相关申请的交叉引用
本申请要求2008年6月20日提交的临时申请No.61/074,251的 优先权。上述申请的全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及从停乳链球菌似马亚种(Streptococcus dysgalactiae subsp.equisimilis)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、星 座链球菌星座亚种(Streptococcus constellatus subsp. constellatus)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)或星座链球 菌咽炎亚种(Streptococcus constellatus subsp.pharyngis)获得的 多核苷酸和由所述多核苷酸编码的多肽。
背景技术
β-溶血性链球菌是导致多种人类疾病(从浅表感染到更严重的疾 病)的重要病原体。其包括来自血清型A、B、C和G的种。A型链球菌(酿 脓链球菌(Streptococcus pyogenes))导致大部分疾病病例并且可以导 致非侵入性疾病例如咽炎、猩红热、脓疱病、蜂窝织炎或丹毒。一些链 球菌菌株可以导致更严重的侵入性感染，例如中毒性休克综合征、坏死 性筋膜炎和败血症。另外，表面感染的并发症可以导致免疫介导的后遗 症。Lancefield B型链球菌(无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)) 是新生儿中新生儿脓毒症的主要原因并且可以在年长患者中引起肺炎。 C和G型链球菌最初被认为是动物病原体，但是近年来已经表明其对于 人类疾病具有很强的潜能。由C和G型链球菌引起的疾病通常与A型链 球菌引起的疾病表现类似，但是未显示其导致免疫介导的后遗症。C和 G型链球菌经常存在于具有潜在健康问题的患者中，对于年长患者很重 要并且分散在数个链球菌的种中。
发明简述
本发明基于相应于酿脓链球菌开放阅读框1358(ORF1358)的新的 停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球 菌或星座链球菌咽炎亚种的多核苷酸的发现。本发明包括由所述多核苷 酸编码的多肽。
在一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，所述多肽包含至少SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的片段，所述序列为由停乳链球菌似马亚 种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽 炎亚种获得的各种新的ORF 1358序列的共有序列。在一些实施方案中， 所述分离的多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、 SEQ ID NO：30、或SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列或其片段。在一些 实施方案中，所述分离的多肽包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、 SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、或SEQ ID NO：32所示 的氨基酸序列至少97.5％、98％或99％同一的氨基酸序列。在一些实施方 案中，所述分离的多肽具有锌结合活性。在一些实施方案中，所述分离 的多肽包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、 SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列至少90％、95％、 97.5％、98％或99％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸编 码包含SEQ ID NO：31所示氨基酸序列或其片段的多肽。在一些实施方 案中，所述分离的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、 SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、或SEQ ID NO：32所示 的氨基酸序列或其片段的多肽。在一些实施方案中，所述分离的多核苷 酸包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、 SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述分 离的多核苷酸编码多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、 SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、 SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32所示的 氨基酸序列至少90％、95％、97.5％、98％或99％同一的氨基酸序列。在一 些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：25、 SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、或SEQ ID NO：31所示多核苷酸序列至 少90％、95％或99％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述分离的 多核苷酸编码锌结合多肽。在一些实施方案中，所述多核苷酸与调控元 件可操作地连接。在一些实施方案中，所述调控元件包含诱导型启动子 和/或组成型启动子。
在一个实施方案中，本发明提供抗体，所述抗体与至少一种停乳链 球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星 座链球菌咽炎亚种的ORF1358分离多肽的至少片段特异性结合。在一些 实施方案中，所述抗体结合包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、 SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26、 SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的分离 的多肽。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
在一个实施方案中，本发明提供包含ORF 1358分离多肽或其片段 的试剂盒，所述多肽或其片段的氨基酸序列来自停乳链球菌似马亚种、 中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚 种。在一些实施方案中，所述试剂盒包含分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、 SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中， 所述试剂盒包含表达多肽或其片段的多核苷酸载体，所述多肽由停乳链 球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星 座链球菌咽炎亚种的ORF 1358编码。在一些实施方案中，所述试剂盒 包含表达多肽的多核苷酸载体，所述多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、 SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、 SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32所示的 氨基酸序列或其片段。
在一个实施方案中，本发明提供表达停乳链球菌似马亚种、中间链 球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种 ORF1358多肽的多核苷酸载体。在一些实施方案中，分离的多核苷酸载 体表达包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、 SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的多肽。在一 些实施方案中，所述多核苷酸载体包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸 编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、 SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的多肽。在一些实施方 案中，所述多核苷酸载体包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、 SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、 SEQ ID NO：29、或SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列。在一些实施方案 中，所述多核苷酸载体包含多核苷酸，所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、 SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列至少90％、95％、97.5％、98％％或99％同 一的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述多核苷酸载体包含分 离的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、 SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、 SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32所示的 氨基酸序列至少90％、95％、97.5％、98％或99％同一的氨基酸序列的多肽。 在一些实施方案中，所述多核苷酸载体包含编码锌结合多肽的分离的多 核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸载体包含分离的多核苷酸， 其包含与所述分离的多核苷酸可操作地连接的调控序列。在一些实施方 案中，所述多核苷酸载体包含调控元件，其可以是组成型启动子或诱导 型启动子。在一些实施方案中，所述多核苷酸载体是质粒、病毒载体或 表达载体。
在一个实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，所述组合物包含 分离的停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡 炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的ORF 1358多肽。在一些实施方案中， 所述免疫原性组合物包含多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、 SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、 SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32所示的 氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，所述组合物包含 编码ORF1358多肽的停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星 座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的分离的多核苷酸。在一 些实施方案中，所述免疫原性组合物包含多核苷酸，所述多核苷酸包含 SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、 SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、或SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供用于在哺乳动物中诱导对β溶血性 链球菌或β溶血性链球菌感染的免疫应答的方法，其包括对哺乳动物施 用包含停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡 炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的分离的ORF1358多肽的免疫原性组合 物。
在一个实施方案中，本发明提供离体宿主细胞，所述细胞表达由停 乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌 或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358编码的分离的多肽。在一些实施方案 中，所述宿主细胞表达包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、 SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26、 SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的多肽。 在一些实施方案中，所述宿主细胞包含多核苷酸载体，所述载体包含编 码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、 SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的多肽的分离的多核苷 酸。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含多核苷酸载体，所述载体包 含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、 SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、或SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含多 核苷酸载体，所述载体包含多核苷酸，所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、 SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列至少90％、95％、97.5％、98％或99％同一 的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含多核苷酸 载体，所述载体包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、 SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列至少90％、95％、97.5％、98％、或99％ 同一的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含多核 苷酸载体，所述载体包含编码锌结合多肽的分离的多核苷酸。在一些实 施方案中，所述宿主细胞包含多核苷酸载体，所述载体包含分离的多核 苷酸，所述分离的多核苷酸包含与所述分离的多核苷酸可操作地连接的 调控序列。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含多核苷酸载体，所述 载体包含调控元件，所述调控元件可以是组成型启动子或诱导型启动 子。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含多核苷酸载体，所述载体是 质粒、病毒载体或表达载体。在一些实施方案中所述宿主细胞选自细菌、 哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞。
