射麻醉，以后用半量每小时注射一次以维 持麻醉，用股动脉插管(PE-90)采集血样，并用肝素(50μl/ml) 抗凝，兔子左眼滴入50μl胰岛素溶液，分别于0、10、20、30、60、 90、120分钟以后每隔1小时，取血1ml，取至5小时，血样经离 心，取血浆冻存用于放射免疫性测定，血胰岛素用RIA方法测定。
胰岛素的RIA：测定方法同前述的胰岛素经眼给药全身性吸 收实验中的测定方法。
胰岛素滴眼液的安全性：用萤光素染料和生物裂隙灯来检查 眼睛的局部刺激性、充血、结膜炎、角膜损伤、球结膜水肿和虹膜 炎等，这些症状可能会由于长期使用胰岛素滴眼液引起，根据 Draize试验方法，评价眼睛的刺激性。
B.结果
兔眼每天两次，滴入50μl 0.25％胰岛素加0.5％SPE-103 一周时，滴药后90分钟血糖从104mg％降至74mg％(表8)。三个 月中每次的测定结果相似，这说明长期经眼投用胰岛素溶液没产 生耐受性，每周用萤光素染料和生物裂隙灯检查-次，没发现有 眼刺激反应，无角膜损伤、充血、结膜炎或虹膜炎。这说明长期使 用胰岛素滴眼液是安全的。三个月实验结果时，测定血糖和血胰 岛素结果与首次滴眼时相似，血胰岛素于滴眼后20分钟达峰值 (图3)，滴眼后90分钟血糖值最低(图3)。
用0.25％胰岛素加0.5％SPE-109进行实验，其结果与 SPE-103相似(表8)。三个月实验结束时的测定，结果与首次滴 眼时胰岛素进入全身性循环的效果相近，，滴眼后30分钟血胰岛 素达峰值(图4)，血糖浓度也明显降低，滴药后30～120分钟血糖 浓度最低(图4)。 表8 为期3个月的长期滴入0.25％胰岛素加0.5％SPE-103 或0.5％SPE-109对血葡萄糖含量的影响 时间 (周) 血葡萄糖(mg％) 0.25％胰岛素加 0.5％ SPE-103 0.25％胰岛素加 0.5％ SPE-109 0分钟时 的对照值 给药后90分钟 的糖值 0分钟时 的对照值 给药后90分钟 的糖值 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 104±6a 97±7 118±5 119±3 117±3 122±2 115±3 118±4 113±4 118±3 115±2 112±3 117±4 74±5b 69±4b 80±4b 88±4b 70±13b 88±5b 79±7b 83±4b 84±2b 91±5b 65±6b 66±4b 72±7b 118±2 119±3 135±2 111±3 115±4 117±5 111±3 110±3 111±2 115±2 114±1 113±3 - 80±9b 73±3b 89±7b 70±5b 76±5b 71±9b 68±9b 59±10b 56±7b 77±10b 69±9b 77±5b - a.均值±SEM，对兔使用SPE-103，a＝5；以及对兔使用SPE-109，n＝6 b.明显低于对照值P＜0.05.
这些研究表明，长期使用胰岛素滴眼，以控制糖尿病人的血 糖是可行的，因为它并不产生耐受性和局部副作用。
各种吸收增强剂对多肽药物经眼全身性吸收的增强作用：
为了试验各种吸收增强剂增加多肽药物吸收的作用，特进行 以下实验。
A.材料：胰岛素、甘胆酸钠、溴化十烷双铵、吐温20、皂草苷、 EDTA、和梭链孢酸钠购自Sigma(St.Louis，Mo)125I胰岛素 (Spec.Act.94μCi/kg)购自DuPont NEN Research Products (Wilmington，DE)，所有上述试剂与放射性胰岛素均用磷酸缓冲 液配制，pH调至7.4。
B.方法：新西兰白兔、雌性、体重2.0～3.0kg，采用30mg/kg 的苯巴比妥钠耳静脉麻醉，以1 mg/kg/hr的苯巴比妥维持麻醉， 由股动脉插入PE-90管取血，用肝素(50μ/ml)抗凝，25μl放 射性胰岛素溶液(0.625μCi/25μl)，滴入兔子左眼，于滴药后 0、5、10、20、30、60、90、120、150、180分钟以后每隔1小时，一直持 续6小时，每次取血1ml，血样的放射性用γ-计数器(Packard Auto Gamma 500，Packard Instrument Company，Downers Grove，IL)以测定血胰岛素浓度，血糖则以糖试纸和Glucoscan 2000 Meter(Lifescan INC.Mountain View，CA)测定，实验结束 时用过量的苯巴比妥钠麻醉致死兔子，血中胰岛素用ng/ml表 示。
C.结果：所有实验数据均进行t-检验，测定值用均值±标 准误差表示，当p＜0.05时认为有显著性差异。
用1％胰岛素滴眼时，血胰岛素浓度仅为6.5ng/ml(图5)
甘胆酸盐(Glycocholate)是一种阴离子型表面活性剂和胆 盐，1％的甘胆酸盐可使胰岛素吸收增加2倍，血糖从108mg％明 显降至94mg％(表9)。
溴化十烷双铵(Decamethonium)是一种阳离子型表面活性 剂，它不能改善胰岛素的吸收，也不能使血糖下降(表9)。
SPE-103是一种非离子型表面活性剂，1％SPE-103可使 胰岛素吸收至少增加3倍，血糖明显下降，从97mg％降至 56mg％(表9)。
吐温20的情形与溴化十烷双铵相似，只能使胰岛素吸收有 轻微的增加，使血糖略有降低(表9)。
EDTA是一种螯合剂，它能松开细胞之间的紧密结合， 1％EDTA使胰岛素吸收增加3倍，血糖从94mg％降至 64mg％(表9)。
1％梭链孢酸钠(fusidic acid)能明显增加胰岛素的吸收(约4 倍)，使血糖明显降低，从90mg％降至51mg％(表9)。
在这些试剂中，1％皂草苷是最有效的，它能使胰岛素吸收增 加10倍，血糖从102mg％降至41mg％(表9，图6)。
对各种浓度的皂草苷进行了实验，以研究它对血糖和增加胰 岛素吸收的量-效关系，当皂草苷浓度大于1％时，并不能明显的 进一步增加胰岛素的吸收和降低血糖(图5)，但将皂草苷浓度从 1％降至0.5％，则会降低它促进胰岛素吸收和降低血糖的作用 (图7)，1％胰岛素加1％或2％皂素，其血糖浓度下降的幅度相 当，从95mg％降至40mg％(图6，9)，单独1％胰岛素滴眼，血胰岛 表9 吸收增强剂对胰岛素吸收以及对血葡萄糖浓度的影响 吸收增强剂 (1％溶液) 胰岛素峰 值浓度 (ng/ml) 血葡萄糖浓度 (mg％) 血葡萄糖浓度 变化的百分数 (％) 给药前 给药后 对照 皂草苷 梭链孢酸 SPE-103 EDTA 甘胆酸盐 十烷双胺 吐温20 6.5±0.8 63.0±6.3 26.5±4.5 20.0±1.8 22.5±5.7 13.3±1.4 10.8±1.3 8.8±0.9 93±2 102±4 90±3 97±2 94±3 108±7 90±3 90±3 94±3 41±2 51±2 56±3 64±5 94±4 83±2 77±9 无变化 60 43 42 32 13 8 14
滴眼液中含有1％胰岛素和1％吸收增强剂 表10 吸收增强剂对胰岛素渗入眼球内的影响 1％胰岛素 加增强剂 眼球吸收胰岛素 的百分数(％) 眼球中胰岛素 的绝对量 1％ 皂草苷 0.5％ 皂草苷 1％ 梭链孢酸 1％ SPE-103 1％ EDTA 1％ 甘胆酸盐 1％ C10 1％ 吐温20 对照(仅用1％胰岛素) 1.9186 0.6733 0.4767 1.5221 0.1684 0.0804 0.0683 0.0771 0.0744 4796ng 1683ng 1191ng 1305ng 420ng 200ng 170ng 192ng 185ng 素浓度仅为6.5ng/ml，不能达到降低血糖的有效浓度(20ng/ml) (图8)，不用吸收增强剂时，胰岛素浓度至少要5％才能降低血 糖，从表9可见，吸收增强剂不仅可以增加胰岛素吸收进入全身 循环，而且还可以促进胰岛素进入眼球，全身胰岛素的浓度与眼 球中胰岛素的量具有良好的相关关系(表9，10)。
