技术领域
本发明属中药提取物，具体地说涉及从当归中提取的有效组分，及其制备 方法，以及该有效组分在制备治疗、预防肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的 一类疾病。目前业内对恶性肿瘤的治疗主要还是以手术、放疗、化疗为主，但 许多化学抗癌药物在作用于靶细胞时往往累及正常细胞，造成严重的副反应。 植物药的遗传毒性不明显，中草药在抗癌抗突变方面有独特的优势和广阔的应 用前景，而且中药在对肿瘤的辅助治疗中也起到不容忽视的作用。紫杉醇即是 典型的从植物中获得的具有良好抗癌活性的天然化合物，现已开发为抗肿瘤药 物。目前我国危害性最为严重的肿瘤为肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大肠癌、 肝癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病及淋巴瘤等。特别是肝癌的发生率近年来有所 增加。值得重视，这些肿瘤的病因学、发病学及其防治，均为我国肿瘤研究的 重点。寻找高效低毒的抗癌药物以及抗癌辅助药物是当前肿瘤研究的重要内 容。
我国药用生物资源十分丰富，其生理活性物质是研究和发现新药先导化学 物，开发新药的天然宝库。目前，我国从天然产物中提取活性物质，用于开发 成治疗肿瘤疾病、安全性好、毒性低的新药还很少，从天然产物中提取活性物 质，开发成具有抗肿瘤疗效的新药，具有重要应用价值和广阔发展前景。
当归为伞形植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的根，始载于《神农本草 经》。当归喜阴凉湿润气候，多生于高山寒湿的落叶林，在我国主产于甘肃、 云南、四川等地。当归味甘平，性温，广泛应用于临床，素有“十方九归”之 称，“药王”之美誉。当归的主要成分为藁本内酯类及其异构物、香豆素类、 黄酮类以及有机酸类物质，其有效成分对神经系统、免疫系统、循环系统、血 液系统、呼吸系统等均有作用，同时还具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种当归有效组分，该有效组分主要含有化合物A： Japoangelol D，化合物B：Angelicolide，化合物C：Angeolide，其中化合物A 的含量为15～30％，化合物B的含量为60～75％，化合物C的含量为10～25％。
优选A的含量为15～25％，B的含量为60～70％，C的含量为10～20％。
最佳选A的含量为17～22％，B的含量为63～68％，C的含量为12～18％。
化合物A的结构式为：
化合物B的结构式为：
化合物C的结构式为：
本发明的另一目的是提供该当归有效组分的制备方法，通过以下步骤实 现：将当归药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液，将提取液浓 缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油 醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇作为流动 相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得 到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度 洗脱，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。
优选的当归有效组分制备方法，包括下列步骤：将当归药材粉碎后加入乙 酸乙酯和乙醇(1∶0.8～1.2)，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得 提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进 行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(47～53∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之， 然后改换氯仿和甲醇(8～13∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥 后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱 柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为9～11ml/min，柱温为室温， 收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。
最佳的当归有效组分制备方法，包括下列步骤：将当归药材粉碎后加入乙 酸乙酯和乙醇(1∶1)，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液；将提取 液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用 石油醚和乙酸乙酯(50∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲 醇(10∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液 相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱(Zorbax SB-C1 8；21.2mm×250mm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：0 分钟时，流动相为70％的水溶液和30％的乙腈溶液；18分钟时，流动相为60％ 的水溶液和40％的乙腈溶液；30分钟时，流动相为50％的水溶液和50％的乙 腈溶液；32分钟时，流动相为30％的水溶液和70％的乙腈溶液；53分钟时， 流动相为5％的水溶液和95％的乙腈溶液；60分钟时，流动相为5％的水溶液 和95％的乙腈溶液；流速为10ml/min，柱温为室温；样品用100％乙醇溶解， 经制备液相色谱分离，在时间段34.2～44.0min收集溶液，溶液经浓缩干燥后得 到有效组分。
本发明的再一个目的是提供该当归有效组分在制备治疗、预防肿瘤的药物 中的应用。
本发明的当归有效组分可以作为活性成分，加入药剂学上接受的药物赋形 剂或载体，按照药剂学上记载的方法制成制剂。
本发明的当归有效组分还可以作为活性成分之一，还含有其他抗肿瘤药 物，加入药剂学上接受的药物赋形剂或载体，按照药剂学上记载的方法制成制 剂。
所述药物的制剂形式包括液体制剂、固体制剂、胶囊剂、胶丸剂。包括注 射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄 膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸 剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。
本发明的有益效果为：
1.本发明的提取分离工艺中使用了正相硅胶柱，能有效地除去糖、蛋白 质、氨基酸等杂质，提高有效成分的含量，同时采用了制备色谱，能快速准确 的得到有效成分。
2.本发明提供的当归有效组分化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐 明其作用机制，在生产中更易于药物的质量控制。
3.本发明提供的方法首次从当归中得到A、B、C等几个成分的组合物， 并首次将其在多种肿瘤细胞株上进行药效筛选，得到较好的药理活性。
具体实施方式
本发明结合附图和下面实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施 例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。
实施例一当归有效组分的制备
将200g当归药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液，将提 取液浓缩成浸膏10.2g，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离， 首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲 醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品3.3g；用制备液相 色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱，流动相为 水和乙腈，梯度洗脱。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间 段34.2～44.0min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分0.25g。
