本申请是2004.01.30提交的CN 20048008275.4，题为“抗多种脑膜炎球菌 血清组的可注射性疫苗”的分案申请。
技术领域
本发明涉及疫苗学领域，尤其针对细菌性脑膜炎。
背景技术
脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是导致细菌性脑膜炎的革兰氏阴性人 病原体[1]。脑膜炎奈瑟球菌与淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)密切相关，虽然明 确判别脑膜炎球菌的一个特征是存在在所有病原性脑膜炎球菌中的多糖荚膜。
在生物体荚膜多糖的基础上，已鉴定到12种脑膜炎奈瑟球菌血清组(A，B，C，H， I，K，L，29E，W135，X，Y和Z)。血清组A(MenA)是在亚撒哈拉非洲流行病的最普遍原 因。血清组B和C引起发达国家的大多数病例，而血清组W135和Y引起发达 国家的其余病例。
除用于分类之外，荚膜多糖已被用于疫苗。多年来已知血清组A，C，Y和W135 荚膜多糖的可注射四价疫苗[2，3]，并批准用于人类。尽管它们在青少年和成人 中有效，它们诱导的免疫反应差且保护持续时间短，不能用于婴儿[例如4]。本 疫苗中的多糖未缀合，以1∶1∶1∶1重量比存在[5]。一旦从它们的冻干形式再重建， Mencevax ACWYTM和MenomuneTM都含有50g纯化的各种多糖。也已将血清组 A，C，W135和Y的荚膜多糖以缀合物形式联合[6-9]以产生四价疫苗，例如不含佐 剂的MenactraTM产品。
已批准将缀合的血清组C寡糖用于人类，包括MenjugateTM[10，11]， MeningitecTM和NeisVac-CTM。产品MenjugateTM，MeningitecTM具有与CRM197载体缀合的寡糖抗原，而NeisVac-CTM利用了与破伤风毒素载体缀合的完全多糖 (O-脱乙酰化)。
然而，还需要改进抗血清组A，W135和Y的缀合疫苗及其制造。参考文献7 中揭示的产品、方法和应用致力于解决这种需求，但是还可以进行更多的调整和 改进。
发明描述
本发明提供一种含有荚膜糖的可注射免疫原性组合物，荚膜糖来自脑膜炎奈 瑟球菌血清组A，C，W135和Y中的至少两种，其中所述荚膜糖与载体蛋白缀合和 /或是寡糖，其中该组合物每剂量含有≤50μg脑膜炎球菌糖。
本发明还提供一种含有荚膜糖的可注射免疫原性组合物，荚膜糖来自脑膜炎 奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y中的至少两种，其中所述荚膜糖与载体蛋白缀合 和/或是寡糖，其中该组合物还含有来自下列一种或多种的抗原：(a)脑膜炎奈瑟 球菌血清组B；(b)流感嗜血杆菌B型；和/或(c)肺炎链球菌。
本发明优选的16种组合物中包括的抗原是：(1)脑膜炎奈瑟球菌血清组 C，W135和Y；(2)脑膜炎奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y；(3)脑膜炎奈瑟球 菌血清组B，C，W135和Y；(4)脑膜炎奈瑟球菌血清组A，B，C，W135和Y；(5)流 感嗜血杆菌B型和脑膜炎奈瑟球菌血清组C，W135和Y；(6)流感嗜血杆菌B型 和脑膜炎奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y；(7)流感嗜血杆菌B型和脑膜炎奈瑟 球菌血清组B，C，W135和Y；(8)流感嗜血杆菌B型和脑膜炎奈瑟球菌血清组 A，B，C，W135和Y；(9)肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟球菌血清组C，W135和Y；(10) 肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y；(11)肺炎链球菌和脑膜 炎奈瑟球菌血清组B，C，W135和Y；(12)肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟球菌血清组 A，B，C，W135和Y；(13)流感嗜血杆菌B型，肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟球菌血清 组C，W135和Y；(14)流感嗜血杆菌B型，肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟球菌血清 组A，C，W135和Y；(15)流感嗜血杆菌B型，肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟球菌血 清组B，C，W135和Y；(16)流感嗜血杆菌B型，肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟球菌血 清组A，B，C，W135和Y。
本发明组合物中的糖抗原优选与载体缀合。本发明组合物中的糖抗原优选为 寡糖。本发明组合物中的糖抗原最优选与寡糖缀合。
脑膜炎球菌糖混合物
本发明组合物含有来自脑膜炎奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y中的至少两种 (即2，3或4种)的荚膜糖。本发明组合物优选包含至少来自血清组C，W135和 Y(即非MenA糖)的脑膜炎奈瑟球菌糖。优选将各糖抗原组合而不消除各自的保 护功效，虽然实际的免疫原性(例如ELISA效价)可能降低。
优选来自一种以上脑膜炎奈瑟球菌血清组的糖的混合物，例如含有来自血清 组A+C，A+W135，A+Y，C+W135，C+Y，W135+Y，A+C+W135，A+C+Y， C+W135+Y，A+C+W135+Y等的糖的组合物。优选的组合物含有来自血清组C和 Y的糖。其它优选的组合物含有来自血清组C，W135和Y的糖。不优选含有仅来 自血清组A和仅来自血清组C的荚膜糖的组合物(参看参考文献10，13和14)。
当混合物含有来自血清组A和C的荚膜糖时，MenA糖∶MenC糖的比例(w/w) 可大于1(例如2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，10∶1或更高)。当混合物含有来自血清组Y及血 清组C和W135两者中的一种或两种的荚膜糖时，MenY糖∶MenW135糖的比 例(w/w)可大于1(例如2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，10∶1或更高)和/或MenY糖∶MenC糖 的比例(w/w)可小于1(例如1∶2，1∶3，1∶4，1∶5或更低)。
每剂量各脑膜炎球菌糖抗原的典型含量为1μg-20μg，例如约1μg，约2.5μg， 约4μg，约5μg，或约10μg(表示为糖)。
来自血清组A∶C∶W135∶Y的糖，优选的比例(w/w)是1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶ 1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶ 2；4∶4∶1∶2；和2∶2∶2∶1。来自血清组C∶W135∶Y的糖，优选的比例(w/w)是1∶1∶ 1；1∶1∶2；1∶1∶1；2∶1∶1；4∶2∶1；2∶1∶2；4∶1∶2；2∶2∶1；和2∶1∶1。优选采用基本上 等量的各种糖。
荚膜多糖的纯化
通常用来制备脑膜炎球菌荚膜多糖的方法包括以下步骤：多糖沉淀(例如利用 阳离子去垢剂)，乙醇分级分离，冷酚抽提(去蛋白质)和超速离心(去LPS)[例如参 考文献15]。
然而，更优选的程序[7]包括多糖沉淀，然后用低级醇溶解沉淀的多糖。可以 用阳离子去垢剂进行沉淀，例如四丁铵和十六烷基三甲基铵盐(例如溴盐)，或海 地美溴铵和肉豆蔻基三甲铵盐。尤其优选十六烷基三甲基溴化铵(‘CTAB’)[16]。 可以用低级醇例如甲醇，1-丙醇，2-丙醇，1-丁醇，2-丁醇，2-甲基-1-丙醇， 2-甲基-2-丙醇，二醇等来溶解沉淀的物质，但乙醇尤其适于溶解CTAB-多糖复 合物。优选将乙醇加入沉淀的多糖，达到乙醇终浓度在50％和95％之间。
重新溶解后，可进一步处理该多糖以除去污染物。这在较少污染物也不能接 受的情况下(例如人疫苗的生产)尤其重要。这一步通常包括一个或多个过滤步骤 例如深度过滤，经活性碳过滤，大小过滤和/或超过滤。
一旦过滤除去了杂质，可将多糖沉淀以进行进一步处理和/或加工。可用交换 阳离子(例如加入钙或钠盐)方便地实现这一目的。
作为纯化的替代方法，可用全部或部分合成来获得本发明的荚膜糖，例如参 考文献17描述了Hib合成，参考文献18的MenA合成。
可化学修饰多糖。例如，可修饰多糖以封闭基团替代一种或多种羟基。这对 降低血清组A的水解尤其有用[19](见下)。也可进行多糖的O-脱乙酰化。
脑膜炎奈瑟球菌血清组B
本发明的一些组合物包含来自脑膜炎奈瑟球菌血清组B的抗原。不同于血清 组A，C，W135和Y，MenB的荚膜糖因为与人自身抗原有相似性，所以不适用于 作为人的免疫原。因此如果将一种糖抗原用于MenB，需要用一种经修饰的糖， 例如唾液酸残基中的N-乙酰基被N-酰基替代的糖。合适的N-酰基是C1-C8的酰 基，例如N-丙酰基[20]。然而，优选采用多肽抗原而非糖抗原。
因此该组合物可包含一种或多种多肽抗原，这些抗原诱导抗MenB感染的保 护性免疫反应或抗MenB的杀菌性免疫反应。更一般地，该组合物优选在给予对 象后可在该对象中诱导抗脑膜炎奈瑟球菌血清组B的两种或多种(例如2或3)高 毒性谱系A4，ET-5和谱系3的抗体反应。
已出版了MC58和MenB菌株的基因组序列[21]，可从编码的多肽中选择合 适的抗原[22]。参考文献22-32描述了优选的抗原。优选本发明组合物包含10种 或更少的(例如9，8，7，6，5，4，3，2)纯化抗原混合物而非单一抗原，尤其优选该组合 物不应包含复杂的或不确定的抗原混合物例如优选该组合物中不含有外膜囊泡 (OMVs)。
优选的组合物包含一种或多种以下五种抗原[32]：(1)‘NadA’蛋白，优选寡 聚形式(例如三聚体形式)；(2)‘741’蛋白；(3)‘936’蛋白；(4)‘953’蛋白； 和(5)‘287’蛋白。
优选的MenB抗原含有菌株2996，MC58，95N477，和394/98之一中发现的氨 基酸序列。蛋白287优选来自菌株2996，或更优选来自菌株394/98。蛋白741 优选来自血清组B菌株MC58、2996、394/98或95N477，或来自血清组C菌株 90/18311。更优选菌株MC58。蛋白936、953和NadA优选来自菌株2996。当组 合物包括特定蛋白抗原(如741或287)时，该组合物可包括大于1种变体形式的 抗原，例如来自相同蛋白，但来自1种以上菌株。可作为串联或单独蛋白加入这 些蛋白。
