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天仙果萃取物作为用于防止皮肤老化的药剂的用途.pdf

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文档编号：8127931

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1、(10)授权公告号 CN 102274288 B (45)授权公告日 2013.07.17 CN 102274288 B *CN102274288B* (21)申请号 201010199413.9 (22)申请日 2010.06.09 A61K 36/60(2006.01) A61K 8/97(2006.01) A23L 1/29(2006.01) A61Q 19/08(2006.01) A61P 17/02(2006.01) A61P 17/16(2006.01) A61K 125/00(2006.01) A61K 131/00(2006.01) (73)专利权人台湾糖业股份有限公司地址。

2、中国台湾台南市 (72)发明人杨寄明黄怡仁吕思洁陈嘉琪 (74)专利代理机构北京汇智英财专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 11301 代理人郑玉洁 CN 101612218 A,2009.12.30, 全文 . 黄燮才；等 . 台湾榕 .广西民族药简编 .1980,144. Sheu Y W, Chiang L C, Chen I S,et al Cytotoxic flavonoids and new chromenes from Ficus formosana F. formosana.Planta Med .2005, 第 71 卷 ( 第 12 期 ),1165-。

3、1167. (54) 发明名称天仙果萃取物作为用于防止皮肤老化的药剂的用途 (57) 摘要本发明提供一种用于防止皮肤老化的组合物，其包含天仙果萃取物。本发明还提供一种包含天仙果萃取物的防止皮肤老化的化妆品。本发明还涉及天仙果萃取物用于制备防止皮肤老化的组合物的用途。 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员程心旻权利要求书 2 页说明书 9 页附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书2页说明书9页附图1页 (10)授权公告号 CN 102274288 B CN 102274288 B *CN102274288B* 1。

4、/2 页 2 1. 一种天仙果萃取物用于制备防止皮肤老化的组合物的用途，其中该天仙果萃取物是以选自下列群组的溶剂萃取天仙果制得：醇类、 DMSO、乙酸乙酯、丙酮、卤烷类溶剂及其混合物。 2. 如权利要求 1 所述的用途，其中所述萃取是以超声波震荡或回流方式进行。 3. 如权利要求 1 所述的用途，其中所述醇类为甲醇、乙醇或正丁醇。 4. 如权利要求 1 所述的用途，其中所述醇类为甲醇。 5. 如权利要求 3 所述的用途，其中所述甲醇或乙醇的浓度为 100% 至 25%。 6. 如权利要求 3 所述的用途，其中所述甲醇或乙醇的浓度为 100%、 75%、 70% 或。

5、50%。 7. 如权利要求 1 所述的用途，其中所述天仙果是台湾天仙果 (Ficus formosana Maxim)。 8. 如权利要求 1 所述的用途，其中所述天仙果为其果实或根须状部分。 9. 如权利要求 1 所述的用途，其中所述天仙果萃取物具有 HPLC 图谱，其中，该 HPLC 分析是使用以下条件进行： 1) 仪器：美商沃特斯（WATERS）高效液相色谱系统（LC-Module I）； 2) 色谱柱： ODS3， 2504.6mm， 5m 的 C18 管柱； 3) 柱温度：室温； 4) 测定波长： 254nm ； 5) 进样体积： 15L ；。

6、6) 流动相速度： 0.8mL/min ； 7) 分析时间； 42 分钟； 8) 天仙果指标成分标准品： HPLC 标定 99% 的芹菜素 (Aplgenin) ； 9) 进样前，样品先以 0.45m 的尼龙（Nylon）滤膜过滤； 10) 进样后， C18 管柱另有保护柱过滤； 11) 流动相 A ： 0.1% 三氯醋酸（TFA）水溶液，流动相 B ： 100% 甲醇；以及 12) 梯度分析条件：时间 ( 分钟 ) 流动相 A%流动相 B%方式 05050线性 351090线性 365050线性。 10. 如权利要求 1 至 9 中任一权利要求所述的用途，。

7、其中所述天仙果萃取物具有抑制 MMP-1、 MMP-2 及 / 或 MMP-9 的活性。 11.如权利要求1至9中任一权利要求所述的用途，其中所述天仙果萃取物具有抑制弹性蛋白酶的活性。 12.如权利要求1至9中任一权利要求所述的用途，其中所述防止皮肤老化为减少皮肤细纹、促进皮肤伤口愈合、保存皮肤水分或增加皮肤弹性。权利要求书 CN 102274288 B 2 2/2 页 3 13. 如权利要求 1 至 12 中任一权利要求所述的用途，其中所述组合物包含所述萃取物以及构成该组合物所需的载剂。 14. 如权利要求 13 所述的用途，其中所述组合物进一步包含其它可用于防止。

8、皮肤老化的活性成分。 15.如权利要求13所述的用途，其中所述萃取物在所述组合物中的含量为0.1mg/mL至 10mg/mL。 16. 如权利要求 13 所述的用途，其中所述组合物为化妆品、食品、动物用药品或人类用药品。 17. 如权利要求 13 所述的用途，其中所述组合物为保养品或保健食品。 18. 如权利要求 13 所述的用途，其中所述组合物为健康食品。权利要求书 CN 102274288 B 3 1/9 页 4 天仙果萃取物作为用于防止皮肤老化的药剂的用途技术领域 0001 本发明涉及天仙果萃取物及其用于防止皮肤老化的用途。背景技术 0002 天仙果为桑科(。

9、Moraceae)榕属(Ficus genus)植物，别名台湾榕、小本牛乳埔、羊奶头、羊奶仔、山金枣、山拔紫、玉带角等。天仙果分布在中国大陆、香港、越南及台湾全境山麓至低海拔山区的阴湿地阔叶林内或荒野灌木丛中，在台湾东部地区低海拔山区也可发现其踪迹。天仙果植株为常绿性灌木，全株内含白色乳汁，叶互生具短柄，叶片形状呈长椭圆形、披针形或长菱形，全缘或具有疏锯齿，叶部型态变异很大，叶片颜色为银色或绿色，果实呈卵形或倒卵形，果实未成熟时呈绿色，表面有白色斑点，果实成熟时呈紫黑色。根据甘伟松教授所著的 “药用植物学” 记载，全株均可为药用，具有袪。

10、风活血及治疗风湿病等效用 ( 请参张同吴 “台湾保健植物的多样性与利用研究” ； 2005 年 9 月 22 日，台湾地区植物资源的多样性发展研讨会 )。 0003 已知天仙果具有袪风活血、强筋壮骨及消肿等功能，民间常以天仙果全株主治风湿关节痛、急慢性肝炎、腰扭伤、小儿发育不良、白带、下消、月经不顺、乳汁不下、咳嗽、毒蛇咬伤及尿路感染等病症。 0004 民间习知对于天仙果的用法干品鲜品均可，多以汤剂或炖剂煮食天仙果的根部及果实以制成天仙酒，并宣称其具有壮阳功效。 0005 国内针对天仙果的药理作用的研究发现，台湾天仙果具有抗人类肝癌细胞株及淋巴癌细胞株的。

11、毒杀作用等能力(许(Sheu YW)、常(Chiang LC)、陈(Chen IS)、陈(ChenYC)、蔡 (Tsai IL)，天然药物学会会志 (Planta Med.)2005 年 12 月； 71(12) ： 1165-7)。目前仍有待开发天仙果多方面的应用性。 0006 人口老化是全球性的趋势，而老化后最明显的即是皮肤外观的变化，因此延缓皮肤老化的相关产品特别受到瞩目。一般来说，皮肤老化可分为两种基本过程：内源性老化及外源性老化。内源性老化为自然衰老的过程，又称固有性老化，与遗传因素、年龄有关，而外源性老化与外界刺激例如紫外线、太阳风暴、。