所以吸收增强剂对于增加胰岛素的全身性吸收是十分有用 的，虽然上述研究仅进行了胰岛素试验，但这些吸收增强剂对其 他肽类药物也同样有效，特别是对大分子的多肽。
吸收增强剂之混合使用以减少副作用：
虽然某种吸收增强剂在高浓度时会有局部刺激的副作用，但 在低浓度时其刺激性就会消失，因此混合使用两种以上的低浓度 吸收增强剂一则可以消失副作用，二则可以增加胰岛素之全身性 吸收而获得良好的效果，例如SPE-103和SPE-109可分别在 0.5％浓度产生良好的增强胰岛素吸收作用，但把0.25％的 SPE-103及SPE-109混合使用时，其增加胰岛素的全身性吸收 作用相同而局部刺激的副作用产生之可能性即可减少一半。
A.方法，将16只新西兰白兔(体重2.5-3.0kg)用35mg/kg 氯胺酮及5mg/kg赛拉嗪肌注麻醉。之后每小时再补给半量之麻 醉剂以保持麻酸状态，股动脉用PE-90管子插入以取血之用，在 滴入胰岛素滴眼剂后0、10、20、30、60、90、120、180、240及300分 钟抽取血样，血糖用Glucoscan 2000 Meter(Lifescan，Mountain View，CA)测量，胰岛素用量为0.01％、0.05％、和0.25％加以 0.25％之SPE-103和0.25％之SPE-109。胰岛素、SPE-103及 SPE-109皆购自Sigma公司(St.Louis，Mo.)。
B.结果：血糖可因氯胺酮/赛拉嗪之麻醉而稍稍上升(由 121±7mg％上升到172±12mg％，n＝12)。因所有的实验皆用氯 胺酮/赛拉嗪麻醉，所以所有血糖量皆以在0时的血糖量为100％ 计算。
当50μl的胰岛素滴眼剂含有0.01％的胰岛素及0.25％之 SPE-103和0.25％SPE-109混合剂滴入兔眼时，0.01％的胰岛 素对血糖并不产生有效的下降，但0.05％及0.25％的胰岛素加以 0.25％SPE-103和0.25％SPE-109时能使血糖显著地下降(表 11)，其血糖下降的程度和SPE-103及SPE-109分别单独使用 在0.5％时之增加胰岛素降血糖作用差不多或有过之(表11及表 4，6)，由此实验可以看出，单独一种吸收增强剂如 0.5％SPE-103或0.5％SPE-109可增强胰岛素(0.25％)之降 血糖作用，不过使用各半量(0.25％)之SPE-103及SPE-109 吸收增强剂亦能同样地增加胰岛素(0.25％)之降血糖作用。重要 的是吸收增强剂用量减半后它们所可能产生的副作用便大为减 少，因而使用安全度大为提高。
表11：对兔经眼给予胰岛素和0.25％SPE-103
以及0.25％SPE-109后血液中葡萄糖的浓度 血葡萄糖(mg％) 时间 (分钟) 0.25％SPE-103 ＋ 0.25％SPE-109 0.01％胰岛素 0.25％SPE-103 0.25％SPE-109 0.05％胰岛素 ＋0.25％SPE-103 ＋0.25％SPE-109 0.25％胰岛素 ＋0.25％SPE-103 ＋0.25％SPE-109 0 10 20 30 60 90 120 180 240 300 100 96±5a 103±4 113±4 96±8 96±9 86±6 80±2 71±4 74±3 100 106±9 104±8 105±10 86±6 84±5 85±7 73±6 63±7 65±8 100 86±8 71±9 70±4 54±4 57±6 60±8 67±9 63±9 67±7 100 107±13 71±10 55±6 29±4 29±3 25±2 25±2 28±5 29±4 a，均值±SEM
吸收增强剂促进蛋内啡肽和亮内啡肽经眼给药的全身性吸收
A.材料和方法
材料：蛋内啡肽(Met-Enk)、亮内啡肽(Leu-Enk)、聚氧乙 烯9-月桂基醚(SPE-109)和聚氧乙烯20-硬脂基醚 (SPE-103)皆购自Sigma化学公司(St.Louis，MO)，滴眼液用无 菌磷酸盐缓冲液配制(pH7.4)。
动物实验：采用体重为2.0～3.0kg的新西兰白兔。用苯巴比 妥钠(30 mg/kg)经耳缘静脉给药使兔麻醉，实验过程中用另外的 苯巴比妥钠(1mg/kg/hr)维持麻醉。股动脉插入聚乙烯管，用于采 集血样，并用生理盐水替换血液体积。将50μl Met-Enk或 Leu-Enk滴眼液滴入左眼，或者经耳缘静脉给药。给药后于0、5、 10、20、30、60、120和180分钟，用塑料注射器从股动脉取血3ml， 并迅速转移至含有EDTA(1.5mg/ml全血)的玻璃试管中。尽可 能快地分离血浆并保存于-70℃直至进行放射性免疫实验 (RIA)。采血结束后，用过量苯巴比妥钠将兔麻醉致死。
从血浆中萃取Met-Enk和Leu-Enk：通过在预先装填的 ODS-硅胶柱(Incstar Corporation，catalog number 20096)进行 吸附法，从血浆中萃取Met-Enk和Leu-Enk。将血浆样品解 冻，取2ml，加入0.2ml 1NHCl调节pH至3～4。用5ml甲醇和 10ml蒸馏水流经所述柱，进行预洗。然后用塑料注射器取1ml血 浆并慢慢(2～3分钟)推入所述硅胶柱，然后用2ml 4％乙酸冲 洗。用4ml甲醇将Met-Enk或Leu-Enk从柱中洗脱出，收集在 经硅化处理的玻璃试管中。在氮气氛下在37℃水浴中彻底蒸发甲 醇洗脱液，并于放射性免疫实验的当天用1ml实验用缓冲液重新 配制。
放射性免疫实验：从Incstar Corporation(Stillwater， Minnesota)购得放射性免疫试剂盒。向10×75mm玻璃试管中加 入200μl未知的Met-Enk或Met-Enk标准品，然后加入 100μl抗体和125I-Met-Enk。在4℃培养16-24小时后，通过向 每一试管中加入100μl兔γ-球蛋白和500μl饱和硫酸铵，将 结合的Met-Enk与游离的多肽分离。将试管剧烈振摇，置于室 温维持25分钟，然后于760xg下离心20分钟。用自动γ-计数 器(Hewlett-Packard)测定每一试管中沉淀物的放射活性。用标 准曲线计算每一样品中Met-Enk的浓度。Leu-Enk的放射性 免疫实验方法与Met-Enk之方法类似。向10×75mm玻璃试管 中加入200μl样品或Leu-Enk标准品，然后加入100μl抗体 (购自Amersham Co.，Arlington Heights，IL)和碘标记的 Leu-Enk(约3500cpm)(购自Dupont Co.，Wilmington，DE)。在 24℃下培养24小时后，向每一试管中加入100μl 0.82％兔γ- 免疫球蛋白，然后加入0.5ml 25％PEG-8000溶液。将试管剧烈 振摇，并置于室温维持25分钟。将试管在760xg下离心30分钟， 所得丸状物用自动γ-计数器测定其放射活性。
B.结果