来自MenB的‘NadA’(奈瑟球菌粘附素A)在参考文献25中示为蛋白‘961’ (SEQ IDs 2943和2944)且在参考文献21中示为‘NMB1994’(也参见GenBank 登录号：11352904和7227256)。蛋白的详细描述可见于参考文献33。当根据本发 明使用时，NadA可采用多种形式。优选的NadA形式是截短或缺失变体，如参 考文献29到31中所示。特别是优选没有其C末端膜锚的NadA(如对于菌株2996， 缺失残基351-405[SEQ ID NO：1])，在本文中有时用‘C’上标区分，例如NadA(C)。 在大肠杆菌(E.coli)中表达无其膜锚结构域的NadA使蛋白分泌到培养物上清中， 伴随去除其23聚体的前导肽(如对于菌株2996，留下327聚体[SEQ ID NO：2])。 无前导肽的多肽在本文中有时用‘NL’上标区分，例如NadA(NL)或NadA(C)(NL)。 优选的NadA多肽具有的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：2有50％或更多同一性 (例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多)；和/或(b)包括至少n个来自 SEQ ID NO：1的连续氨基酸，其中n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、 20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。对 于(b)优选的片段缺乏1个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 25或更多)来自SEQ ID NO：1C末端和/或N末端的氨基酸(如NadA(C)、NadA(NL)、 NadA(C)(NL))。其它优选的片段包括来自SEQ ID NO：1的表位，SEQ ID NO：1尤其 优选的片段是SEQ ID NO：2。这写不同的序列包括NadA变体(如等位基因变体、 同源物、直系同源物、侧向同源物、突变体等)。各种NadA序列示于参考文献 34的图9。
来自MenB的‘741’蛋白示于参考文献25(SEQ IDs 2535和2536)且在参考 文献21中示为‘NMB1870’(也参见GenBank登录号GI：7227128)。血清组A中 的对应蛋白[35]具有GenBank登录号7379322。741是天然脂蛋白。当根据本发 明使用时，741蛋白可采用多种形式。优选的741形式是截短或缺失变体，如参 考文献29到31所示。特别741的N末端可缺失到和包括其聚甘氨酸序列(即对 于菌株MC58，缺失残基1到72[SEQ ID NO：3])，在本文中有时用‘ΔG’前缀 区分。此缺失能提高表达。缺失也去除741的脂化位点。优选的741序列具有氨 基酸序列：(a)与SEQ ID NO：3有50％或更多同一性(例如60％、70％、80％、90％、 95％、99％或更多)；和/或(b)包括至少n个来自SEQ ID NO：3的连续氨基酸，其 中n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、 70、80、90、100、150、200、250或更多)。对于(b)优选的片段包括来自741的 抗原表位。其它优选的片段缺乏1个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、25或更多)来自SEQ ID NO：3C末端和/或N末端的氨基酸。这些序 列包括741变体(如等位基因变体、同源物、直系同源物、侧向同源物、突变体等)。 各种741序列可见于参考文献31的SEQ IDs 1-22和参考文献36的SEQ IDs 1-23。 参考文献37的SEQ IDs 1-299。
蛋白741是引起抗脑膜炎球菌抗体反应的极有效抗原，它在所有脑膜炎球菌 血清组中表达。系统发育分析显示蛋白分裂成2组，这些分裂中之一再次分裂， 产生总共3个变体[38]，尽管抗特定变体培养的血清在相同变体组中是杀菌性的， 它对表达另2个变体之一的菌株无活性，即有变体内交叉保护，但没有变体间交 叉保护[36，38]。因此，为了最大交叉菌株效率，组合物优选应包括大于1个蛋白 741变体。来自各变体的示范序列在本文的SEQ IDs 10、11和12中给出，起始 是741脂蛋白形式中脂类共价附着的N末端半胱氨酸残基。因而，组合物优选应 包括下列至少两种：(1)第1种蛋白，所含氨基酸序列与SEQ ID NO：10有至少 a％序列同一性和/或所含氨基酸序列由来自SEQ ID NO：10的至少x个连续氨 基酸片段组成；(2)第2种蛋白，所含氨基酸序列与SEQ ID NO：11有至少b％ 序列同一性和/或所含氨基酸序列由来自SEQ ID NO：11的至少y个连续氨基酸 片段组成；和(3)第3种蛋白，所含氨基酸序列与SEQ ID NO：12有至少c％序 列同一性和/或所含氨基酸序列由来自SEQ ID NO：12的至少z个连续氨基酸片 段组成。a值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99、99.5或更多。b值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、99.5或更多。c值至少是85，例如86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更多。a、b和c值彼此 内在不相关。x值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、 80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。y值至少是7，例如8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、 200、225、250。z值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、 70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。x、y和z值彼此内在 不相关。任何特定741氨基酸序列优选不属于一种以上类别(1)、(2)和(3)。因此， 任何特定741序列仅属于类别(1)、(2)和(3)之一。因而优选：蛋白(1)与蛋白(2)有 小于i％的序列同一性；蛋白(1)与蛋白(3)有小于j％的序列同一性；蛋白(2)与蛋白 (3)有小于k％的序列同一性。i值是60或更多(例如61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90等)且至多是a。j值是60或更多(例如61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、 84、85、86、87、88、89、90等)且至多是b。k值是60或更多(例如61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90等)且至多是c。i、j和k值彼此内在不相 关。
来自血清组B的‘936’蛋白示于参考文献25(SEQ IDs 2883和2884)且在参 考文献21中示为‘NMB2091’(也参见GenBank登录号GI：7227353)。血清组A 中的对应基因[35]具有GenBank登录号7379093。当根据本发明使用时，936蛋 白可采用多种形式。优选的936形式是截短或缺失变体，如参考文献29到31中 所示。特别是936的N末端前导肽可缺失(即对于菌株MC58，缺失残基1到23[SEQ ID NO：4])以产生936(NL)。优选的936序列具有氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO： 4有50％或更多同一性(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多)；和/ 或(b)包括至少n个来自SEQ ID NO：4的连续氨基酸，其中n为7或更多(例 如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、 150、200、250或更多)。对于(b)优选的片段包括来自936的抗原表位。其它优选 的片段缺乏1个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更 多)来自SEQ ID NO：4C末端和/或N末端的氨基酸。这些序列包括936变体(如 等位基因变体、同源物、直系同源物、侧向同源物、突变体等)。
来自血清组B的‘953’蛋白示于参考文献25(SEQ IDs 2917和2918)且在参 考文献21中示为‘NMB1030’(也参见GenBank登录号GI：7226269)。血清组A 中的对应蛋白[35]具有GenBank登录号7380108。当根据本发明使用时，953蛋 白可采用多种形式。优选的953形式是截短或缺失变体，如参考文献29到31中 所示。特别是953的N末端前导肽可缺失(即对于菌株MC58，缺失残基1到19[SEQ ID NO：5])以产生953(NL)。优选的953序列具有氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO： 5有50％或更多同一性(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多)；和/ 或(b)包括至少n个来自SEQ ID NO：5的连续氨基酸，其中n为7或更多(例 如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、 150、200、250或更多)。对于(b)优选的片段包括来自953的抗原表位。其它优选 的片段缺乏1个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更 多)来自SEQ ID NO：5C末端和/或N末端的氨基酸。这些序列包括953变体(如 等位基因变体、同源物、直系同源物、侧向同源物、突变体等)。953的等位基因 形式可见于参考文献28的图19。
