一种苦碟子注射液的制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102283879 B (45)授权公告日 2013.11.13 CN 102283879 B *CN102283879B* (21)申请号 201110202166.8 (22)申请日 2011.07.19 A61K 36/28(2006.01) A61K 9/08(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 21/33(2006.01) A61P 1/14(2006.01) A61P 39/02(2006.01) A61P 19/08(2006.01) A61P 1/02(2006.01) A61P 11/04(2006.01) A61P 。

2、29/00(2006.01) (73)专利权人 沈阳双鼎制药有限公司 地址 110179 辽宁省沈阳市浑南新区高科路 15 号 (72)发明人 陈玉香 王学东 (74)专利代理机构 沈阳利泰专利商标代理有限 公司 21209 代理人 刘忠达 CN 1682970 A,2005.10.19, (54) 发明名称 一种苦碟子注射液的制备方法 (57) 摘要 一种苦碟子注射液的制备方法和质量控制方 法。 一种苦碟子注射液的制备方法， 是用抱茎苦荬 菜水煎煮液， 用 10% 氧化钙调 pH 值至 10， 取离心 沉淀物称重， 悬浮于95%乙醇中， 加硫酸溶液调pH 值至 3-4， 反应后滤液用氢氧化钠。

3、中和 pH 至 7， 滤 液回收乙醇， 挥去乙醇， 用注射用水稀释至 1ml 相 当于原生药 10g， -5 度以下静置 24 小时， 过滤， 取 苦碟子浓缩液， 用 30KD 分子量超滤膜过滤， 滤液 用水稀释至规定量， 调 pH 值至 7.0-7.5， 灭菌， 即 得。采用本发明方法制备的苦碟子注射液有效成 分保留率高， 稳定性好， 工艺成本低， 适于工业化 生产。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 翟羽 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书9页 附图3页 (10)授权公告号 CN 。

4、102283879 B CN 102283879 B *CN102283879B* 1/1 页 2 1. 一种苦碟子注射液的制备方法， 其特征在于该方法为 ： 取抱茎苦荬菜， 加水煎煮二次， 第一次1小时， 第二次0.5小时， 合并煎液， 浓缩至每1ml 相当于原生药0.5g， 放冷至40以下， 在搅拌下加10%氧化钙乳调节pH值至10， 放置12-24 小时， 离心， 离心沉淀物称重， 悬浮于适量 95% 乙醇中使含醇量达 80%， 加 50% 硫酸溶液调 节 pH 值至 3 4， 充分搅拌使反应完全， 离心或过滤， 离心液或过滤液加 40% 氢氧化钠溶液 中和 pH 值至 7， 离心或滤过。

5、， 滤液回收乙醇， 并挥尽乙醇， 用注射用水稀释至每 1ml 相当于 原生药 10g， 置 -5以下放置 12-24 小时， 滤过， 滤液加 0.1 0.2% 药用活性炭粉末， 煮沸 15 分钟， 置 -5以下放置达 24-48 小时， 滤过， 滤液 121 灭菌 45 分钟， 得苦碟子浓缩液， 置 -5以下放置 ； 取苦碟子浓缩液， 滤过， 用 30KD 分子量超滤膜超滤， 滤液加注射用水稀释 至规定量， 调节pH值至7.07.5， 用10KD分子量超滤膜超滤， 后用孔径0.22m的微孔滤 膜滤过， 灌封， 在 115灭菌 35 分钟， 即得苦碟子注射液 ； 苦碟子注射液中每 10ml 含总。

6、黄铜 以无水芦丁计为 4.0-15.0mg ； 每 10ml 含抱茎苦荬菜以腺苷计含量不少于 0.025mg ； 每 1ml 含木犀草素 7-O-D- 葡萄糖醛酸苷含量不得少于 0.010mg， 含菊苣酸不得少于 0.010mg。 权 利 要 求 书 CN 102283879 B 2 1/9 页 3 一种苦碟子注射液的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种中药提取物的制备方法和质量控制方法及其制药用途， 特别涉及 一种苦碟子注射液的制备方法和质量控制方法。 背景技术 0002 苦碟子为菊科苦荬菜属抱茎苦荬菜 Ixeris sonchifolia (Bge)Hance 的两年 生干燥地上部。