在一个实施方案中，本发明提供试剂盒，所述试剂盒包含多核苷酸 或多肽，其包含停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚 种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358多核苷酸或多肽。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗哺乳动物中的β溶血性链 球菌感染的方法，其包括施用治疗有效量的抗体，所述抗体与至少一种 包含由停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡 炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358编码的多肽的分离的多肽特 异性结合。在一些实施方案中，所述方法使用结合包含SEQ ID NO：2、 SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、 SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32所示的 氨基酸序列的分离的多肽的抗体。所述方法中使用的抗体可以是单克隆 抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，治疗人类β溶血性链球菌感染。
在一个实施方案中，本发明提供分离的多肽在制备用于哺乳动物β 溶血性链球菌感染的预防性治疗的药物中的用途，所述分离的多肽包含 由停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链 球菌或星座链球菌咽炎亚种的ORF 1358编码的多肽。在一些实施方案 中，所述药物用于人类的预防性治疗。
在一个实施方案中，本发明提供用于哺乳动物β溶血性链球菌感染 的预防性治疗的药物。在一些实施方案中，所述药物使用包含ORF1358 多肽的分离的停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、 咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的多核苷酸。在一些实施方案中， 所述药物使用包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、 SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的分离的多肽。 在一些实施方案中，所述药物使用包含ORF1358多核苷酸的分离的停乳 链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或 星座链球菌咽炎亚种的多核苷酸。在一些实施方案中，所述药物使用分 离的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、或SEQ ID NO：31所示核苷酸序列。在一些 实施方案中，所述药物使用包含停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星 座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358多 核苷酸的多核苷酸载体。在一些实施方案中，所述药物使用与至少一种 分离的多肽特异性结合的抗体，所述分离的多肽包含由停乳链球菌似马 亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌 咽炎亚种的ORF1358编码的多肽。在一些实施方案中，所述药物使用特 异性结合分离的多肽的抗体，所述分离的多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、或SEQ ID NO：32所示的氨 基酸序列。所述药物可以使用单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方 案中，使用所述药物的哺乳动物是人类。
序列表简述
SEQ ID NO：1是停乳链球菌似马亚种orf 1358的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是由SEQ ID NO：1所示的停乳链球菌似马亚种orf 1358 编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是中间链球菌orf 1358的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是由SEQ ID NO：3所示的中间链球菌orf 1358编码的 氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是星座链球菌星座亚种orf 1358的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6是由SEQ ID NO：5所示的星座链球菌星座亚种orf 1358 编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是咽峡炎链球菌orf 1358的核苷酸序列。
SEQ ID NO：8是由SEQ ID NO：7所示的咽峡炎链球菌orf 1358编码 的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是停乳链球菌似马亚种orf 1358的核苷酸序列。
SEQ ID NO：10是由SEQ ID NO：9所示的停乳链球菌似马亚种orf 1358 编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是星座链球菌咽炎亚种orf 1358的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12是由SEQ ID NO：11所示的星座链球菌咽炎亚种orf 1358编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13是通过比对SEQ ID NO：2、4、6、8、10和12所示的 多肽序列而获得的共有氨基酸序列。
SEQ ID NO：14是引物D1358 F1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：15是引物D1358 F3的核苷酸序列。
SEQ ID NO：16是引物D1358 F5的核苷酸序列。
SEQ ID NO：17是引物D1358 R2的核苷酸序列。
SEQ ID NO：18是引物D1358 R3的核苷酸序列。
SEQ ID NO：19是引物D1358 R5的核苷酸序列。
SEQ ID NO：20是引物1358 F的核苷酸序列。
SEQ ID NO：21是引物1358 R的核苷酸序列。
SEQ ID NO：22是NCBI登录号为gi 50902983的酿脓链球菌高亲合 力锌吸收系统蛋白质znuA前体的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23是NCBI登录号为gi 22536713的无乳链球菌2603V/R 锌结合粘着脂蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：24是由无乳链球菌ORF1358编码的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25是停乳链球菌似马亚种orf 1358的核苷酸序列。
SEQ ID NO：26是由SEQ ID NO：25所示的停乳链球菌似马亚种orf 1358编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：27是停乳链球菌似马亚种orf 1358的核苷酸序列。
SEQ ID NO：28是由SEQ ID NO：27所示的停乳链球菌似马亚种orf 1358编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：29是咽峡炎链球菌orf 1358的核苷酸序列。
SEQ ID NO：30是由SEQ ID NO：29所示的咽峡炎链球菌orf 1358 编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：31是星座链球菌星座亚种orf 1358的核苷酸序列。
SEQ ID NO：32是由SEQ ID NO：31所示的星座链球菌星座亚种orf 1358编码的氨基酸序列。
发明详述
本发明描述了获自停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌 星座亚种、咽峡炎链球菌和星座链球菌咽炎亚种(链球菌C+G)菌株的相 应于酿脓链球菌开放阅读框1358(ORF1358)的新的多核苷酸。ORF 1358 的多核苷酸和氨基酸序列已在已公开的国际专利申请WO 02/083859中 提供。所述新的ORF1358多核苷酸编码新的多肽。这些多核苷酸和多肽 可以用于免疫原性组合物以在哺乳动物中诱导对β溶血性链球菌或β 溶血性链球菌感染的免疫应答。
术语″多核苷酸″和″核酸″/″核酸片段″在本文中可互换使用。这些 术语包括通过磷酸二酯键连接的核苷酸。″多核苷酸″可以是单链的或双 链的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物，其任选地包括合成 的、非天然的或经改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可以 包括一个或多个片段的cDNA、基因组DNA、合成的DNA或其混合物。核 苷酸碱基在下文中通过单字母代码表示：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺 嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、次黄嘌呤(I)和尿嘧啶(U)。
″蛋白″或″多肽″是以特定顺序排列的氨基酸链，其由编码所述多肽 的多核苷酸的编码序列决定。
术语″分离的″是指“经由人工”从天然状态改变的。如果组合物或 物质天然存在，那么为了使它被认为是″分离的″，其必须已经发生变化 或从它的原始环境取出，或两者兼有之。例如，天然存在于活的动物中 的多核苷酸或多肽不是″分离的″，但是与其天然状态中的共存材料分离 的相同多核苷酸或多肽是″分离的″，如在下文中所使用的。分离的多核 苷酸或分离的多肽可以从它们天然存在的细胞中纯化。本领域技术人员 已知的常规的核酸和多肽纯化方法可以用于获得本文公开的分离的多 核苷酸或多肽。
术语″可操作地连接″指单个多核苷酸上核酸序列的关系，其使得一 个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如当启动子能够影响 编码序列的表达(即，编码序列在启动子的转录调控之下)时，启动子与 编码序列可操作地连接。编码序列能够以有义或反义方向与调控序列可 操作地连接。
本文描述的ORF1358多核苷酸和ORF1358多肽可以用标准克隆和筛 选技术获得。停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、 咽峡炎链球菌和星座链球菌咽炎亚种的ORF1358多核苷酸可以，例如， 从基因组DNA、从衍生自mRNA的cDNA文库、从基因组DNA文库获得或 可以用公知的和市场上可获得的技术合成，例如通过从cDNA文库PCR 或通过RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)获得。
术语″重组(recombinant)″指例如，通过人工组合两个否则分离的 多核苷酸区段，例如通过化学合成或通过使用基因工程技术操作分离的 多核苷酸来制备多核苷酸。″重组DNA构建体″包含与至少一个调控元件 可操作地连接的任何本发明的分离的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸 序列的分离的多肽。SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列是在比对由停乳链 球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌和星 座链球菌咽炎亚种的多核苷酸序列ORF1358编码并且如SEQ ID NO：2、 SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、 SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32所示的 氨基酸序列后获得的共有序列。
在一个实施方案中，本发明提供了编码多肽的分离的多核苷酸，所 述多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、 SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32或其片段。本文包括由于遗传密 码子的简并性而不同于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、 SEQ ID NO：29、或SEQ ID NO：31所示多核苷酸序列的多核苷酸。这些 多核苷酸编码包含与酿脓链球菌ORF1358编码的多肽相同的功能的多 肽。所述多肽可以包括锌结合活性。
停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎 链球菌和星座链球菌咽炎亚种的ORF1358多核苷酸的直系同源物和等位 基因变体可以使用本领域熟知的方法容易地进行鉴定。ORF1358多核苷 酸的直系同源物和等位基因变体可以包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：25、 SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列的任 一个或多个或其片段通常具有至少约90-95％或更高的同一性的核苷酸 序列。ORF1358多核苷酸的等位基因变体和直系同源物可以编码包含与 SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、 SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32所示氨基酸序列至少90％、95％或97.5％同一的氨 基酸序列的多肽。当其能够在严格条件下与来自具有SEQ ID NO：1、3、 5、7、9、11、25、27、29或31所示核苷酸序列或其片段的任一个或多 个多核苷酸的至少一个片段杂交时，可以容易地鉴定此类多核苷酸。
此外，ORF1358多核苷酸的等位基因变体和直系同源物可以仅包含 停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球 菌和星座链球菌咽炎亚种的ORF1358多核苷酸或基因的编码区的片段， 例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29 或SEQ ID NO：31所示的多核苷酸的片段。在某些实施方案中，此类片 段编码免疫原性片段。
本领域技术人员公认，许多水平的序列同一性可用于鉴定相关多核 苷酸和多肽。用LASERGENE生物信息学计算套组(DNASTAR Inc.，Madison， WI)的Megalign程序进行序列比对和百分比同一性计算。用缺省参数(缺 口罚分＝10，缺口长度罚分＝10)使用Clustal比对法(Higgins和Sharp (1989)CABIOS.5：151-153)进行序列的多重比对。使用Clustal方法 进行配对比对的缺省参数为KTUPLE 1，缺口罚分＝3，窗口＝5和DIAGONALS SAVED＝5。还使用BLAST(Altschul SF，Madden TL，Schaffer AA等人， Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.Nucleic Acids Research.Sep 1 1997；25(17)： 3389-3402)进行序列比对。