来自血清组B的‘287’蛋白示于参考文献25(SEQ IDs 3103和3104)且在参 考文献21中示为‘NMB2132’，在参考文献13中示为‘GNA2132’(也参见GenBank 登录号GI：7227388)。血清组A中的对应蛋白[35]具有GenBank登录号7379057。 当根据本发明使用时，287蛋白可采用多种形式。优选的287形式是截短或缺失 变体，如参考文献29到31中所示。特别是287的N末端可缺失到和包括其聚甘 氨酸序列(例如对于菌株MC58，缺失残基1到24得到ΔG287[SEQ ID NO：6])。 此缺失能提高表达。优选的287序列具有氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：6有 50％或更多同一性(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多)；和/或(b)包 括至少n个来自SEQ ID NO：6的连续氨基酸，其中n为7或更多(例如8、10、 12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更多)。对于(b)优选的片段包括来自287的抗原表位。其它优选的片段缺乏 1个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)来自SEQ ID NO：6C末端和/或N末端的氨基酸。这些序列包括287变体(如等位基因变 体、同源物、直系同源物、侧向同源物、突变体等)。287的等位基因形式可见于 参考文献28的图5和15、参考文献25的实施例13和图21(SEQ IDs 3179到3184)。
5种基本MenB抗原(NadA，741，953，936和287)可作为5种单独蛋白存在 于组合物中，但优选至少2种抗原表达为单一多肽链(‘杂合’蛋白[参考文献29 到31])，即5种抗原形成少于5种多肽。杂合蛋白提供2个主要优点：首先，通 过加入克服问题的合适杂合伴侣来协助本身不稳定或表达差的蛋白；第二，简化 商业生产，因为仅需使用1种表达和纯化便于生成2个单独有用的蛋白。发明组 合物中包括的杂合蛋白可包含2种或更多(即2、3、4或5)的5种基本抗原。优 选由5种基本抗原中的2种组成的杂合体。
在5种基本抗原的组合内，抗原可存在于大于1种杂合蛋白和/或作为非杂合 蛋白。然而，抗原优选作为杂合体或非杂合体存在，但不是两者，尽管包括蛋白 741作为杂合和非杂合(优选脂蛋白)抗原可能有用，特定是当使用一种以上741 变体时。
杂合蛋白可由公式NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH表示，其中：X是5个基本抗原 之一的氨基酸序列；L是任选的接头氨基酸序列；A是任选的N末端氨基酸序列； B是任选的C末端氨基酸序列；n是2、3、4或5。
如果-X-部分在其野生型形式中有前导肽序列，它可包括或省略于杂合蛋白。 在一些实施方案中，将缺失前导肽，除了位于杂合蛋白N末端的-X-部分，即保 留X1的前导肽，但省略X2…Xn的前导肽。这相等于缺失所有前导肽并使用X1的前导肽作为-A-部分。
对于各n[-X-L-]例子，接头氨基酸序列-L-可存在或缺乏。例如，当n＝2时， 杂合体可以是NH2-X1-L1-X2-L2-COOH、NH2-X1-X2-COOH、NH2-X1-L1-X2- COOH、NH2-X1-X2-L2-COOH等。接头氨基酸序列-L-通常短(例如20个或更少 氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、 2、1)。例子包括促进克隆的短肽序列、聚甘氨酸接头(即包括Glyn，其中n＝2、3、 4、5、6、7、8、9、10或更多)、和组氨酸标志(即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、 8、9、10或更多)。其它合适接头氨基酸序列对本领域技术人员是显而易见的。 有用的接头是GSGGGG(SEQ ID NO：9)，Gly-Ser二肽从BamHI限制性位点形成， 从而协助克隆和操作，(Gly4)四肽是典型的聚甘氨酸接头。如果Xn+1是ΔG蛋白 且Ln是甘氨酸接头，这可相等于Xn+1不是ΔG蛋白且缺乏Ln。
-A-是任选的N末端氨基酸序列。它通常短(例如40个或更少氨基酸，即39、 38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、 20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。 例子包括指导蛋白运输的前导序列或者促进克隆或纯化的短肽序列(如组氨酸标 志，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其它合适的N末端氨 基酸序列对本领域技术人员是显而易见的。如果X1缺乏其自身的N末端甲硫氨 酸，-A-优选是提供N末端甲硫氨酸的寡肽(例如有1、2、3、4、5、6、7或8个 氨基酸)。
-B-是任选的C末端氨基酸序列。它通常短(例如40个或更少氨基酸，即39、 38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、 20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。 例子包括指导蛋白运输的前导序列、促进克隆或纯化的短肽序列(如包括组氨酸标 志，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、或提高蛋白稳定性的序 列。其它合适的C末端氨基酸序列对本领域技术人员是显而易见的。
最优选n为2。用于发明的二抗原杂合体包括：NadA和741；NadA和936； NadA和953；NadA和287；741和936；741和953；741和287；936和953； 936和287；953和287。2种优选蛋白是：X1是936且X2是741；X1是287 且X2是953。
发明的2种尤其优选杂合蛋白如下：
n A X1 L1 X2 L2 B SEQ ID NO： 2 MA ΔG287 GSGGGG 953(NL) - - 7 2 M 936(NL) GSGGGG ΔG741 - - 8
这2种蛋白可组合NadA(尤其是与SEQ ID NO：2)使用。因此用于本发明的 优选的MenB抗原组合物包含第一多肽，该多肽含有氨基酸序列SEQ ID NO：2， 包含氨基酸序列SEQ ID NO：7的第二多肽和包含氨基酸序列SEQ ID NO：8的第三 多肽。这是用于本发明的优选的MenB抗原组。
如上所述，包含MenB抗原的发明组合物可优选地诱导有效地抗2或3种 MenB的高毒性谱系A4，ET-5和谱系3的血清杀菌抗体反应。此外它们可能诱导 抗一种或多种高毒性谱系亚组I，亚组III，亚组IV-1或ET-37复合物和抗其它谱 系例如高侵入性谱系的杀菌抗体反应。这些抗体反应可在小鼠中方便地检测并且 是疫苗功效的标准指示[例如，见参考文献22的后记14]。血清杀菌活性(SBA)测 量补体介导的细菌杀死，能用人或幼兔补体测定。WHO标准要求疫苗在超过90％ 受体中诱导SBA上升至少4倍。
该组合物不需诱导杀菌抗体抗这些高毒性谱系内各个和每一个MenB菌株； 而是，对于特定高毒性谱系内4种或更多血清组B脑膜炎奈瑟球菌菌株的任何特 定组，组合物诱导的抗体是杀菌性的，抗至少50％(例如60％、70％、80％、90％ 或更多)组。优选的菌株组包括在至少4个下列国家中分离的菌株：大不列颠、澳 大利亚、加拿大、挪威、意大利、美国、新西兰、荷兰、比利时和古巴。血清优 选具有至少1024的杀菌效价(例如210、211、212、213、214、215、216、217、218或 更多，优选至少214)，即当稀释1/1024时，血清能杀死至少50％的特定菌株的测 试细菌，如参考文献22所述。优选的组合物可诱导抗下列血清组B脑膜炎球菌 菌株的杀菌反应：(i)来自簇A4，菌株961-5945(B:2b:P1.21，16)和/或菌株 G2136(B:-)；(ii)来自ET-5复合体，菌株MC58(B:15:P1.7，16b)和/或菌株 44/76(B:15:P1.7，16)；(iii)来自谱系3，菌株394/98(B:4:P1.4)和/或菌株 BZ198(B:NT:-)。更优选的组合物可诱导抗菌株961-5945、44/76和394/98的杀菌 反应。菌株961-5945和G2136都是奈瑟球菌MLST参考菌株[参考文献39中的 ids 638和1002]。菌株MC58广泛可用(例如ATCC BAA-335)且是参考文献21 中测序的菌株。菌株44/76广泛使用并鉴定(例如参考文献40)且是奈瑟球菌MLST 参考菌株之一[参考文献39中的id 237；参考文献41中表2的第32行]。菌株394/98 最初于1998年在新西兰分离，有一些使用此菌株的发表研究(例如参考文献42 和43)。菌株BZ198是另一种奈瑟球菌MLST参考菌株[参考文献39中的id 409； 参考文献41中表2的第41行]。组合物可另外诱导杀菌反应抗血清组W135菌株 LNP17592(W135:2a:P1.5，2)，来自ET-37复合体。这是2000年在法国分离的Haji 菌株。
发明组合物中可包括的其它MenB多肽抗原选自下列氨基酸序列之一：来自 参考文献23的SEQ ID NO：650；来自参考文献23的SEQ ID NO：878；来自参考 文献23的SEQ ID NO：884；来自参考文献24的SEQ ID NO：4；来自参考文献25 的SEQ ID NO：598；来自参考文献25的SEQ ID NO：818；来自参考文献25的SEQ ID NO：864；来自参考文献25的SEQ ID NO：866；来自参考文献25的SEQ ID NO：1196；来自参考文献25的SEQ ID NO：1272；来自参考文献25的SEQ ID NO：1274；来自参考文献25的SEQ ID NO：1640；来自参考文献25的SEQ ID NO：1788；来自参考文献25的SEQ ID NO：2288；来自参考文献25的SEQ ID NO：2466；来自参考文献25的SEQ ID NO：2554；来自参考文献25的SEQ ID NO：2576；来自参考文献25的SEQ ID NO：2606；来自参考文献25的SEQ ID NO：2608；来自参考文献25的SEQ ID NO：2616；来自参考文献25的SEQ ID NO：2668；来自参考文献25的SEQ ID NO：2780；来自参考文献25的SEQ ID NO：2932；来自参考文献25的SEQ ID NO：2958；来自参考文献25的SEQ ID NO：2970；来自参考文献25的SEQ ID NO：2988，或多肽，其包括氨基酸序列：
(a)与所述序列有50％或更多同一性(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或 更多)；和/或(b)来自所述序列至少n个连续氨基酸的片段，其中n为7或更多(例 如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、 150、200、250或更多)。对于(b)的优选片段包括来自相关序列的抗原表位。可包 括大于1种(例如2、3、4、5、6)的这些多肽。
流感嗜血杆菌b型(Hib)
当组合物包括流感嗜血杆菌B型抗原时，它通常是Hib荚膜糖抗原。来自流 感嗜血杆菌的糖抗原是熟知的。