12、臭氧层破坏、地心引力、抽烟、温湿度变化、皮肤病症、血管病变、过敏等有关。由紫外线引起的皮肤老化又称为光老化 (photoaging)，其也是引起皮肤癌的主要原因。 0007 皮肤老化的主要症状为失去弹性，其是由于皮肤中胶原蛋白的产生减少，或胶原蛋白的降解增加。胶原蛋白为纤维状结构的蛋白质，其为结缔组织的细胞外基质 (extracellular matrix， ECM) 的主要成分。胶原蛋白的降解会导致皮肤外貌及功能的改变，例如产生皮肤表面细纹、深层皱纹、裂缝、肿块、粗大毛孔、鳞片化、失去皮肤弹性 ( 如眼袋 )、失去皮肤紧实度、皮肤变色 ( 如黑。

13、眼圈 )、产生斑点、色素沉淀、皮肤角化、毛细管扩张及其它组织变化。弹性蛋白酶可使皮肤有弹性。由于在自然老化过程中，弹性蛋白会被自由基或弹性蛋白酶所破坏，导致皮肤弹性降低。因此，化妆品中经常会添加弹性蛋白酶抑制剂。说明书 CN 102274288 B 4 2/9 页 5 0008 皮肤的细胞外基质提供皮肤的强度及完整性。基质金属蛋白酶 (matrixmetalloproteinase， MMP) 是一种可分解肽键结的蛋白酶，因此其可降解细胞外基质中的胶原蛋白。MMP 在皮肤自我修护的正常降解及重塑部分扮演重要的角色。

14、。然而，当 MMP 过度活化时，会导致病理状况或使病理状况恶化，而造成组织功能及 / 或构造的丧失。目前已知有超过25种的MMP与皮肤细胞外基质的重塑、伤口愈合、炎症反应等反应有关。其中 3 种 MMP，即 MMP-1、 MMP-2 及 MMP-9 被认为与皮肤细胞外基质特别相关，且在正常及病理组织重塑中扮演重要角色。MMP-1、 MMP-2 及 MMP-9 特别受到重视的原因有两个，其一是这些 MMP 的底物为皮肤的重要结构成分，其二是皮肤长期暴露在会刺激这些 MMP 形成病理状态的因素下，例如炎症反应、氧化性应激及紫外线。因此，目前认为选择性抑制MMP。

15、-1、 MMP-2 及 MMP-9 比抑制所有金属蛋白酶在减缓皮肤老化上更有益处及有效。 0009 基于安全性及天然性考虑，所属领域中已尝试由天然产物中开发抗老化制剂。例如，中国台湾第 I287997 号专利揭露一种防止皮肤老化组成物，其特征为含有医学上容许的皮肤外用基剂及或添加剂，与 1 种或 2 种以上选自以下植物的植物萃取物：水丁香 (Ludwigia octovalvis)、鱼针草 (Anisomeles indica)、半边莲 (Lobelia chinensis)、虱母草 (Urena lobata)、马鞭草 (Verbana officinalis)、菟。

16、丝子 (Cuscuta australis)、马蹄金 (Dchondra micrantha)、叶下珠 (Phyllanthus urinaria)、苦职 (Physalis angulata)、白花菜 (Cleome gynandra)、山芥菜 (Rorippa indica)、遍地锦 (Hydrocotyle formosana)、伤寒草 (Vernonia cinerae)、金钮扣 (Spilanthes acmella)、美人蕉 (Canna indica)、马鞍藤 (Ipomoeapes-caprae)、化石树 (Clerodendrum calamito。

17、sum)、锦地罗 (Drosera burmanni)、金线莲 (Anoectochilus formosanus)、南岭荛花 (Wikstroemia indica)、白叶刺根 (Elaeagnusoldhamii)、玉叶金花 (Mussaenda parviflora)、台湾马兜铃 (Aristolochia mollis)、黄金桂 (Cudrania cochinchinensis var.gerontogea)、臭茉莉 (Clerodendrum philippinum)、大青 (Clerodendrum cyrtophyllum)、白龙船花 (Cler。

18、odendrum paniculataum var.albifloraum)、木苎麻 (Boehmeria densiflora)、鸦臼 (Sapium sebiferum)、三叶葡萄 (Tetrastigmadentatum)、小叶葡萄 (Vitis thunbergii)、金石榴 (Bredia oldhami)、哈在花 (Staurogyneconcinnula)、石上柏 (Selaginella doederleinii)、胡枝子 (Lespedeza cuneata)、细叶水丁香 (Ludwigia hyssopifolia)、乌蕨 (Sphenomer。

19、is chusana)、铁线蕨 (Adiantum flabellulatum)、眼草 (Kummerowia striata)、海州常山 (Clerodendrum trichotomum)、黄荆 (Vitexnegundo)、咸豊草 (Bidens pilosa var.minor)、鼠曲草 (Gnaphalium affine)、紫背草 (Emiliasonchifolia)、含羞草 (Mimosa pudica)、乳仔草 (Euphorbia hirta)、车前草 (Plantagoformosana)、白花藤 (Plumbago zey。

20、lanica)、钉地蜈蚣 (Torenia concolor var.formosona)、大甲草 (Euphorbia formosana)、戟叶紫花地丁 (Viola phillippica)、台湾何首乌 (Polygonummultiflorum var.hyopleucum)、牛乳榕 (Ficus erecta var.beecheyana)、蓖叶灯笼草 (Kalanchoe spathulata)、扛香藤 (Mallotus repandus)、台湾钩藤 (Uncaria hirsuta)、罗氏盐肤木 (Rhus semialat。

21、a var.roxburghiana)、金剑草 (Rubia lanceolata)、红花鼠尾草 (Salviacoccinea)、兔仔菜 (Ixeris chinensis)、刀伤草 (Ixeris laevigata var.oldhami)、苦蓝盘 (Clerodendrum inerme)、杜虹花 (Callicarpa formosana)、铜锤玉带草 (Pratianummularia)B 三叶五加 (Acanthopanax trifoliatus)。说明书 CN 102274288 B 5 3/9 页 6 根据现在的潮流，仍有需要发展天然、。

22、安全且具更佳效果的美白防皱、增进皮肤弹性的产品。发明内容 0010 本发明的一个目的是提供一种用于防止皮肤老化的组合物，其包含天仙果萃取物。 0011 本发明的另一目的是提供一种防止皮肤老化的化妆品，其包含本发明的组合物。 0012 本发明的又一目的是提供一种天仙果萃取物的用途，其用于制备防止皮肤老化的组合物。 0013 本发明在以下部分中详细描述。本发明的其它特征、目的及优点可易见于本发明的实施方式及权利要求书中。附图说明 0014 图 1 为本发明天仙果萃取物样品及标准品样品的 HPLC 分析图谱。 0015 图 2 为本发明天仙果萃取样品的明胶 / 酪蛋白酶分析图。

23、谱。具体实施方式 0016 在本发明之前，并没有任何报告指出或推测天仙果具有延缓皮肤老化，特别是防皱、美白、减少细纹、增进皮肤弹性等功效，也甚至没有任何报告指出天仙果具有帮助皮肤创伤愈合的效果。在本发明中，出人意料地发现天仙果萃取物具有抑制细胞分泌 MMP-1、 MMP-2 及 MMP-9 及抑制弹性蛋白酶的功效。因此，本发明提供一种可用于防止皮肤老化，例如防皱、美白、减少细纹、增进皮肤弹性及帮助伤口愈合的效果的含有天仙果萃取物。 0017 本发明另外提供一种防止皮肤老化的组合物，其包含如本发明的天仙果萃取物。本发明还提供一种如本发明的天仙果萃取物用于制备防。