本发明的ORF1358多核苷酸可以，例如用于产生免疫原性组合物中 包含的重组多肽。为了产生重组多肽，所述多核苷酸可以包括单独的成 熟多肽的编码序列，或与其他编码序列(例如编码前导或分泌序列、前 蛋白序列或原蛋白序列或前原蛋白序列、或其他的融合肽部分的那些) 连接的成熟多肽的编码序列。例如，帮助纯化融合多肽的标记序列可以 与编码序列连接(参见Gentz等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，86： 821-824，1989)。所述多核苷酸还可以包括编码序列的5′和/或3′序列， 例如转录序列，非翻译序列，剪接信号和多聚腺苷酸化信号。
在某些实施方案中，本文提供的多核苷酸序列信息允许制备能够与 本文公开的选择的多核苷酸的核苷酸序列特异性杂交的相对短的DNA (或RNA)寡核苷酸序列。如本文使用的，术语″寡核苷酸″定义为包含两 个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸(通常三个(3)以上，一般地10 个(10)以上并且多至100个(100)或更多(然而优选在20个和30个之间)) 的分子。确切的大小将取决于许多因素，其又取决于寡核苷酸最终的功 能或用途。因此，在一些实施方案中，基于选择的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、或SEQ ID NO：31 所示的序列)制备合适长度的核酸探针。此类核酸探针与编码停乳链球 菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座 链球菌咽炎亚种的ORF1358多肽的多核苷酸特异性杂交的能力导致其在 各种实施方案中的具体应用。在一些实施方案中，所述探针可用于各种 测定以检测给定的样品中互补序列的存在。这些引物可以以任何方式产 生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。使用本文描述的多核 苷酸设计此类引物的序列，以通过使用聚合酶链式反应(PCR)技术来检 测，扩增或突变来自原核细胞的编码停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、 星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌、或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358 多肽的多核苷酸的界定的片段。
在一些实施方案中，本文描述的多核苷酸可以与合适的标记组合用 于检测杂交体的形成。多种合适的标记是本领域已知的，包括放射性、 酶或其他配体，例如抗生物素蛋白/生物素，其能够发出可检测的信号。
与包含在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、 SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、 SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：14至SEQ ID NO：21之一中的核苷酸序列或 其片段同一或足够同一的多核苷酸，可以用作cDNA和基因组DNA的杂 交探针，或用作核酸扩增(PCR)反应的引物，以分离编码本文描述的多 肽的全长cDNA和基因组克隆，和分离与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、和SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、或SEQ ID NO：31所示多核苷酸 序列或其片段具有高序列相似性的其他基因(包括来自除停乳链球菌以 外的种的编码同源物和直系同源物的基因)的基因组克隆和cDNA。一般 地，这些核苷酸序列与参照多核苷酸序列至少约90％同一至至少约99％ 同一。所述探针或引物通常包含至少15个核苷酸，至少30个核苷酸或 至少50个核苷酸。
本领域技术人员可获得并且公知的数种方法可用于获得全长cDNA 或延伸短的cDNA。例如此类方法可基于cDNA末端快速扩增法(RACE)(参 见Frohman等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，8998-9002，1988)。 例如，该技术的变形(以MarathonTM技术(Clontech，Mountain View， CA)为例)例如显著简化了对较长的cDNA的检索。在MarathonTM技术中， 从提取自选择的组织的mRNA制备cDNA并且在各个末端上连接″接头 (adaptor)″序列。然后使用基因特异和接头特异的寡核苷酸引物进行核 酸扩增(PCR)以扩增″缺失″5′端的cDNA。然后用″嵌套″引物(即，设计 用于在扩增产物内退火的引物(一般地，在接头序列的更3′端退火的接 头特异性引物和在已知基因序列的更5′端退火的基因特异性引物))重 复PCR反应。然后可以通过DNA测序分析所述反应的产物，并通过将产 物直接与现有cDNA连接(以提供全序列)或通过使用新序列信息(用于设 计5′引物)进行单独的全长PCR来构建全长cDNA。
在一个实施方案中，本发明提供分离的和纯化的停乳链球菌似马亚 种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽 炎亚种的ORF 1358多肽，其可用于免疫原性组合物。本发明的免疫原 性组合物中使用的ORF1358多肽可以是重组多肽。
用于本发明的免疫原性组合物的停乳链球菌似马亚种、中间链球 菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的 ORF1358多肽包括包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26、 SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32所示氨基酸序列或其片 段的多肽；所述多肽的功能性的和非功能性的天然存在的变体或生物学 等同物；所述多肽的重组产生的变体或生物学等同物；所述多肽的直系 同源物或等位基因变体。
停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎 链球菌或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358的生物学等同物或变体包括功 能性的和非功能性的停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星 座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358多肽。功能性 的生物学等同物或变体包括停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链 球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358多肽的 天然存在的氨基酸序列变体，其保持在受试者中引发免疫应答或抗原应 答的能力。一般地，功能性变体包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、 SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32中的一 个或多个的一个或多个氨基酸的保守置换；或所述多肽的非关键区域中 的非关键残基的置换、缺失或插入。
在一些实施方案中，可以对本发明的多肽的结构进行修饰和改变， 并且仍然获得具有与未改变的停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座 链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种ORF1358多肽相 同的抗原性的分子。例如，序列中某些氨基酸可以用其他氨基酸进行置 换而不明显损失抗原性。因为确定多肽的生物学功能活性的是多肽的相 互作用能力和性质，所以可以在多肽序列(或其DNA编码序列)中进行某 些氨基酸序列置换并且仍获得具有相似性质的多肽。
在进行改变以获得直系同源物或等位基因变体时，可以考虑氨基酸 的亲水指数(hydropathic index)。本领域公知亲水氨基酸指数在赋予 多肽相互作用生物学功能中的重要性(Kyte和Doolittle，J Mol Biol， 157：p.105-132，1982)。已知某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或 评分的其他氨基酸置换并且仍然产生具有相似生物学活性的多肽。根据 其疏水性和电荷特征赋予各个氨基酸亲水指数。这些指数为：异亮氨酸 (+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱 氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸 (-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)； 组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天 冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域公认，氨基酸残基的相对亲水特征决定所得多肽的二级和三 级结构，所述结构又确定了多肽与其他分子(例如酶、底物、受体、抗 体、抗原等等)的相互作用。本领域已知，氨基酸可以由具有相似亲水 指数的另一个氨基酸置换并且仍然获得功能等同的多肽。在一些实施方 案中，编码ORF1358多肽的多核苷酸可以包含其亲水指数在+/-2以内的 置换的氨基酸。在一些实施方案中，疏水指数在+/-1以内，并且在一些 实施方案中，疏水指数在+/-0.5以内。
还可以基于亲水性(hydrophilicity)进行相似氨基酸的置换，特别 是在由此产生的生物学功能等同的多肽或肽意欲用于免疫学实施方案 的情况下。通过引用并入本文的美国专利4,554,101陈述，多肽的最大 局部平均亲水性(由其邻近的氨基酸的亲水性决定)与其免疫原性和抗 原性相关。
本文使用的术语″变体″为分别与参照多核苷酸或参照多肽不同的 多核苷酸或多肽，其保持至少一个基本性质。多核苷酸的一般变体在核 苷酸序列上区别于参照多核苷酸。变体的核苷酸序列的变化可以改变或 可以不改变由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化可以 引起由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸的置换、添加、缺失、融合和 截短，如下文所描述的。多肽的一般变体在氨基酸序列上区别于参照多 肽。通常，区别是受限制的，从而参照多肽和变体多肽的序列整体上非 常相似并且在许多区域是同一的。变体多肽和其参照多肽可以因一个或 多个置换、添加或缺失或任何组合而在氨基酸序列上不同。置换或插入 的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码子编码的氨基酸残基。多核 苷酸或多肽的变体可以是天然存在的(例如等位基因变体)，或其可以是 已知为非天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可以通 过诱变技术或直接合成来制备。
为了重组生产多肽，宿主细胞经遗传工程改造以包含表达系统，其 部分，或本发明的多核苷酸。包含ORF1358的多核苷酸可以通过例如许 多标准实验手册中描述的方法(例如Davis等人，BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986)和Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))引入宿主细胞。这些方法包括，例 如磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，转介(transvection)，显微 注射，超声，阳离子脂质介导的转染，电穿孔，转导，划痕装载(scrape loading)，基因枪导入(ballistic introduction)和感染。
合适的宿主细胞的代表性例子包括细菌细胞(例如链球菌 (streptococci)、葡萄球菌(staphylococci)、大肠杆菌(E.coli)、链 霉菌(Streptomyces)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞)、酵母 细胞(例如毕赤酵母(Pichia)、酵母(Saccharomyces))、哺乳动物细胞 (例如vero细胞、中国仓鼠卵巢细胞、鸡胚成纤维细胞、BHK细胞、人 SW13细胞)和昆虫细胞(例如Sf9、Sf21)。
重组产生的多肽可以通过公知的方法从重组细胞培养物中回收和 纯化，所述方法包括高效液相色谱、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离 子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、 羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。
任一个或多个系统可用于在异源细胞系统中表达和产生停乳链球 菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座 链球菌咽炎亚种的ORF1358多肽。所述系统尤其包括染色体、附加体和 病毒衍生的系统。载体可以来源于细菌质粒、减毒细菌、噬菌体、转座 子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件或病毒。载体可获自病毒， 例如牛痘及其他痘病毒、辛德毕斯病毒、腺病毒、杆状病毒、乳头多瘤 空泡病毒(例如SV40)、禽痘病毒、伪狂犬病病毒、逆转录病毒、甲病毒 (例如委内瑞拉马脑炎病毒(美国专利5,643,576))、非节段化负链RNA 病毒(例如水疱口炎病毒(美国专利6,168,943))。载体还可来源于其组 合，例如来源于质粒和噬菌体基因元件的载体(例如粘粒和噬粒)。表达 系统应该包括调控和促成表达的调控区，例如启动子及其他调控元件 (例如多聚腺苷酸化信号)。通常，可以使用适于维持、扩增或表达多核 苷酸以在宿主中产生多肽的任何系统或载体。合适的核苷酸序列可以通 过任何公知的和常规的技术(例如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING， A LABORATORY MANUAL(同上)中所示的技术)插入表达系统。
在一个实施方案中，本发明提供表达用于免疫原性组合物的停乳链 球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星 座链球菌咽炎亚种的ORF 1358多肽的表达载体。所述表达载体包含编 码多肽的ORF1358多核苷酸，所述多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、 SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、 SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32所示氨 基酸序列或其片段。可选地，所述表达载体包含多核苷酸，所述多核苷 酸包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、 或SEQ ID NO：31所示核苷酸序列或其片段。在其他实施方案中，本发 明的表达载体包含与增强子-启动子可操作地连接的多核苷酸。在其他 实施方案中，所述表达载体包含与原核启动子可操作地连接的多核苷 酸。可选地，所述表达载体包含与增强子-启动子(其为真核启动子)可 操作地连接的多核苷酸。所述表达载体还可以包含位于羧基端氨基酸的 3′端和编码的多肽的转录单元内的多聚腺苷酸化信号。