有利的是，Hib糖与载体蛋白共价缀合以提高其免疫原性，尤其是在儿童中 的免疫原性。一般多糖缀合物制备和特定Hib荚膜多糖制备在文献中详细记载[例 如参考文献44到52等]。发明可使用任何合适的Hib缀合物。合适载体蛋白描述 于下，用于Hib糖的优选载体是CRM197(‘HbOC’)、破伤风类毒素(‘PRP-T’) 和脑膜炎奈瑟球菌的外膜复合体(‘PRP-OMP’)。
缀合物的糖部分可以是多糖(例如全长磷酸多核糖基核糖醇(PRP))，但优选水 解多糖以形成寡糖(例如MW从～1到～5kDa)。
优选的缀合物包括Hib寡糖，经己二酸接头共价连接CRM197[53，54]。破伤 风类毒素也是优选载体。
施用Hib抗原优选使抗PRP抗体浓度≥0.15μg/ml，更优选≥1μg/ml。
发明的组合物可包括一种以上Hib抗原。
当组合物包括Hib糖抗原时，它优选也不包括氢氧化铝佐剂。如果组合物包 括磷酸铝佐剂，则Hib糖抗原可吸附于佐剂[55]或可以不吸收[56]。
Hib抗原能冻干，例如与脑膜炎球菌抗原一起。
肺炎链球菌
当组合物包括肺炎链球菌抗原时，它通常是荚膜糖抗原，此抗原优选与载体 蛋白缀合[例如参考文献57到59]。优选包括来自1种以上肺炎链球菌血清型的 糖。例如，广泛使用来自23种不同血清型的多糖混合物，有来自5到11种不同 血清型的多糖的缀合疫苗也广泛使用[60]。例如，PrevNarTM[61]包含来自7种血 清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，各糖通过还原胺化单独缀合CRM197， 用2μg各糖每0.5ml剂量(4μg血清型6B)，缀合物吸附于磷酸铝佐剂上。发明 的组合物优选包括至少血清型6B、14、19F和23F。缀合物可吸附于磷酸铝上。
除了使用来自肺炎球菌的糖抗原外，组合物可包括1种或多种多肽抗原。一 些肺炎球菌菌株的基因组序列是有用的[62，63]并能经受反向疫苗学[64-67]以鉴 定合适的多肽抗原[68-69]。例如，组合物可包括1种或多种下列抗原：PhtA、PhtD、 PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130和Sp130， 如参考文献70所定义。组合物可包括1种以上(例如2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13或14种)的这些抗原。
在一些实施方案中，组合物可包括来自肺炎球菌的糖和多肽抗原。这些能用 于简单混合物，或肺炎球菌糖抗原可缀合肺炎球菌蛋白。这些实施方案的合适载 体蛋白包括前面段落中所列抗原[70]。
肺炎球菌抗原可冻干，例如与脑膜炎球菌和/或Hib抗原一起。
修饰的脑膜炎奈瑟球菌血清组A糖
当发明的组合物包括MenA糖抗原时，抗原优选是修饰糖，其中天然糖上的 1个或多个羟基由阻断基团取代[19]。此修饰改善对水解的抗性，意味着血清组A 抗原可保存于和用于液体制剂，而不需要冻干。
有阻断基团的单糖单位数可变化。例如，所有或大体所有单糖单位可具有阻 断基团。或者，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％单 糖单位可具有阻断基团。至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个 单糖单位可具有阻断基团。
同样，单糖单位上的阻断基团数可变化。例如，单糖单位上的阻断基团数可 以是1或2。阻断基团一般是在单糖单位的4位置和/或3位置。
末端单糖单位可以或可没有阻断基团来取代其天然羟基。优选在末端单糖单 位上保留游离异头羟基以提供进一步反应(例如缀合)的柄。异头羟基可通过还原 胺化(使用例如NaBH3CN/NH4Cl)转变成氨基(-NH2-或-NH-E，其中E是氮保护基 团)，然后可在其它羟基转变成阻断基团后再生。
取代羟基的阻断基团可直接接近，通过羟基的衍化反应，即羟基的氢原子由 另一基团取代。作为阻断基团的合适羟基衍生物是例如氨基甲酸盐、磺酸盐、碳 酸盐、酯、醚(例如硅烷基醚或烷基醚)和缩醛。这种阻断基团的一些特定例子是 烯丙基、Aloc、苄基、BOM、t-丁基、三苯甲基、TBS、TBDPS、TES、TMS、 TIPS、PMB、MEM、MOM、MTM、THP等。其它不能直接接近以及完全取代 羟基的阻断基团包括C1-12烷基、C3-12烷基、C5-12芳基、C5-12芳基-C1-6烷基、 NR1R2(R1和R2在下列段落中定义)、H、F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、CN、 CF3、CCl3等。优选的阻断基团是吸电子基团。
优选的阻断基团具有公式：-O-X-Y或-OR3，其中X是C(O)、S(O)或SO2； Y是C1-12烷基、C1-12烷氧基、C3-12环烷基、C5-12芳基或C5-12芳基-C1-6烷基，各 自可任选用1、2或3个独立选自F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或Cl3的基团取代；或Y是NR1R2；R1和R2独立选自H、C1-12烷基、C3-12环烷 基、C5-12芳基、C5-12芳基-C1-6烷基；或R1和R2可连接以形成C3-12饱和杂环基团； R3是C1-12烷基或C3-12环烷基，各自可任选用1、2或3个独立选自F、Cl、Br、 CO2(C1-6烷基)、CN、CF3或CCl3的基团取代；或R3是C5-12芳基或C5-12芳基-C1-6烷基，各自可任选用1、2、3、4或5个选自F、Cl、Br、CO2H、CO2(C1-6烷基)、 CN、CF3或Cl3的基团取代。当R3是C1-12烷基或C3-12环烷基时，它通常用1、2 或3个上面定义的基团取代。当R1和R2连接以形成C3-12饱和杂环基团时，意味 着R1和R2与氮原子一起形成饱和杂环基团，含3到12间任意数量的碳原子(例 如C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)。除了氮原子，杂环基团可包 含1或2个杂原子(如N、O或S)。C3-12饱和杂环基团的例子是吡咯烷基、哌啶 基、吗啉基、哌嗪基、咪唑烷基、氮杂环丁烷基和吖丙啶基。
阻断基团-O-X-Y和-OR3能制备自-OH基团，通过标准衍生程序如羟基与酰 基卤、烷基卤、磺酰卤等反应。因此，-O-X-Y中的氧原子优选是羟基的氧原子， 而-O-X-Y中的-X-Y基团优选取代羟基的氢原子。
或者，阻断基团可经取代反应接近，如Mitsonobu-型取代。这些和其它从羟 基制备阻断基团的方法是熟知的。
阻断基团更优选是-OC(O)CF3[71]，或是氨基甲酸盐基团-OC(O)NR1R2，其 中R1和R2独立选自C1-6烷基。R1和R2更优选都是甲基，即阻断基团是 -OC(O)NMe2。氨基甲酸盐阻断基团对糖苷键有稳定作用且能在温和条件下制备。
优选的修饰MenA糖包含n个单糖单位，其中至少h％单糖单位在3位和4 位都没有-OH基团。h值是24或更多(例如25、26、27、28、29、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、99或100)且优选是50或 更多。缺乏的-OH基团优选是上面定义的阻断基团。
其它优选的修饰MenA糖包括单糖单位，其中至少s单糖单位在3位没有-OH 和在4位没有-OH。s值至少为1(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 35、40、45、50、60、70、80、90)。缺乏的-OH基团优选是上面定义的阻断基团。
用于发明的合适修饰MenA糖具有公式：
其中n是1到100的整数(优选15到25的整数)；
T具有公式(A)或(B)：
各Z基团独立选自OH或上面定义的阻断基团；和
各Q基团独立选自OH或上面定义的阻断基团；
Y选自OH或上面定义的阻断基团；
E是H或氮保护基团；
其中大于约7％(例如8％、9％、10％或更多)的Q基团是阻断基团。
各n+2Z基团彼此可相同或不同。同样，各n+2Q基团彼此可相同或不同。 所有Z基团可以是OH。另外，至少10％、20％、30％、40％、50％或60％Z基 团可以是OAc。优选约70％Z基团是OAc，剩余Z基团是OH或上面定义的阻 断基团。至少约7％Q基团是阻断基团。优选至少10％、20％、30％、40％、50％、 60％、70％、80％、90％或甚至100％Q基团是阻断基团。
优选的发明组合物可在37℃保存28天，此阶段后，小于f％初始总量的缀合 MenA糖将非缀合，其中f是20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、 8、7、6、5或更低。
寡糖
荚膜糖一般以寡糖形式应用。它们易形成，通过纯化的荚膜多糖的断裂(如 水解)，通常接着是纯化所需大小的片段。
优选进行多糖断裂以产生小于30的寡糖中最终平均聚合度(DP)(如对于血清 组A在10和20间，优选约10；对于血清组W135和Y在15和25间，优选约 15-20；对于血清组C在12和22间；等等)。DP易通过离子交换层析或比色测定 来测量[72]。
优选的MenC糖抗原如参考文献10所示，如MenjugateTM所用。
如果进行水解，水解产物一般是进行尺寸定位以取出长度短的寡糖[73]。这 能用多种方式完成，如超滤，接着是离子交换层析。对于血清组A，优选取出聚 合度小于或等于约6的寡糖，对于血清组W135和Y，优选取出小于约4的寡糖。
共价缀合
发明组合物中的荚膜糖通常缀合载体蛋白。一般，缀合提高糖的免疫原性， 因为它使它们从T-不依赖性抗原转变成T-依赖性抗原，因而能刺激免疫记忆。 缀合对于儿科疫苗尤其有用且是熟知的技术[如参考文献44和52所综述]。
优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉类毒素或破伤风类毒素。特别 优选CRM197白喉类毒素[75-77]。其它合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜 蛋白[78]、合成肽[79-80]、热激蛋白[81-82]、百日咳蛋白[83-84]、细胞因子[85]、 淋巴因子[85]、激素[85]、生长因子[85]、人工蛋白，含多个来自不同病原体衍生 抗原的人CD4+T细胞抗原表位[86]、来自流感嗜血杆菌的蛋白D[87，88]、肺炎 球菌表面蛋白PspA[89]、铁吸收蛋白[90]、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或 B[91]等。优选的载体是白喉类毒素、破伤风类毒素、流感嗜血杆菌蛋白D和 CRM197。
在发明的组合物内，可能使用1种以上载体蛋白，例如用于降低载体抑制风 险。因此，不同载体蛋白可用于不同血清组，例如血清组A糖可能缀合CRM197， 而血清组C糖可能缀合破伤风类毒素。也可能使用多于1种的载体蛋白用于特定 糖抗原，例如血清组A糖可能在2组中，一些缀合CRM197，其它的缀合破伤风 类毒素。然而，一般优选对所有糖使用相同载体蛋白。