24、止皮肤老化的组合物的用途。 0018 除非本文中另外定义，否则结合本发明使用的科技术语应具有所属领域的技术人员通常理解的含义。术语的含义及范畴应为明确的；然而，若存在任何潜在含糊性，则本文所提供的定义优先于任何词典或外来定义。 0019 除非另外指示，否则应了解如本揭示案所用的以下术语具有以下含义： 0020 如本文所使用的术语 “皮肤老化” 一词包括皮肤外貌及功能的改变，例如产生皮肤表面细纹、深层皱纹、裂缝、肿块、粗大毛孔、鳞片化、失去皮肤弹性 ( 如眼袋 )、失去皮肤紧实度、皮肤变色 ( 如黑眼圈 )、产生斑点、色素沉淀、皮肤角化、毛细管扩张。

25、及其它组织变化。 0021 如本文所用的术语 “防止” 表示预防或阻止症状产生，或改善或回复已产生的症状。 0022 术语 “载剂” 或 “化妆品中可接受的载剂” 是指稀释剂、赋形剂或类似物，其为各该行业所属技术领域的技术人员所熟知。 0023 本发明的化妆品还可进一步包含可用于防止皮肤老化的活性成分，例如维生素 A 酸、维生素 A 醇、熊果素、玻尿酸、表皮生长因子及其它天然美白成分等。 0024 术语 “天仙果萃取物” 表示将天仙果植株经溶剂萃取后的萃取物。优选地，本发明的天仙果萃取物采用台湾产出的台湾天仙果 (Ficus formosana Maxim.)，将天仙。

26、果植株全说明书 CN 102274288 B 6 4/9 页 7 株经干燥后，使用超声波震荡或回流方式以溶剂萃取获得。优选地，本发明的天仙果萃取物是取自天仙果果实或根须状部分。本发明所使用的溶剂优选地为选自醇类、 DMSO、乙酸乙酯、丙酮、卤烷类溶剂或其混合物所组成的群组，更优选地为浓度为约 100至约 25的甲醇或乙醇。更优选地，本发明天仙果萃取物具有如图 1 的 HPLC 图谱。本发明天仙果萃取物的制备可使用芹菜素作为指标成份，作为工艺中质量控制的标准。 0025 在一个优选实施例中，本发明提供一种组合物，其包含本发明的天仙果萃取物。 0026 在一个优。

27、选实施例中，本发明的组合物包含约 0.5mg/mL 至 5mg/mL 的天仙果萃取物。优选地，本发明的组合物包含约 1mg/mL 至 5mg/mL 的天仙果萃取物。最优选地，本发明的组合物包含约 1、 2.5 或 5mg/mL 的天仙果萃取物。 0027 本发明的萃取物及组合物具有抑制基质金属蛋白酶 -1、 -2 及 -9(MMP-1、 MMP-2 及 MMP-9) 的活性及抑制弹性蛋白酶的活性。 0028 除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。 0029 本发明是以以下的非限制性的实例探讨天仙果萃取物的制备及其应用于防止皮肤老化的用途。所述实例不应视为。

28、过度地限制本发明。本发明所属技术领域的技术人员可在不背离本发明的精神或范畴的情况下对本文所讨论的实施例进行修改及变化，而仍属于本发明的范围。 0030 实例 0031 实例 1 台湾天仙果萃取物样品的制备 0032 本实例是以产地为台湾的天仙果作为原料，其中所采用的台湾天仙果已通过 “台湾天仙果农药及重金属限量标准值” 。 0033 取台湾天仙果 ( 干材进货 )，取其外观为部分根须状物，部分夹杂小于四厘米片状物，进行研磨以通过 30 孔筛。根据红外线水分测定仪操作说明测试含水率，并控制台湾天仙果样品的水分含量低于 10。 0034 取上述水分含量低于 10的台湾天仙果。

29、50 克置于 1 升四颈平底烧瓶，加入 100 甲醇 500 毫升，加热回流萃取 4 小时，离心及过滤，定量滤液体积 (V1) 并取其中 1 毫升滤液进行后续 HPLC 分析。再次加入 100甲醇 500 毫升溶解烧瓶内残渣，进行第二次加热回流萃取 3 小时，离心及过滤，定量滤液体积 (V2) 并取其中 1 毫升进行 HPLC 分析。 0035 秤取烘干至约10毫克的浸膏样品，加入1毫升100甲醇，在室温下以超声波震荡器震荡 30 分钟，离心及过滤，取 1 毫升滤液进行 HPLC 分析。 0036 实例 2 标准品及空白溶液的制备 0037 秤取芹菜素 5mg 置于。

30、 2mL 容量瓶中，加入少许甲醇摇匀溶解后，再加入甲醇至刻度，使标准品浓度为2500g/mL。随后根据表2标示的体积，加入甲醇连续稀释不同浓度的标准品： 0038 表 2 芹菜素标准品浓度 0039 浓度 (g/mL) ； ppm 0 100 200 300 400 500 0040 2500g/mL 标准品 (mL) 0 0.08 0.16 0.24 0.32 0.4 0041 甲醇 (mL) 2 1.92 1.84 1.76 1.68 1.6 0042 上述不同浓度标准品溶液，经 HPLC 分析后，以标准品的浓度为横坐标值，峰面积值为纵坐标值作直线回归分析，得到经。

31、过原点的 X-Y 直线，当标准曲线相关系数说明书 CN 102274288 B 7 5/9 页 8 (R2)0.9991，才能使用。在本实施例中，以50流动相A及50流动相B作为空白溶液。 0043 实例 3 本发明天仙果萃取物及标准品 HPLC 分析测试 0044 HPLC 分析设备及方法 0045 材料 0046 所有溶剂和试剂均为HPLC级(购自默克(Merck)。天仙果指标成分标准品(HPLC 标定 99 ) 芹菜素 (Aplgenin)( 购自西格玛 (Sigma)。 0047 仪器 0048 美商沃特斯 (WATERS) 高效液相色谱系统 (LC 模块 I 型 (L。

32、C-Module I)。分析用天平，读值可至 0.1 毫克。 0049 HPLC 分析条件 0050 色谱柱为 ODS3， C18 柱 (2504.6mm， 5m)( 购自瓦里安 (Varian)，柱温度为室温，测定波长 254nm，进样体积 15L，流动相速度 0.8mL/min，以甲醇作为样本溶剂，分析时间为 42 分钟。进样前，各样品先分别以 0.45m 的尼龙 (Nylon) 滤膜过滤。进样后， C18 柱另有保护柱过滤。 0051 HPLC 分析的流动相制备 0052 流动相 A ： 0.1三氟醋酸 (TFA) 水溶液。 0053 流动相 B ： 100甲醇。

33、0054 梯度分析条件如表 1 所示： 0055 表 1 HPLC 梯度分析条件 0056 时间 ( 分钟 ) 流动相 A 流动相 B 方式 0 50 50 线性 35 10 90 线性 36 50 50 线性 0057 先行进行五次注射，包括二次标准品溶液，二次样品溶液及至少注射一次空白溶液，确认无干扰物质出现，再进行样品的分析。每当注射六次样品后，必须再分析标准品一次，以确认 HPLC 仪器的稳定度，当全部样品分析完毕之后，再分析标准品一次。 0058 根据上述实例 1 及 2 所制备的天仙果样品及标准品样品的 HPLC 分析图谱如图 1 所示，其中芹菜素的滞留时间。

34、 (RT) 为 24.5 分钟。 0059 芹菜素含量的计算方式如下： 0060 0061 浓度 1 ：为第一次萃取根据外标法所测得的芹菜素浓度 (ppm ； g/mL) 0062 浓度 2 ：为第二次萃取根据外标法所测得的芹菜素浓度 (ppm ； g/mL) 0063 V1 及 V2 ：为第一、二次萃取所量取滤液体积 (mL)。 0064 天仙果萃取物样品生物活性的测试说明书 CN 102274288 B 8 6/9 页 9 0065 天仙果萃取物样品活性测试委托台北医学大学进行。测试项目包括：天仙果萃取物对于 MMP-1、 MMP-2、 MMP-9 及弹性蛋白酶的抑制。