″编码序列″指编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。″调控序列″指位 于编码序列的上游(5′非编码序列)，内部，或下游(3′非编码序列)的核 苷酸序列，其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调 控序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。
″启动子″指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核苷酸序列。 通常，编码序列位于启动子序列3′端。启动子序列由邻近的和更远端的 上游元件组成，后一个元件经常称为增强子。因此，″增强子″是可以促 进启动子活性的核苷酸序列，并且可以是启动子的固有元件或被插入以 提高启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可以全部来源于天 然基因，或可以由来源于天然发现的不同启动子的不同元件组成，或甚 至可以包含合成的核苷酸区段。本领域技术人员理解，不同的启动子可 以指导基因在不同组织或细胞类型中，或在不同发育阶段，或应答不同 环境条件的表达。引起核酸片段在大多数细胞类型中在大多数时间表达 的启动子通常称为″组成型启动子″。还公认，由于在大多数情况下没有 完全确定调控序列的精确边界，不同长度的核酸片段可以具有相同的启 动子活性。
常用的启动子来源于病毒，例如多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒 和猿猴病毒40。关于用于原核细胞和真核细胞的其他合适的表达系统， 参见Sambrook等人，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″第 2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989的第16和17章(通过引用并 入本文)。在某些情况下，表达载体能够指导核酸优先地在特定胞类型 中表达(例如，组织特异性调控元件用于表达所述核酸)。组织特异性调 控元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限定性实例包括 白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等人，Genes Dev，1：p.268-277， 1987)，淋巴特异性启动子(Calame和Eaton，Adv Immunol 43：p.235-275， 1988)，特别地，T细胞受体启动子(Winoto和Baltimore，EMBO J，8：p. 729-733，1989)和免疫球蛋白启动子(Banerji等人，Cell，33：p. 729-740，1983)，(Queen和Baltimore，Cell，33：p.741-748，1983)， 神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；Byrne和Ruddle，PNAS，86： p.5473-5477，1989)，胰腺特异性启动子(Edlund等人，Science，230： p.912-916，1985)，和乳腺特异性启动子(例如乳清启动子；美国专利 4,873,316和国际申请EP 264,166)。发育调控启动子还包括例如鼠hox 启动子(Kessel和Gruss，Science，249：p.374-379，1990)和甲胎蛋 白启动子(Campes和Tilghman，Genes Dev，3：p.537-546，1989)。
本文还提供包含编码停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球 菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种ORF1358多肽的至少 一部分的多核苷酸的重组表达载体，所述多核苷酸以反义方向克隆入表 达载体。即，DNA分子与调控序列以这样的方式可操作地连接，其允许 表达对于停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽 峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358多肽mRNA是反义的RNA 分子(通过DNA分子的转录)。可以选择指导反义RNA分子在各种细胞类 型中连续表达的与以反义方向克隆的核酸可操作地连接的调控序列。例 如，可以选择指导反义RNA组成型、组织特异性或细胞种类特异性表达 的病毒启动子和/或增强子，或调控序列。反义表达载体可以为重组质 粒、噬粒或减毒病毒，其中在高效调控区(其活性可以由引入所述载体 的细胞种类决定)的控制下产生反义核酸。
本文描述的重组表达载体可以插入任何合适的宿主细胞。术语″宿 主细胞″和″重组宿主细胞″在本文可互换使用。应理解，此类术语不仅 指特定的受试细胞，还指该细胞的后代或可能的后代。因为可能在后续 世代中发生某些修饰(由于突变或环境影响)，所以所述后代实际上可能 与亲代细胞不同，但是其仍然包括在本文使用的术语的范围内。宿主细 胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如停乳链球菌似马亚种、中间链 球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的 ORF1358多肽可以在细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞(例如Sf9、 Sf21)、酵母细胞或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、VERO、 鸡胚胎成纤维细胞、BHK细胞或COS细胞)中表达。其他合适的宿主细胞 是本领域技术人员已知的。
载体DNA可通过常规的转化、感染或转染技术引入原核细胞或真核 细胞。如本文使用的，术语″转化″和″转染″意指各种本领域公认的用于 将外源核酸(例如DNA)引入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉 淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质转染、超声或电穿孔。用于转化或 转染宿主细胞的合适的方法可以参见例如Sambrook等人(″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor N.Y.1989)及其他实验手册。
本文描述的宿主细胞(例如培养的原核或真核宿主细胞)可用于制 备(即表达)停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、 咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358多肽。因此，本文还描 述使用此类宿主细胞制备多肽的方法。在一个实施方案中，所述方法包 括在合适的培养基中培养所述宿主细胞(其中已经引入编码ORF1358多 肽的重组表达载体)直至产生所述多肽。在另一个实施方案中，所述方 法还包括从所述培养基或所述宿主细胞分离ORF1358多肽。
原核生物中的多肽表达通常在大肠杆菌(其具有包括指导融合或非 融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体)中进行。组成型启动子 包括例如λPL、spc核醣体和β-内酰胺酶启动子。诱导型启动子包括 例如阿拉伯糖、lac、tac和麦芽糖结合蛋白启动子。融合载体将许多氨 基酸添加至其中编码的蛋白，通常添加至重组蛋白质的氨基末端。一般 地，此类融合载体用于三个目的：增加重组蛋白质的表达；增加重组蛋 白质的可溶性；和通过用作亲和纯化的配体帮助纯化重组蛋白质。通常， 在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白质的连接处引入蛋白水解切 割位点，以使得能够在纯化融合蛋白后将所述重组蛋白质与所述融合部 分分开。此类酶和它们的相应识别序列包括因子Xa，凝血酶和肠激酶。 本发明还提供包含至少一个本发明的多核苷酸的载体(例如表达载体、 测序载体、克隆载体)，用本发明的载体遗传工程改造的宿主细胞，和 通过重组技术产生本发明的多肽。无细胞翻译系统也可以用于使用来源 于本发明的DNA构建体的RNA制备所述蛋白。
可用于表达停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚 种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358多肽的表达载体是 病毒载体，例如慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺病毒相关 病毒、痘苗病毒、杆状病毒及其他具有期望的细胞嗜性的重组病毒。因 此，编码功能性或突变的蛋白或多肽或其片段的基因可以使用病毒载体 或通过DNA的直接引入来体内、离体或体外引入。可以通过将转基因载 体靶向特定细胞(例如具有病毒载体或受体配体的细胞)或通过使用组 织特异性启动子，或通过上述两者，影响靶向的组织中的表达。靶向基 因递送在PCT公开案WO 95/28494中描述。
通常用于体内或离体靶向和治疗方法的病毒载体是基于DNA的载体 和逆转录病毒载体。用于构建和使用病毒载体的方法是本领域已知的 (例如Miller和Rosman，BioTechniques，1992，7：980-990)。优选地， 病毒载体是复制缺陷型的，即它们不能在靶细胞中自主复制。优选地， 所述复制缺陷型病毒是最小的病毒，即其仅保留包装基因组以产生病毒 颗粒所必须的基因组序列。
DNA病毒载体包括减毒的或缺陷型DNA病毒，例如单纯疱疹病毒 (HSV)，乳头瘤病毒，EB病毒(EBV)，腺病毒，腺病毒相关病毒(AAV)等。 完全或几乎完全缺失病毒基因的缺陷型病毒是优选的。缺陷型病毒在引 入细胞后不是感染性的。缺陷型病毒载体的使用允许施用至特定的限定 区域中的细胞，而不用担心所述载体会感染其他的细胞。因此，可以特 异性靶向特定组织。特定载体的实例包括但不限于缺陷型疱疹病毒1 (HSV1)载体(Kaplitt等人，Molec.Cell.Neurosci.，1991 2：320-330)， 缺失糖蛋白L基因的缺陷型疱疹病毒载体，或其他缺陷型疱疹病毒载体 (PCT公开号WO 94/21807和WO 92/05263)；减毒的腺病毒载体，例如 Stratford-Perricaudet等人描述的载体(J.Clin.Invest.，1992，90： 626-630；也参见La Salle等人，Science，1993，259：988-990)；和缺 陷型腺病毒相关病毒载体(Samulski等人，J.Virol.，1987，61：3096- 3101；Samulski等人，J.Virol.，1989，63：3822-3828；Lebkowski 等人，Mol.Cell.Biol.，1988，8：3988-3996)。
本发明的多肽(包括包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、 SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、或SEQ ID NO：13所示氨 基酸序列的多肽，它们的片段和其类似物)，或表达所述多肽的细胞还 可以用作免疫原以产生对本发明的多肽免疫特异的抗体。本发明包括对 停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球 菌或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358多肽具有免疫特异性的抗体，所述 抗体用于检测细胞、细胞或组织提取物或生物液体中停乳链球菌似马亚 种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽 炎亚种ORF1358多肽的存在，或测量所述多肽的量或浓度的用途，或用 于治疗停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡 炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种感染的用途。
本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和抗独特型 抗体。多克隆抗体是来源于用抗原免疫的动物的血清的异质性抗体分子 群体。单克隆抗体是抗特定抗原的基本上均质的抗体群体。通常，可以 例如使用常规的杂交瘤技术(Kohler和Milstein，Nature，256：495- 499，1975)，重组DNA方法(美国专利4,816,567)，或使用抗体文库的 噬菌体展示(Clackson等人Nature 352：624-628，1991；Marks等人J. Mol.Biol.222：581-597，1991)产生抗体。对于其他抗体产生技术， 参见Antibodies：A Laboratory Manual，eds.Harlow和Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。本发明不限于抗体的任何特定来源、 制备方法、或其他特殊的特征。
完整的抗体是免疫球蛋白(Ig)，并且它们一般是两条轻链(各～25 kDa)和两条重链(各～50kDa)组成的四聚体糖基化蛋白质。轻链分为两 种同种型(λ和κ)，而重链分为五种同种型(A、D、E、G和M)。一些重 链同种型进一步分为同种型亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
不同抗体的结构域和三维结构是本领域已知的(Harlow和Lane，同 上)。简言之，轻链由恒定结构域(CL)和N-末端可变结构域(VL)组成。重 链由三个或四个恒定结构域(CH)，绞链区和N-末端可变结构域(VH)组成。 与VH结构域邻近的CH称为CH1。VH和VL结构域包括称为构架(FR)区(FR1、 FR2、FR3和FR4)的四个保守序列区域，其形成称为互补决定区(CDR)的 三个高变序列区域的支架。CDR(CDR1、CDR2和CDR3)包括大多数特异 性识别和结合抗原的抗体氨基酸。重链CDR表示为H1、H2和H3，而轻 链CDR表示为L1、L2和L3。
Fab片段(抗原结合片段)由通过恒定区之间的二硫键共价连接的 VH-CH1和VL-CL结构域组成。Fv片段较小，并且由非共价连接的VH和VL结构域组成。为了克服非共价结构域相互分离的趋势，可以构建单链Fv 片段(scFv)。scFv包括(1)将VH的C末端连接至VL的N-末端的柔性多肽， 或(2)将VL的C末端连接至VH的N-末端的柔性多肽。15聚体(Gly4Ser)3肽可以用作接头，但是其他接头是本领域已知的。
使用多个编码可变区的种系基因和多种体细胞事件来产生抗体多 样性。所述体细胞事件包括可变基因区段和多样性(D)及连接(J)基因区 段的重组(以产生完整VH区域)以及可变和连接基因区段的重组(以产生 完整VL区域)。CDR3(H3)是抗体序列内分子多样性的最大来源。例如 H3可以短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸残基。最小的抗原结合 段是Fv，其由VH和VL结构域组成。
本发明的抗ORF1358多肽抗体任选地可以包含抗体恒定区或其部 分。例如，VL结构域可以在其C-末端连接到轻链恒定结构域如Cκ或Cλ。 相似地，VH结构域或其部分可以连接至重链如IgA、IgD、IgE、IgG和 IgM和任何同种型亚类的全部或部分。抗体同种型例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4由CH2和CH3结构域决定。可以通过改变这些结构域转换同种型 而不影响抗原结合。恒定区是本领域已知的(参见例如Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，No.91-3242， National Institutes of Health Publications，Bethesda，MD，1991)。