7、分， 主产于我国东北、 华北等地。 卫生部药品标准内蒙古分册 记载， 抱茎苦 荬菜味苦、 辛， 锐、 凉， 具开胃， 解毒， 接骨， 去痞作用， 用于不思饮食， 解毒， 骨折， 牙痛。民间 主要用于治疗阑尾炎、 扁桃体炎、 无名肿痛等症。 0003 对苦碟子药材及制剂的研究近几年有了很大的发展， 据文献报道抱茎苦荬菜含有 黄酮、 腺苷、 内酯等化学成分。药理研究表明黄酮类成分是其中的主要活性成分类别之一， 化学研究表明抱茎苦荬菜黄酮类成分以木犀草素 7-O-D 葡萄糖醛酸苷、 木犀草素 7-O-D- 葡萄糖苷、 芹菜素 7-O-D- 葡萄糖醛酸苷、 芹菜素 7-O-D- 葡萄糖苷以及其 他数种。

8、黄酮类成分含量较高。 发明内容 0004 本发明的目的， 在于公开一种苦碟子注射液的制备方法 ； 0005 本发明的另一目的， 在于公开一种苦碟子注射液的质量控制方法。 0006 采用的技术方案是 ： 0007 一种苦碟子注射液的制备方法， 其特征在于该方法为 ： 0008 取抱茎苦荬菜， 加水煎煮二次， 第一次 1 小时， 第二次 0.5 小时， 合并煎液， 浓缩至 每 1ml 相当于原生药 0.5g， 放冷至 40以下， 在搅拌下加 10% 氧化钙乳调节 pH 值至 10， 放 置 12-24 小时， 离心， 离心沉淀物称重， 悬浮于适量 95% 乙醇中 （使含醇量达 80%） ， 加 5。

9、0% 硫 酸溶液调节 pH 值至 3 4， 充分搅拌使反应完全， 离心或过滤， 离心液或过滤液加 40% 氢氧 化钠溶液中和pH值至7， 离心或滤过， 滤液回收乙醇， 并挥尽乙醇， 用注射用水稀释至每1ml 相当于原生药10g， 置-5以下放置12-24小时， 滤过， 滤液加0.10.2%药用活性炭粉末， 煮沸 15 分钟， 置 -5以下放置达 24-48 小时， 滤过， 滤液 121 加热 45 分钟， 得苦碟子浓 缩液， 置 -5以下放置。取苦碟子浓缩液， 滤过， 用 30KD 分子量超滤膜超滤， 滤液加注射用 水稀释至规定量， 调节 pH 值至 7.0 7.5， 用 10KD 分子量超滤。

10、膜超滤， 后用微孔滤膜 （孔径 0.22m） 滤过， 灌封， 在 115 灭菌 35 分钟， 即得苦碟子注射液 ； 0009 通过本发明方法制得的苦碟子注射液中每10ml含总黄铜以无水芦丁 （C27H30O16） 计 为 4.0-15.0mg ； 每 10ml 含抱茎苦荬菜以腺苷 （C10H12N5O4） 计含量不少于 0.025mg ； 每 1ml 含 木犀草素 7-O-D- 葡萄糖醛酸苷含量不得少于 0.010mg， 含菊苣酸不得少于 0.010mg。 0010 一种苦碟子注射液的质量控制方法， 其特征在于该方法中包含如下测定步骤 ： 0011 1、 总黄酮 对照品溶液的制备 ： 精密称取。

11、芦丁对照品适量， 加 60% 乙醇制成每 1ml 含 0.1mg 的溶液 （必要时， 可置 80水浴中加热， 使溶解） ， 即得 ； 说 明 书 CN 102283879 B 3 2/9 页 4 0012 供试品溶液的制备 精密量取装置差异项下的本品 10ml， 置 50ml 量瓶中， 加 60% 乙醇稀释至刻度， 摇匀， 即得 ； 0013 测定法 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 5ml， 分别置 10ml 量瓶中， 各加入 5% 亚硝酸钠溶液 0.3ml， 摇匀， 放置 6 分钟。分别加入 10% 硝酸铝溶液 0.3ml， 摇匀， 放置 6 分钟， 再加入 1mol/L 氢氧化钠溶液 4。

12、ml， 用 60% 乙醇稀释至刻度， 摇匀， 放置 10 分钟。同时 取供试品溶液 5ml， 加 60% 乙醇稀释至 10ml， 作为空白。照分光光度法 （中国药典 2010 年版 一部附录 B） ， 在 505nm 波长处测定吸收度， 减去校正， 计算， 即得。 0014 本品每 10ml 含总黄酮以无水芦丁 （C27H30O16） 计， 应为 4.0mg-15.0mg。 0015 2、 腺苷 照高效液相色谱法 （中国药典 2010 年版一部附录 D） 测定。 0016 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ； 乙腈 - 水 （6:94） 为流动相 ； 检测波长为 260。