35、能力。 0066 实例 4 天仙果萃取物样品的 MMP 活性抑制的测试 0067 天仙果萃取物样品是根据实例 1 的方法制备。 0068 比较样品： (1)10g/mL维生素A酸(retinoic acid)及(2)10g/mL维生素A醇 (retinol)。 0069 MMP 活性抑制测试的实验方式如下： 0070 (1) 材料 0071 细胞： 0072 1.WS-1( 人类胎儿皮肤纤维母细胞，正常对照组 ) ：购自台湾食品工业发展研究所的菌种保存研究中心 (BCRC 60300)，以 DMEM 培养，所述细胞用于测试天仙果萃取物对于 MMP-1 的影响。 0073 2.N。

36、IH-3T3( 小鼠纤维母细胞 ) 购自台湾食品工业发展研究所的菌种保存研究中心 (BCRC 60008)，所述细胞用于测试天仙果萃取物对于 MMP-2 及 MMP-9 的影响。 0074 (2) 试剂 0075 1. 明胶 (USB) 0076 2.- 酪蛋白、维生素 A 酸及维生素 A 醇 ( 西格玛 (Sigma) 0077 3. 人类重组 TNF-( 阿迪公司 (R&D) 0078 4. 五倍的洗涤缓冲液 2 ：包含 12.5 (v/v) 曲拉通 X-100(Triton X-100)、 250mMTris-HCl pH7.5 及 15mM NaN3 0079 5. 五倍的洗涤。

37、缓冲液 3 ：包含 12.5 (v/v) 曲拉通 X-100(Triton X-100)、 250mMTris-HCl pH7.5、 25mM CaCl2、 5M ZnCl2及 15mM NaN3 0080 6. 五倍的洗涤缓冲液 4 ：包含 250mM Tris-HCl pH7.5、 25mM CaCl2、 5M ZnCl2及 15mM NaN3 0081 7. 明胶 / 酪蛋白缓冲液：包含 40 (v/v)2M Tris-HCl pH8.8 及 60 (v/v)H2O 0082 8.30丙烯酰胺：包含 1 (w/v) 双 - 丙烯酰胺及 29 (w/v) 丙烯酰胺 0083 9。

38、. 五倍的样品缓冲液：包含 0.2M Tris-HCl pH6.8、 5 (w/v) 十二烷基硫酸钠 (SDS)、 20 (w/v) 甘油及 0.1 (w/v) 溴酚蓝 0084 10. 考马斯蓝 (Coomassie blue)R250 ：包含 0.25 (w/v) 考马斯亮蓝 (Coomassiebrilliant blue)、 45 (v/v) 甲醇及 10 (v/v) 冰醋酸 0085 11. 脱色剂：包含 10 (v/v) 冰醋酸、 30 (v/v) 甲醇及 60 (v/v)Q-H2O 0086 (3) 实验步骤 0087 WS-1 细胞处理 0088 1.。

39、将 24 孔盘中的每一个孔放入 1105个 WS-1 细胞，置于 37、 5二氧化碳的培养箱中，使细胞完全附着于孔盘底部。 0089 2. 吸出孔盘每一个孔的培养液，加入新的培养液并混有适当的样品，置于培养箱 24 小时。 0090 3. 吸出孔盘中混有样品的培养液，加入不含血清但含 10ng/mL TNF- 并混有适当的样品的培养液，置于培养箱 24 小时。说明书 CN 102274288 B 9 7/9 页 10 0091 4. 收取上清液并保存于 -80冰箱。 0092 NIH-3T3 细胞处理 0093 1. 以含有 10 FBS 的 DMEM 培养基，将 N。

40、IH-3T3 细胞分盘至 24 孔盘中，每个孔的细胞数为 1105个，培养基体积为 0.5mL。 0094 2. 待细胞贴附至孔底部后，将 1mg/mL 的样品加入细胞中处理 48 小时，之后将含有 FBS 的培养基去除，加入不含 FBS 的培养基，并重新加入 1mg/mL 的样品，再以人类重组 TNF-(10ng/mL) 刺激细胞 24 小时后，收集 0.5mL 的细胞悬浮液做实验测试。 0095 3. 收取上清液并保存于 -80冰箱。 0096 酶谱法凝胶 (zymography gel) 分析 0097 1. 准备酶谱法凝胶。 0098 2. 将样品与其 1/4 体积。

41、的缓冲液混合，置于室温 5 至 10 分钟。 0099 3. 进行酶谱法电泳。 0100 4. 于电泳凝胶上加上一倍的洗涤缓冲液 2，于室温下均匀摇晃 1 小时。 0101 5. 移除洗涤缓冲液 2，加入一倍的洗涤缓冲液 3，室温摇晃 30 分钟。 0102 6. 移除洗涤缓冲液 3，加入一倍的洗涤缓冲液 4，于 37均匀摇晃 18 小时。 0103 7. 移除洗涤缓冲液 4，加入考马斯蓝均匀摇晃 20 分钟。 0104 8. 移除考马斯蓝，加入曲拉通 X100(Triton X100) 或脱色剂，直到凝胶上的条带明显可见，此步骤约需 30 分钟至 1 小时。 0105 。

42、9.以柯达(KODAK)EDAS290提取凝胶图像，并以柯达(KODAK)1D图像分析软件定量每个条带。 0106 10. 用柯达 (KODAK)1D 图像分析软件框出已知分子量为 52kD(MMP-1)、 72kD(MMP-2) 及 92kD(MMP-9) 的条带，再框出其下方相同区域面积的背景值，再将所框出的条带的亮度总强度扣掉相同区域面积的背景值亮度总强度。由于培养液为阴性对照组，所以将求得的数值再除以培养液的数值比较，则此数值即为抑制 MMP-1、 MMP-2 及 MMP-9 的活性百分比，即 100 -( 样品背景值 )/ 培养液强度。

43、 )100。 0107 11. 将凝胶用玻璃纸固定于塑料板上风干并保存。 0108 本发明实例 1 天仙果萃取物样品的酶谱如图 2 所示，而天仙果萃取物样品与比较样品对于细胞分泌 MMP-1、 MMP-2 及 MMP-9 的抑制能力测试结果如表 3 所示。 0109 表 3 天仙果萃取物样品对于 MMP 活性抑制的结果 0110 说明书 CN 102274288 B 10 8/9 页 11 0111 根据图 2 可知，经本发明天仙果萃取物处理过的细胞，在凝胶上的显色类似于经维生素 A 酸处理过的细胞。因此，本发明天仙果萃取物与维生素 A 酸类似，均具有抑制 MMP-1、 MM。

44、P2 及 MMP-9 活性的能力 0112 根据表 3 所示的结果可知，天仙果萃取物的浓度达 1mg/mL 时对于 MMP-1 及 MMP-9 的抑制效果优于或接近 10g/mL 的 A 酸。已知 A 酸是美国 FDA 核准用于缓解因光老化而造成的细纹，并治疗因阳光中紫外线造成的肌肤伤害的药物。因此，本发明天仙果萃取物具有减少细纹及减缓皮肤老化的功效。 0113 此外，表 3 所示的结果显示天仙果萃取物对于 MMP-2 的抑制效果优于或接近 10g/mL 的 A 酸，因此具有利于皮肤创伤愈合的效果。 0114 实例 5 天仙果萃取物样品的弹性蛋白酶 (elastase) 活性抑。