当用50μl 1％Met-Enk局部滴入兔的一只眼内时，血液中 Met-Enk浓度在10分钟内由92pg/ml升至峰值为153pg/ml， 然后在3小时内逐渐降低至95pg/ml。以同样剂量将Met-Enk 静脉内给药，在约5分钟(T1/2)时血液Met-Enk浓度迅速下降， 并在30分钟内很快回复至原始水平(图10)。当向0.3％和 1％Met-Enk眼用溶液中加入吸收增强剂SPE-109(0.5％)，在 滴药后5～10分钟，血液中Met-Enk浓度明显地增高，分别升高 至204和503 pg/ml(图10和11)。当向0.3％和1％Met-Enk溶 液中加入另一种吸收增强剂SPE-103(0.5％)，在滴药后10～20 分钟，血液中Met-Enk浓度分别达到峰值为297和524pg/ml (图10和11)。这些结果表明，SPE-109和SPE-103均能促进 Met-Enk经眼吸收，并且表明，用SPE-103时，到达血液Met- Enk浓度峰值的时间比用SPE-109稍慢(图10和11)，而且还 发现，用加有吸收增强剂的1％Met-Enk眼用溶液进行所述局 部给药，与相同剂量的Met-Enk单独静脉内注射给药比较，能 够维持更长时间的血药浓度。
如图12和13所示，Leu-Enk可得到类似的结果。当用 1％Leu-Enk滴眼液单独局部滴入兔的一只眼内时，在60分钟 内血液Leu-Enk浓度从53pg/ml升至峰值为155pg/ml并在3 小时内逐渐降低，回复到52pg/ml(图12)。静脉内注射相同剂量 的Leu-Enk，在约3分钟(T1/2)内血液Leu-Enk浓度迅速降 低(图12)。当向0.3％Leu-Enk滴眼液中加入0.5％SPE-109 和SPE-103，血液Leu-Enk浓度分别从111pg/ml升至548pg/ ml(5分钟，4.9倍)和489pg/ml(20分钟，4.4倍)(图13)。当更高 浓度(1％)的Leu-Enk滴眼液与0.5％SPE-109和SPE-103 混合时，血液Leu-Enk浓度分别从155pg/ml升至1557pg/ml(5 分钟，10.1倍)和1293pg/ml(30分钟，8.3倍)(图12)。与静脉内 注射比较，加有吸收增强剂的Leu-Enk滴眼液滴眼给药，能更大 幅度地升高血液Leu-Enk浓度(图12)。
吸收增强剂促进降钙素经眼给药的全身性吸收
A.材料和方法
材料：纯的人降钙素购自Bachem Inc.(Torrance，CA)，聚氧 乙烯9-月桂基醚(SPE-109)和聚氧乙烯20-硬脂基醚 (SPE-103)购自Sigma化学公司(St.Louis，MO)，降钙素放射性 免疫实验试剂盒(RIA Kit)购自Nichols Institute Diagnostics(San Juna Capistrano，CA)。
将降钙素(1mg)溶解在无氧蒸馏水中，然后在使用前用无氧 缓冲液(pH6.8)稀释至合适浓度。
血液样品：实验中采用新西兰白兔，两性均可，体重为2.5～ 3kg，用30mg/kg苯巴比妥钠经耳缘静脉注射使兔麻醉。实验过 程中用另外的苯巴比安钠(1mg/kg/hr)维持麻醉。股动脉插入聚 乙烯管(PE-90)，用于采集血样，并用生理盐水替换血液体积。通 过静脉内注射降钙素或者通过经眼滴入其中含有或不含吸收增 强剂的滴眼液，对兔给予降钙素，所用剂量如附图简述中和附图 中所述。在给予降钙素后，于0、15、30、60、90、120分钟且每隔1 小时取血2.5ml，直至5小时止，血样收集在经硼硅酸盐处理的冰 冷玻璃试管中。将样品于4℃保持1～4小时，然后于0℃和 1500xg下离心30分钟。立即冷冻上清液直至进行实验。采血结束 后，用过量苯巴比妥钠将兔麻醉处死。
放射性免疫实验：在4℃时进行放射性免疫实验。用实验用缓 冲液配制含有80.0～4.0pg/ml人降钙素标准品的系列稀释液， 在进行降钙素实验前立即将上述冷冻的血清解冻。将含有300μl 血清样品、标准品或者对照物的全部试管与降钙素抗体混合，然 后在4℃下培养约44小时。用放射性免疫试剂盒中的Zero标准 试剂稀释其值大于80pg/ml的血清样品。培养结束时，向所有试 管中加入100μl 125I-降钙素并在4℃培养22小时。此后，加入1ml 抗羊沉积物。将所有试管置于室温保持20分钟，然后于4℃和 1500xg下离心15分钟。用γ-计数器(Packard Auto-Gamma 500，Chicago，IL)测量放射活性。由标准曲线计算样品的结果值， 以pg/ml血清表示。每一数值表示为均值±均值标准误差。
B.结果：
当用治疗剂量(25μl，0.05％)降钙素滴入眼时，在给药后30 分钟时达到峰值浓度，其血流中降钙素浓度仅达30pg/ml(图 14)，远远低于通过静脉内注射相同剂量药物在相同时间点上所 达到的降钙素浓度(2272pg/ml)(图15)。血液降钙素浓度在约20 分钟(T1/2)内迅速下降。虽然将降钙素滴眼液浓度增高至0.1％ 和0.5％时，血液中降钙素峰值浓度可分别升高至99和279pg/ ml(图14)但它们仍远远低于通过静脉内注射所达到的血液降钙 素浓度。
然后在降钙素滴眼液中加入吸收增强剂例如SPE-109和 SPE-103，用以改善降钙素进入全身性循环的吸收作用。对于 0.05％和0.15％降钙素滴眼液，0.5％SPE-109可显著地升高 血液降钙素浓度，使峰值分别升高为491pg/ml和1656pg/ml(图 15和16)。然而，这些峰值仍低于通过静脉内注射所能达到的血 药浓度。如图17所示，SPE-109(0.5％)显著地增强降钙素 (0.5％滴眼液)的吸收作用(20倍)，15分钟时血液中峰值为 5680pg/ml。该血液降钙素浓度与通过静脉内注射在该时间期间 所获得的血药浓度约为相当，并且血液降钙素浓度明显高于通过 静脉内注射在30分钟和之后所获得的血药浓度。
加入SPE-103(0.5％)有更强的增强作用，采用0.5％降钙 素滴眼液，血液降钙素浓度在45分钟时峰值为6816pg/ml(增加 24倍)，远远高于通过静脉内注射在30分钟和之后所获得的血药 浓度(图17)。采用0.15％降钙素滴眼液，血药浓度在30分钟时 峰值为1228pg/ml，所得血液降钙素浓度高于通过静脉内注射在 60分钟和之后所获得的血药浓度(图16)。采用0.05％降钙素滴 眼液，加入0.5％SPE-103不能使得血液降钙素浓度高于通过静 脉内注射所获得的血药浓度(图15)。
上述结果表明，通过加入吸收增强剂例如SPE-109和 SPE-103，可以在血流中获得治疗浓度的降钙素。
吸收增强剂对LHRH、蛙皮素、ANP、ACTH经眼全身性吸收的 促进作用
A.材料和方法
材料：促黄体激素释放激素(LHRH)、蛙皮素、心钠素 (ANP)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、牛血清白蛋白(BSA， fraction V，RIA级)、聚氧乙烯9-月桂基醚(SPE-109)、聚氧乙 烯20-硬脂基醚(SPE-103)、抑肽酶(Trasylol)和Triton X-100皆购自Sigma化学公司(St.Louis，MO)，葡聚糖T-70 (Pharmacia，Sweden)、活性炭(C-190N，Nuchar，Matheson Coleman&Bell，East Rutherford，NJ)、和标准羊血清(North American Biologicals，Miami，FL)皆为市售。用于蛙皮素和ANP 的放射性免疫实验(RIA)试剂盒购自Incstar Co.(Stillwater， MN)。用于LHRH测定的抗体和125I-LHRH皆购自Amersham Co.(Arlington Heights，IL)。用于ACTH实验的RIA试剂盒购 自Nichols Institute Diagnostics(San Juan Capistrano，CA)。
