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1、(10)授权公告号 CN 102362839 B (45)授权公告日 2014.08.06 CN 102362839 B (21)申请号 201110344431.6 (22)申请日 2011.11.04 A61K 8/64(2006.01) A61Q 17/04(2006.01) (73)专利权人 大连海洋大学 地址 116000 辽宁省大连市沙河口区黑石礁 街 52 号 (72)发明人 李伟 孔亮 曲敏 佟长青 谭成玉 金桥 (74)专利代理机构 大连非凡专利事务所 21220 代理人 闪红霞 JP 昭 62-298507 A,1987.12.25, 全文 . WO 0174762 A2,。
2、2001.10.11, 全文 . CN 1738631 A,2006.02.22, 全文 . 柯佳颖等 . 凝集素及其生物学作用 .宁德 师专学报 ( 自然科学版 ) .2005, 第 17 卷 ( 第 1 期 ), 第 19-22 页 . Amanda Greatens et al.Effective inhibition of melanosome transfer to keratinocytes by lectins and niacinamide is reversible.Experimental Dermatology .2005,( 第 14 期 ), 第 498-508 页，。
3、 尤其第 498 页摘要， 第 499 页左栏第 15-27 行、 倒 数第1-6行， 右栏第1-7行，“test compounds” ， 第 501 页图 2 及表格 . 李伟等 . 贻贝凝集素抗 -HIV 活性研究 .沈 阳农业大学学报 .2007, 第 38 卷 ( 第 2 期 ), 第 207-210 页 . (54) 发明名称 贻贝凝集素在制备化妆品中的应用 (57) 摘要 本发明是贻贝凝集素在制备化妆品中的应 用， 所述贻贝凝集素是 N- 乙酰半乳糖胺 / 半乳糖 (GalNAc/Gal) 特异性的贻贝凝集素 （CGL） ， 即将 贻贝凝集素作为生物活性成分添加到护肤化妆品 中。。
4、因贻贝凝集素具有显著的促进成纤维细胞生 长及对成纤维细胞紫外辐射损伤具有保护作用， 因此本发明可以有效预防紫外线损伤， 避免因紫 外线照射而引起的皮肤老化等。因贻贝凝集素来 自于贻贝， 来源容易且安全可靠， 制备工艺简单成 熟、 成本低， 便于应用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李小晶 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 (10)授权公告号 CN 102362839 B CN 102362839 B 1/1 页 2 1. 一种贻贝凝集素在制备化妆品中的应用， 所述贻贝凝集素是 N - 乙酰。
5、半乳糖胺 / 半乳糖 ( GalNAc/Gal) 特异性的贻贝凝集素 （CGL） ， 其特征是在防晒化妆品中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102362839 B 2 1/4 页 3 贻贝凝集素在制备化妆品中的应用 发明领域 0001 本发明涉及贻贝凝集素的新用途， 尤其是贻贝凝集素在制备化妆品中的应用。 背景技术 0002 目前， 化妆品的种类较多， 有护肤霜， 眼霜、 隔离霜、 护手霜和按摩霜等。如中国发 明专利号为ZL02817885.8， 名称为 “二氧化硅被覆混晶氧化物颗粒、 其制备方法以及用其制 备的化妆品材料” 的发明专利就公开了一种具有防晒 （预防紫外线造成皮肤损伤） 功能。
6、的化 妆品， 是在化妆品基本原料中添加具有遮挡紫外线能力的二氧化硅被覆混晶氧化物颗粒而 制成， 即通过物理方法预防紫外线损伤。还有一种防晒化妆品是在化妆品基料中添加纤维 细胞生长因子， 通过促表皮细胞修复增殖预防紫外线损伤， 此方法比物理方法更加有效。 但 因现有纤维细胞生长因子生产工艺复杂、 价格昂贵， 为此限制了它的广泛应用。 0003 N - 乙酰半乳糖胺 / 半乳糖 ( GalNAc/Gal) 特异性的贻贝凝集素 （CGL） 是一种 分子量为 18000 道尔顿的糖结合蛋白， 来自贻贝 （Crenomytilus grayanus） 。李伟、 熊川男 和王建华等作者在 “沈阳农业大学学。