45、制的测试 0115 天仙果萃取物样品是根据实例 1 的方法制备。弹性蛋白酶活性抑制测试的实验方法如下： 0116 1. 在待测 96 孔盘中分别加入 50L 的 1 倍反应缓冲液作为阴性对照组、 50L 的 N-甲氧基琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Val-氯甲基酮(N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val- chloromethyl ketone)( 最终浓度为 0.01mM) 作为阳性对照组及 50L 的本发明天仙果萃取物，其浓度为1mg/mL，并一式两份进行试验。其中前述阴性对照组中1倍反应缓冲液是由 10 倍反应缓冲液以去离子水 (Mill-Q 。

46、或同等级 ) 稀释而得， 10 倍缓冲液的成分为在 28mL 中含有 1M Tris-HCl， pH8.0、 2mM 叠氮化钠 (sodium azide)。 0117 2. 加入 100L 弹性蛋白酶 (0.5U/mL)，其最终浓度为 0.25U/mL。 0118 3. 之后加入 50L 弹性蛋白 (elastin)(100g/mL)，其是弹性蛋白酶的底物，其最终浓度为 25g/mL。 0119 4.在室温使其作用两小时之后，以激发波长48510nm、发射波长53015nm测荧光强度 (HIDEX 变色龙酶标仪 (HIDEX Chameleon Microplate Reade。

47、r)，芬兰 (Finland)，而后计算抑制百分比。 0120 5. 计算公式：说明书 CN 102274288 B 11 9/9 页 12 0121 (阴性对照组荧光强度值抑制剂(阳性对照组或是待测样品)荧光强度值)/阴性对照组荧光强度值 100 0122 根据实例 1 所得本发明天仙果萃取物对于弹性蛋白酶活性抑制能力测试结果如表 4 所示。 0123 表 4 天仙果萃取物对于弹性蛋白酶活性抑制的结果 0124 样品抑制能力 ( ) 0125 阳性对照组 (0.01mM) 88.97 0126 阴性对照组 NC(0.01mM) 0 0127 天仙果萃取物 (1mg/mL) 72.1 0128 根据表 4 所示的结果可知，本发明天仙果萃取物的浓度约为 1mg/mL 时，其对于弹性蛋白酶的抑制效果接近 0.01mM N- 甲氧基琥珀酰基 -Ala-Ala-Pro-Val- 氯甲基酮 (N-Me thoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethyl ketone) 的抑制效果。因此，本发明天仙果萃取物具有保护皮肤弹性蛋白、保存皮肤水分及增加皮肤弹性的功效。说明书 CN 102274288 B 12 1/1 页 13 图 1 图 2 说明书附图 CN 102274288 B 13 。

摘要
申请专利号：	CN201010199413.9	申请日：	20100609
公开号：	CN102274288B	公开日：	20130717
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	A61K36/60,A61K8/97,A23L1/29,A61Q19/08,A61P17/02,A61P17/16,A61K125/00,A61K131/00	主分类号：	A61K36/60,A61K8/97,A23L1/29,A61Q19/08,A61P17/02,A61P17/16,A61K125/00,A61K131/00
申请人：	台湾糖业股份有限公司
发明人：	杨寄明,黄怡仁,吕思洁,陈嘉琪
地址：	中国台湾台南市
优先权：	CN201010199413A
专利代理机构：	北京汇智英财专利代理事务所(普通合伙)	代理人：	郑玉洁
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内容摘要

本发明提供一种用于防止皮肤老化的组合物，其包含天仙果萃取物。本发明还提供一种包含天仙果萃取物的防止皮肤老化的化妆品。本发明还涉及天仙果萃取物用于制备防止皮肤老化的组合物的用途。

权利要求书

1.一种天仙果萃取物用于制备防止皮肤老化的组合物的用途，其中该天仙果萃取物是以选自下列群组的溶剂萃取天仙果制得：醇类、DMSO、乙酸乙酯、丙酮、卤烷类溶剂及其混合物。 2.如权利要求1所述的用途，其中所述萃取是以超声波震荡或回流方式进行。 3.如权利要求1所述的用途，其中所述醇类为甲醇、乙醇或正丁醇。 4.如权利要求1所述的用途，其中所述醇类为甲醇。 5.如权利要求3所述的用途，其中所述甲醇或乙醇的浓度为100%至25%。 6.如权利要求3所述的用途，其中所述甲醇或乙醇的浓度为100%、75%、70%或50%。 7.如权利要求1所述的用途，其中所述天仙果是台湾天仙果(Ficus formosana Maxim)。 8.如权利要求1所述的用途，其中所述天仙果为其果实或根须状部分。 9.如权利要求1所述的用途，其中所述天仙果萃取物具有HPLC图谱，其中，该HPLC分析是使用以下条件进行：1)仪器：美商沃特斯（WATERS）高效液相色谱系统（LC-Module I）；2)色谱柱：ODS3，250×4.6mm，5μm的C18管柱；3)柱温度：室温；4)测定波长：254nm；5)进样体积：15μL；6)流动相速度：0.8mL/min；7)分析时间；42分钟；8)天仙果指标成分标准品：HPLC标定99%的芹菜素(Aplgenin)；9)进样前，样品先以0.45μm的尼龙（Nylon）滤膜过滤；10)进样后，C18管柱另有保护柱过滤；11)流动相A：0.1%三氯醋酸（TFA）水溶液，流动相B：100%甲醇；以及12)梯度分析条件：。 10.如权利要求1至9中任一权利要求所述的用途，其中所述天仙果萃取物具有抑制MMP-1、MMP-2及/或MMP-9的活性。 11.如权利要求1至9中任一权利要求所述的用途，其中所述天仙果萃取物具有抑制弹性蛋白酶的活性。 12.如权利要求1至9中任一权利要求所述的用途，其中所述防止皮肤老化为减少皮肤细纹、促进皮肤伤口愈合、保存皮肤水分或增加皮肤弹性。 13.如权利要求1至12中任一权利要求所述的用途，其中所述组合物包含所述萃取物以及构成该组合物所需的载剂。 14.如权利要求13所述的用途，其中所述组合物进一步包含其它可用于防止皮肤老化的活性成分。 15.如权利要求13所述的用途，其中所述萃取物在所述组合物中的含量为0.1mg/mL至10mg/mL。 16.如权利要求13所述的用途，其中所述组合物为化妆品、食品、动物用药品或人类用药品。 17.如权利要求13所述的用途，其中所述组合物为保养品或保健食品。 18.如权利要求13所述的用途，其中所述组合物为健康食品。

说明书

技术领域

本发明涉及天仙果萃取物及其用于防止皮肤老化的用途。

背景技术

天仙果为桑科(Moraceae)榕属(Ficus genus)植物，别名台湾榕、小本牛乳埔、羊奶头、羊奶仔、山金枣、山拔紫、玉带角等。天仙果分布在中国大陆、香港、越南及台湾全境山麓至低海拔山区的阴湿地阔叶林内或荒野灌木丛中，在台湾东部地区低海拔山区也可发现其踪迹。天仙果植株为常绿性灌木，全株内含白色乳汁，叶互生具短柄，叶片形状呈长椭圆形、披针形或长菱形，全缘或具有疏锯齿，叶部型态变异很大，叶片颜色为银色或绿色，果实呈卵形或倒卵形，果实未成熟时呈绿色，表面有白色斑点，果实成熟时呈紫黑色。根据甘伟松教授所著的“药用植物学”记载，全株均可为药用，具有袪风活血及治疗风湿病等效用(请参张同吴“台湾保健植物的多样性与利用研究”； 2005年9月22日，台湾地区植物资源的多样性发展研讨会)。

已知天仙果具有袪风活血、强筋壮骨及消肿等功能，民间常以天仙果全株主治风湿关节痛、急慢性肝炎、腰扭伤、小儿发育不良、白带、下消、月经不顺、乳汁不下、咳嗽、毒蛇咬伤及尿路感染等病症。