动物实验：采用新西兰白兔，体重2.5～3.0kg，用氯胺酮 (40mg/kg)和赛拉嗪(5mg/kg)经肌肉注射使其麻醉。以后每小时 用半剂量注射一次以维持麻醉。股动脉插入聚乙烯管(PE-90)用 于采集血样。多肽滴眼给药后0、5、10、20、30、60、120和180分钟 时，取血3ml，收集在预先冷却的试管中，所述试管中含有EDTA (1.44mg/ml血液)和抑肽酶(一种肽酶抑制剂，500KIU/ml血 液)。将样品混合并立即在4℃和1500xg下离心10分钟。血浆立 即贮存于-20℃冷冻箱中，直至用于放射性免疫实验。
LHRH的放射性免疫实验(RIA)：用0.05M磷酸盐缓冲液 (pH7.2)和0.1％牛血清白蛋白和0.1％Triton-X 100配制 RIA缓冲液。向从Amersham Co.购得的冷冻干燥粉末的小瓶中 加入2ml RIA缓冲液以配制兔抗体溶液(可用于250次实验)，并 于-70℃低温冷冻箱中贮存。使用时，用RIA缓冲液将贮液进一 步稀释15倍。用RIA缓冲液将125I-LHRH稀释至最终浓度为约 6500dpm/100μl，作为示踪物。制作3.9pg～1000pg/ml范围内 的标准曲线。在使用前，于4℃在100ml缓冲液中将0.5g炭和 0.25g葡聚糖的混合物搅拌至少20分钟，配制炭悬浮液。
在12×75mm经硅化处理的玻璃试管中加入100μl抗体， 通过向其中加入200μl样品和标准品，进行LHRH的放射性免 疫实验。将混合物缓慢振摇，在4℃下培养24小时。然后，向每一 试管中加入100μl 125I-LHRH，并将混合物进一步在4℃培养 另外24小时。通过加入200μl羊血清和500μl炭悬浮液，振摇 并室温放置20分钟，将结合的和游离的125I-LHRH分离。在4℃ 和2000xg下离心15分钟，用自动γ-计数器测定沉积物的放 射活性。由标准曲线计算每一样品中的LHRH浓度。
蛙皮素的放射性免疫实验：采用购自Incstar Co.的RIA试 剂盒测定血浆中蛙皮素浓度。向200μl样品或标准品中，加入 100μl蛙皮素的兔抗血清和100μl 125I-蛙皮素。于4℃培养24 小时，加入0.2ml标准羊血清和0.5ml炭-葡聚糖混合物(0.5％ 炭和0.5％葡聚糖T-70，在0.01M磷酸盐缓冲液中，pH7.4)， 用于分离游离的示踪物和结合的示踪物。振摇待测试管并置于室 温保持30分钟。然后在4℃和1500xg下将混合物离心15分钟。 弃掉上清液，用自动γ-计数器测定炭丸的放射活性。
ANP的放射性免疫实验：将ODS-硅胶柱预先分别用5ml 乙酸/86％乙醇、5ml甲醇、5ml蒸馏水和5ml 4％乙酸活化，然后 将1ml血浆小心地与3ml 4％乙酸混合，并上样至所述活化的 ODS-硅胶柱上，随后用6ml蒸馏水洗涤。吸附在柱子上的ANP 用3ml 4％乙酸/86％乙醇洗脱。将洗脱液置于37℃水浴保持1 小时，在压缩空气气流下蒸发溶剂。1小时后，加入1ml 95％乙 醇，并继续蒸发至干。将残余的干燥样品溶解在1ml RIA缓冲液 中，用于放射性免疫实验。
采用购自Incstar Co.的RIA试剂盒，在非平衡系统中测定 血浆中A NP浓度。在12×75mm可任意处理的聚乙烯试管中，向 100μl萃取物或A NP标准品中加入200μl ANP抗体。在4℃ 下培养24小时后，加入200μl 125I-ANP，并在4℃下再培养另 外24小时。通过加入0.5ml马抗羊沉淀复合物，将游离的示踪物 与抗体结合的示踪物分离。缓慢振摇试管，并置于室温保持25分 钟，然后在1500xg下离心25分钟。弃掉上清液，用自动γ-计数 器测定丸状物放射活性。
ACTH的放射性免疫实验：就在ACTH的放射性免疫实验 之前，将血浆解冻并离心除去任何纤维凝块，它们可能会干扰实 验体系。采用购自Nichlos Institute Diagnostics的RIA试剂盒进 行ACTH的放射性免疫实验。将200μl血浆或标准品与125I -ACTH、生物素偶合的抗体和抗生物素蛋白包衣的塑料头一起 在室温培养20小时。培养结束后，用洗液将所述塑料头洗涤两 次，用自动γ-计数器测定每一试管的放射活性。由标准曲线计 算血浆中ACTH的浓度。
统计学分析：所有数据均进行Student t-检测并表示为均 值±SD。当p＜0.05时处理组数值被认为与对照组数值有显著性 差异。
B.结果
当用LHRH滴眼液滴眼时，在给药后10～20分钟达到全身 性血液LHRH峰值浓度(表12)，当向滴眼液中加入 0.5％SPE-109时，全身性循环中LHRH峰值出现更快，在给药 后5分钟达到LHRH峰值。采用0.5％SPE-103，全身性循环中 LHRH峰值比不加吸收增强剂的LHRH之峰值出现晚10分钟 (表12)。有兴趣的是注意到，在较低剂量的LHRH(10μg)的情 况下，SPE-109和SPE-103分别增强LHRH吸收作用达17.0 倍和13.9倍，而在较高剂量的LHRH(20μg)的情况下， SPE-109和SPE-103分别进一步增强LHRH吸收作用达20.8 倍和21.5倍(表12)。
采用15μg蛙皮素滴眼液，得到相类结果(表13)。 0.5％SPE-109和0.5％SPE-103增强蛙皮素滴眼液吸收作用 之效果稍差，分别增强8.3倍和6.5倍，并分别在滴药后5分钟和 60分钟时达到血药峰值浓度。
虽然ANP的分子量是LHRH分子量的约3倍并且是蛙皮 素分子量的约2倍，但0.5％SPE-109和0.5％SPE-103分别增 强ANP全身性吸收作用高达7.8倍和9.0倍，并分别在滴药后 10分钟和30分钟达到血药峰值浓度(表14)。吸收增强剂在ANP 中的效率比在LHRH稍差，但与在蛙皮素中相当。
在这四种多肽中，所研究的最大分子量的多肽药物是 ACTH，其分子量是LHRH的约4倍，蛙皮素的3倍，ANP的1.5 倍。0.5％SPE-109和0.5％SPE-103分别增强ACTH经眼全身 性吸收作用高达6.1倍和7.7倍，与蛙皮素和ANP所得结果非 常类似。采用所述两种吸收增强剂，在给药后20分钟达到血药峰 值浓度(表15)。
表12.LHRH经眼全身性吸收及其由SPE-109和SPE-103的增强作用 时间 (分钟) 血浆中LHRH的浓度(pg/ml) 10μg LHRH 滴眼液 (N＝5) 10μg LHRH ＋0.5％SPE-109 滴眼液 (N＝5) 10μg LHRH 20μg LHRH ＋0.5％SPE-103 滴眼液 滴眼液 (N＝5) (N＝5) 20μg LHRH ＋0.5％SPE-109 滴眼液 (N＝4) 20μl LHRH ＋0.5％SPE-103 滴眼液 (N＝5) 0 5 10 20 30 60 120 180 29±18a 34±17 42±25 39±17 32±16 38±18 34±13 31±10 26±33 714±266 586±239 220±168 96±40 44±45 32±24 29±23 30±4 27±13 39±8 54±60 160±35 62±64 584±289 118+181 543±254 103±96 69±41 45±39 31±3 13±4 37±10 16±18 69±47 2450±1756 1202±702 772±442 364±427 94±26 40±33 74±34 33±33 75±70 181±118 1716±630 2532±829 788±676 120±134 57±59 增强吸收c - 17.0x l3.9x - 20.8x 21.5 x a，均值±SD b，峰值浓度下划线 c，(含有吸收增强剂时的峰值浓度)/ (不含吸收增加剂时的峰值浓度)