13、nm。理论板数按腺苷峰计算应不低于 5000。 0017 对照品溶液的制备 精密称取腺苷对照品适量， 加 10% 甲醇制成每 1ml 含 35g 的溶液， 即得。 0018 供试品溶液的制备 取本品 6 支， 内容物混匀， 精密吸取 25ml， 置分液漏斗中， 加 三氯甲烷振摇提取 2 次， 每次 10ml， 弃去三氯甲烷液， 将水溶液蒸干， 残渣加 10% 甲醇使溶 解， 定量转移至 5ml 量瓶中， 加 10% 甲醇稀释至刻度， 摇匀， 用微孔滤膜 （0.45m） 滤过， 即 得。 0019 测定法 分别精密吸取对照品溶液 10l 与供试品溶液 10 15l， 注入液相色 谱仪， 测定， 。

14、即得。 0020 本品每 10ml 含抱茎苦荬菜以腺苷 （C10H12N5O4） 计， 不得少于 0.025mg。 0021 3、 木犀草素 7-O-D- 葡萄糖醛酸苷和菊苣酸 照高效液相色谱法 （中国药典 2010 年版一部附录 D） 测定。 0022 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ； 乙腈 0.4磷酸溶液 （ml/ml） （16 ： 84）为流动相 ； 检测波长为 327nm。理论板数按木犀草素 7-O-D- 葡萄糖醛酸苷峰计算应不低于 5000。 0023 对照品溶液的制备 取木犀草素 7-O-D- 葡萄糖醛酸苷、 菊苣酸对照品适量， 分别加甲醇制成毎 1ml。

15、 含木犀草素 7-O-D- 葡萄糖醛酸苷 0.1mg， 含菊苣酸 0.05mg 的溶 液， 即得。 0024 供试品溶液的制备 取本品适量， 用 0.45m 滤膜滤过， 即得。 0025 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 5l， 注入液相色谱仪， 测定， 即得。 0026 本品每 ml 含木犀草素 7-O-D- 葡萄糖醛酸苷不得少于 0.010mg， 含菊苣酸不得 少于 0.010mg。 0027 4、 指纹图谱 0028 色谱条件 色谱柱 Phenomenex Luna C18 4.6mm250mm 5; 流动相 A 为乙 腈， B 为 0.4磷酸溶液 （ml/ml） , 按表 。

16、1 程序进行梯度洗脱， 流速 0.9ml/min; 检测波长为 327nm; 柱温 40。 0029 表 1 梯度洗脱程序 0030 说 明 书 CN 102283879 B 4 3/9 页 5 0031 参照物溶液的制备 取菊苣酸对照品适量， 加 50% 甲醇制成每 1ml 含 0.05mg 的溶 液， 即得。 0032 标准提取物溶液的制备 取本品约 0.1g， 置 25ml 量瓶中， 加 50% 甲醇溶解并稀释 至刻度， 摇匀， 即得。 0033 供试品溶液的制备 取本品适量， 用 0.45m 滤膜滤过， 即得。 0034 测定法 精密吸取上述叁种溶液， 注入高效液相色谱仪， 记录 90。

17、 分钟内的色谱 图。供试品液相色谱图应与对照指纹图谱基本一致， 有相对应的 10 个特征峰。按中药色谱 指纹图谱相似度评价系统， 供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算， 相似度不得低 于 0.80。 0035 实验实施例 1 ： 加水煎煮时间的研究 0036 1、 加水煎煮时间考察 ： 根据苦碟子药材性质， 将其 （苦碟子干燥地上部分） 剪成 2-3cm 小段儿， 混匀， 随机称取 2 份， 每份 40g。 0037 2、 加水煎煮 ： 分别煎煮 2 次， 一份煎煮时间 （1.0， 0.5h） ， 一份煎煮时间 （2.0， 1.0h） 。 0038 3、 检测 ： 第一、 二次煎煮液分别检。

18、测， 研究煎煮次数的提取率 ； 合并两次煎煮液， 减压浓缩， 检测水量对含测的影响。 0039 4、 固体物 ： 将减压浓缩物， 水浴蒸干， 称重， 比较差异。 0040 5、 检测数据如下表所示 ： 0041 表 2 苦碟子加水煎煮时间的研究结果 0042 0043 结论 ： 综合考虑各种因素， 苦碟子注射液水煎煮优选工艺为加水煎煮 2 次， 第一次 1.0 小时， 第二次 0.5 小时， 水量以 15 倍量为好。 0044 实验实施例 2 ： 苦碟子石灰乳沉淀物乙醇分散液调酸影响因素试验 0045 表 3 石灰乳沉淀物乙醇分散液调酸实验结果 0046 说 明 书 CN 102283879 。