单一载体蛋白可携带多于1种的糖抗原[92]。例如，单一载体蛋白可缀合其 来自血清组A和C的糖。为达到此目标，可在缀合反应前混合糖。然而，一般 优选各血清组有单独缀合物。
优选糖∶蛋白比例(w/w)在1∶5(即过量蛋白)和5∶1(即过量糖)间的缀合物。优选 1∶2和5∶1间的比例，更优选1∶1.25和1∶2.5间的比例。过量载体蛋白优选用于 MenA和MenC。
缀合物可用于缀合游离载体蛋白[93]。当特定载体蛋白在游离和缀合形式的 发明组合物中都存在时，未缀合形式优选大体上不超过5％的组合物中载体蛋白 总量，更优选以小于2％重量存在。
可使用任何合适的缀合反应，必要时可有任意合适的接头。
糖一般在缀合前活化或功能化。活化可包括例如氰化剂(cyanylating)如 CDAP(如1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓四氟硼酸盐[94，95等])。其它合适技术使用 碳化二亚胺、酰肼、活性酯、去甲硼烷(norborane)、p-硝基苯甲酸、N-羟基琥珀 酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；也参见参考文献50的导言)。
经接头基团连接可用任何已知方法进行，例如参见参考文献96和97所述方 法。一类连接包括还原胺化多肽，偶联所得氨基与己二酸接头基团的一末端，然 后偶联蛋白到己二酸接头基团的另一末端[48，98，99]。其它接头包括B-丙酰胺 基[100]、硝基苯基-乙胺[101]、卤酰基卤化物(haloacyl halides)[102]、糖苷键[103]、 6-氨基己酸[104]、ADH[105]、C4到C12部分[106]等。除了使用接头外，可使用 直接连接。直接连接蛋白可包括氧化多糖，接着与蛋白还原胺化，如参考文献107 和108所述。
优选的方法包括引入氨基到糖(如通过用-NH2取代末端＝O基团)中，接着用 己二酸二酯(例如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺基二酯)衍生。优选与载体蛋白反应。 另一种优选反应使用具有蛋白D载体的CDAP活化，例如用于MenA或MenC。
缀合后，可分离游离和缀合的糖。有许多合适的方法，包括疏水层析、切向 超滤、渗滤等[也参见参考文献109和110等]。
当发明的组合物包括缀合寡糖时，优选寡糖制备先于缀合。
本发明组合物的制备
本发明的组合物包括来自脑膜炎奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y中的至少2 种的荚膜糖。糖优选单独制备(包括任何断裂、缀合等)然后混合以产生发明的组 合物。
然而，当组合物包括来自血清组A的荚膜糖时，血清组A糖优选不结合其 它糖直到使用之前不久，用于将水解可能降到最低。这易完成，通过使血清组A 成分(通常与适当赋形剂一起)处于冻干形式和使其它血清组成分处于液体形式 (也有适当赋形剂)，准备使用时液体成分用于重建MenA成分。当使用铝盐佐剂 时，优选包括佐剂于含液体疫苗的小瓶中并冻干无佐剂的MenA成分。
因此，发明的组合物可从试剂盒制备，试剂盒包括：(a)来自脑膜炎奈瑟球菌 血清组A的荚膜糖，以冻干形式；(b)来自脑膜炎奈瑟球菌血清组C，W135和Y 中的一种或多种(例如1，2，3种)的荚膜糖，以液体形式。发明也提供制备发明 组合物的方法，包括混合来自脑膜炎奈瑟球菌血清组A的荚膜糖与来自脑膜炎奈 瑟球菌血清组C，W135和Y中的一种或多种(例如1，2，3种)的荚膜糖，其中一 种或多种糖是以液体形式。
本发明还提供发明组合物，包括来自脑膜炎奈瑟球菌血清组C，W135和Y的 荚膜糖，其中糖是以液体形式。该组合物可与冻干的血清组A糖抗原一起包装用 于重建，或该组合物可单独作为组合物使用，例如当不需要抗血清组A的免疫接 种时。
发明也提供一种试剂盒，试剂盒包括：(a)第1个容器，含来自2个或多个脑 膜炎奈瑟球菌血清组C、W135和Y的荚膜糖，都以冻干形式；(b)第2个容器， 含液体形式的(i)来自非或1个脑膜炎奈瑟球菌血清组C、W135和Y的荚膜糖， 和任选(ii)更多不包括脑膜炎奈瑟球菌荚膜糖的抗原(见下)，其中通过容器(b)的 内含物重建容器(a)的内含物来提供发明组合物。
本发明组合物的外观
本发明组合物可以不同的方式存在和包装。
组合物可存在于小瓶中，或它们可存在于易充满的注射器中。提供的注射器 可有或没有针。注射器包括单剂量组合物，而小瓶包括单剂量或多剂量。可注射 组合物通常是液体溶液或悬浮液。另外，它们可以固体形式存在(例如冷冻干燥) 用于液体载体中的溶液或悬浮液，然后注射。
发明的组合物可以单位剂型或多剂型包装。对于多剂型，小瓶优选是预充满 的注射器。有效剂量体积能常规确定，但用于注射的典型人剂量的组合物体积为 0.5ml。
当发明的组合物在使用前临时制备(如血清组A糖以冻干形式存在)和作为试 剂盒存在时，试剂盒可包括2个小瓶，或可包括1个易充满的注射器和1个小瓶， 注射器的内含物用于在注射前再活化小瓶的内含物。
在各剂量内，单独糖抗原量一般在1-50μg间(作为糖质量测量)，各优选约 为2.5μg、5μg或10μg。A∶C∶W135∶Y重量比例为1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1； 4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2和 2∶2∶2∶1，因此，图1所示量优选约为2.5μg、5μg或10μg。因而，对于1∶1∶1∶1 比例的A∶C∶W∶Y组合物和10μg每糖，施用40μg糖每剂量。优选的组合物具 有大约下列μg糖每剂量：
A 10 0 0 0 10 5 2.5 C 10 10 5 2.5 5 5 2.5 W135 10 10 5 2.5 5 5 2.5 Y 10 10 5 2.5 5 5 2.5
优选的发明组合物包括小于50μg的脑膜炎球菌糖每剂量。其它优选组合物 包括≤40μg脑膜炎球菌糖每剂量。另外的优选组合物包括≤30μg脑膜炎球菌 糖每剂量。其它优选组合物包括≤25μg脑膜炎球菌糖每剂量。另外的优选组合 物包括≤20μg脑膜炎球菌糖每剂量。其它优选组合物包括≤10μg脑膜炎球菌 糖每剂量，但发明的组合物理想上包括至少10μg脑膜炎球菌糖每剂量。
本发明组合物优选是无菌的，优选不含热源，优选缓冲例如pH和pH8间， 一般约7。当组合物包含氢氧化铝盐时，优选使用组氨酸缓冲液[111]。发明组合 物可相对人等渗。
佐剂
该组合物一般包含一种或多种佐剂。可在佐剂和糖混合形成本发明组合物之 前和/或之后将佐剂加入糖，但优选在将各种糖混合前将佐剂与糖抗原组合。
然而，不一定每种糖在混合前都必须加入佐剂。在一种糖的制备中可包括过 量的佐剂，例如当加入更多的未加佐剂的糖抗原时，过量的佐剂被稀释到所需终 浓度。在一个具体实施方案中，当本发明组合物从冻干抗原(例如冻干的血清组A 组分)制备时，优选该组合物不包含冻干形式的佐剂。
优选包含在本发明组合物中的佐剂是铝盐(矾)，例如氢氧化铝(包括羟基氧化 物)，磷酸铝(包括碱式磷酸盐)，硫酸铝等[参考文献112第8和9章]。特别优选 羟磷酸铝，尤其在包括流感嗜血杆菌糖抗原的组合物中，典型佐剂是无定形羟磷 酸铝，PO4/Al摩尔比在0.84和0.92间，包括0.63mg Al3+/ml。可使用低剂量磷酸 铝的吸收，例如50到100μg Al3+每缀合物每剂量。当组合物中有1种以上缀合 物时，不是所有缀合物都需吸收。MenjugateTM和NeisVacTMMenC缀合物采用氢 氧化物佐剂，而MeningitecTM采用磷酸盐。
磷酸钙是另一种优选的佐剂。
还可采用或替代铝盐的其它佐剂包括：
A.含矿物质的组合物
含矿物质的组合物适合用作发明佐剂，包括无机盐，如铝盐和钙盐。发明包 括无机盐如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸 盐等[例如参见参考文献112的第8和9章]或不同无机化合物的混合物，化合物 采用任何合适的形式(例如凝胶、晶体、无定形等)，优选吸收。含矿物质的组合 物可制成金属盐的颗粒[113]。
B.油乳剂
适合用作发明佐剂的油乳剂组合物包括鲨烯-水乳剂，如MF59[参考文献112 的第10章；也参见参考文献114](5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85，用微 流化机制成亚微米颗粒)。也可使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。
C.皂苷制剂[参考文献112的第22章]
皂苷制剂也能用作发明的佐剂。皂苷是甾醇糖苷和三萜糖苷的异种组，在广 范围的植物种类的树皮、叶、茎干、根和甚至花中发现。来自皂树(Quillaia saponaria)Molina树皮的皂苷作为佐剂已广泛研究。皂苷也能商业获得自丽花菝 葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(brides veil)和肥皂 草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21以及脂质制 剂如ISCOMs。QS21以StimulonTM出售。
皂苷制剂用HPLC和RP-HPLC纯化。鉴定了使用这些技术的特定纯化部分， 包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选是QS21。生 成QS21的方法示于参考文献42。皂苷制剂也可包括甾醇，如胆固醇[116]。
皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合体(ISCOMs)的独特颗粒 [参考文献112的第23章]。ISCOMs通常也包括磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆 碱。任何已知的皂苷可用于ISCOMs。ISCOM优选包括1种或多种QuilA、QHA 和QHC。ISCOMs进一步描述于参考文献116-118。ISCOMs任选可缺乏另外的 去垢剂[119]。
开发以皂苷为基础的佐剂的综述可发现于参考文献120和121。
D.病毒体和病毒样颗粒
病毒体和病毒样颗粒(VLPs)也可用作发明的佐剂。这些结构一般包含1种或 多种来自病毒的蛋白，病毒任选结合磷脂或用磷脂制成。它们通常不致病、不复 制且一般不包含任何天然病毒基因组。病毒蛋白可从完整病毒中重组生成或分 离。这些适用于病毒体或VLPs的病毒蛋白包括获得自流感病毒(如HA或NA)、 乙肝病毒(如核心或衣壳蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状 病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌 体、Qβ-噬菌体(如外被蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(如反 转录转座子Ty蛋白p1)的蛋白。VLPs进一步讨论于参考文献122-127。病毒体进 一步讨论于例如参考文献128。