表13.蛙皮素经眼全身性吸收及其由SPE-109和SPE-103的增强作用 时间 (分钟) 血浆中蛙皮素的浓度(pg/ml) 15μg蛙皮素 滴眼液 15μg蛙皮素 ＋0.5％SPE-109 滴眼液 15μg蛙皮素 ＋05％SPE-103 滴眼液 0 5 10 20 30 60 120 180 81±23a 84±31b 78±32 65±15 69±18 70±12 62±24 80±21 120±33 699±161 585±104 372±166 243±83 180±94 112±27 113±140 112±54 90±50 145±69 261±131 514±245 548±304 120±39 130±142 增强吸收c - 8.3x 6.5x a，均值±SD，N＝4 b，峰值浓度下划线 c，(含有吸收增强剂时的峰值浓度)/ (不含吸收增加剂时的峰值浓度)
表14.ANP经眼全身性吸收及其由SPE-109和SPE-103的增强作用 时间 (分钟) 血浆中ANP的浓度(pg/ml) 15μg ANP 滴眼液 15μg ANP ＋0.5％SPE-109 滴眼液 15μg ANP ＋0.5％SPE-103 滴眼液 0 5 10 20 30 60 120 180 31±13a 41±25b 31±10 30±7 25±5 26±8 32±8 32±9 42±8 316±146 321±174 152±58 80±20 65±16 72±7 51±15 39±7 54±14 100±44 245±86 368±166 179±82 121±50 84±30 增强吸收c - 7.8x 9.0x a，均值±SD，N＝5 b，峰值浓度下划线 c，(含有吸收增强剂时的峰值浓度)/ (不含吸收增加剂时的峰值浓度)
表15.ACTH经眼全身性吸收及其由SPE-109和SPE-103的增强作用 时间 (分钟) 血浆中ACTH的浓度(pg/ml) 25μg ACTH 滴眼液 25μg ACTH ＋0.5％SPE-109 滴眼液 25μg ACTH ＋0.5％SPE-103 滴眼液 0 5 10 20 30 60 90 120 180 4±4a 3±3 15±7 168±67b 139±27 84±28 58±21 45±33 17±8 8±8 572±123 936±335 1030±342 944±397 686±200 408±150 309±149 132±41 18±16 972±254 1090±313 1300±122 1042±236 914±114 706±151 567±204 221±150 增强吸收c - 6.1x 7.7x a，均值±SD，N＝5 b，峰值浓度下划线 c，(含有吸收增强剂时的峰值浓度)/ (不含吸收增加剂时的峰值浓度)
吸收增强剂促进α-MSH、生长激素释放抑制因子、VIP和 ACTH经眼给药的全身性吸收
A.材料和方法
材料：(α-促黑色细胞激素(α-MSH)、生长激素释放抑制 因子、脉管活化肠多肽(VIP)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、抑肽 酶(Trasylol)、牛血清白蛋白(BSA，fraction V，RIA级)、聚氧乙烯 9-月桂基醚(SPE-109)、聚氧乙烯20-硬脂基醚(SPE-103)、 和Triton X-100皆购自Sigma化学公司(St.Louis，MO)，葡聚 糖T-70(Pharmacia，Sweden)、活性炭(C-190N，Nuchar， Matheson Coleman&Bell，East Rutherford，NJ)、和标准羊血清 (North American Biologicals，Miami，FL)皆为市售。用于 α-MS H、VIP和生长激素释放抑制因子的放射性免疫实验 (RIA)试剂盒皆购自Incstar(Stillwater，MN)，用于ACTH的 RIA试剂盒购自Nichols Institute Diagnostics(San Juan Capistran o，CA)。
动物实验：采用新西兰白兔，体重2.5～3.0kg，用40mg/kg 氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪经肌肉注射使其麻醉，在实验过程中， 为了维持兔麻醉状态，每一小时注射半剂量的氯胺酮和赛拉嗪。 股动脉插入聚乙烯管(PE-90)，用于采集血样。在多肽药物滴眼 后0、5、10、20、30、60、120和180分钟，从股动脉取血3ml，收集 在冷却的试管中，所述试管中含有EDTA作为抗凝剂(1.44mg/ ml)。加入抑肽酶(1000KIU/ml全血)作为多肽酶抑制剂。在 1500xg下离心10分钟，尽可能快地分离血浆，并贮存在-20℃， 直至用于放射性免疫实验。
α-MSH的放射性免疫实验：将1ml解冻的血浆与等体积 的1N HCl混合，然后在1500xg下离心10分钟。将SEP-PAK C-18柱预先用3ml甲醇和6ml蒸馏水活化，然后将上述上清液 上样至该柱。用6ml蒸馏水冲洗柱子并在空气流下干燥。吸附在 柱子上的α-MSH用4ml 90％经酸化处理的甲醇(含16％的 4％乙酸)洗脱。在37℃和空气流下干燥洗脱液并用RIA试剂盒 中的1ml RIA缓冲液重新配制。
采用购自Incstar Co.的试剂盒进行放射性免疫实验。将 50μl萃取物样品或α-MSH标准品与200μl抗血清一起在 4℃下培养，24小时后，加入200μl 125I标记的α-MSH，并在 4℃下再培养另外24小时。通过加入500μl羊抗兔沉淀的复合 物，离心分离游离和结合形式的α-MSH。
生长激素释放抑制因子的放射性免疫实验：搅拌下向1ml解 冻的血浆中加入2ml冷丙酮，振摇并离心。上清液倾至另一试管 中，与4ml石油醚混合，离心，弃掉上层醚层。在空气流下于37℃ 干燥低含水丙酮层。将干燥的残余物用0.5ml BSA-硼酸盐缓冲 液溶解，所述缓冲液由购自Incstar Co.的RIA试剂盒提供。在进 行放射性免疫实验前于37℃加热10分钟，并充分混合。
为了提高灵敏度，实验在非平衡系统中(disequilbrated)进 行。将样品或标准品与兔抗生长激素释放抑制因子抗体一起混合 并于4℃培养24小时。然后加入125I-生长激素释放抑制因子并于 4℃再培养另外24小时。然后加入羊抗兔血清并于室温培养15～ 25分钟。离心分离结合和游离形式的生长激素释放抑制因子并用 自动γ-计数器测定其放射活性。
VIP的放射性免疫实验：由Incstar Corp提供VIP的放射性 免疫实验。简言之，在聚乙烯试管中，将200μl在RIA缓冲液中 的血浆样品或标准品与抗血清一起混合，所述RIA缓冲液含有 0.01M磷酸盐缓冲液和0.9％NaCl、0.005M EDTA和0.1％ BSA，pH7.4。将混合物于4℃培养24小时，随后加入125I-VIP(约 5000dpm)并于4℃再培养另外24小时。用标准羊血清和葡聚糖 包衣的炭(0.5g炭和0.25g葡聚糖T70，在0.01M PBS中)分离 结合和游离形式的经标记的VIP。缓慢振摇试管于室温保持30分 钟，然后于4℃和1500xg下离心15分钟。用自动γ-计数器测定 丸状物的放射活性。