19、B 5 4/9 页 6 0047 由上表所示， 苦碟子石灰乳乙醇分散液用硫酸调节 pH 值越小， 含量测定值越大， 优选 pH 值为 3.0-4.0。 0048 实验实施例 3 ： 苦碟子硫酸乙醇解析液用 NaOH 调节 pH 值影响因素实验 0049 表 4 硫酸乙醇解析液用 NaOH 调节 pH 值影响因素实验结果 0050 0051 由上表所示， 苦碟子硫酸乙醇解析液用 NaOH 调节 pH 值， 黄酮类化合物 （木犀草素 醛酸苷） 含量随着 pH 值增加而降低， 而考虑到去除杂质的因素， 最佳 pH 值为 7.0。 0052 实验实施例 4 ： 超滤实验方法及结果 0053 1 实验方。

20、法 0054 （1） 超滤前后腺苷含量测定 0055 色谱条件 色谱柱 ODS 柱 (250mm46 mm) ； 柱温 ： 30； 流动相 ： 甲醇 - 水 ( 体 积比 13 ： 87) ； 流速为 1mL min ； 检测波长 ： 260nm 。 0056 样品测定 取超滤前后样品溶液， 经 0.45m 滤膜滤过， 注入高效液相色谱仪， 测 定腺苷峰面积， 计算含量。结果， 超滤前后腺苷含量变化不大， 见表 5 。 0057 表 5 苦碟子注射液超滤前后腺苷含量测定比较结果 0058 说 明 书 CN 102283879 B 6 5/9 页 7 0059 （2） 超滤前后木犀草素 7-O-。

21、D 葡萄糖醛酸苷的含量测定 0060 色谱条件 色谱柱 ODS 柱 (250mm46 mm) ； 柱温 ： 30； 流动相 ： 乙腈 -0.4% 磷 酸溶液 （20 ： 80） ； 流速为 1mL min ； 检测波长 ： 348nm。 0061 样品测定 取超滤前后样品溶液， 经 0.45m 滤膜滤过， 精密吸取一定量， 注入高 效液相色谱仪， 测定醛酸苷峰面积， 计算， 即得。结果见下表。 0062 表 6 木犀草素 7-O-D 葡萄糖醛酸苷的含量测定 0063 0064 （3） 超滤前后总黄酮的含量测定， 结果见下表。 0065 表 7 苦碟子注射液超滤前后紫外吸收度值检测结果 0066。

22、 说 明 书 CN 102283879 B 7 6/9 页 8 0067 （4） 超滤前后指纹图谱比较 0068 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ( 色谱柱 250mm46mm 5m) ； 柱温 ： 40 ； 流动相 A 为乙腈 ； B 为 0.4% 磷酸溶液 （ml/ml） , 按下 表程序进行梯度洗脱 ； 流速为 1mL min ； 检测波长 ： 348nm。 0069 测定法 精密吸取供试品溶液 5l， 注入高效液相色谱仪， 记录 40 分钟内各峰的 保留时间和积分面积。具体检测结果如图 1 所示。 0070 依据上述试验结果， 暂定应有 11 个共同色谱峰， 。

23、照中药色谱指纹图谱相似度分析 系统检验， 超滤前后供试品色谱图基本一致， 相似度均大于 0.9。 0071 （5） 超滤前后苦碟子注射液中杂质检测结果， 见表 8 ： 0072 表 8 超滤前后苦碟子注射液中杂质检测结果 0073 0074 综合实验结果来看， 超滤膜纯化苦碟子提液的工艺， 有效成分保留率高， 提取液稳 定性好， 工艺成本低的特点， 提示该超滤工艺可适用于苦碟子注射液的工业化纯化过程。 0075 实验实施例 5 ： 木犀草素 7-O-D 葡萄糖醛酸苷和菊苣酸的方法学考察 0076 1、 测定波长的确定 0077 通过绘制木犀草素 7-O-D 葡萄糖醛酸苷和菊苣酸的紫外吸收图谱，。