E.细菌或微生物衍生物
适合用于发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌脂多糖(LPS)的非 毒性衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和其去 毒衍生物。
LPS的非毒性衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰MPL(3d MPL)。3d MPL是3-O-脱酰单磷酰脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。3-O-脱酰单磷酰 脂质A的优选“小颗粒”形式示于参考文献129。这种“小颗粒”3d MPL小到 足以经0.22μm膜无菌过滤[129]。其它非毒性LPS衍生物包括单磷酰脂质A模 拟物，如氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，例如RC-529[130，131]。
脂质A衍生物包括来自大肠杆菌的脂质A衍生物，如OM-174。OM-174描 述于例如参考文献132和133。
适合用作发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序(二核苷酸序列， 含通过磷酸键连接鸟苷的未甲基化胞嘧啶)的核苷酸序列。含回文或聚(dG)序列的 双链RNAs和寡核苷酸也显示是免疫刺激性的。
CpG可包括核苷酸修饰/类似物如硫代磷酸修饰且可以是双链或单链。参考 文献61、62和63揭示可能的类似物取代，如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。 CpG寡核苷酸的佐剂效果进一步讨论于参考文献137-142。
CpG序列可引向TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT[70]。CpG序列可对诱 导Th1免疫反应特异，如CpG-A ODN，或它可对诱导B细胞反应更特异，如CpG-B ODN。CpG-A和CpG-B ODN讨论于参考文献144-146。CpG优选是CpG-A ODN。
优选构成CpG寡核苷酸，使5’末端易接受受体识别。2种CpG寡核苷酸序 列可任选在其3’末端附着以形成“免疫聚体”(immunomers)。参见例如参考文献 143和147-149。
细菌ADP-核糖基化毒素和其去毒衍生物可用作发明的佐剂。蛋白优选获得 自大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定性肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。 使用去毒ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂描述于参考文献150且用作肠胃外佐 剂描述于参考文献151。毒素或类毒素优选以全毒素形式，包括A和B亚基。A 亚基优选包含去毒突变；B亚基优选不突变。佐剂优选是去毒LT突变体，如 LT-K63、LT-R72和LT-G192。使用ADP-核糖基化毒素和其去毒衍生物特定是 LT-K63和LT-R72作为佐剂可发现于参考文献152-159。关于氨基酸取代的数字 参考优选基于参考文献160所列ADP-核糖基化毒素的A和B亚基排列，参考文 献160特别全部纳入本文供参考。
F.人免疫调节剂
适合用作发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子如白介素(例如IL-1、IL-2、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[161]等)[162]、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞 集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
G.生物粘合剂和粘膜粘合剂
生物粘合剂和粘膜粘合剂也可用作发明的佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化 透明质酸微球体[163]或粘膜粘合剂如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、 多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳聚糖和其衍生物也可用作发明的佐剂 [164]。
H.微粒
微粒也可用作发明的佐剂。优选从可生物降解和非毒性物质(如聚(α-羟酸)、 聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)材料形成的微粒(即～100nm到 ～150nm直径的颗粒，更优选～200nm到～30μm直径，最优选～500nm到～10μm 直径)，优选具有聚交酯聚乙交酯共聚物，任选处理的以具有带负电的表面(例如 用SDS)或带正电的表面(例如用阳离子去垢剂，如CTAB)。
I.脂质体(参考文献112的第13和14章)
适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献165-167。
J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂
适用于发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[168]。这种制剂进一步包括 组合辛苯昔醇的聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂[169]以及组合至少1种另外非 离子表面活性剂如辛苯昔醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[170]。优选的聚氧 乙烯醚选自下列组：聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-硬脂基醚、聚氧乙 烯-8-硬脂基醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
K.聚磷腈(PCPP)
PCPP制剂描述于例如参考文献171和172。
L.胞壁酰肽
适合用作发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷 氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰 胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧 基)-乙胺(MTP-PE)。
M.咪唑喹诺酮(imidazoquinolone)化合物
适合用作发明佐剂的咪唑酮化合物的例子包括咪喹莫特和其同源物(例如“瑞 喹莫德3M”)，它们进一步描述于参考文献173和174。
发明也可包括1种或多种上面鉴定的佐剂的组合。例如，下列佐剂组合物能 用于发明：(1)皂苷和水包油乳剂[175]；(2)皂苷(例如QS21)+非毒性LPS衍生物(例 如3dMPL)[176]；(3)皂苷(例如QS21)+非毒性LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇； (4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+甾醇)[177]；(5)3dMPL与例如QS21和/ 或水包油乳剂的组合[178]；(6)SAF，含10％鲨烯、0.4％吐温80TM、5％pluronic- 嵌段共聚物L121和thr-MDP，微流化成亚微米乳剂或涡旋产生较大粒度乳剂； (7)RibiTM佐剂体系(RAS)(Ribi Immunochem)，含2％鲨烯、0.2％吐温80和1种或 多种来自单磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸(TDM)和细胞壁骨架(CWS)的细菌 细胞壁成分，优选MPL+CWS(DetoxTM)；(8)1种或多种无机盐(如铝盐)+非毒性 LPS衍生物(如3dMPL)。
其它用作免疫刺激剂的物质示于参考文献112的第7章。
当使用硫酸铝时，一种或多种糖可能吸附到铝盐上，但优选不这样做，这通 过溶液中包含游离的磷酸离子(例如使用磷酸缓冲液)来促进。当使用氢氧化铝时， 优选糖吸附到盐上。对于血清组A的糖优选使用氢氧化铝作为佐剂。
在发明的组合物中，可能一些抗原吸附于氢氧化铝，但其它抗原与磷酸铝相 联。对于例如四价脑膜炎奈瑟球菌血清组组合，可得到下列排列
对于三价脑膜炎奈瑟球菌血清组组合，可得到下列排列：
组合物的其它组分
除上述抗原外，本发明组合物可包含脑膜炎球菌蛋白质抗原。
也可包含非脑膜炎球菌和非奈瑟球菌抗原，优选没有减少抗脑膜炎球菌组分 的免疫反应的抗原。例如参考文献179描述了来自脑膜炎奈瑟球菌血清组B和C 的寡糖与Hib糖的组合。优选来自肺炎球菌，甲肝病毒，乙肝病毒，百日咳博德 特氏菌(B.pertussis)，白喉，破伤风，骨髓灰质炎和/或流感嗜血杆菌的抗原。尤 其优选的抗原包括：
-白喉抗原，如白喉类毒素[例如参考文献180的第3章]。
-破伤风抗原，如破伤风类毒素[例如参考文献180的第4章]。
-来自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，任选也组 合百日咳粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3[例如参考文献181和182]。
-细胞百日咳抗原。
-来自甲肝病毒的抗原，如灭活病毒[例如183，184]。
-来自乙肝病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[例如184，185]，表面抗原优 选吸附到硫酸铝上[186]。