民间习知对于天仙果的用法干品鲜品均可，多以汤剂或炖剂煮食天仙果的根部及果实以制成天仙酒，并宣称其具有壮阳功效。

国内针对天仙果的药理作用的研究发现，台湾天仙果具有抗人类肝癌细胞株及淋巴癌细胞株的毒杀作用等能力(许(Sheu YW)、常(Chiang LC)、陈(Chen IS)、陈(Chen YC)、蔡(Tsai IL)，天然药物学会会志(Planta Med.)2005年12月；71(12)：1165-7)。目前仍有待开发天仙果多方面的应用性。

人口老化是全球性的趋势，而老化后最明显的即是皮肤外观的变化，因此延缓皮肤老化的相关产品特别受到瞩目。一般来说，皮肤老化可分为两种基本过程：内源性老化及外源性老化。内源性老化为自然衰老的过程，又称固有性老化，与遗传因素、年龄有关，而外源性老化与外界刺激例如紫外线、太阳风暴、臭氧层破坏、地心引力、抽烟、温湿度变化、皮肤病症、血管病变、过敏等有关。由紫外线引起的皮肤老化又称为光老化(photoaging)，其也是引起皮肤癌的主要原因。

皮肤老化的主要症状为失去弹性，其是由于皮肤中胶原蛋白的产生减少，或胶原蛋白的降解增加。胶原蛋白为纤维状结构的蛋白质，其为结缔组织的细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)的主要成分。胶原蛋白的降解会导致皮肤外貌及功能的改变，例如产生皮肤表面细纹、深层皱纹、裂缝、肿块、粗大毛孔、鳞片化、失去皮肤弹性(如眼袋)、失去皮肤紧实度、皮肤变色(如黑眼圈)、产生斑点、色素沉淀、皮肤角化、毛细管扩张及其它组织变化。弹性蛋白酶可使皮肤有弹性。由于在自然老化过程中，弹性蛋白会被自由基或弹性蛋白酶所破坏，导致皮肤弹性降低。因此，化妆品中经常会添加弹性蛋白酶抑制剂。

皮肤的细胞外基质提供皮肤的强度及完整性。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一种可分解肽键结的蛋白酶，因此其可降解细胞外基质中的胶原蛋白。MMP在皮肤自我修护的正常降解及重塑部分扮演重要的角色。然而，当MMP过度活化时，会导致病理状况或使病理状况恶化，而造成组织功能及/或构造的丧失。目前已知有超过25种的MMP与皮肤细胞外基质的重塑、伤口愈合、炎症反应等反应有关。其中3种MMP，即MMP-1、MMP-2及MMP-9被认为与皮肤细胞外基质特别相关，且在正常及病理组织重塑中扮演重要角色。MMP-1、MMP-2及MMP-9 特别受到重视的原因有两个，其一是这些MMP的底物为皮肤的重要结构成分，其二是皮肤长期暴露在会刺激这些MMP形成病理状态的因素下，例如炎症反应、氧化性应激及紫外线。因此，目前认为选择性抑制MMP-1、MMP-2及MMP-9比抑制所有金属蛋白酶在减缓皮肤老化上更有益处及有效。

基于安全性及天然性考虑，所属领域中已尝试由天然产物中开发抗老化制剂。例如，中国台湾第I287997号专利揭露一种防止皮肤老化组成物，其特征为含有医学上容许的皮肤外用基剂及或添加剂，与1种或2种以上选自以下植物的植物萃取物：水丁香(Ludwigia octovalvis)、鱼针草(Anisomeles indica)、半边莲(Lobelia chinensis)、虱母草(Urena lobata)、马鞭草(Verbana officinalis)、菟丝子(Cuscuta australis)、马蹄金 (Dchondra micrantha)、叶下珠(Phyllanthus urinaria)、苦职(Physalis angulata)、白花菜 (Cleome gynandra)、山芥菜(Rorippa indica)、遍地锦(Hydrocotyle formosana)、伤寒草 (Vernonia cinerae)、金钮扣(Spilanthes acmella)、美人蕉(Canna indica)、马鞍藤 (Ipomoeapes-caprae)、化石树(Clerodendrum calamitosum)、锦地罗(Drosera burmanni)、金线莲(Anoectochilus formosanus)、南岭荛花(Wikstroemia indica)、白叶刺根(Elaeagnus oldhamii)、玉叶金花(Mussaenda parviflora)、台湾马兜铃(Aristolochia mollis)、黄金桂 (Cudrania cochinchinensis var.gerontogea)、臭茉莉(Clerodendrum philippinum)、大青 (Clerodendrum cyrtophyllum)、白龙船花(Clerodendrum paniculataum var.albifloraum)、木苎麻(Boehmeria densiflora)、鸦臼(Sapium sebiferum)、三叶葡萄(Tetrastigma dentatum)、小叶葡萄(Vitis thunbergii)、金石榴(Bredia oldhami)、哈在花(Staurogyne concinnula)、石上柏(Selaginella doederleinii)、胡枝子(Lespedeza cuneata)、细叶水丁香 (Ludwigia hyssopifolia)、乌蕨(Sphenomeris chusana)、铁线蕨(Adiantum flabellulatum)、眼草(Kummerowia striata)、海州常山(Clerodendrum trichotomum)、黄荆(Vitex negundo)、咸豊草(Bidens pilosa var.minor)、鼠曲草(Gnaphalium affine)、紫背草(Emilia sonchifolia)、含羞草(Mimosa pudica)、乳仔草(Euphorbia hirta)、车前草(Plantago formosana)、白花藤(Plumbago zeylanica)、钉地蜈蚣(Torenia concolor var.formosona)、大甲草(Euphorbia formosana)、戟叶紫花地丁(Viola phillippica)、台湾何首乌(Polygonum multiflorum var.hyopleucum)、牛乳榕(Ficus erecta var.beecheyana)、蓖叶灯笼草 (Kalanchoe spathulata)、扛香藤(Mallotus repandus)、台湾钩藤(Uncaria hirsuta)、罗氏盐肤木(Rhus semialata var.roxburghiana)、金剑草(Rubia lanceolata)、红花鼠尾草(Salvia coccinea)、兔仔菜(Ixeris chinensis)、刀伤草(Ixeris laevigata var.oldhami)、苦蓝盘 (Clerodendrum inerme)、杜虹花(Callicarpa formosana)、铜锤玉带草(Pratia nummularia)B三叶五加(Acanthopanax trifoliatus)。根据现在的潮流，仍有需要发展天然、安全且具更佳效果的美白防皱、增进皮肤弹性的产品。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于防止皮肤老化的组合物，其包含天仙果萃取物。

本发明的另一目的是提供一种防止皮肤老化的化妆品，其包含本发明的组合物。

本发明的又一目的是提供一种天仙果萃取物的用途，其用于制备防止皮肤老化的组合物。

本发明在以下部分中详细描述。本发明的其它特征、目的及优点可易见于本发明的实施方式及权利要求书中。

附图说明

图1为本发明天仙果萃取物样品及标准品样品的HPLC分析图谱。

图2为本发明天仙果萃取样品的明胶/酪蛋白酶分析图谱。

具体实施方式

在本发明之前，并没有任何报告指出或推测天仙果具有延缓皮肤老化，特别是防皱、美白、减少细纹、增进皮肤弹性等功效，也甚至没有任何报告指出天仙果具有帮助皮肤创伤愈合的效果。在本发明中，出人意料地发现天仙果萃取物具有抑制细胞分泌MMP-1、MMP-2及MMP-9及抑制弹性蛋白酶的功效。因此，本发明提供一种可用于防止皮肤老化，例如防皱、美白、减少细纹、增进皮肤弹性及帮助伤口愈合的效果的含有天仙果萃取物。