嵌合抗体是其不同部分来源于不同动物物种的分子，例如具有来源 于鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。嵌合抗体和用 于制备它们的方法是本领域已知的(Cabilly等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 81：3273-3277，1984；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81：6851-6855，1984；Boulianne等人Nature 312：643-646，1984； Cabilly等人，欧洲专利申请125023(1984年11月14日公开)； Taniguchi等人，欧洲专利申请171496(1985年2月19日公开)； Morrison等人，欧洲专利申请173494(1986年3月5日公开)；Neuberger 等人，PCT申请WO 86/01533(1986年3月13日公开)；Kudo等人，欧 洲专利申请184187(1986年6月11日公开)；Morrison等人，欧洲专 利申请173494(1986年3月5日公开)；Sahagan等人，J.Immunol.137： 1066-1074，1986；Robinson等人，PCT/US86/02269(1987年5月7日 公开)；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443，1987； Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218，1987；Better 等人，Science 240：1041-1043，1988)。
抗独特型(抗Id)抗体是识别独特的决定簇的抗体，所述决定簇通常 与抗体的抗原结合位点相关。通过用单克隆抗体(针对其制备抗Id)免疫 与单克隆抗体的来源相同的物种和基因型(例如小鼠品系)的动物来制 备抗Id抗体。经免疫的动物通过产生抗这些同种型决定簇的抗体(抗Id 抗体)来识别和应答免疫抗体的独特决定簇。
因此，产生的抗本发明的多肽的单克隆抗体可用于在合适的动物中 诱导抗Id抗体。来自经免疫的动物的脾细胞可用于产生分泌抗Id单克 隆抗体的抗Id杂交瘤。此外，抗Id抗体可以偶联至载体(例如钥孔血 蓝蛋白(KLH))和用于免疫另外的BALB/c小鼠。来自这些小鼠的血清包 括抗抗Id抗体，其具有对RPTPase表位特异的最终的mAb的结合性质。 因此，抗Id抗体具有它们的独特表位或″独特位(idiotopes)″，其在结 构上与待评估的表位(例如由ORF1358编码的停乳链球菌似马亚种、中 间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌、或星座链球菌咽炎亚 种的多肽)类似。
术语″抗体″还意欲包括完整分子以及片段(例如Fab)两者，其能够 结合抗原。Fab片段缺少完整抗体的Fc片段，其更快地从循环系统清除， 并且可以比完整抗体具有更少的非特异性组织结合(Wahl等人，J.Nucl. Med.24：316-325，1983)。应理解，按照用于完整抗体分子的方法，Fab 及本发明可使用的其他抗体片段可以用于停乳链球菌似马亚种、中间链 球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的多 肽的检测和定量。
抗Id抗体还可以用作″免疫原″，以在另一动物中诱导免疫应答， 产生所谓的抗抗Id抗体。抗抗Id可以与初始的mAb(其诱导抗Id)表 位相同。因此，通过使用抗mAb的独特决定簇的抗体，可以鉴定表达具 有相同特异性的抗体的其他克隆。
抗体可以用于多种方法中，例如用于证明蛋白已表达，或用于证明 蛋白表达的位置。标记的抗体(例如用于FACS的荧光标记)可以与完整 细菌一起温育，并且细菌表面上标记的存在证明蛋白的位置。
可以使用其他合适的方法来产生或分离抗体，所述抗体特异性结合 C型或G型链球菌的ORF1358多肽表位。在一些实施方案中，重组抗体 选自肽或蛋白展示文库，例如噬菌体、核糖体、寡核苷酸、RNA和cDNA 展示文库(EP368,684；PCT/GB91/01134；PCT/GB92/01755； PCT/GB92/002240；PCT/GB92/00883；PCT/GB93/00605； PCT/GB94/01422；PCT/GB94/02662；PCT/GB97/01835；WO90/14443； WO90/14424；WO90/14430；PCT/US94/1234；WO92/18619；WO96/07754； EP614,989；WO95/16027；WO88/06630；WO90/3809；美国专利 4,704,692；PCT/US91/02989；WO89/06283；EP371,998；EP550,400； EP229,046；和PCT/US91/07149)。在其他实施方案中，重组抗体选自随 机产生的肽或蛋白质的文库(美国专利5,723,323；5,763,192； 5,814,476；5,817,483；5,824,514；5,976,862；WO 86/05803；和EP 590,689)。在其他实施方案中，重组抗体在转基因动物中产生，所述动 物能够产生人抗体库(repertoire)(Nguyen等人，Microbiol.Immunol. 41：901-907，1997；Sandhu等人，Crit.Rev.Biotechnol.16：95-118， 1996；和Eren等人，Immunol.93：154-161，1998)。用于产生重组抗体 的其他技术包括例如单细胞抗体产生技术，例如选择淋巴细胞抗体方法 (″SLAM″)(美国专利5,627,052)，凝胶微滴和流式细胞术法(Powell等 人，Biotechnol.8：333-337，1990)，和B细胞选择(Steenbakkers等 人，Molec.Biol.Reports 19：125-134，1994)。这些方法还可以用于 改善抗C型或G型链球菌PPI抗体对其特异性结合的靶的亲和力和/或 亲合力。
本发明提供包含一个或多个由ORF1358编码的停乳链球菌似马亚 种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽 炎亚种的多肽的免疫原性组合物。在某些实施方案中，免疫原性组合物 包含一个或多个停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚 种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的多肽和一个或多个生理学可 接受的载体，所述多肽包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、26、 28、30、32至少97.5％、98％、99％或100％同一的氨基酸残基序列。
在其他实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含编码停乳链球菌 似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链 球菌咽炎亚种的ORF1358多肽的多核苷酸和一个或多个生理学可接受的 载体。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含具有与SEQ ID NO：1、3、 5、7、9、11、25、27、29、或31的一个或多个至少90％、95％、99％或 100％同一的核苷酸序列的多核苷酸。
如本文使用的，术语″免疫原性组合物″指可施用形式的任何种类的 生物制剂，其能够在用免疫原性组合物接种的动物(包括人)中刺激免疫 应答。免疫应答可以包括诱导抗体和/或诱导T细胞应答。在本文中， 当用于免疫原性组合物时，术语″保护″指与所述的疾病或病况相关的任 何症状的改善(部分或完全)。因此，通过呈递免疫原性组合物来保护动 物抵抗链球菌或链球菌的种(例如停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、 星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种)的感染， 通常导致细菌生长和/或与链球菌的种的感染相关的一个或多个临床症 状的减少，所述症状包括关节炎、心内膜炎、脑膜炎、多发性浆膜炎、 支气管肺炎、脑膜炎、永久性听力损失和脓毒性休克。
本文公开的方法可以包括诱导抗一个或多个病原体的免疫应答。所 述病原体包括链球菌的种(例如停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星 座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种)。例如，所 述方法可以包括诱导抗一个或多个病原体的多克隆抗体，所述病原体包 括链球菌的种(其可以包括停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链 球菌星座亚种、咽峡炎链球菌、或星座链球菌咽炎亚种)。在一些实施 方案中，所述方法包括向受试者(任何脊椎动物，包括人类患者及其他 哺乳动物)施用包括分离的停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链 球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358多肽或 多核苷酸的组合物。
可将多种测试用于评估本发明的多肽的体外免疫原性。例如，通过 将停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链 球菌或星座链球菌咽炎亚种的细胞、包含抗所述多肽的特异性抗体的热 灭活的血清和外源补体来源的混合物共同温育，实施体外调理素测定 (opsonic assay)。在新鲜分离的多形核细胞(PMN′s)和抗体/补体/停乳 链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或 星座链球菌咽炎亚种细胞的混合物的温育期间发生调理吞噬作用。在调 理吞噬后，包被抗体和补体的细菌细胞被杀死。逃脱调理吞噬作用的存 活细菌的菌落形成单位(cfu)通过将测定混合物涂板来确定。滴度报告 为杀死≥50％细菌(如通过与测定对照相比所确定的)的最高稀释度的倒 数。在测试的最低血清稀释度(1∶8)下杀死小于50％细菌的样品报告为具 有4的OPA(调理吞噬抗体)滴度。测试的最高稀释度为1∶2560。在最 高稀释度下杀死≥50％细菌的样品以更高的初始稀释度开始进行重复。 上述方法为改进的Gray′s方法(Gray，Conjugate Vaccines Supplement， p.694-697，1990)。对于每一个单独的血清，包括包含测试血清加细菌 细胞和热灭活的补体的测试血清对照。该对照用于评估抗生素或其他血 清组分的存在是否能够直接杀死细菌菌株(即在补体或PMN′s不存在的 情况下)。具有已知的调理素滴度的人血清用作阳性人血清对照。各个 未知血清的调理素抗体滴度计算为产生50％的cfu减少(与不具有血清 的对照相比)的血清初始稀释度的倒数。
全细胞ELISA测定也用于评估多肽抗原的体外免疫原性和表面暴 露，其中将目的细菌菌株包被至平板(例如96孔板)上，并且将来自免 疫的动物的测试血清与细菌细胞反应。如果对测试多肽抗原特异的任何 抗体与表面暴露的多肽抗原的表位反应，那么其可以通过本领域技术人 员已知的标准方法来检测。
然后，显示期望的体外活性的任何多肽可以在体内动物攻击模型中 进行测试。在某些实施方案中，通过本领域技术人员已知的免疫方法和 途径(例如经鼻的、胃肠外的、肌内的、口服的、直肠的、阴道的、经 皮的、腹膜内的、静脉内的、皮下的等等)，将免疫原性组合物用于免 疫动物(例如小鼠)。在用特定的停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星 座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的免疫原性组 合物免疫动物后，用相同的或其他链球菌的种攻击所述动物，并且测定 对相同或其他链球菌的种的感染的抗性。
将停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡 炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358多肽和多核苷酸掺入适于施 用给受试者(例如人)的免疫原性组合物。一般地，此类组合物包含核酸 分子或蛋白，和药学上可接受的载体。如在下文中使用的，术语″药学 上可接受的载体″意欲包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介 质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、赋形剂等。此类 介质和试剂用于药学活性物质的用途是本领域已知的。除非常规介质或 试剂与活性化合物不相容，否则此类介质可用于本发明的组合物。还可 将补充的活性化合物掺入组合物。
配制本发明的免疫原性组合物以与其预期的施用途径相容。施用途 径的实例包括胃肠外(例如肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内)、经粘 膜(例如口服、直肠、经鼻、阴道、呼吸道)和经皮(局部)途径。用于胃 肠外、皮内、或皮下施用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释 剂例如注射用水、盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他 合成的溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如 抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙 酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。 pH可以用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)调节。胃肠外制剂可以装入安 瓿，一次性注射器或玻璃或塑料制成的多次剂量小瓶。
适合用于注射的药物组合物包括无菌水溶液(在水可溶的情况下) 或分散体和用于无菌注射溶液或分散体的即时制备的无菌粉剂。对于静 脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF， Parsippany，N.J)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必 须是无菌的并且应该为易于注射的液体。其在制备和储存条件下必须是 稳定的并且必须在抗微生物(例如细菌和真菌)的污染作用下进行保存。 载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、 丙二醇、和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物。可以例如通过使用包 衣例如卵磷脂，通过维持所需颗粒大小(在分散体的情况下)以及通过 使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂 例如对羟苯甲酸、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸等来预防微生物的作用。在 许多情况下，组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山 梨醇)、氯化钠。可以通过将延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶) 包括在组合物中来实现可注射组合物的延长的吸收。