-来自脑膜炎奈瑟球菌血清组B的微泡[187]，‘天然OMVs’[188]，水泡或外 膜囊泡制品[例如参考文献189-190191192193194等]。这些制品可从经过遗传 操作的细菌制备，例如遗传操作以增强免疫原性(例如过表达免疫原)，减低毒性， 抑制荚膜多糖合成，下调PorA表达等。这些制品可从超发泡菌株[199-200 201 202] 制备。可包含来自非病原性奈瑟球菌的囊泡[203]。制备OMVs可不使用去垢剂 [204，205]。这些制品可在其表面表达非奈瑟球菌蛋白质[206]。这些制品可以是 LPS耗竭的。这些制品可与重组抗原混合[189，207]。可使用来自具有不同I类外 膜蛋白质亚型的细菌的囊泡，例如用各呈现三种亚型的两种不同遗传工程囊泡群 的六种不同亚型[208，209]，或用各呈现三种亚型的三种不同遗传工程囊泡群的九 种亚型等。有用的亚型包括：P1.7，16；P1.5-1，2-2；PI.19，15-1；P1.5-2，10；PI. 12-1，13；P1.7-2，4；P1.22，14；P1.7-1，1；P1.18-1，3，6。
-脊髓灰质炎抗原[例如210，211]，如IPV。
混合物可包含一种或多种这些抗原，需要时可去毒(例如百日咳毒素用化学 和/或遗传方法去毒)。
当组合物中包括白喉抗原时，优选也包括破伤风抗原和百日咳抗原。类似地， 当包括破伤风抗原时，优选也包括白喉和百日咳抗原。类似地，当包括百日咳抗 原时，优选也包括白喉和破伤风抗原。这种DTP组合可用于重建冻干缀合物。
混合物中的抗原通常以至少各1μg/ml的浓度存在。一般任何给定抗原的浓 度足够引起针对该抗原的免疫应答。
除了在发明组合物中使用蛋白抗原外，可使用编码抗原的核酸。因此，发明 组合物的蛋白成分能用编码蛋白的核酸(优选DNA，如以质粒的形式)取代。类似 地，发明组合物可包括模拟糖抗原如模拟表位[212]或抗独特型抗体的蛋白质。 它们可取代单独糖成分，或能补充它们。例如，疫苗可包括MenC[213]或MenA[214] 荚膜多糖的肽模拟物取代糖本身。
发明的组合物可包括抗菌剂，特别是当以多剂量形式包装时。
发明的组合物可包括去垢剂，例如吐温(聚山梨醇酯)，如吐温80。去垢剂一 般以低水平存在，如＜0.01％。
发明的组合物可包括钠盐(例如氯化钠)以产生渗透性。典型浓度为10± 2mg/ml NaCl。
发明的组合物一般包括缓冲液。典型是磷酸缓冲液。
发明的组合物可包括糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖[215]或海藻糖[216])，例 如约15-30mg/ml(如25mg/ml)，特别是如果它们要冻干或如果它们包括从冻干物 质再复原的物质。用于冻干的组合物pH可调至约6.1，然后冻干。
本发明提供包含缀合荚膜糖的组合物，缀合荚膜糖来自脑膜炎奈瑟球菌血清 组A，C，W135和Y的至少三种，其中该组合物包含蔗糖。这些糖优选是寡糖。 该组合物可包含≤50μg总脑膜炎球菌糖每剂量(例如≤40μg，≤30μg，≤20μg， ≤10μg)。优选的组合物包括：血清组A，C，W135；血清组A，C，Y；血清组 C，W135，Y；和血清组A，C，W135和Y四种。可采用经修饰的MenA糖。 该组合物可为液体或干燥(例如冻干)形式。当为液体形式时，蔗糖浓度优选在 5-50mg/ml之间例如约25mg/ml。当为冻干形式时，优选该组合物不包含铝盐佐 剂。该组合物还可包含来自下列一种或多种的抗原：(a)脑膜炎奈瑟球菌血清组B；
(b)流感嗜血杆菌B型；和/或(c)肺炎链球菌。
免疫原性
发明组合物是免疫原性的。优选的免疫原性组合物是疫苗。根据发明的疫苗 可以是预防(即防止感染)或治疗性(即治疗感染后的疾病)，但通常是预防性。
除了以上提到的成分外，发明的免疫原性组合物和疫苗通常包括1种或多种 ‘药学上可接受载体’，药学上可接受载体所包括的载体本身不诱导对接受组合 物个体有害的抗体生成。合适的载体一般是大、缓慢代谢的大分子，如蛋白、多 糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖[216]、乳糖 和脂质聚集物(例如油滴或脂质体)。这种载体对本领域普通技术人员熟知。疫苗 也可包含稀释剂，如水、盐水、甘油等。另外，可存在辅助物质如润湿剂或乳化 剂、pH缓冲物质等。无菌、无热原的磷酸缓冲生理盐水是典型的载体。关于药 学上可接受赋形剂的详尽讨论可获得自参考文献217。
用作疫苗的免疫原性组合物包括免疫上有效量的抗原以及所需任何其它成 分。‘免疫上有效量’指以单剂量或作为一系列的部分施用给个体的量对治疗或 预防有效。此量可变化，取决于待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个 体的分类组(例如非人的灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的 能力、所需保护程度、疫苗制剂、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素。 预期量在相对广泛的范围内，范围能通过常规试验确定，每剂量各脑膜炎球菌糖 抗原的典型量在1μg和200μg间，例如约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg 或约10μg(表示为糖)。
能确定发明组合物的免疫原性，通过将它们施用给测试受试者(如12-16个月 龄的儿童或动物模型[218])并然后确定标准参数，包括总和高亲合力抗荚膜IgG 的血清杀菌抗体(SBA)和ELISA效价(GMT)。这些免疫反应一般在组合物施用后 约4周确定，与组合物施用前确定的值相比较。优选SBA增加至少4倍或8倍。 当施用超过1个剂量组合物时，可进行1次以上的施用后确定。
优选的发明组合物能赋予病人的抗体效价，效价高于可接受百分比人受试者 各抗原成分的血清保护的标准。熟知有相关抗体效价的抗原，在其之上认为宿主 是对抗原血清转换的，这种效价由组织如世界卫生组织(WHO)公布。优选大于 80％的统计显著性受试者样品发生血清转换，更优选大于90％，更加优选大于93％ 且最优选96-100％。
给予本发明组合物
本发明组合物可注射。
肠胃外注射可以是皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内。优选肌肉内施用到大腿 或上臂。注射可经针(例如皮下注射针)，但可另外使用无针的注射。典型的肌肉 内剂量是0.5ml。
给药可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初步的免疫方案和/或加 强的免疫方案。初步的剂量方案可接着加强的免疫方案。致敏剂量间(例如4-16 周间)和致敏与加强间的合适时间选择可常规确定。
一般将本发明组合物给予动物，具体说，可治疗人对象。该组合物对于疫苗 接种儿童和青年尤其有用。
医学方法和应用
发明也提供在哺乳动物中产生免疫反应的方法，包括用本发明组合物注射患 者。免疫反应优选保护性地抗脑膜炎球菌疾病，可包括体液免疫反应和/或细胞免 疫反应。患者优选儿童。
该方法可在已经引起抗脑膜炎奈瑟球菌的患者中引起加强反应。
本发明还提供以下物质在制造在动物中引起免疫反应的可注射药物中的应 用：(i)来自脑膜炎奈瑟球菌血清组A，C，W135和Y中的至少两种的荚膜糖，其 中所述荚膜糖与载体蛋白缀合和/或是寡糖，和(ii)来自下列一种或多种的抗原： (a)脑膜炎奈瑟球菌血清组B；(b)流感嗜血杆菌B型；和或(c)肺炎链球菌。药物 优选用于预防和/或治疗细菌性脑膜炎。
一种检查治疗性处理功效的方法包括监控施用发明组合物后的细菌感染。一 种检查预防性处理功效的方法包括监控施用组合物后抗需处理抗原的免疫反应。
异源宿主
尽管用于本发明组合物的多肽可在原始宿主(例如脑膜炎奈瑟球菌或肺炎链 球菌)中表达，但优选使用异源宿主。异源宿主可以是原核(如细菌)或真核生物。 它优选是大肠杆菌，但其它合适的宿主包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱 弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏杆菌 (Salmonella typhimurium)、乳酰胺奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟球菌 (Neisseria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteris)(例如结核分枝杆菌)、酵母等。
综合
术语“包含”指“包含”以及“由…组成”，例如“包含”X的组合物可由 X唯一组成或包括另外成分，例如X+Y。
涉及数值x的术语“约”指例如x±10％。
单词“基本上”不排除“完全”，例如，“基本没有”Y的组合物可完全没 有Y。必要时，单词“基本上”可从发明定义中省略。
菌株可作为下标表示，例如741MC58是来自菌株MC58的蛋白741。除非另有 说明，本文所示蛋白(例如没有下标)来自脑膜炎奈瑟球菌菌株2996，此菌株可作 为‘参考’菌株。然而，要理解发明一般不受菌株限制。如上所示，一般参考蛋 白(例如‘287’、‘919’等)可包括来自任何菌株的蛋白。通常，它与2996的序 列同一性为90％或更多(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或更多)。当使用杂合蛋白时，杂合体(即个别的-X-部分)内的单独抗原可来自 1个或多个菌株。例如当n＝2时，X2可来自与X1相同的菌株或来自不同菌株。 当n＝3时，菌株可以是(i)X1＝X2＝X3(ii)X1＝X2≠X3(iii)X1≠X2＝X3(iv)X1≠X2≠ X3或(v)X1＝X2≠X3等。
术语“烷基”指直和分支形式的烷基。烷基能用1、2或3个杂原子间断， 杂原子选自-O-、-NH-或-S-。烷基也能用1、2或3个双和/或三键间断。然而， 术语“烷基”通常指没有杂原子间断或双或三键间断的烷基。当提及C1-12烷基时， 烷基可包含1到12间任意数量的碳原子(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、 C9、C10、C11、C12)。类似地，当提及C1-6烷基时，烷基可包含1到6间任意数量 的碳原子(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6)。
术语“环烷基”包括环烷基、聚环烷基和环链烯基以及这些与烷基的组合， 如环烷基烷基。环烷基能用1、2或3个杂原子间断，杂原子选自-O-、-NH-或-S-。 然而，术语“环烷基”通常指没有杂原子间断的环烷基。环烷基的例子包括环戊 基、环己基、环己烯基、环己基甲基和金刚烷基。当提及C3-12环烷基时，环烷基 可包含3到12间任意数量的碳原子(例如C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、 C11、C12)。
术语“芳基”指芳族基，如苯基或萘基。当提及C5-12芳基时，芳基可包含5 到12间任意数量的碳原子(例如C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)。