24、 结果显示 木犀草素 7-O-D 葡萄糖醛酸苷在 348nm 处有最大吸收， 菊苣酸在 330nm 处有最大吸收。 0078 2、 线性 说 明 书 CN 102283879 B 8 7/9 页 9 0079 精密称取木犀草素 7-O-D 葡萄糖醛酸苷对照品和蒲公英素对照品适量配成浓 度为 （0.2018mg/ml、 0.116 mg/ml） 的混合对照品溶液， 精密吸取 1、 3、 5、 7、 9、 13、 15、 20l， 分别注入液相色谱仪， 测定色谱峰面积， 进行线性回归， 结果如图 2， 图 3 所示。 0080 结论 ： 木犀草素 7-O-D 葡萄糖醛酸苷对照品溶液在浓度 0.20。

25、18mg 4.036mg 之间线性关系良好 ； 菊苣酸对照品溶液在浓度 0.116mg 2.32mg 之间线性关系良好。 0081 3、 精密度 0082 精密吸取木犀草素 7-O-D 葡萄糖醛酸苷和菊苣酸混合对照品溶液 5l， 注入 液相色谱仪， 测定色谱峰面积， 连续进 6 次， 结果如下 ： 0083 表 9 木犀草素 7-O-D 葡萄糖醛酸苷和菊苣酸混合对照品精密度 0084 0085 4、 稳定性 0086 按质量标准正文含量测定项下指纹图谱检测方法操作， 精密吸取供试品溶液 5l 分别于 0、 1、 2、 3、 4、 5、 6 小时间隔注入液相色谱仪， 测定色谱峰面积， 结果如下 。

26、： 0087 表 10 苦碟子注射液含量测定稳定性 0088 0089 结论 ： 供试品溶液在 5 小时内稳定。 0090 5、 重复性 0091 取同一批号苦碟子注射液6支,按质量标准正文含量测定项下指纹图谱检测方法 操作， 精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 5l 分别注入液相色谱仪， 测定色谱峰面积， 计算含量， 结果如下 ： 0092 表 11 苦碟子注射液含量测定重复性 0093 0094 结论 ： 符合规定。 说 明 书 CN 102283879 B 9 8/9 页 10 0095 6、 回收率 0096 精密称取木犀草素 7-O-D 葡萄糖醛酸苷对照品和蒲公英素对照品适量配成 浓度。

27、为 （0.10812mg/ml、 0.02368mg/ml）的混合对照品溶液取已知含量的样品 （木犀草素 7-O-D 葡萄糖醛酸苷 0.1169mg/ml ； 菊苣酸 0.02497mg/ml） 各 5ml， 加入上述对照品溶 液5ml， 制备6个供试品溶液， 精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5l分别注入液相色谱 仪， 测定色谱峰面积， 计算含量， 结果如下 ： 0097 表 12 木犀草素 7-O-D 葡萄糖醛酸苷加样回收率 0098 0099 表 13 菊苣酸加样回收率 0100 0101 结论 ： 符合规定。 0102 实验实施例 6 ： 苦碟子注射液指纹图谱研究 0103 色谱条件 0。

28、104 色谱柱 Phenomenex Luna C18 4.6mm250mm 5; 流动相 A 为乙腈， B 为 0.4 磷酸溶液 （ml/ml） , 按下表程序进行梯度洗脱， 如表 10 所示， 流速 0.9ml/min; 检测波长为 327nm; 柱温 40。 0105 表 15 梯度洗脱条件 0106 说 明 书 CN 102283879 B 10 9/9 页 11 0107 参照物溶液的制备 取菊苣酸对照品适量， 加 50% 甲醇制成每 1ml 含 0.05mg 的溶 液， 即得。 0108 标准提取物溶液的制备 取本品约 0.1g， 置 25ml 量瓶中， 加 50% 甲醇溶解并稀释。

29、 至刻度， 摇匀， 即得。 0109 供试品溶液的制备 取本品适量， 用 0.45m 滤膜滤过， 即得。 0110 测定法 精密吸取上述叁种溶液， 注入高效液相色谱仪， 记录 90 分钟内的色谱 图。供试品液相色谱图应与对照指纹图谱基本一致， 有相对应的 10 个特征峰。按中药色谱 指纹图谱相似度评价系统， 供试品指纹图谱与对照指纹图谱 （图 1） 经相似度计算， 相似度 为 0.982-0.995， 不低于 0.8， 符合相关规定， 结果见图 4 和图 5。 0111 图 1 是超滤前后指纹图谱比较 0112 图 2 是木犀草素 7-O-D 葡萄糖醛酸苷线性图 0113 图 3 是菊苣酸线性图 0114 图 4 是苦碟子注射液对照指纹图谱 0115 图 5 是 10 批次苦碟子注射液指纹图谱研究结果 说 明 书 CN 102283879 B 11 1/3 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102283879 B 12 2/3 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102283879 B 13 3/3 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 102283879 B 14 。