ACTH的放射性免疫实验：就在ACTH的放射性免疫实验 之前，将血浆解冻并离心除去任何纤维凝块，它们可能会干燥实 验体系。采用购自Nichols Institute Diagnostics的RIA试剂盒进 行ACTH的放射性免疫实验。将100μl血浆或标准器 于室温与125I-ACTH、生物素偶合的抗体和抗生物素蛋白包衣的 塑料头一起培养20小时。培养结束后，用洗液将所述塑料头洗涤 两次，用自动γ-计数器测定每一试管的放射活性。由标准曲线 计算血浆中ACTH的浓度。
统计学分析：所有数据均进行Student t-检测并表示为均 值±SEM。当p＜0.05时，处理组数值被认为与对照组数值有显 著性差异。
B.结果
当用15μgα-MSH滴眼时，30分钟内在全身性循环中达 到峰值浓度(91pg/ml)(表16)。在滴眼液中加入0.5％SPE-109 或0.5％SPE-103，明显增强其全身性吸收，在全身性循环中峰 值分别达到705pg/ml(增强11倍)和604pg/ml(增强10倍)。 SPE-109加快α-MSH吸收，在滴药后5分钟达到血浆峰值浓 度，而SPE-103需要30分钟(表17)。
虽然生长激素释放抑制因子的分子量(MW＝1638)与 α-MSH分子量(MW＝1500)很接近，但吸收增强剂增强其全 身性吸收的作用却小得多。当用90μg生长激素释放抑制因子滴 眼液滴眼时，在30分钟时达到血浆峰值浓度。0.5％SPE-109和 0.5％SPE-103分别增强生长激素释放抑制因子全身性吸收作 用达5.1倍和6.4倍。采用SPE-109，血液生长激素释放抑制因 子浓度在5分钟时达到峰值，而SPE-103需要10分钟(表17)。
虽然VIP的分子量(MW＝3325)是生长激素释放抑制因子 的两倍，但其由SPE-109和SPE-103增强的全身性吸收作用 却与生长激素释放抑制因子情形下增强的程度相似，相当于 α-MSH情形下增强程度的一半，分别为增强4.0倍和5.2倍 (表16、17、18)。单独使用VIP时，30分钟内达到血液峰值浓度。 当加入0.5％SPE-109和0.5％SPE-103，分别在5分钟和30 分钟时达到血液VIP峰值浓度(表18)。
在所研究的4个多肽药物中，ACTH分子量(MW＝4540)最 大。其分子量约为α-MSH和生长激素释放抑制因子的3倍。但 是，其吸收增强情形却与生长激素释放抑制因子和VIP相当， SPE-109和SPE-103分别增强ACTH全身性吸收达5.3倍和 5.8倍(表17、18、19)。SPE-109缩短达到血液ACTH峰值浓度 所需时间，由30分钟变为20分钟，而SPE-103延长其时间，由 30分钟变为60分钟(表19)。
表16.α-MSH经眼全身性吸收及其由SPE-109和SPE-103的增强作用 时间 (分钟) 血浆中α-MSH的浓度(pg/ml) 15μg α-MSH 滴眼液 (N＝5) 15μg α-MSH ＋0.5％SPE-109 滴眼液 (N＝4) 15μg α-MSH ＋0.5％SPE-103 滴眼液 (N＝4) 0 5 10 20 30 60 120 180 30±3a 34±4 34±2 49±9 91±31b 46±7 35±4 31±3 38±11 705±35 485±28 360±47 220±24 77±11 42±12 29±5 18±2 38±7 365±28 556±122 604±54 182±24 39±2 31±6 增强吸收c - 10.9x 9.8x a，均值±SEM b，峰值浓度下划线 c，比值＝(含有吸收增强剂时的峰值浓度)/ (不含吸收增加剂时的峰值浓度)
表17.生长激素释放抑制因子经眼全身性吸收及其
由SPE-109和SPE-103的增强作用 时间 (分钟) 血浆中生长激素释放抑制因子的浓度(pg/ml) 90μg生长激素释 放抑制因子 滴眼液 (N＝4) 90μg生长激素释 放抑制因子 ＋0.5％SPE-109 滴眼液 (N＝6) 90μg生长激素释 放抑制因于 ＋0.5％SPE-103 滴眼液 (N＝6) 0 5 10 20 30 60 120 180 246±11a 342±31 411±23 486±56 491±49b 426±65 425±21 318±24 193±18 1440±156 1373±160 979±99 766±50 396±76 218±35 201±23 225±22 1693±72 1793±75 1550±120 1417±133 924±128 439±61 389±45 增强吸收c - 5.1x 6.4x a，均值±SEM b，峰值浓度下划线 c，比值＝(含有吸收增强剂时的峰值浓度)/ (不含吸收增加剂时的峰值浓度)
表18.VIP经眼全身性吸收及其由SPE-109和SPE-103的增强作用 时间 (分钟) 血浆中VIP的浓度(pg/ml) 15μg VIP 滴眼液 15μg VIP ＋0.5％SPE-109 滴眼液 15μg VIP ＋0.5％SPE-103 滴眼液 0 5 10 20 30 60 120 180 14±1 19±2 17±2 17±1 33±14 17±1 12±2 12±1 31±2 106±14 88±3 61±11 41±4 33±2 36±3 32±2 22±4 31±1 57±10 106±11 121±5 72±7 32±1 28±2 增强吸收c - 4.0x 5.2x a，均值±SEM，N＝5 b，峰值浓度下划线 c，比值＝(含有吸收增强剂时的峰值浓度)/ (不含吸收增加剂时的峰值浓度)
表19.ACTH经眼全身性吸收及其由SPE-109和SPE-103的增强作用 时间 (分钟) 血浆中ACTH的浓度(pg/ml) 50μg ACTH 滴眼液 50μg ACTH ＋0.5％.SPE-109 滴眼液 50μg ACTH ＋0.5％SPE-103 滴眼液 0 5 10 20 30 60 120 180 9±3 43±16 78±18 253±34 277±35 115±29 40±8 24±7 10±2 100±17 280±50 1437±108 1256±57 786±62 299±28 156±15 10±4 110±9 307±40 1075±157 1325±118 1558±25 1067±37 438±28 增强吸收c - 5.3x 5.8x a，均值±SEM，N＝5 b，峰值浓度下划线 c，比值＝(含有吸收增强剂时的峰值浓度)/ (不含吸收增加剂时的峰值浓度)
吸收增强剂促进催产素和AVP经眼全身性吸收作用
A.材料和方法
材料：催产素、精氨酸加压素(AVP)、聚氧乙烯9-月桂基醚 (SPE-109)、聚氧乙烯20-硬脂基醚(SPE-103)和牛血清白蛋 白(BSA)(RIA级，fractionV)皆购自Sigma化学公司(St.Louis， MO)，单碘标记的125I-催产素(2200Ci/mmol)和125I-AVP(2200 Ci/mmol)皆购自Dupont Co.(Wilmington，DE)，兔抗催产素抗 体和兔抗AVP抗体皆购自Calbiochem(San Diego，CA)， Sep-pak C18柱购自Waters Associates(Milford，MA)。用磷酸盐 缓冲液(P BS)配制滴眼液。