本发明另外提供一种防止皮肤老化的组合物，其包含如本发明的天仙果萃取物。本发明还提供一种如本发明的天仙果萃取物用于制备防止皮肤老化的组合物的用途。

除非本文中另外定义，否则结合本发明使用的科技术语应具有所属领域的技术人员通常理解的含义。术语的含义及范畴应为明确的；然而，若存在任何潜在含糊性，则本文所提供的定义优先于任何词典或外来定义。

除非另外指示，否则应了解如本揭示案所用的以下术语具有以下含义：

如本文所使用的术语“皮肤老化”一词包括皮肤外貌及功能的改变，例如产生皮肤表面细纹、深层皱纹、裂缝、肿块、粗大毛孔、鳞片化、失去皮肤弹性(如眼袋)、失去皮肤紧实度、皮肤变色(如黑眼圈)、产生斑点、色素沉淀、皮肤角化、毛细管扩张及其它组织变化。

如本文所用的术语“防止”表示预防或阻止症状产生，或改善或回复已产生的症状。

术语“载剂”或“化妆品中可接受的载剂”是指稀释剂、赋形剂或类似物，其为各该行业所属技术领域的技术人员所熟知。

本发明的化妆品还可进一步包含可用于防止皮肤老化的活性成分，例如维生素A 酸、维生素A醇、熊果素、玻尿酸、表皮生长因子及其它天然美白成分等。

术语“天仙果萃取物”表示将天仙果植株经溶剂萃取后的萃取物。优选地，本发明的天仙果萃取物采用台湾产出的台湾天仙果(Ficus formosana Maxim.)，将天仙果植株全株经干燥后，使用超声波震荡或回流方式以溶剂萃取获得。优选地，本发明的天仙果萃取物是取自天仙果果实或根须状部分。本发明所使用的溶剂优选地为选自醇类、 DMSO、乙酸乙酯、丙酮、卤烷类溶剂或其混合物所组成的群组，更优选地为浓度为约100％至约25％的甲醇或乙醇。更优选地，本发明天仙果萃取物具有如图1的HPLC 图谱。本发明天仙果萃取物的制备可使用芹菜素作为指标成份，作为工艺中质量控制的标准。

在一个优选实施例中，本发明提供一种组合物，其包含本发明的天仙果萃取物。

在一个优选实施例中，本发明的组合物包含约0.5mg/mL至5mg/mL的天仙果萃取物。优选地，本发明的组合物包含约1mg/mL至5mg/mL的天仙果萃取物。最优选地，本发明的组合物包含约1、2.5或5mg/mL的天仙果萃取物。

本发明的萃取物及组合物具有抑制基质金属蛋白酶-1、-2及-9(MMP-1、MMP-2 及MMP-9)的活性及抑制弹性蛋白酶的活性。

除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。

本发明是以以下的非限制性的实例探讨天仙果萃取物的制备及其应用于防止皮肤老化的用途。所述实例不应视为过度地限制本发明。本发明所属技术领域的技术人员可在不背离本发明的精神或范畴的情况下对本文所讨论的实施例进行修改及变化，而仍属于本发明的范围。

实例

实例1 台湾天仙果萃取物样品的制备

本实例是以产地为台湾的天仙果作为原料，其中所采用的台湾天仙果已通过“台湾天仙果农药及重金属限量标准值”。

取台湾天仙果(干材进货)，取其外观为部分根须状物，部分夹杂小于四厘米片状物，进行研磨以通过30孔筛。根据红外线水分测定仪操作说明测试含水率，并控制台湾天仙果样品的水分含量低于10％。

取上述水分含量低于10％的台湾天仙果50克置于1升四颈平底烧瓶，加入100 ％甲醇500毫升，加热回流萃取4小时，离心及过滤，定量滤液体积(V1)并取其中1 毫升滤液进行后续HPLC分析。再次加入100％甲醇500毫升溶解烧瓶内残渣，进行第二次加热回流萃取3小时，离心及过滤，定量滤液体积(V2)并取其中1毫升进行HPLC 分析。

秤取烘干至约10毫克的浸膏样品，加入1毫升100％甲醇，在室温下以超声波震荡器震荡30分钟，离心及过滤，取1毫升滤液进行HPLC分析。

实例2 标准品及空白溶液的制备

秤取芹菜素5mg置于2mL容量瓶中，加入少许甲醇摇匀溶解后，再加入甲醇至刻度，使标准品浓度为2500μg/mL。随后根据表2标示的体积，加入甲醇连续稀释不同浓度的标准品：

表2 芹菜素标准品浓度

浓度(μg/mL)；ppm 0 100 200 300 400 500

2500μg/mL标准品(mL) 0 0.08 0.16 0.24 0.32 0.4

甲醇(mL) 2 1.92 1.84 1.76 1.68 1.6

上述不同浓度标准品溶液，经HPLC分析后，以标准品的浓度为横坐标值，峰面积值为纵坐标值作直线回归分析，得到经过原点的X-Y直线，当标准曲线相关系数 (R2)0.999～1，才能使用。在本实施例中，以50％流动相A及50％流动相B作为空白溶液。

实例3 本发明天仙果萃取物及标准品HPLC分析测试

HPLC分析设备及方法

材料

所有溶剂和试剂均为HPLC级(购自默克(Merck))。天仙果指标成分标准品(HPLC 标定99％)芹菜素(Aplgenin)(购自西格玛(Sigma))。

仪器

美商沃特斯(WATERS)高效液相色谱系统(LC模块I型(LC-Module I))。分析用天平，读值可至0.1毫克。

HPLC分析条件

色谱柱为ODS3，C18柱(250×4.6mm，5μm)(购自瓦里安(Varian))，柱温度为室温，测定波长254nm，进样体积15μL，流动相速度0.8mL/min，以甲醇作为样本溶剂，分析时间为42分钟。进样前，各样品先分别以0.45μm的尼龙(Nylon)滤膜过滤。进样后，C18柱另有保护柱过滤。

HPLC分析的流动相制备

流动相A：0.1％三氟醋酸(TFA)水溶液。

流动相B：100％甲醇

梯度分析条件如表1所示：

表1 HPLC梯度分析条件

时间(分钟) 流动相A％流动相B％方式 0 50 50 线性 35 10 90 线性 36 50 50 线性

先行进行五次注射，包括二次标准品溶液，二次样品溶液及至少注射一次空白溶液，确认无干扰物质出现，再进行样品的分析。每当注射六次样品后，必须再分析标准品一次，以确认HPLC仪器的稳定度，当全部样品分析完毕之后，再分析标准品一次。

根据上述实例1及2所制备的天仙果样品及标准品样品的HPLC分析图谱如图1 所示，其中芹菜素的滞留时间(RT)为24.5分钟。

芹菜素含量的计算方式如下：

浓度1：为第一次萃取根据外标法所测得的芹菜素浓度(ppm；μg/mL)

浓度2：为第二次萃取根据外标法所测得的芹菜素浓度(ppm；μg/mL)

V1及V2：为第一、二次萃取所量取滤液体积(mL)。

天仙果萃取物样品生物活性的测试

天仙果萃取物样品活性测试委托台北医学大学进行。测试项目包括：天仙果萃取物对于MMP-1、MMP-2、MMP-9及弹性蛋白酶的抑制能力。

实例4 天仙果萃取物样品的MMP活性抑制的测试

天仙果萃取物样品是根据实例1的方法制备。

比较样品：(1)10μg/mL维生素A酸(retinoic acid)及(2)10μg/mL维生素A醇 (retinol)。

MMP活性抑制测试的实验方式如下：

(1)材料

细胞：

1.WS-1(人类胎儿皮肤纤维母细胞，正常对照组)：购自台湾食品工业发展研究所的菌种保存研究中心(BCRC 60300)，以DMEM培养，所述细胞用于测试天仙果萃取物对于MMP-1的影响。