术语“C5-12芳基-C1-6烷基”指基团如苄基、苯乙基和萘甲基。
氮保护基团包括甲硅烷基(如TMS、TES、TBS、TIPS)、酰基衍生物(如邻苯 二甲酰亚胺、三氟乙酰胺、甲氧基羰基、乙氧基羰基、t-丁氧基羰基(Boc)、苄氧 基羰基(Z或Cbz)、9-芴甲氧基羰基(Fmoc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、2，2，2- 三氯乙氧基羰基(Troc))、磺酰衍生物(如β-三甲基甲硅烷基乙磺酰(SES))、亚磺酰 衍生物、C1-12烷基、苄基、二苯甲基、三苯甲基、9-苯基芴等。优选的氮保护基 团是Fmoc。
应理解糖环能以开放或闭合形式存在，尽管本文的结构式中显示闭合形式， 发明也包括开放形式。
用于促进克隆或纯化等的序列不一定有助于发明且可省略或去除。
发明的多肽能通过多种方法(如重组表达、从细胞培养物中纯化、化学合成(至 少部分)等)和以多种形式(如天然、融合、非糖基化、脂化等)制备。它们优选制成 基本纯化的形式(即基本没有其它脑膜炎奈瑟球菌或宿主细胞蛋白质)。
根据发明的核酸能以许多方式制备(如通过化学合成(至少部分)、来自基因组 或cDNA文库、来自生物体本身等)且可采用多种形式(如单链、双链、载体、探 针等)。它们优选制成充分纯化的形式(即基本没有其它脑膜炎奈瑟球菌或宿主细 胞核酸)。术语“核酸”包括DNA和RNA以及它们的类似物，如含修饰主链(例 如硫代磷酸等)以及肽核酸(PNA)等。发明包括所含序列与上述互补的核酸(例如用 于反义或探测目的)。
血清组之后，脑膜炎球菌分类包括血清型、血清亚型，然后是免疫型，标准 命名列出血清组、血清型、血清亚型和免疫型，各由冒号隔开，如B:4:P1.15:L3，7，9。 在血清组B内，一些谱系导致疾病频繁(高侵入性)，一些谱系引起比其它谱系更 严重的疾病形式(高毒性)，其它的根本不导致疾病。识别了7个高毒性谱系，即 亚群I、III和IV-1、ET-5复合体、ET-37复合体、A4簇和谱系3。它们通过多位 点酶电泳(MLEE)确定，但多位点序列分型(MLST)也用于分类脑膜炎球菌[参考文 献41]。
实施发明的方式
1.用于人肌肉内给药的脑膜炎球菌糖
如参考文献7所述制备来自MenC，MenW135，MenY和任选地，MenA的 寡糖缀合物。用这些制备下列6种组合物的各0.5ml剂量(每0.5ml剂量的量)：
*血清组A组分为冻干形式，用CWY液体组合物稀释得到最终的ACWY组合物。
通过肌肉内注射在12-16月龄的儿童大腿部给予这些疫苗，单剂量(对于 MenjugateTM在大于12个月的儿童中有效)或4周后第二次注射。可比较接种疫苗 前和接种疫苗后(例如在第4周，如果接受了两次剂量然后在第8周)的血清 BCA和IgG。
2.两瓶组合物
用于人的缀合物制备为2个独立的瓶。瓶1含有MenA缀合物的冻干粉，还 有蔗糖和磷酸二氢钾。瓶2含有MenC，MenW135和MenY缀合物，还有氯化钠， 聚山梨醇酯80，磷酸钠缓冲液，和任选的悬液形式的磷酸铝佐剂。使用之前，用 瓶2的0.6ml液体重建瓶1，得到的0.5ml可用于给药。
制备了3种剂量。在重建的形式中，疫苗含有下列抗原：
组分 每0.5ml剂量的量 血清组A缀合物 10μg糖+12.5-33μg CRM197 或5μg糖+6.25-16.5μg CRM197 或2.5μg糖+3.125-8.25μg CRM197 血清组C缀合物 10μg糖+12.5-25μg CRM197 或5μg糖+6.25-12.5μg CRM197 或2.5μg糖+3.125-6.25μg CRM197 血清组W135缀合物 10μg糖+6.6-20μg CRM197 或5μg糖+3.3-10μg CRM197 或2.5μg糖+1.65-5μg CRM197 血清组Y缀合物 10μg糖+6.6-20μg CRM197 或5μg糖+3.3-10μg CRM197 或2.5μg糖+1.65-5μg CRM197
在重建的形式中，疫苗含有下列其它抗原：
因此可有六种疫苗-3种不同剂量(10，20或40μg总糖)，各有或没有磷酸铝 佐剂。
将糖剂量最高的佐剂疫苗给予健康的年龄18-45岁的人对象。用于比较，对 照对象接受(a)瓶1(在缓冲液中重建)和瓶2产品，在相同时间不同手臂，或 (b)MencevaxTM。各患者组有30个人。
在疫苗接种前28天和疫苗接种后28天收集血液，以评价免疫反应和收集实 验室安全指数(全血计数，血液化学分析，肝肾功能测试和尿分析)。疫苗被很好 耐受，没有意外的不良反应。在研究过程中实验室指数未发生显著异常改变。
在血清样品中测定血清组A，C，W135，Y特异性SBA和IgG(用ELISA检测)。 SBA效价表示为在60分钟时杀伤率≥50％的最终血清稀释度的倒数。对于IgG 检测，用改进的ELISA来测定高亲和力抗体。对于功能性抗体的检测，使用了有 两个不同外源补体来源的SBA：幼兔补体来源和人补体来源。
高亲和力IgG结果如下(平均GMC(μg/ml)，95％置信区间)：
后 18(12-29) 21(13-33) 20(12-31)
SBA结果如下(％反应者和平均GMT，均为95％置信区间)：
对于各血清组，在各疫苗组(ACWY，A+CWY和Mencevax对照)中，高亲 和力ELISA抗荚膜IgG GMC和以兔和人补体试验测定的SBA GMT，在注射后 均升高。在疫苗注射后29天，对各血清组的人补体SBA效价≥1∶4的对象百分 数在缀合物疫苗组中为90％-100％，在对照组中为83％-100％。用兔补体来源， 对各血清组的补体SBA效价≥1∶128的对象百分数在缀合物疫苗组中为93％-100 ％，在对照组中为90％-100％。
总体来说，缀合物组中的免疫反应(GMC和GMT)好于Mencevax对照组。尤 其在血清组W-135中看到这种改善。因此，本发明缀合疫苗安全，耐受性好，诱 导的功能性免疫反应与用批准的四价多糖疫苗免疫接种后相同或更好。
3.使用修饰的MenA糖
从MenA中纯化得到荚膜多糖并水解产生MenA寡糖。多糖(2g)在50mM乙 酸钠缓冲液pH4.75中50℃水解约4小时，多糖浓度为10mg/mL[73]。水解后， 溶液通过旋转蒸发来干燥。
寡糖用下列反应流程活化：
寡糖溶解于DMSO以产生10mg/mL的糖浓度。根据1∶20的寡糖∶CDI摩尔比， 然后加入21.262g CDI且反应混合物室温搅拌16小时。通过在80∶20(v/v)丙 酮∶DMSO混合物中选择性沉淀，接着离心纯化所得MenA-CDI化合物。通过确 定游离咪唑与结合咪唑的比例计算活化反应效率约为67.9％。
在第2个反应步骤中，MenA-CDI寡糖溶解于DMSO，糖浓度约为10mg/mL。 根据1∶100的MenA-CDI单位：DMA摩尔比，加入36.288g 99％盐酸二甲胺(即 R1和R2＝Me)且反应混合物室温搅拌16小时。反应产物冷冻干燥并再溶解于10 mg/mL水溶液。
为从寡糖制品中去除低分子量反应试剂(特别是二甲胺(DMA))，经3.5kDa MWCO膜(Spectra/PorTM)进行透析步骤。完成4个透析步骤：(i)相对2L 1M氯化 钠透析16小时(透析因子1∶20)，(ii)相对2L 0.5M氯化钠透析16小时(透析因子 1∶20)，(iii)和(iv)相对2L WFI透析16小时(透析因子1∶20)。为改善纯化，也经1kDa MWCO膜(CentriconTM)进行透析步骤。
纯化的MenA-CDI-DMA产物在25mM L-组氨酸(FlukaTM)中缓冲于pH6.5。
为制备修饰的MenA糖缀合物(MenA-CDI-DMA)，总方法如下：
-水解多糖以产生寡糖片段
-寡糖片段的尺寸定位
-还原胺化依大小排列的寡糖上的末端醛基
-在CDI反应前通过Fmoc基团保护末端-NH2基团
-在DMA反应期间内部去保护-NH2基团
-通过SIDEA(N-羟基琥珀酰亚胺己二酸)活化末端-NH2基团
-共价附着于CRM197蛋白
修饰的MenA寡糖缀合物在升高的温度下对水解的抗性比其天然对应物大许 多。例如，37℃28天后，修饰寡糖的释放糖百分比为6.4％，相比之下，天然抗 原的释放糖百分比为23.5％。此外，修饰寡糖诱导的效价不显著低于用天然糖结 构获得的效价。
修饰的MenA缀合物结合MenC、MenW135和MenY缀合物，替代未修饰 的寡糖缀合物。
加入MenB抗原
在如上所述冻干的MenA缀合物重建之前，将MenB抗原ΔG287-953(SEQ ID NO：7)，936-ΔG741(SEQ ID NO：8)和NadA(SEQ ID NO：2)加入到最高剂量液 体C-W135-Y混合物中，以达到这3种多肽的每一种终浓度为20μg/剂量。因此 重建的疫苗含有下列抗原：
成分 每0.5ml剂量的量 血清组A缀合物 10μg糖+12.5-33μg CRM197 血清组C缀合物 10μg糖+12.5-25μg CRM197 血清组W135缀合物 10μg糖+6.6-20μg CRM197 血清组Y缀合物 10μg糖+6.6-20μg CRM197 ΔG287-953 20μg多肽 936-ΔG741 20μg多肽 NadA 20μg多肽
4.加入Hib抗原
将冻干的HbOC缀合物与冻干的MenA缀合物混合，一起用C-W135-Y混合 物重建以产生下列疫苗：
成分 每0.5ml剂量的量 血清组A缀合物 10μg糖+12.5-33μg CRM197 血清组C缀合物 10μg糖+12.5-25μg CRM197
血清组W135缀合物 10μg糖+6.6-20μg CRM197 血清组Y缀合物 10μg糖+6.6-20μg CRM197 HbOC Hib缀合物 10μg糖+2-5μg CRM197
5.加入肺炎链球菌抗原
在如上所述冻干的MenA缀合物重建之前，将肺炎链球菌缀合物抗原加入 到中等剂量液体C-W135-Y混合物中，以达到各血清型终浓度为2μg/剂量(对于 血清型6B加倍)。因此重建的疫苗含有下列抗原：
成分 每0.5ml剂量的量 血清组A缀合物 5μg糖+6.25-16.5μg CRM197 血清组C缀合物 5μg糖+6.25-12.5μg CRM197 血清组W135缀合物 5μg糖+3.3-10μg CRM197 血清组Y缀合物 5μg糖+3.3-10μg CRM197 肺炎链球菌血清型4缀合物 2μg糖+2.5μg CRM197 肺炎链球菌血清型9V缀合物 2μg糖+2.5μg CRM197 肺炎链球菌血清型14缀合物 2μg糖+2.5μg CRM197 肺炎链球菌血清型18C缀合物 2μg糖+2.5μg CRM197 肺炎链球菌血清型19F缀合物 2μg糖+2.5μg CRM197 肺炎链球菌血清型23F缀合物 2μg糖+2.5μg CRM197 肺炎链球菌血清型6B缀合物 4μg糖+5μg CRM197
应理解本发明仅通过实施例进行了描述，可进行修改而仍在本发明的范围和 构思内。
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