动物实验：采用新西兰白兔，体重为2.0～3.0kg，用30mg/kg 苯巴比妥钠经耳缘静脉注射使动物麻醉。为了使兔保持麻醉状 态，在实验过程中给兔注射另外的苯巴比妥钠(1mg/kg/hr)。股动 脉插入聚乙烯管(PE-90)用于采集血样，并用经肝素(50μ/ml) 处理的生理盐水替换血液体积。将50μl催产素或加压素滴眼液 滴入兔眼，或者经耳缘静脉给药。于给药后0、5、10、20、30、60分 钟和此后每1小时，用塑料注射器从股动脉收集3ml血样，并立 即转移至冷却的玻璃试管中，取血过程共进行5小时。尽可能快 地分离血浆，然后贮存于-70℃直至用于萃取。贮存前将含有 AVP的血浆用10μl/ml 5％三氟乙酸进行酸化处理。采血结束 后，用过量的苯巴比妥钠处死兔子。
从血浆中萃取催产素和AVP：按Grell等人所述方法 (Farmaci.Sci Ed.16：48-52，1988)，将血浆吸附在预先装填的 十八烷基硅烷柱(sep-pak C18)上，从血浆中萃取催产素。将所述 柱子用5ml四氢呋喃预先活性，再取1ml血浆慢慢流经该柱，然 后用6ml蒸馏水冲洗，并用4ml纯甲醇洗脱。将甲醇洗脱液收集 在在经硅化处理的玻璃试管中，然后在45℃水浴中在空气流下蒸 发至干。按Carman等人的方法(Clin，Biochem.21：265-269， 1988)萃取血浆AVP。将解冻的血浆和萃取中所用全部溶剂和溶 液置于冰上。将Sep-Pak柱用2ml 50％甲醇和6ml蒸馏水进行 水合处理，在用1ml血浆上样后，依次用6ml磷酸盐缓冲液 (50mM磷酸盐、0.15M NaCl，pH8.5)和2ml 3％含水丙酮洗涤。 用含有0.02M HCl的2ml 80％丙酮洗脱AVP，流速为1ml/分 钟，随后使用3-5ml空气。在氮气氛中将AVP萃取液蒸发至干， 残余物贮存于-20℃。在进行放射性免疫实验的当天，将残余物 用含有0.1％BSA和0.02％叠氮化钠的1ml磷酸盐缓冲液 (pH7.4)重新配制。
放射性免疫实验：为提高实验灵敏度，在非平衡系统中进行 催产素的放射性免疫实验。将200μl未知的萃取物或催产素标 准品置于12×75mm经硅化处理的玻璃试管中，向所述玻璃试 管中加入了100μl抗体。于4℃进行48小时培养后，向每一试管 中加入50μl 125I-催产素(约4000dpm)，并将混合物在4℃下再 培养另外48小时。通过采用硫酸铵技术，其中向每一试管中依次 加入了20μl 1％牛γ-球蛋白和350μl饱和硫酸钠，将结合和 游离的125I-催产素进行分离。剧烈振摇试管，置于室温保持20分 钟，然后于2000xg下离心20分钟。采用200μl未知的萃取物或 AVP标准品和100μl抗血清进行AVP的放射性免疫实验。在 4℃下进行24小时预培养后，向每一试管中加入100μl 125I -AVP(4000-6000dpm)，并在4℃下重新培养24小时。加入 500μl 25％PEG，将游离的AVP与抗体结合的示踪物分离。将 混合物于室温保持20分钟，然后于1500xg下离心30分钟。弃掉 上清液后，用自动γ-计数器测定沉积物的放射活性，由标准曲 线计算每一样品中催产素和AVP的浓度。
B.结果
当用0.33μg/kg催产素进行静脉内注射时，血液催产素浓 度很快达到456pg/ml并迅速降低，T1/2约为25分钟(图18和 19)。当用相同剂量的催产素滴眼时，在给药后60分钟在血流中 达到血药峰值，但在血流中催产素峰值浓度仅为29pg/ml，远远低 于通过静脉内注射在同一时期所获得的血药浓度(99pg/ml)(图 18)。甚至3倍增加催产素滴眼液的剂量，使剂量达到1μg/kg 时，在滴眼后60分钟时血药浓度也仅为64pg/ml，仍低于通过静 脉内注射所获得的血药浓度(图19)。
为改善催产素经眼吸收进入全身性循环，向滴眼液中加入吸 收增强剂例如SPE-109和SPE-103。如图18所示，SPE-103 (0.5％)明显增加0.33μg/kg催产素滴眼液的吸收作用，在60 分钟时血流中达到峰值为66pg/ml(图18)。但该浓度仍低于通过 静脉内注射在60分钟时所达到的血药浓度(图18)。如SPE-103 一样，0.5％的SPE-109不能有效改善0.33μg/kg催产素的吸 收作用。
为了升高血液催产素浓度，使之高于通过静脉内注射所达到 的血药浓度，向较高剂量的催产素(1μg/kg)中加入吸收增强剂。 如图19所示，0.5％SPE-103升高血液催产素浓度，使之高于通 过静脉内注射在30分钟和之后所达到的血药浓度。如SPE-103 一样，SPE-109也不能很显著地提高血药水平，但其能达到静脉 内注射所得相同高度的血药浓度，或者稍微更高。
加压素获得类似的结果(图20和21)。静脉内注射加压素达 到662pg/ml的血药浓度，T1/2为约15分钟。加压素本身经眼全 身性吸收较差，其本身达到的血药浓度明显低于通过静脉内注射 相同剂量(0.5U/kg)所达到的浓度(图20)。加入0.5％SPE-103， 明显升高了血液加压素浓度，达到的血药浓度相等于通过静脉内 注射在60分钟或之后所达到的血药浓度(图20)。当以0.5U/kg 剂量水平加压素给药时，0.5％SPE-109不能和SPE-103一样 有效地提高全身性循环中加压素的浓度(图20)。
在较高剂量(1.5U/kg)加压素的情形下，SPE-103提高血液 加压素浓度，使之远远高于通过静脉内注射0.5U/kg所达到的血 药浓度(图21)。SPE-109未能升高血液加压素浓度使之高于通 过静脉内注射所达到的血药浓度(图21)。
吸收增强剂促进高血糖素经眼全身性吸收
A.材料和方法
材料：高血糖素、SPE-103和SPE-109皆购自Sigma化学 公司(St.Louis，Mo)，滴眼液用无菌磷酸盐缓冲液配制，用氢氧化 钠调节pH。
实验动物：新西兰白兔、雌性、体重2.0～3.0kg，采用苯巴比 妥钠(30mg/kg)静脉内注射麻醉，实验过程中用苯巴比妥钠1mg /kg/hr维持麻醉，股动脉插入聚乙烯管(PE-90)采集血样，并用 肝素生理溶液(50U/ml)抗凝。左眼滴入50μl高血糖素溶液，从 股动脉于滴药后0、10、20、30、60、90、120分钟且以后每1小时取 血，直到5小时，血样经离心后，冻存用于放射免疫性测定，高血 糖素用RIA方法测定，血糖浓度取新鲜全血用糖试纸和 Glucoscan 2000 Meter(Lifescan，Mountain View，CA)测定，实验 结束时，用过量的苯巴比妥钠将兔麻醉致死。
高血糖素之RIA：RIA试剂盒购自Cambridge Medical Diagnostic Inc.(Billerica，MA)，用于测定血浆高血糖素，血浆 (100μl)加入125I-标记的高血糖素和高血糖素特异性抗体，于 4℃孵育20小时，然后加入含第二种抗体的试剂，并在室温放置 15分钟，以1500g离心10分钟，倾弃上清液，将试管倒立在吸水 纸上，样品的放射性用Parkardγ-计数器测定，根据标准曲线 计算高血糖素浓度。
B.结果
用高血糖素溶液滴眼以增加血糖的实验：用50μl的0.05％ 和0.1％的高血糖素滴眼液滴眼后，血中高血糖素的峰值为614pg /ml和738pg/ml(表20)，用0.05％和0.1％高血糖素加 0.5％SPE-103溶液滴眼时，血中高血糖素浓度为分别达到 2694pg/ml和3956pg/ml，这个浓度的高血糖素足以增加血糖，使 血糖分别从102mg％和96mg％增至162mg％和211mg％(表 21)，使血糖升高。