2.NIH-3T3(小鼠纤维母细胞)购自台湾食品工业发展研究所的菌种保存研究中心 (BCRC 60008)，所述细胞用于测试天仙果萃取物对于MMP-2及MMP-9的影响。

(2)试剂

1.明胶(USB)

2.β-酪蛋白、维生素A酸及维生素A醇(西格玛(Sigma))

3.人类重组TNF-α(阿迪公司(R&D))

4.五倍的洗涤缓冲液2：包含12.5％(v/v)曲拉通X-100(Triton X-100)、250mM Tris-HCl pH7.5及15mM NaN3

5.五倍的洗涤缓冲液3：包含12.5％(v/v)曲拉通X-100(Triton X-100)、250mM Tris-HCl pH7.5、25mM CaCl2、5μM ZnCl2及15mM NaN3

6.五倍的洗涤缓冲液4：包含250mM Tris-HCl pH7.5、25mM CaCl2、5μM ZnCl2及15mM NaN3

7.明胶/酪蛋白缓冲液：包含40％(v/v)2M Tris-HCl pH8.8及60％(v/v)H2O

8.30％丙烯酰胺：包含1％(w/v)双-丙烯酰胺及29％(w/v)丙烯酰胺

9.五倍的样品缓冲液：包含0.2M Tris-HCl pH6.8、5％(w/v)十二烷基硫酸钠 (SDS)、20％(w/v)甘油及0.1％(w/v)溴酚蓝

10.考马斯蓝(Coomassie blue)R250：包含0.25％(w/v)考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)、45％(v/v)甲醇及10％(v/v)冰醋酸

11.脱色剂：包含10％(v/v)冰醋酸、30％(v/v)甲醇及60％(v/v)Q-H2O

(3)实验步骤

WS-1细胞处理

1.将24孔盘中的每一个孔放入1×105个WS-1细胞，置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中，使细胞完全附着于孔盘底部。

2.吸出孔盘每一个孔的培养液，加入新的培养液并混有适当的样品，置于培养箱24小时。

3.吸出孔盘中混有样品的培养液，加入不含血清但含10ng/mL TNF-α并混有适当的样品的培养液，置于培养箱24小时。

4.收取上清液并保存于-80℃冰箱。

NIH-3T3细胞处理

1.以含有10％FBS的DMEM培养基，将NIH-3T3细胞分盘至24孔盘中，每个孔的细胞数为1×105个，培养基体积为0.5mL。

2.待细胞贴附至孔底部后，将1mg/mL的样品加入细胞中处理48小时，之后将含有FBS的培养基去除，加入不含FBS的培养基，并重新加入1mg/mL 的样品，再以人类重组TNF-α(10ng/mL)刺激细胞24小时后，收集0.5mL 的细胞悬浮液做实验测试。

3.收取上清液并保存于-80℃冰箱。

酶谱法凝胶(zymography gel)分析

1.准备酶谱法凝胶。

2.将样品与其1/4体积的缓冲液混合，置于室温5至10分钟。

3.进行酶谱法电泳。

4.于电泳凝胶上加上一倍的洗涤缓冲液2，于室温下均匀摇晃1小时。

5.移除洗涤缓冲液2，加入一倍的洗涤缓冲液3，室温摇晃30分钟。

6.移除洗涤缓冲液3，加入一倍的洗涤缓冲液4，于37℃均匀摇晃18小时。

7.移除洗涤缓冲液4，加入考马斯蓝均匀摇晃20分钟。

8.移除考马斯蓝，加入曲拉通X100(Triton X100)或脱色剂，直到凝胶上的条带明显可见，此步骤约需30分钟至1小时。

9.以柯达(KODAK)EDAS290提取凝胶图像，并以柯达(KODAK)1D图像分析软件定量每个条带。

10.用柯达(KODAK)1D图像分析软件框出已知分子量为52kD(MMP-1)、72 kD(MMP-2)及92kD(MMP-9)的条带，再框出其下方相同区域面积的背景值，再将所框出的条带的亮度总强度扣掉相同区域面积的背景值亮度总强度。由于培养液为阴性对照组，所以将求得的数值再除以培养液的数值比较，则此数值即为抑制MMP-1、MMP-2及MMP-9的活性百分比，即100％-[(样品背景值)/培养液强度)]×100％。

11.将凝胶用玻璃纸固定于塑料板上风干并保存。

本发明实例1天仙果萃取物样品的酶谱如图2所示，而天仙果萃取物样品与比较样品对于细胞分泌MMP-1、MMP-2及MMP-9的抑制能力测试结果如表3所示。

表3 天仙果萃取物样品对于MMP活性抑制的结果

根据图2可知，经本发明天仙果萃取物处理过的细胞，在凝胶上的显色类似于经维生素A酸处理过的细胞。因此，本发明天仙果萃取物与维生素A酸类似，均具有抑制MMP-1、MMP2及MMP-9活性的能力

根据表3所示的结果可知，天仙果萃取物的浓度达1mg/mL时对于MMP-1及 MMP-9的抑制效果优于或接近10μg/mL的A酸。已知A酸是美国FDA核准用于缓解因光老化而造成的细纹，并治疗因阳光中紫外线造成的肌肤伤害的药物。因此，本发明天仙果萃取物具有减少细纹及减缓皮肤老化的功效。

此外，表3所示的结果显示天仙果萃取物对于MMP-2的抑制效果优于或接近 10μg/mL的A酸，因此具有利于皮肤创伤愈合的效果。

实例5天仙果萃取物样品的弹性蛋白酶(elastase)活性抑制的测试

天仙果萃取物样品是根据实例1的方法制备。弹性蛋白酶活性抑制测试的实验方法如下：

1.在待测96孔盘中分别加入50μL的1倍反应缓冲液作为阴性对照组、50μL的 N-甲氧基琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Val-氯甲基酮 (N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethyl ketone)(最终浓度为0.01mM) 作为阳性对照组及50μL的本发明天仙果萃取物，其浓度为1mg/mL，并一式两份进行试验。其中前述阴性对照组中1倍反应缓冲液是由10倍反应缓冲液以去离子水(Mill-Q或同等级)稀释而得，10倍缓冲液的成分为在28mL中含有1M Tris-HCl，pH8.0、2mM叠氮化钠(sodium azide)。

2.加入100μL弹性蛋白酶(0.5U/mL)，其最终浓度为0.25U/mL。

3.之后加入50μL弹性蛋白(elastin)(100μg/mL)，其是弹性蛋白酶的底物，其最终浓度为25μg/mL。

4.在室温使其作用两小时之后，以激发波长485±10nm、发射波长530±15nm测荧光强度(HIDEX变色龙酶标仪(HIDEX Chameleon Microplate Reader)，芬兰 (Finland))，而后计算抑制百分比。

5.计算公式：

(阴性对照组荧光强度值—抑制剂(阳性对照组或是待测样品)荧光强度值)/阴性对照组荧光强度值×100％

根据实例1所得本发明天仙果萃取物对于弹性蛋白酶活性抑制能力测试结果如表 4所示。

表4 天仙果萃取物对于弹性蛋白酶活性抑制的结果

样品抑制能力(％)

阳性对照组(0.01mM) 88.97

阴性对照组NC(0.01mM) 0

天仙果萃取物(1mg/mL) 72.1

根据表4所示的结果可知，本发明天仙果萃取物的浓度约为1mg/mL时，其对于弹性蛋白酶的抑制效果接近0.01mM N-甲氧基琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Val-氯甲基酮 (N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethyl ketone)的抑制效果。因此，本发明天仙果萃取物具有保护皮肤弹性蛋白、保存皮肤水分及增加皮肤弹性的功效。