技术领域
本发明涉及自然铜微生物浸出液在制备治疗骨折药物中的应用，具体地说是利用微生物 技术，将中药自然铜溶解浸出，然后将自然铜微生物浸出液用于制备治疗骨折药物的技术，属 于中药新技术、新工艺领域。
背景技术
自然铜(PYRITUM)为硫化物类矿物黄铁矿族黄铁矿，主含二硫化铁(FeS2)，是常见 的矿物类中药。自然铜具有散瘀、接骨、止痛等作用，用于跌扑肿痛、筋骨折伤[1]。现代医 学认为自然铜具有促进骨折愈合的作用，在临床和药理研究上已成功地用于骨折愈合的治疗 ，因此越来越受到国内外学者的广泛关注，成为矿物中药研究的一个热点。
矿物药是中华民族的文化瑰宝，但是由于其水不溶性，导致生物利用度低、临床用量大 、毒性高等问题，严重制约了矿物中药的发展与进军国际市场。因此，找出一种能够有效的 溶出矿物药有效成分，降低矿物药使用量、增加疗效、降低毒性的矿物药炮制方法意义十分 重大。
目前用于炮制自然铜的主要方法为煅淬法，但是这种方法存在许多问题[2-4]，首先，不 但费时、费力、耗能，而且在煅制过程中会产生大量二氧化硫气体，严重污染环境，影响操 作人员的身体健康；其次，煅淬法不能有效溶解自然铜，使其使用受到一些限制，更无法定 量控制药物中有效成分含量，难以在注射用药物组方中应用等。
从理论上讲，采用化学方法可以溶解自然铜，但化学法要求硝酸、盐酸、高氯酸等苛刻 条件，难于保存自然铜中所必须的有效成分，从而失去自然铜的治疗作用；另一方面，采用 化学方法处理自然铜还可能将药物本身所不具有的成分，甚至将有毒和剧毒成分引入药物。
由于上述种种难以克服的种种问题，导致当前市场上自然铜质量良莠不齐，自然铜及其 相关产品难以走向国际市场。
目前，一项高新生物技术微生物冶金技术异军突起[5-7]。在一定的空气、pH、温度条 件下，一些特殊的细菌(氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌等)可将不溶性的硫化物转变为可 溶性的矿石溶解液，然后对所需元素进行回收[8-10]。该技术的最大特点是简单、高效、低成 本、无污染、条件温和，因而在世界冶金业得到广泛推崇和应用，目前世界铜产量的30％来 自微生物冶金技术。自然铜也是一种硫化矿，具有被浸矿微生物溶解的潜能。
中国发明专利2006102000675已经公开了矿物中药的微生物处理方法[11]。本发明涉及了 微生物处理的自然铜浸出液在制备治疗骨折药物中的应用，该浸出液能够对骨折愈合起到良 好治疗作用。由于经过微生物的溶解与转化，自然铜中的多种有效成分得到有效的溶解，因 此该自然铜微生物浸出液能够在低浓度范围内发挥功效。
参考文献：
[1]《中华人民共和国药典》2005年版一部.
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[3]楼冠峰。自然铜炮制方法改进的探讨。时珍国医国药，2003，14(8)：457
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[10]Karavaiko G I.Microbiological processes for the leaching of metals from ores.State-of-the-art review.In：Torma A E，editor.Moscow：Centre of International Projects，GKNT，1985.