7、报” 期刊， 2007 年第 38 卷第 2 期第 207-210 页中登载 的 贻贝凝集素抗 -HIV 活性研究 中论述了贻贝凝集素的制备方法及抗 -HIV 活性。但是， 迄今为止还没有关于贻贝凝集素 （CGL） 在化妆品方面应用的相关报道。 发明内容 0004 本发明是发现了 N - 乙酰半乳糖胺 / 半乳糖 ( GalNAc/Gal) 特异性的贻贝凝集 素 （CGL） 具有显著的促进成纤维细胞生长的作用， 从而发明了贻贝凝集素在制备化妆品中 的应用。 0005 一种贻贝凝集素在制备化妆品中的应用， 所述贻贝凝集素是 N - 乙酰半乳糖胺 / 半乳糖 ( GalNAc/Gal) 特异性的贻。
8、贝凝集素 （CGL） 。 0006 所述的贻贝凝集素在制备化妆品中的应用， 是在防晒化妆品中的应用。 0007 本发明是贻贝凝集素在制备化妆品中的应用， 即将贻贝凝集素作为生物活性成分 添加到护肤化妆品中。 因贻贝凝集素具有显著的促进成纤维细胞生长及对成纤维细胞紫外 辐射损伤具有保护作用， 因此本发明可以有效预防紫外线损伤， 避免因紫外线照射而引起 的皮肤老化等。因贻贝凝集素来自于贻贝， 来源容易且安全可靠， 制备工艺简单成熟、 成本 低， 便于应用。 具体实施方式 0008 实施例 1 ： 0009 含有贻贝凝集素 （CGL） 的护肤霜对成纤维细胞生长促进活性测定 ： 0010 1样品制备 。
9、0011 N - 乙酰半乳糖胺 / 半乳糖 ( GalNAc/Gal) 特异性的贻贝凝集素 （CGL） 按照李 伟、 熊川男和王建华等作者在 “沈阳农业大学学报” 期刊， 2007 年第 38 卷第 2 期第 207-210 说 明 书 CN 102362839 B 3 2/4 页 4 页中登载的 贻贝凝集素抗 -HIV 活性研究 中记述的方法制备。 0012 护肤霜为表 1 所示配方 ： 0013 表 1 0014 成分质量百分比成分质量百分比 单硬脂酸甘油酯8尼泊金丙酯0.5 硬脂酸8丙三醇10 十六烷醇1三乙醇胺1 对羟苯甲酸丙酯0.1蒸馏水69.9 二甲基硅油1香精0.5 0015 （。
10、1） 含凝集素的护肤霜样品制备 ： 即按表 1 将油相原料和油溶性乳化剂， 在不断搅 拌下混合加热至 80， 维持 20 min 灭菌， 将水相原料和水溶性乳化剂加入至蒸馏水中， 搅 拌下加热至 80， 维持 20min 灭菌， 然后冷却， 将与护肤霜按质量比为十万分之一的贻贝凝 集素 （CGL） 缓慢加到水相中搅拌乳化， 再将水相加入到油相中， 当温度降至 45时加入香 精， 继续搅拌冷却， 即得含凝集素的护肤霜。取 0.5g 含凝集素的护肤霜溶于 2.5ml 蒸馏水 中， 10000 rpm 离心 20 min 取上清， 经过 0.2 m 滤膜过滤， 4保存。 0016 （2） 凝集素样品。
11、的制备 ： 配制 2.4g/ml 的 CGL 溶液， 10000 rpm 离心 20 min 取上 清， 经过 0.2 m 滤膜过滤， 4保存。 0017 （3） 对照样品 ： 取 0.5g 护肤霜溶于 2.5ml 蒸馏水中， 10000 rpm 离心 20 min 取上 清， 经过 0.2 m 滤膜过滤， 4保存。 0018 2样品对成纤维细胞生长促进作用的测定 ： 0019 成纤维细胞为第 10 代体外培养的人成纤维细胞。 0020 将数量为 4.5104 个 /ml 处于对数生长期的人成纤维细胞 100 l、 不同的样 品 （含凝集素的护肤霜样品、 凝集素样品、 对照样品） 溶液各 2.。
12、5ml， 并加含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基液至每孔 200 l， 在 5%CO2的 37oC 培养箱中培养 24h 后， 加入 20 L MTT（g/L） ， 再培养 4h 后， 弃去培养基， 加入 180 l DMSO， 在恒温振荡器上振荡 60s 后， 用酶标仪在 570 nm/630 nm 波长处检测吸光度。 0021 每个样品溶液设 3 个平行样。 0022 根据测得的吸光度值计算生长促进率 ： 生长促进率 = （实验组吸光度值 对照组 吸光度值） / 对照组吸光度值 100%。 0023 结果如表 2。 0024 表 2 0025 样品对照组 含凝集素的护肤霜凝。