可以通过将需要的量的活性化合物(例如停乳链球菌似马亚种、中 间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌、或星座链球菌咽炎亚 种的ORF1358多肽或抗所述多肽的抗体)与上文列举的成分之一或组合 一起(需要时)掺入合适的溶剂中，然后进行过滤灭菌来制备无菌可注射 溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物(其含有基本分散介质 和所需的来自上面例举的成分的其他成分)来制备分散体。在用于制备 无菌注射液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干 燥(所述方法从其之前的无菌过滤的溶液产生活性成分加任何额外的期 望的成分的粉剂)。
通常，口服组合物包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以装入明 胶胶囊或压制成片剂。为了进行口服治疗施用，可以将活性化合物与赋 形剂一起掺入并且用于形成片剂、锭剂或胶囊。还可以使用液体载体来 制备用作嗽口水的口服组合物，其中将液体载体中的化合物口服施用， 并且漱口和吐出或咽下。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可以被包 括作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以包含任何下列成 分，或具有相似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素，黄蓍胶或明 胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、Primogel或玉米 淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶体二氧化硅； 甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调 味剂。
为了通过吸入施用，化合物以气溶胶喷雾形式从加压容器或分配器 (其包含合适的推进剂，例如气体例如二氧化碳)或喷雾器递送。还可以 通过经粘膜或经皮方式全身施用。为了经粘膜或经皮施用，在制剂中使 用适合于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂是本领域公知的，并且包 括例如用于经粘膜施用的去垢剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。可以通过 使用喷鼻剂或栓剂来实现经粘膜施用。为了经皮施用，如本领域公知的， 将活性化合物配制成软膏、油膏、凝胶或乳膏。
化合物还可以制备成栓剂(例如使用常规的栓剂基质(例如可可脂 及其他甘油酯))或保留灌肠剂用于直肠递送。
在一个实施方案中，将活性化合物与载体一起制备，所述载体防止 所述化合物从体内快速清除，例如控释制剂，包括植入物和微囊密封的 递送系统。
可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、 聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法 对本领域技术人员来说是显而易见的。材料还可以从Alza Corporation (Mountain View，CA)和Nova Pharmaceuticals，Inc.(Baltimore，MD) 商购获得。脂质体悬浮液(包括用抗病毒抗原的单克隆抗体靶向感染的 细胞的脂质体)还可以用作药学上可接受的载体。可以按照本领域技术 人员已知的方法(例如如美国专利4,522,811所述的)制备它们。
以剂量单位形式(为了便于施用和剂量均一)配制口服或胃肠外组 合物是有利的。如本文使用的，剂量单位形式是指适合作为用于待治疗 的受试者的单位剂量的物理上分开的单位；各个单位包含预定量的活性 化合物(与所需的药物载体结合)，其经计算产生期望的治疗效果。本发 明的剂量单位形式的规格(specification)受制于和直接取决于活性 化合物的独特特征和要获得的具体治疗效果，以及配制用于治疗个体的 此类活性化合物的领域中固有的限制。
通过将本发明的一个或多个多肽与一个或多个已知的链球菌多糖 或多糖-蛋白缀合物组合来提供组合的免疫原性组合物。
糖-蛋白缀合物的蛋白组分称为″载体蛋白″。术语″载体蛋白″包括 非毒性、非反应原性和可以以足够的量和纯度获得的蛋白。载体蛋白应 适合于标准缀合方法。例如CRM197可以用作载体蛋白。CRM197(Wyeth， Sanford，N.C.)是分离自在基于酪蛋白氨基酸和酵母提取物的培养基中 培养的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7(β197)的 培养物的白喉毒素的无毒变体(类毒素)。通过超滤、硫酸铵沉淀和离子 交换色谱纯化CRM197。其他白喉类毒素也适合用作载体蛋白。
其他合适的载体蛋白包括灭活的细菌毒素，例如破伤风类毒素、百 日咳类毒素、霍乱类毒素(例如PCT公开案WO/2004/083251中描述的)、 大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、和来自铜绿假单胞菌的外毒素A。还可以使 用细菌外膜蛋白，例如外膜复合物C(OMPC)、孔蛋白、转铁结合蛋白、 肺炎球菌溶血素(pneumolysis)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球 菌粘附蛋白(PsaA)或流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D。 其他蛋白，例如卵白蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或 结核菌素的纯化的蛋白衍化物(PPD)，也可以用作载体蛋白。
通过各种载体和表达系统，将包含停乳链球菌似马亚种、中间链球 菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的 ORF1358多核苷酸的免疫原性组合物递送至接受者。此类系统尤其包括 如上所述的染色体、附加体和病毒衍生的系统。
一般地，以单位剂量制剂胃肠外施用本发明的免疫原性组合物，所 述的制剂包含标准的，公知无毒的生理学可接受的载体、佐剂、和媒介 物(需要时)。
药学上可接受的媒介物是指加入药物或免疫原性组合物的化合物 或化合物的组合，其不引起副作用并且使得能够，例如促进活性化合物 的施用，增加其在体内的寿命和/或功效，增加其在溶液中的溶解性或 可选地提高其保存。这些药学上可接受的媒介物是公知的，并且本领域 技术人员根据选择的活性化合物的性质和施用方式可以对其进行调整。
使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂，根据已知的技术，可配制注 射制剂(例如无菌注射水性或油性悬浮液)。无菌注射制剂还可以是在无 毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在 1，3-丁二醇中的溶液。
可以使用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格溶液和等渗氯化钠 溶液。此外，无菌的非挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使 用任何温和的非挥发油，包括合成的甘油单或双酯。此外，脂肪酸(例 如油酸)可用于注射制剂中。
载体包括用磷酸盐、乳酸盐、Tris等缓冲的中性盐溶液。当施用病 毒载体时，将载体充分纯化以使其基本上不含不期望的污染物，例如缺 陷型干扰腺病毒颗粒或内毒素及其他热原，从而使其不在接受载体构建 体的个体中引起任何不良反应。在一些实施方案中，纯化载体的方法包 括使用浮力密度梯度，例如氯化铯梯度离心。
载体还可以是脂质体。将脂质体用作递送媒介物的方法是本领域公 知的(参见例如，Schwendener RA的综述，Adv.Exp.Med.Biol.620： 117-128，2007)。
本发明的免疫原性组合物还包含与控制基因表达的调控序列可操 作地连接的本发明的多核苷酸序列。将目的多核苷酸序列改造入表达载 体(例如质粒)，使其在调控元件的控制下，所述调控元件促进DNA的表 达，即启动子和/或增强子元件。在一些实施方案中，使用人巨细胞病 毒立即早期启动子/增强子(美国专利5,168,062)。启动子可以是细胞特 异性的，并且只允许在预先确定的细胞中大量转录多核苷酸。
将本发明的多核苷酸直接引入宿主作为“裸”DNA(美国专利 5,580,859)或配制到具有促进剂例如布比卡因和其他局部麻醉剂(美国 专利5,593,972)和阳离子聚胺(美国专利6,127,170)的组合物中。在该 多核苷酸的免疫方法中，在体内瞬时表达本发明的多肽；没有遗传物质 插入或整合到宿主的染色体中。该方法与基因治疗不同，基因治疗的目 的是将目的遗传物质插入或整合到染色体中。测定用于证实，通过免疫 施用的多核苷酸没有引起宿主表型的改变(例如美国专利6,168,918)。
在某些实施方案中，本文描述的免疫原性组合物还包括一个或多个 佐剂。佐剂是当与免疫原或抗原一起施用时增强免疫应答的物质。许多 细胞因子或淋巴因子已显示具有免疫调节活性，并且因此可用作佐剂， 其包括但不限于，白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(参 见例如美国专利5,723,127)、13、14、15、16、17和18(和其突变形 式)；干扰素α、β、γ；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(参见 例如美国专利5,078,996和ATCC登录号39900)；巨噬细胞集落刺激因 子(M-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；和肿瘤坏死因子α和β。可 与本文描述的免疫原性组合物一起使用的其他佐剂还包括趋化因子，包 括但不限于MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES；粘附分子，例如选择 素，例如L-选择素、P-选择素和E-选择素；粘蛋白样分子，例如CD 34、 GlyCAM-1和MadCAM-1；整合蛋白家族成员，例如LFA-1、VLA-1、Mac-1 和p150.95；免疫球蛋白超家族的成员，例如PECAM、ICAM(例如ICAM-1、 ICAM-2和ICAM-3)、CD2和LFA-3；共刺激分子，例如CD40和CD40L； 生长因子，包括血管生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、 表皮生长因子、B7.2、PDGF、BL-1和血管内皮生长因子；受体分子，包 括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、 LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6；和Caspase (ICE)。
用于增强免疫应答的合适的佐剂还包括但不限于美国专利 4,912,094中描述的MPLTM(3-O-脱酰单磷酰脂质A，Corixa，Hamilton， MT)。适合用作佐剂的还有合成的脂质A类似物或氨基烷基葡萄糖胺磷 酸酯化合物(AGP)，或其衍生物或类似物，其可以从Corixa(Hamilton， MT)获得，并且在美国专利6,113,918中描述。此类AGP之一为2-[(R)-3- 十四酰基氧十四酰基氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四 酰基氧十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰基氧十四酰基-氨基]-b-D-吡喃葡 萄糖苷，其又称为529(以前称为RC529)。将该529佐剂配制为含水形 式(AF)或稳定乳剂(SE)。
其他佐剂还包括胞壁酰肽，例如N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷 氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-normuramyl-L-丙氨酸-2-(1′-2′二棕榈酰 -sn-甘油-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(MTP-PE)；水包油乳剂，例如MF59(美 国专利6,299,884)(包含5％角鲨烯、0.5％Tween 80和0.5％Span 85(任 选地包含不同量的MTP-PE)，使用微射流机例如110Y型微射流机 (Microfluidics，Newton，MA)制成亚微米颗粒)，和SAF(包含10％角 鲨烯、0.4％Tween 80、5％pluronic-嵌段共聚物L121，和thr-MDP， 微流化为亚微米乳剂或涡旋产生较大颗粒尺寸的乳剂)；不完全弗氏佐 剂(IFA)；铝盐(铝)，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝；Amphigen； Avridine；L121/角鲨烯；D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷；pluronic多元醇； 杀死的博德特氏菌(Bordetella)；皂苷，例如StimulonTM QS-21 (Antigenics，Framingham，MA)(描述于美国专利5,057,540中)， ISCOMATRIX(CSL Limited，Parkville，Australia)(描述于美国专利 5,254,339中)和免疫刺激复合物(ISCOMS)；结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)；细菌脂多糖；合成的多核苷酸，例如 包含CpG基序的寡核苷酸(例如美国专利6,207,646)；欧洲专利 1,296,713和1,326,634中描述的IC-31(Intercell AG，Vienna， Austria)；百日咳毒素(PT)或其突变体，霍乱毒素或其突变体(例如美 国专利7,285,281、7,332,174、7,361,355和7,384,640)；或大肠杆菌 不耐热毒素(LT)或其突变体，尤其是LT-K63、LT-R72(例如美国专利 6,149,919、7,115,730和7,291,588)。
本发明特别涉及通过在受试者中产生有益的治疗应答的条件下，对 受试者施用治疗性免疫学试剂(例如识别停乳链球菌似马亚种、中间链 球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种 ORF1358多肽内的特定表位的人源化单克隆抗体)来治疗链球菌感染。
“免疫学试剂”包括例如抗体、人源化抗体、抗体片段、包含抗原结合 元件或CDR的肽等。″有益的治疗应答″包括例如诱导对β-溶血性链球 菌的吞噬作用或调理作用。本发明还涉及公开的免疫学试剂在制备用于 治疗或预防β溶血性链球菌感染的药物中的用途。
在一个方面，本发明提供预防或治疗患者中与β溶血性链球菌感染 相关的疾病的方法。本发明的一些方法需要给患者施用有效剂量的与停 乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌 或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358表位特异性结合的抗体。所述方法对 预防或治疗受试者中的β溶血性链球菌疾病特别有用。″受试者″包括任 何脊椎动物，例如伴侣动物、家畜、哺乳动物和人类患者。示例性方法 包括施用有效剂量的与停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌 星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种的ORF1358多肽结合的 抗体或抗原结合肽。一些实施方案包括施用有效剂量的抗体或包含抗原 识别位点或CDR的其他肽，所述抗体或其他肽特异性结合停乳链球菌似 马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球 菌咽炎亚种的ORF1358多肽(例如包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、 13、26、28、30或32的任一个或多个的氨基酸序列的多肽)内的表位。