[11]李红玉，张景红，支德娟。200610200067.5，矿物药中的重金属去除方法。
发明内容：
自然铜微生物浸出液的制备方法：称取0.5g自然铜，磨碎过200目筛，放入干净的 250mL锥形瓶中，加入灭菌后的9K无铁液体培养基100mL，5M硫酸调pH至1.60，待pH稳定后 ，接种体积分数为10％氧化亚铁硫杆菌，空白对照不接种菌液。称取质量后，在25℃、 130r/min浸出15天。实验过程中采用5M硫酸调节pH值，用蒸馏水补充所蒸发的水分。摇瓶浸 出15天后停止，静置过夜，收集上清液，调节溶液pH至7左右，过0.22微米滤膜除菌后，备 用。
骨折大鼠口服自然铜浸出液21天后，碱性磷酸酶活性明显提高，并且该自然铜浸出液能 够促进骨折处骨痂生长，说明该自然铜浸出液具有促进骨折愈合的作用。
同领域研究人员可以理解，通过采用上述方法处理所得的自然铜微生物浸出液，可以制 成各种制剂，包括：栓剂，栓剂、片剂、丸剂、颗粒剂、膜剂、微囊剂、滴丸剂、气雾剂、 酒剂、糖浆剂、口服液、注射液或注射粉针剂，这些药物组合物可以含有0.1％～100％自然铜 微生物浸出液。
本发明克服了现有技术的缺陷，本发明所提供的自然铜浸出液使用量远远低于传统自然 铜，达到了安全用药，且疗效显著的目的。
具体实施方式：
实施例一自然铜微生物浸出液的制备
称取0.5g自然铜，磨碎过200目筛，得粉末。于干净的250mL锥形瓶中，加入灭菌后的9 K无铁液体培养基100mL，5M硫酸调pH至1.60，待pH稳定后，接种体积分数为10％氧化亚铁硫 杆菌，空白对照不接种菌液。称取质量后，在25℃、130r/min浸出15天。实验过程中采用 5M硫酸调节pH值，用蒸馏水补充所蒸发的水分。摇瓶浸出15天后停止，静置过夜，收集上清 液，调节溶液pH至7左右，过0.22靘滤膜除菌后，备用。
实施例二自然铜浸出液对骨折大鼠血清钙浓度和碱性磷酸酶活性的影响
实验动物：健康SD大鼠，雌性，6～8周龄，体重(200±20)g，SPF级，购于兰州大学动 物实验中心。
骨折模型：戊巴比妥钠麻醉SD大鼠，右后肢脱毛，碘伏消毒，手术刀直切开皮肤，暴露 出胫骨，于上1/3处切除部分骨质(约1mm深、2mm宽)，不完全锯断，保持连接，缝合皮肤 ，术后不固定。术后肌注青霉素，4万单位/只，肌注三天。术后第四天开始灌胃给药，骨折 大鼠分为三组：阳性组(n＝9，伤科接骨片粉碎后溶于蒸馏水，按成人用量12片/d，折算大 鼠为1.305片/kg.d，即522mg/kg.d)；实验组(n＝9，自然铜浸出液20ml/kg.d，相当于自然 铜44mg/kg.d)；阴性组(n＝9，蒸馏水20ml/kg.d)。
每组动物分别于术后7d、14d、21d心脏采血，4℃静置4小时，2000rpm离心10min，取上 清。全自动生化分析仪测定血清碱性磷酸酶活性。
血清碱性磷酸酶的测定结果表明，实验组血清碱性磷酸酶活性在14d达到最高值，然后 开始降低，恢复到正常值。在14d时，实验组血清碱性磷酸酶活性明显高于阴性组，说明实 验组药物对大鼠骨折具有一定的治疗作用。
表1浸出液对骨折大鼠血清碱性磷酸酶的影响(U/L)
注：*与阴性组比较P＜0.05
实施例三自然铜浸出液对骨折大鼠骨折处骨痂生长的影响
骨折模型同实施例二。每组动物分别于术后7d、14d、21d进行X光拍摄。阅片依据骨折 愈合的五级评定标准进行评定：
I级：断端边缘稍模糊。骨膜反应轻度，无骨痂。
II级：断端边缘明显模糊，内外骨痂密度高于软组织，骨折间隙1/2以上出现骨痂。
III级：断端边缘大部分消失，内外骨痂近似于髓腔，骨折间隙1/2以上骨痂连接。
IV级：断端边缘趋于消失，内外骨痂近似于皮质骨，骨折间隙1/2以上骨痂连接。
V级：断端边缘完全消失，内外骨痂同皮质骨，并连接、塑形，髓腔再通。
X光片显示给药组大鼠骨折处骨痂面积明显大于空白对照组大鼠骨折处骨痂的面积(表 2)。
表2各组骨折愈合程度的X线检查结果