13、集素 成纤维细胞生长促进率 （%）056.764.6 0026 结果表明 ： 含有 CGL 的护肤霜及 CGL 对人体成纤维细胞具有促生长作用。 0027 实施例 2 ： 0028 含贻贝凝集素 （CGL） 的护肤霜对成纤维细胞紫外损伤的保护活性测定 ： 0029 1样品制备 ： 0030 贻贝凝集素 （CGL） 和护肤霜的制备方法同实施例 1。 0031 （1） 含凝集素的护肤霜样品制备 ： 含凝集素的护肤霜样品制备 ： 即按上表将油相 说 明 书 CN 102362839 B 4 3/4 页 5 原料和油溶性乳化剂， 在不断搅拌下混合加热至 80， 维持 20 min 灭菌， 将水相原料和。
14、水 溶性乳化剂加入至蒸馏水中， 搅拌下加热至 80， 维持 20min 灭菌， 然后冷却， 将与护肤霜 按质量比为万分之一的贻贝凝集素 （CGL） 缓慢加到水相中搅拌乳化， 再将水相加入到油相 中， 当温度降至 45时加入香精， 继续搅拌冷却， 即得含凝集素的护肤霜。将 0.5g 含凝集 素的护肤霜溶于 2.5ml 蒸馏水中， 10000 rpm 离心 20 min 取上清， 经过 0.2 m 滤膜过滤， 4保存。 0032 凝集素样品的制备 ： 配制 24g/ml 的 CGL 溶液， 10000 rpm 离心 20 min 取上清， 经过 0.2 m 滤膜过滤， 4保存。 0033 对照样品。
15、 ： 取 0.5g 护肤霜溶于 2.5ml 蒸馏水中， 10000 rpm 离心 20 min 取上清， 经过 0.2 m 滤膜过滤， 4保存。 0034 2对成纤维细胞紫外损伤的保护活性测定 ： 0035 成纤维细胞为第 10 代体外培养的人成纤维细胞。 0036 将数量为 4.5104 个 /ml 处于对数生长期的人成纤维细胞 100 l、 并加含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基液至每孔 200 l， 在 5%CO2的 37oC 培养箱中培养 24h 后， 加 入不同的样品 （含凝集素的护肤霜样品、 凝集素样品、 对照样品） 溶液各 2.5ml， 在相同条件 下培养 30 。
16、min， 用 UVA 辐射 5s， 辐射强度 1.8710-3J/cm2， 另外相同一组用 UVB 辐射 5s， 辐 射强度 1.1110-3J/cm2。辐射结束后， 再培养 30 min， 然后加入 20 L MTT（g/L） ， 再 培养 4h 后， 弃去培养基， 加入 180 l DMSO， 在恒温振荡器上振荡 60s 后， 用酶标仪在 570 nm/630 nm 波长处检测吸光度。 0037 每个样品溶液设 3 个平行样。 0038 根据测得的吸光度值计算生长促进率 ： 生长促进率 = （实验组吸光度值 对照组 吸光度值） / 对照组吸光度值 100%。 0039 结果如表 3。 00。
17、40 表 3 0041 样品对照样品 含凝集素的护肤霜凝集素 UVA 处理后成纤维细胞生长促进率 （%）10.960.169.7 UVB 处理后成纤维细胞生长促进率 （%）-1.9744.947.7 0042 结果表明 ： UVA 短时间辐射， 对成纤维细胞有促进生长作用 ； UVB 对成纤维细胞具 有损伤作用， 而含有CGL的护肤霜及CGL对成纤维细胞具有紫外损伤保护和生长促进作用。 0043 实施例 3 ： 0044 实施例 1、 2 分别表明 N - 乙酰半乳糖胺 / 半乳糖 ( GalNAc/Gal) 特异性的贻贝 凝集素 （CGL） 对成纤维细胞生长具有显著促进作用， 对成纤维细胞具。
18、有紫外损伤保护作用。 为此可将 N - 乙酰半乳糖胺 / 半乳糖 ( GalNAc/Gal) 特异性的贻贝凝集素 （CGL） 以与化 妆品基本原料质量比为千分之一至十万分之一的量添加至现有化妆品基本原料中， 制成护 肤霜、 眼霜、 隔离霜、 护手霜和按摩霜等， 可涂敷于皮肤用于预防紫外线造成皮肤损伤。 0045 按表 4 所示组方配比制备护手霜 ： 0046 表 4 0047 说 明 书 CN 102362839 B 5 4/4 页 6 0048 按表 4 将油相原料和油溶性乳化剂， 在不断搅拌下混合加热至 80， 维持 20 min 灭菌， 将水相原料和水溶性乳化剂加入至蒸馏水中， 搅拌下加热至 80， 维持 20min 灭菌， 然后冷却， 将 CGL 缓慢加到水相中搅拌乳化， 再将水相加入到油相中， 当温度降至 45时加 入香精， 继续搅拌冷却， 即得防晒护手霜。 说 明 书 CN 102362839 B 6 。