在另一个方面中，本发明的特征为在受试者中施用与停乳链球菌似 马亚种、中间链球菌、星座链球菌星座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球 菌咽炎亚种的ORF1358多肽结合的抗体或其他抗原结合肽并且诱导抗β 溶血性链球菌的清除应答。例如，可以通过Fc受体介导的吞噬作用实 现清除应答。
一般地，本发明的治疗性免疫学试剂是基本上纯的，不含不想要的 污染物。这是指一般地，免疫学试剂纯度为至少约50％w/w(重量/重量)， 而且基本上不含干扰蛋白质和污染物。在一些实施方案中，免疫学试剂 纯度为至少约80％w/w。在其他的实施方案中，免疫学试剂纯度为至少 90％或约95％w/w。然而，使用常规的蛋白纯化技术，可以获得纯度为至 少99％w/w的均质的肽。
所述方法可以用于无症状的受试者和当前表现出疾病症状的受试 者。所述方法中使用的抗体可以是人的、人源化的、嵌合的或非人的抗 体，或其片段(例如抗原结合片段、包含表位结合区或CDR的肽)并且如 本文所述的，可以是单克隆的或多克隆的。
在另一个方面，本发明的特征为将抗体和药物载体一起作为药物组 合物进行施用。可选地，可以通过施用编码至少一个抗体链的多核苷酸 来给受试者施用抗体。表达所述多核苷酸，以在患者中产生抗体链。任 选地，所述多核苷酸编码抗体的重链和轻链。表达所述多核苷酸，以在 患者中产生重链和轻链。在示例性实施方案中，就患者的血液中施用的 抗体的水平监控患者。
适于接受治疗的受试者包括处于疾病风险但没有表现出症状的个 体，和当前已表现出症状的患者。因此，本发明的免疫原性组合物和治 疗性抗体可以预防性地施用给普通群体。在无症状的受试者中，可以在 任何年龄开始治疗。可以通过测定抗体随时间的水平来监控治疗。如果 免疫应答或抗体水平下降，则表示需要加强剂量。
在预防性应用中，给对β-溶血性链球菌感染易感或处于β-溶血性 链球菌感染的风险中的受试者施用足以除去或降低所述风险，减轻严重 度，或延迟疾病(包括与所述感染相关的疾病的生物化学、组织学和/或 行为的症状、其并发症和疾病发展期间表现出的中间病理学表型)的发 作的量的免疫原性组合物或药物。在治疗性应用中，对怀疑患有或已经 患有所述疾病的患者施用足以治愈或至少部分阻止所述疾病的症状(生 物化学的、组织的和/或行为的)，包括其并发症和疾病发展中的中间病 理学表型的量的组合物或药物。
足以实现治疗性或预防性治疗的量定义为治疗或预防有效剂量。在 预防和治疗方案中，通常以数种剂量施用免疫学试剂直到已经获得足够 的免疫应答。术语″免疫应答″或″免疫学应答″包括在接受免疫的受试者 中引发抗抗原的体液应答(抗体介导的)和/或细胞应答(由抗原特异性T 细胞或它们的分泌产物介导的)。此类应答可以是主动应答(即，通过施 用免疫原诱导的(同上))，或被动应答(即，通过施用免疫球蛋白或抗体 或经引发的T细胞诱导的)。一般地，监控免疫应答并且如果所述免疫 应答开始减弱，则给予重复剂量。
用于治疗β溶血性链球菌感染的本发明的组合物的有效剂量取决 于许多不同的因素，包括施用方式、靶标位置、患者的生理状态、患者 是人还是其他动物、施用的其他药物和治疗是预防性的还是治疗性的。 通常，所述受试者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺 乳动物。可能需要滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
对于使用抗体的被动免疫，剂量范围为约0.0001至100mg/kg宿主 体重，和更通常地，0.01至5mg/kg宿主体重(例如0.02mg/kg、 0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、 1mg/kg、2mg/kg等)。例如，剂量可以为约1mg/kg体重或约10mg/kg 体重或在1至10mg/kg的范围内。在上述范围中间的剂量也在本发明的 范围内。可以每天、隔天、每周、每月、每两个月、每三个月或根据通 过经验分析确定的任何其他方案向受试者施用所述剂量。示例性治疗要 求在延长的时期(例如至少六个月)内施用多个剂量。另外的示例性治疗 方案要求每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次。示 例性的剂量方案包括连续日1至10mg/kg或15mg/kg，隔天30mg/kg 或每周60mg/kg。在一些方法中，同时施用具有不同的结合特异性的两 种或更多种单克隆抗体，在此情况下，施用的各种抗体的剂量落在所指 出的范围内。
通常多次施用抗体。单个剂量间的间隔可以是每周、每月或每年。 如通过测量患者中抗停乳链球菌似马亚种、中间链球菌、星座链球菌星 座亚种、咽峡炎链球菌或星座链球菌咽炎亚种ORF1358多肽的抗体的血 液水平所指示的，间隔还可以是不规则的。在一些方法中，调节剂量以 获得1至1000μg/ml血浆抗体浓度并且在一些方法中获得25至300 μg/ml血浆抗体浓度。可选地，抗体可以作为持续释放制剂施用，在此 情况下，需要较不频繁的施用。剂量和频率取决于患者中抗体的半衰期。 通常，人源化抗体表现出最长的半衰期，然后是嵌合抗体和非人抗体。
可以根据治疗是预防性的还是治疗性的改变施用的剂量和频率。在 预防性应用中，对未处于疾病状态的患者施用包含本发明的抗体或其混 合物的组合物，以增强患者的抵抗力。这样的量定义为″预防有效剂量″。 在该应用中，精确的量又取决于患者的整体免疫和健康状态，但是范围 通常为0.1至25mg/剂量，尤其是0.5至2.5mg/剂量。在一段长的时 间内，以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。
在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量(例 如约1至200mg抗体/剂量，更通常使用的是5至25mg/剂量)，直到 疾病的进展降低或终止，并且优选直到患者表现出部分改善或完全改善 疾病的症状。其后，可以以预防性方案施用本专利。
编码抗体的核酸的剂量范围为约10ng至1g、100ng至100mg、 1μg至10mg、或30至300μg DNA/患者。用于感染性病毒载体的剂量 为10至100或更多毒粒/剂量。
可以通过胃肠外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹 膜内、鼻内或肌内方式施用治疗性免疫学试剂，以进行预防性治疗和/ 或治疗性治疗。免疫原性试剂的最一般的施用途径是静脉内输注或皮下 施用，尽管其他途径可以同样有效。其次常用的途径是肌内注射。此类 注射一般在手臂或腿部肌肉中进行。在一些方法中，将免疫学试剂直接 注射入其中沉积物积聚的特定组织，例如颅内注射。肌内注射或静脉内 输注优选用于抗体施用。在一些方法中，抗体以持续释放组合物或装置 的形式施用，例如微量注入器装置(例如MedipadTM装置；参见Meehan 等人，Journal of Controlled Release，46：107-119，1997)。
如上文所述，可以通过施用编码用于被动免疫的抗体和它们的组成 链的核酸在体内(或离体)形成抗β溶血性链球菌感染的免疫应答。此类 核酸可以是DNA或RNA。一般地，将编码免疫学试剂的核酸区段与调控 元件(例如允许DNA区段在患者的预期靶细胞中表达的启动子和增强子) 连接。为了在血液细胞中表达，如对于诱导免疫应答所期望的，来自轻 链或重链免疫球蛋白基因的启动子和增强子元件或CMV主要立即早期启 动子和增强子适用于指导表达。通常将连接的调控元件和编码序列克隆 入载体。关于双链抗体的施用，可以将两条链克隆在相同的或分开的载 体中。
许多病毒载体系统是可获得的，包括逆转录病毒系统(参见例如 Lawrie和Tumin，Cur.Opin.Genet.Develop.3：102 109(1993))； 腺病毒载体(参见例如Bett等人，J.Virol.67：5911(1993))；腺病 毒相关病毒载体(参见例如Zhou等人，J.Exp.Med.179：1867(1994))， 来自痘病毒家族(包括痘苗病毒和禽痘病毒)的病毒载体，来自甲病毒属 的病毒载体例如来源于辛德毕斯病毒和塞姆利基森林病毒的载体(参见 例如Dubensky等人，J.Virol.70：508，1996)，委内瑞拉马脑炎病毒(参 见Johnston等人，美国专利5,643,576)和弹状病毒例如水疱性口炎病 毒(参见Rose，美国专利6,168,943)和乳头瘤病毒(Ohe等人，Human Gene Therapy 6：325，1995；Woo等人，PCT公开号WO 94/12629以及Xiao 和Brandsma，Nucleic Acids.Res.24：2630-2622，1996)。
编码抗体或包含CDR的抗体片段的DNA，或包含其的载体可以包装 到脂质体中。合适的脂质和相关的类似物由Eppstein等人，美国专利 5,208,036，Felgner等人，美国专利5,264,618，Rose，美国专利 5,279,833和Epand等人，美国专利5,283,185描述。编码免疫原的载 体和DNA也可以吸附至微粒载体或与微粒载体结合，所述载体的实例包 括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和聚丙交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)，参见 例如McGee等人，J.Microencapsul.14(2)：197-210，1997。
可以通过施用给个体患者，一般地通过全身施用(例如静脉内、腹 膜内、经鼻、经胃、皮内、肌内、皮下或颅内输注)或局部施用(参见例 如Anderson等人，美国专利5,399,346)来将多核苷酸载体或裸多核苷 酸(例如DNA)递送到体内。术语″裸多核苷酸″指不与转染促进剂一起施 用的多核苷酸。有时将裸多核苷酸克隆入质粒载体中。质粒载体可以进 一步包括转染促进剂，例如布比卡因(Weiner等人，美国专利 5,593,972)。还可以用基因枪施用DNA。参见Xiao和Brandsma，同上。 编码抗体(或包含CDR的片段)的DNA沉淀在微观金属珠粒的表面上。用 冲击波或膨胀氦气加速微粒并且使其穿透组织到达数个细胞层的深度。 例如由Agricetus，Inc.Middleton WI制备的ACCELTM Gene Delivery Device，即DNA枪适用于实施本发明。可选地，可以简单地通过将DNA 点样在皮肤上，用化学或机械刺激使裸DNA透过皮肤进入血流(参见 Howell等人，PCT公开号WO 95/05853)。
在另一个实施方案中，编码免疫学试剂的载体可以递送至离体细 胞，例如从个体患者外植的细胞(例如淋巴细胞、骨髓抽吸物、活检组 织)或全适供者造血干细胞，然后将所述细胞再植入患者(通常在选择已 掺入载体的细胞之后)。
任选地，本发明的免疫学试剂可以与其他试剂组合施用，所述其他 试剂在β-溶血性链球菌疾病的治疗中至少部分有效。本发明的免疫学 试剂也可以与其他试剂组合施用，所述其他试剂增强治疗性免疫学试剂 接近靶细胞或组织，例如脂质体等。共施用此类试剂可以减少获得预期 效果所需的治疗性免疫学试剂(例如治疗性抗体或抗体链)的剂量。
本发明的免疫学试剂经常以药物组合物的形式施用，所述药物组合 物包含活性治疗剂和多种其他的药学上可接受的组分。参见 Remington′s Pharmaceutical Science(第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1980)。优选的形式取决于预期的施用方式和 治疗性应用。取决于期望的制剂，所述组合物还可以包括药学上可接受 的，无毒的载体或稀释剂，其被称为媒介物，通常用于配制施用给动物 或人的药物组合物。选择稀释剂以免影响组合物的生物学活性。此类稀 释剂的实例为蒸馏水、生理学磷酸缓冲盐溶液、林格溶液、葡萄糖溶液 和Hank′s溶液。此外，药物组合物或制剂还可以包括其他载体、佐剂 或无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等。
药物组合物还可以包括大的、代谢缓慢的高分子，例如蛋白质、多 糖例如壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如乳胶官能化的 sepharoseTM、琼脂糖、纤维素等)、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂质 聚集体(例如油滴或脂质体)。另外，这些载体可以用作免疫刺激剂(即 佐剂)。
对于肠胃外施用，本发明的免疫学试剂可以作为可注射剂量的在具 有药学载体的生理学可接受的稀释剂中的物质的溶液或悬浮液施用，所 述稀释剂可以是无菌液体，例如水油、盐水、甘油或乙醇。此外，组合 物中可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物 质等。药物组合物的其他组分为石油、动物、植物或合成来源的组分， 例如花生油、大豆油和矿物油。通常，二元醇例如丙二醇或聚乙二醇为 优选的液体载体，特别是用于注射溶液。可以以积存注射或植入制剂的 形式施用抗体，其可以以允许活性成分的持续释放的方式进行配制。示 例性组合物包括以5mg/mL在由50mM L-组氨酸、150mM NaCl组成的、 用HCl调节至pH 6.0的水性缓冲剂中配制的单克隆抗体。
一般地，组合物制备为可注射的液体溶液或悬浮液；还可以制备成 固体形式，其适合于在注射前在液体媒介物中形成溶液或悬浮液。制剂 还可以被乳化或封装入脂质体或微粒(例如聚丙交酯、聚乙交酯或用于 增强佐剂效果的共聚物，如上文讨论的(参见Langer，Science 249：1527 (1990)和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28：97(1997)))。 可以以积存注射或植入制剂的形式施用本发明的免疫学试剂，其可以以 允许活性成分的持续或脉冲释放的方式进行配制。
适合于其他施用方式的另外的制剂包括口服、鼻内和肺制剂、栓剂 和经皮应用。用于栓剂的结合剂和载体包括例如聚亚烷基二醇或甘油三 酯；此类栓剂可以由包含0.5％至10％，优选1％至2％的活性成分的混合 物形成。口服制剂包括赋形剂，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂 酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、 丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉剂的形式并且包含10％至95％的活性成 分，优选25％至70％的活性成分。
可选地，可以用皮肤贴剂或用transferosome实现经皮递送(Paul 等人，Eur.J.Immunol.25：3521，1995；Cevc等人，Biochem.Biophys. Acta 1368：201-215，1998)。
本发明还提供监控患β溶血性链球菌感染或对所述感染易感的患 者的治疗的方法，即监控施用给患者的治疗的过程的方法。所述方法可 用于监控有症状的患者的治疗性治疗和无症状患者的预防性治疗。特别 地，所述方法可用于监控被动免疫(例如测量施用的抗体的水平)。
一些方法要求在施用一定剂量的免疫学试剂前，测定患者中例如抗 体水平或特征的基线值，并且将基线值与治疗后的特征或水平的值相比 较。水平或特征的值的显著增加(即，大于在相同样品的重复测量中的 实验误差的一般幅度(其表示为所述测量的平均值的一个标准差))表示 阳性治疗结果(即免疫学试剂的施用已经获得了想要的应答)。如果免疫 应答的值没有显著改变，或减少，则表示阴性治疗结果。如果治疗是被 动免疫疗法，那么预期抗体水平随时间降低(具有特征性半衰期)。
用于分析的组织样品一般为来自患者的血液、血浆、血清、粘液或 脑脊液。就例如抗链球菌PPI的抗体的水平或滴度分析样品。检测对链 球菌PPI特异的抗体的ELISA方法在实施例部分中描述。在一些方法中， 用清除测定(例如体外吞噬作用测定)确定施用的抗体的水平或滴度(参 见例如Jansen等人，Clin.Diagn.Lab.Immunol.，8(2)：245-250， 2001)。
被动免疫后的抗体特征一般地表现出即时的抗体浓度峰，然后是指 数衰减。如果没有进一步的剂量，那么所述衰减在数天至数月的时期内 (取决于施用的抗体的半衰期)达到处理前水平。