表22显示了0.5％SPE-109的实验结果，当0.05％和 0.1％高血糖素加0.5％SPE-103溶液滴眼后，血中高血糖素分 别增高至2188pg/ml和4631pg/ml，血糖从109mg％和98mg％分 别增高到214mg％和217mg％(表22)。 表20. 对兔经眼给予不含任何吸收增强剂的高血糖素后的 血浆高血糖素浓度和血葡萄糖浓度 时间 (分钟) 0.05％高血糖素 0.1％高血糖素 高血糖素(pg/ml) 葡萄糖(mg％) 高血糖素(pg/ml) 葡萄糖(mg％) 0 5 10 20 40 60 90 120 180 240 378±26a 611±52 574±43 614±55 454±43 465±43 463±41 439±36 484±49 394±42 97.8±3.7 103.3±3.0 105.6±1.6 105.8±2.8 100.6±3.3 102.5±4.2 105.3±2.2 112.5±2.3 109.4±3.1 109.1±3.8 521±32 577±38 680±87 889±89 738±72 651±52 628±54 706±53 666±28 756±56 99.0±3.8 107.3±4.2 108.9±3.5 113.4±5.2 111.9±2.5 113.9±4.4 110.6±4.5 118.3±6.2 122.6±3.5 113.6±2.6
a，均值±SEM (N＝8.) 表21. 对兔经眼给予高血糖素和SPE-103(0.5％)后的 血浆高血糖素浓度和血葡萄糖浓度 时间 (分钟) 0.05％高血糖素＋0.5％SPE-103 0.1％高血糖素＋0.5％SPE-103 高血糖素(pg/ml) 萄萄糖(mg％) 高血糖素(pg/ml) 葡萄糖(mg％) 0 5 10 20 40 60 90 120 180 240 854±43a 2756±202 2694±222 2213±176 1469±114 1045±27 1089±83 935±84 881±69 831±76 102.1±2.4 113.6±3.0 134.6±4.1 161.8±3.9 161.6±6.3 129.3±2.5 110.0±5.3 105.4±4.3 101.1±5.2 106.9±4.1 446±66 3031±230 3700±268 3956±273 2175±154 1481±160 1008±102 781±64 645±53 549±32 96.3±4.1 118.9±4.1 148.5±6.1 194.1±10.9 211.3±8.9 208.4±6.6 145.5±13.6 117.9±8.7 108.0±5.0 108.8±4.5
a，均值±SEM (N＝8.) 表22.对兔经眼给予SPE-103和SPE-109(0.5％)后的 血浆高血糖素浓度和血葡萄糖浓度 时间 (分钟) 0.05％高血糖素＋0.5％SPE-109 0.1％高血糖素＋0.5％SPE-109 高血糖素(pg/ml) 葡萄糖(mg％) 高血糖素(pg/ml) 葡萄糖(mg％) 0 5 10 20 40 60 90 120 180 240 378±40a 540±35 710±77 1664±220 2188±229 2184±173 1176±123 843±78 685±96 549±48 108.6±3.3 110.4±3.2 117.1±4.8 140.9± 7.9 196.5±7.5 214.3±10.9 182.9±10.4 149.3±8.1 122.5±6.4 119.3±3.2 479±35 628±43 1660±202 4044±424 4631±290 3994±319 2048±205 1373±103 1009±55 738±102 97.6±3.8 98.1±3.1 104.9±4.3 150.4±i0.1 188.5±7.1 217.3±7.3 196.0±10.1 157.3±8.6 129.4±9.4 107.3±5.1
a，均值±SEM (N＝8.)
下面是本发明制剂的一些说明性的具体实施例，应当明白， 本发明制剂绝不仅限于此，并且它不以任何方式限制本发明的范 围，如上文所述，通过阅读本申请，参照或模仿本发明方法，本领 域普通技术人员能作出各种变化，将各种多肽药物与不同的吸收 增强剂和眼用赋形剂或载体一起制成适于各种给药方式的各种 制剂，其中可任意含有各种眼用添加剂如防腐剂、抗生素等等，根 据不同需要，其中药物等成分的含量也可作相应的改变，所有这 些制剂均包括在本发明范围内。在制剂中，活性成分是指具体多 肽药物，如胰岛素、高血糖素等。
实施例1：滴眼液
成分 量
活性成分 0.5g
硝酸苯汞 0.01g
SPE-103 0.25g
SPE-109 0.25g
硼酸 2.0g
羧甲基纤维素钠 0.2g
灭菌蒸馏水 适量 至 100ml
NaOH/HCl 调pH 7.4
取0.01g硝酸苯汞溶于总量约50ml灭菌蒸馏水中，加热到 40～50℃，加入2.0g硼酸溶解，加入0.25g SPE-103和0.25g SPE-109并充分混合。将0.2g羧甲基纤维素钠溶于约20ml蒸 馏水中，过滤。加入活性成分，并与配好的硝酸苯汞溶液混合，添 加剩余的蒸馏水，用少量NaOH/HCl调pH至7.4。分装在10ml 小瓶中并灭菌。制得含0.25％SPE-103和0.25％SPE-109 的0.5％多肽药物滴眼液。
实施例2：眼药膏
成分 量
活性成分 0.5g
皂草苷 1g
液体石蜡 2.5g
无水羊毛脂 10g
凡士林 76.0g
取0.5g活性成分和1g皂草苷之精细粉末置于研钵内，加入 适量经灭菌冷却的液体石蜡，研磨成细糊状，通过6号筛，逐渐加 入灭菌并过滤的羊毛脂、凡士林混合物，混匀即得。
实施例3：粉剂
成分 量 (1)活性成分 0.25g 甘露醇 0.40g (2)硼酸 0.25g 硼酸钠 0.10g 皂草苷 0.25g 灭菌蒸馏水 约25ml HCl/NaOH 调pH至 7.4
将(1)中所述量的活性成分和甘露醇溶解在适量蒸馏水中， 除菌过滤后在灭菌小瓶中冷冻干燥成粉末。
将(2)中所述量的硼酸、硼酸钠和EDTA溶解在约20ml蒸馏 水中，并用剩余水使之总体积为25ml并用HCl/NaOH调pH至 7.4，除菌过滤后装入另一小瓶中。
上述两个独立的包装物，可以临近使用时混合配制，摇匀溶 解后滴眼。
实施例4：粉剂
成分 量 (1)活性成分 0.20g SPE-103 0.05g SPE-109 0.05g 甘露醇 0.20g (2)硼酸 0.20g
硼砂 0.06g
蒸馏水 20ml
HCl/NaOH 调pH至 7.4
按实施例3的类似方法，将上述(1)和(2)中的成分分别配制 在两个独立的包装物中。可在临近使用时将其混合摇匀后滴眼。
实施例5：眼用膜剂
成分 量
活性成分 15g
聚乙烯醇(05-88) 28g
SPE-109 10g
甘油 3g
蒸馏水 40ml
称取28g聚乙烯醇、3g甘油、10g SPE-109与40ml水混合， 待聚乙烯醇膨胀后于90℃水溶上加热使之溶解，趁热经80目筛 过滤，冷却后加入15g活性成分并搅拌溶解。在涂膜机上制成宽 10mm，厚0.15mm，含活性成分约20％的药膜带，经含量测定后 划痕分格(10×5mm2)，每格含药2.5mg(±10％)，最后在紫外灯 下灭菌即得。
实施例6：接触眼镜附属制剂
成分 量
活性成分 5g
皂草苷 10g
硼酸 12g
聚乙烯吡咯烷酮 1.5g
氯化钠 5.0g
碳酸钠 0.5g
磷酸二氢钠 1.8g
氯化苯甲烃铵 0.2ml
注射用水 加至 1000ml
按常规眼用制剂技术，按上述处方配制含药的接触眼镜附属 制剂。其配合使用的接触眼镜例如可以是由甲基丙烯酸羟乙基酯 制备的聚合物构成的常规软接触眼镜(SCL)。将SCL在上述含药 附属制剂中浸泡约10分钟，吸药量可为载体总载量的约50％。这 种含药软接触眼镜可反复使用。