在一些方法中，在施用前进行患者中抗链球菌PPI的抗体的基线测 量，施用后马上进行第二次测量以测定峰抗体水平，并且以一定的间隔 进行一次或多次进一步的测量以监控抗体水平的衰减。当抗体的水平已 下降至基线或减去基线的峰的预定百分数(例如50％、25％或10％)时，施 用进一步剂量的抗体。在一些方法中，将减去背景的峰或随后测量的水 平与之前测定的参考水平相比较，以在其他患者中建立有利的预防性或 治疗性治疗方案。如果测量的抗体水平显著小于参考水平(例如小于受 益于治疗的患者群体中的参考值的平均值减去一个标准差)，那么表明 需要施用额外剂量的抗体。
另外的方法包括在治疗过程中由研究人员或医师常规地监控任何 本领域公认的生理学症状，以诊断或监控链球菌感染或相关的疾病。例 如，可以监控蜂窝织炎、丹毒、脓疱病、坏死性筋膜炎、咽喉痛、红喉、 发冷、发热、头痛、恶心、呕吐、心跳急促、不适、扁桃体肿大、淋巴 结肿大和/或皮疹的症状。
根据本说明书中引用的参考文献的教导，能够非常充分地理解本说 明书，所有的参考文献通过全文引用并入本文。本说明书中的实施方案 举例说明了本发明的实施方案，并且不应解释为限定本发明的范围。本 领域技术人员理解，许多其他实施方案由所请求保护的发明包括，并且 本说明书和实施例仅仅是示例性的，本发明的实际范围和精神由下文的 权利要求表示。
实施例
实施例1：链球菌菌株中的ORF1358的鉴定
已在许多链球菌基因组中鉴定到链球菌候选抗原的DNA和蛋白序 列。然而，在C型和G型链球菌基因组中存在有限的序列信息。目前， 两个动物来源的链球菌基因组(C型)，马链球菌(Streptococcus equi) 和兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)正在由Sanger Centre 测序。使用简并引物部分完成的基因组的数据挖掘产生ORF1358的DNA 序列。
设计简并寡核苷酸探针以鉴定停乳链球菌似马亚种菌株ATCC12394 和菌株ATCC35666、中间链球菌菌株ATCC27335、星座链球菌星座亚种 菌株ATCC27823、咽峡炎链球菌菌株ATCC33397和星座链球菌咽炎亚种 菌株NTCT13122中的ORF1358。
用AlignX(Vector NTI)比对包含ORF1358的所有已知序列，并将 同源区用于构建简并引物。设计引物，使其具有最小的简并性而保持高 的熔解温度和低的自二聚化潜力。引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：14 至21所示。
用Integrated DNA Technologies(Coraville，IA)的网站分析引 物。用C型链球菌分离菌ATCC12394(停乳链球菌似马亚种)的基因组 DNA制备物进行最初的扩增研究。获得了ORF1358的5′和3′端的部分基 因序列。然后根据这些序列设计正向和反向引物，随后将其用于从来自 不同的G和C菌株的ORF1358扩增约700-900bp的序列。基于ATCC12394 的引物如SEQ ID NO：20和21所示。
使用本领域技术人员熟知的方法，从上述的各个菌株制备基因组 DNA，并且用SEQ ID NO：14-21所示的引物扩增对应于ORF1358的多核 苷酸片段。获得的ORF1358的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、 11、25、27、29和31所示。
这些多核苷酸的翻译产生这些链球菌菌株中的ORF1358的氨基酸序 列。所述氨基酸序列如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、26、28、30 和32所示。
用Clustal W比对SEQ ID NO：2、4、6、8、10和12的氨基酸序列， 产生的共有序列如SEQ ID NO：13所示。
表1A描述了用Clustal W(慢的/精确的，Gonnet)获得的配对距离 或在将SEQ ID NO：2，4，6，8，10和12所示的ORF1358氨基酸序列与SEQ ID NO：22、23和24所示的ORF1358氨基酸序列比对后获得的百分比同一性：
表1A：链球菌百分比同一性
SEQ ID NO：22 SEQ ID NO：23 SEQ ID NO：24 SEQ ID NO：2 96.6 72.9 87.1 SEQ ID NO：4 96.5 72.9 87.7 SEQ ID NO：6 96.9 73.6 87.0 SEQ ID NO：8 97.2 73.5 87.3 SEQ ID NO：10 97.0 73.5 87.1 SEQ ID NO：12 97.3 74.0 87.2
表1B描述了配对距离或用BLAST将SEQ ID NO：2，4，6，8，10， 12，26，28，30和32所示的ORF1358氨基酸序列与SEQ ID NO：22和 23所示的ORF1358氨基酸序列比对后获得的百分比同一性：
表1B：链球菌百分比同一性
SEQ ID NO：22 SEQ ID NO：23 SEQ ID NO：2 96 71 SEQ ID NO：4 96 71 SEQ ID NO：6 97 70 SEQ ID NO：8 97 70 SEQ ID NO：10 96 70 SEQ ID NO：12 97 71 SEQ ID NO：26 96 69 SEQ ID NO：28 96 70 SEQ ID NO：30 61 62 SEQ ID NO：32 61 61
实施例2：抗C/G型葡萄球菌ORF 1358表位的抗体
抗体与细菌的结合(称为调理作用的过程)，可以导致通过吞噬细胞 摄取和杀死细菌。来源于大量人或动物来源，或人或鼠或嵌合的单克隆 来源，并且单独或组合使用的此类抗体可用于预防性或治疗性背景，其 中BHS可能存在于血流中，例如新生儿脓毒症或外科手术或脓疮渗漏后 的脓毒症。
在小鼠中产生抗由ORF1358编码的重组C/G型葡萄球菌锌结合多肽 的抗体。在筛选抗β溶血性链球菌的抗血清和抗各种β溶血性链球菌 (BHS)菌株的单克隆抗体的过程中，注意到一些抗血清和抗体交叉反应， 抗许多BHS菌株，包括酿脓链球菌(A型链球菌)、无乳链球菌(B型链球 菌)和C型和G型链球菌(其包括咽峡炎链球菌、星座链球菌、中间链球 菌、停乳链球菌似马亚种和停乳链球菌停乳亚种)的成员(参见表1)。使 用荧光激活细胞分选(FACS)进行抗体的筛选。简言之，将热灭活的链球 菌与小鼠抗C型和G型ORF1358链球菌抗体一起在冰上温育45分钟， 然后用10％FBS/PBS清洗2次。然后将链球菌与山羊抗小鼠-Alexa-488 抗体(Molecular Probes，Eugene，OR)一起在冰上温育30分钟，然后 用10％FBS/PBS清洗两次。然后将细胞在10％FBS/PBS中重悬浮并且在 FACS机器上运行(例如参见DeMaster等人，Infect.Immun.，70(1)： 350-359，2002)。该交叉反应性还意味着，C型或G型ORF1358或由其 编码的多肽可以用于免疫原性组合物中以诱导有效抵抗A型或B型链球 菌以及C型或G型链球菌的感染的免疫应答。
表2描述了抗由ORF1358编码的c/g型链球菌多肽的抗血清和抗体 的交叉反应性。根据表2，符号″+″表示，从抗抗原的特异性抗体获得的 信号是背景的至少三倍高；符号″+/-″表示，从抗抗原的特异性抗体获 得的信号是背景的两倍至三倍高；并且符号″-″表示，从抗抗原的特异 性抗体获得的信号等于或低于背景。
表2.抗体的交叉反应性
菌株 物种 抗ORF 1358的反应性 GAR 1165 酿脓链球菌 + GAR 1199 酿脓链球菌 + 菌株 物种 抗ORF 1358的反应性 GAR 1251 酿脓链球菌 + GAR 1278 酿脓链球菌 + GAR 1362 酿脓链球菌 + GAR 1439 酿脓链球菌 + GAR 1530 酿脓链球菌 + GAR 1566 酿脓链球菌 + GAR 1672 酿脓链球菌 + GAR 1839 酿脓链球菌 + GAR 1923 酿脓链球菌 + GAR 2107 酿脓链球菌 + GAR 2330 酿脓链球菌 + GAR 2646 酿脓链球菌 + GAR 2650 酿脓链球菌 + GAR 2869 酿脓链球菌 + GAR 3104 酿脓链球菌 + GAR 3549 酿脓链球菌 + GAR 3784 酿脓链球菌 + GAR 4029 酿脓链球菌 + GAR 4030 酿脓链球菌 + GAR 4230 酿脓链球菌 + GAR 4773 酿脓链球菌 + GAR 4983 酿脓链球菌 + GAR 4987 酿脓链球菌 + GAR 5861 酿脓链球菌 + GAR 5991 酿脓链球菌 + GAR 6084 酿脓链球菌 + GAR 7055 酿脓链球菌 + GS20 酿脓链球菌 + 菌株 物种 抗ORF 1358的反应性 GS21 酿脓链球菌 + GS22 酿脓链球菌 + GS23 酿脓链球菌 + GS24 酿脓链球菌 + GS25 酿脓链球菌 + GS26 酿脓链球菌 + GS27 酿脓链球菌 + GS28 酿脓链球菌 + GS29 酿脓链球菌 + GS30 酿脓链球菌 + GS31 酿脓链球菌 +/- GS32 酿脓链球菌 + GS33 酿脓链球菌 + GS34 酿脓链球菌 + GS35 酿脓链球菌 + GS36 酿脓链球菌 +/- GS37 酿脓链球菌 + GS38 酿脓链球菌 + GS39 酿脓链球菌 + GS40 酿脓链球菌 + GS41 酿脓链球菌 + GS42 酿脓链球菌 +/- GS43 酿脓链球菌 + GS44 酿脓链球菌 + GS45 酿脓链球菌 + GS46 酿脓链球菌 + GS47 酿脓链球菌 +/- GS 48 酿脓链球菌 +/- 菌株 物种 抗ORF 1358的反应性 GS 49 酿脓链球菌 + GS 50 酿脓链球菌 + GS 51 酿脓链球菌 + GS 52 酿脓链球菌 + GS 53 酿脓链球菌 + GS 54 酿脓链球菌 +/- GS 55 酿脓链球菌 + GS 56 酿脓链球菌 + GS 57 酿脓链球菌 + GS 58 酿脓链球菌 + GS 59 酿脓链球菌 + GS 60 酿脓链球菌 + GS 61 酿脓链球菌 + GS 62 酿脓链球菌 + GS 63 酿脓链球菌 + GS 64 酿脓链球菌 + GS 65 酿脓链球菌 + GS 66 酿脓链球菌 + GAR 1 无乳链球菌 + GAR 1012 无乳链球菌 - GAR 1023 无乳链球菌 - GAR 1049 无乳链球菌 - GAR 10895 无乳链球菌 - GAR 1192 无乳链球菌 +/- GAR 127 无乳链球菌 - GAR 12790 无乳链球菌 - GAR 1305 无乳链球菌 - GAR 131 无乳链球菌 - 菌株 物种 抗ORF 1358的反应性 GAR 1355 无乳链球菌 - GAR 1446 无乳链球菌 - GAR 1494 无乳链球菌 - GAR 154 无乳链球菌 + GAR 176 无乳链球菌 - GAR 18 无乳链球菌 + GAR 1844 无乳链球菌 - GAR 1931 无乳链球菌 - GAR 2369 无乳链球菌 +/- GAR 252 无乳链球菌 - GAR 2533 无乳链球菌 - GAR 2682 无乳链球菌 - GAR 2717 无乳链球菌 - GAR 2723 无乳链球菌 - GAR 2724 无乳链球菌 - GAR 2842 无乳链球菌 - GAR 287 无乳链球菌 - GAR 3003 无乳链球菌 - GAR 3751 无乳链球菌 - GAR 381 无乳链球菌 - GAR 3830 无乳链球菌 - GAR 4131 无乳链球菌 - GAR 4293 无乳链球菌 +/- GAR 4398 无乳链球菌 - GAR 462 无乳链球菌 - GAR 4837 无乳链球菌 - GAR 54 无乳链球菌 - GAR 562 无乳链球菌 + 菌株 物种 抗ORF 1358的反应性 GAR 6016 无乳链球菌 + GAR 614 无乳链球菌 +/- GAR 63 无乳链球菌 + GAR 6332 无乳链球菌 + GAR 6387 无乳链球菌 +/- GAR 6505 无乳链球菌 +/- GAR 67 无乳链球菌 - GAR 864 无乳链球菌 +/- GAR 967 无乳链球菌 - GS19 GGS +/- GS27 GGS +/- ATCC 33397 咽峡炎链球菌 +/- ATCC 33397 咽峡炎链球菌 - GAR 10823 咽峡炎链球菌 +/- GAR 1272 咽峡炎链球菌 - GAR 1370 咽峡炎链球菌 - GAR 1425 咽峡炎链球菌 +/- GAR 1592 咽峡炎链球菌 - GAR 1595 咽峡炎链球菌 - GAR 2044 咽峡炎链球菌 - GAR 2523 咽峡炎链球菌 - GAR 2565 咽峡炎链球菌 - GAR 2697 咽峡炎链球菌 +/- GAR 2822 咽峡炎链球菌 - GAR 3091 咽峡炎链球菌 - GAR 3560 咽峡炎链球菌 + GAR 3576 咽峡炎链球菌 +/- GAR 3858 咽峡炎链球菌 +/- 菌株 物种 抗ORF 1358的反应性 GAR 3938 咽峡炎链球菌 - GAR 4133 咽峡炎链球菌 +/- GAR 4158 咽峡炎链球菌 + GAR 4234 咽峡炎链球菌 + GAR 4426 咽峡炎链球菌 + GAR 4680 咽峡炎链球菌 + GAR 4834 咽峡炎链球菌 +/- GAR 4896 咽峡炎链球菌 + GAR 5093 咽峡炎链球菌 + GAR 5094 咽峡炎链球菌 + GAR 5675 咽峡炎链球菌 - GAR 5776 咽峡炎链球菌 + GAR 5831 咽峡炎链球菌 +/- GAR 6187 咽峡炎链球菌 +/- GAR 6590 咽峡炎链球菌 +/- GAR 7000 咽峡炎链球菌 +/- GAR 7023 咽峡炎链球菌 - GAR 7190 咽峡炎链球菌 - GAR 7214 咽峡炎链球菌 +/- GAR 7468 咽峡炎链球菌 - GAR 7818 咽峡炎链球菌 + GAR 8620 咽峡炎链球菌 + GAR 8693 咽峡炎链球菌 - GAR 8722 咽峡炎链球菌 +/- GAR 8736 咽峡炎链球菌 - GAR 8954 咽峡炎链球菌 +/- ATCC 27823 星座链球菌 - GAR 1235 星座链球菌 - 菌株 物种 抗ORF 1358的反应性 GAR 1384 星座链球菌 +/- GAR 1811 星座链球菌 + GAR 2421 星座链球菌 +/- GAR 3145 星座链球菌 - GAR 3355 星座链球菌 - GAR 4048 星座链球菌 +/- GAR 4083 星座链球菌 + GAR 4861 星座链球菌 + GAR 4870 星座链球菌 + GAR 5757 星座链球菌 +/- GAR 6129 星座链球菌 +/- GAR 6147 星座链球菌 - GAR 6258 星座链球菌 + GAR 7224 星座链球菌 + GAR 7369 星座链球菌 + ATCC 12394 停乳链球菌 +/- ATCC 12394 停乳链球菌 + ATCC 40378 停乳链球菌 - ATCC 40378 停乳链球菌 - GAR 3868 停乳链球菌 +/- GAR 4272 停乳链球菌 + ATCC 35666 停乳链球菌似马亚种 + BAA-338 停乳链球菌似马亚种 +/- GAR 3015 似马链球菌 + ATCC 27335 中间链球菌 + ATCC 27335 中间链球菌 + GAR 2407 中间链球菌 - GS28 unk + 菌株 物种 抗ORF 1358的反应性 GS67 GGS/GCS + GS68 GGS/GCS +/- GS69 GGS/GCS - GS70 GGS/GCS +/- GS71 GGS/GCS + GS72 GGS/GCS + GS73 GGS/GCS - GS74 GGS/GCS - GS75 GGS/GCS +/- GS77 GGS/GCS + GS78 GGS/GCS + GS79 GGS/GCS +/- GS80 GGS/GCS - GS81 GGS/GCS +/- GS82 GGS/GCS +/- GS83 GGS/GCS + GS84 GGS/GCS - GS85 GGS/GCS - GS86 GGS/GCS +/- GS88 GGS/GCS + GS89 GGS/GCS +/- GS90 GGS/GCS +/- GS91 GGS/GCS +/- GS92 GGS/GCS + GS93 GGS/GCS + GS94 GGS/GCS +