实施例二当归有效组分的制备
将500g当归药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶0.8～1.2)，加热回流0.8～1.2 小时，提取1～3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏21.2g，并将其 与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯 (47～53∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(8～13∶1)作为 流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品6.8g；用制备液相色谱继 续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱，流动相为水和乙 腈，梯度洗脱，流速为9～11ml/min，柱温为室温。样品用100％乙醇溶解，经 制备液相色谱分离，在时间段34.2～44.0min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组 分0.60g。
实施例三当归有效组分的制备
取当归药材250g，将其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加热回流1小 时，提取2次，滤液合并得提取液。将提取液浓缩成浸膏得10.5g，将浸膏和 硅胶拌样，用正相硅胶柱进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(50∶1)作为流动 相，得洗脱液I，然后改换氯仿和甲醇(10∶1)作为流动相，得洗脱液II，浓缩干 燥后得3.5g样品。用制备液相色谱继续分离得到的样品。制备色谱的分离条件： 色谱柱为Agient制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)，流动相为水(A)和乙 腈(B)，梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相为70％的水溶液和30％的乙腈 溶液；18分钟时，流动相为60％的水溶液和40％的乙腈溶液；30分钟时，流 动相为50％的水溶液和50％的乙腈溶液；32分钟时，流动相为30％的水溶液 和70％的乙腈溶液；53分钟时，流动相为5％的水溶液和95％的乙腈溶液；60 分钟时，流动相为5％的水溶液和95％的乙腈溶液；流速为10ml/min，柱温为 室温。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段34.2～44.0min 收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分0.28g。
实施例四当归有效组分HPLC-ELSD分析
色谱条件 色谱柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；采用 梯度洗脱，流动相A相为0.2％冰醋酸水溶液，流动相B相为含0.2％冰醋酸的 乙腈溶液；梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相A为90％的0.2％冰醋酸水 溶液、流动相B为10％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；10分钟时，流动相A为50％ 的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为50％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；30分钟时， 流动相A为5％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为95％的0.2％冰醋酸的乙腈 溶液；35分钟时，流动相A为5％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为95％的 0.2％冰醋酸的乙腈。溶液流速0.5mL·min-1；检测波长全波长；柱温30℃。
FLSD参数 氮气流速：2.0L/min；漂移管温度105℃。
供试品溶液的制备 称取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀释至刻度， 摇匀，即得。
测定方法 精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，依色谱分析条件测定， 即得。
本发明中，A的结构式为：
本发明中，B的结构式为：
本发明中，C的结构式为：
实施例五当归有效组分制剂
取实施例三的当归有效组分0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热 熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6～8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸 400粒。
实施例六当归有效组分制剂
取实施例三的当归有效组分0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水 1ml，上述组分混合均匀后，冷冻干燥，分装500支，即得。
实施例七当归有效组分制剂
取降香油1.5g，加入到13ml饱和的羟丙基β-环糊精中，搅拌溶解，滤过， 滤叶低温干燥，的降香油和羟丙基β-环糊精的包合物粉末。除上述降香油合 羟丙基β-环糊精的包合物粉末外，再取实施例三的当归提取物0.5g、甘露醇 5.5g、依地酸钙钠0.9g和蒸馏水2ml，上述组分混匀后，冷冻干燥，分装300 支，即得。
实施例八当归有效组分的药理实验
药理模型：HL 60肿瘤细胞
细胞培养与种板 细胞培养：使用RPMI 1640(Gibco)[添加3.7g/L碳酸 氢钠]90％，胎牛血清(四季青)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％混合培养HL 60细胞，密度需低于106个/mL。计算需要细胞总量NT＝ρcell·mL-1×VT(ρ＝2×104个/mL)，其中VT＝0.1mL×孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞， 加入离心管中。取10μL，加10μL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数 NL，则离心管中的细胞数N为：NL/4×104×2×V个，其中V为离心前离心管中 的溶液体积。离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液V1 mL， 吹打，使细胞混匀，吸取V2 mL加入到细胞槽中，使V2＝NT/N×V1。在细胞槽 中再加入VT-V2mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100μL， 孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100μL PBS， 以减少培养液的蒸发。
给药方案 当归有效组分用DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。96孔板换 液，每孔加入新鲜培养液150μL。在新的96孔板中加入220μL/孔的培养液， 将吸取0.88μL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞 的孔每孔加入50μL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50ng/mL。孵育48h。 每个浓度设4个平行复孔，每板设空白组(blank，只加培养液，不含细胞)， 及阴性对照组(negative，细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200L 的培养液，将吸取0.88μLDMSO加入混匀)。SRB染色：细胞培养结束后，取 出培养板，每孔加入40％(质量/体积)的三氯乙酸(TCA)100μL固定细胞， 室温放置5min，4℃冰箱中放置1h。培养板各孔用去离子水洗涤5遍，以去 除TCA。在空气中干燥后，每孔加0.4％的SRB100μL(1％色谱纯乙酸溶解)， 室温下放置20min，弃去各孔内液体后用1％乙酸洗涤5遍，去除未结合的染 料，空气中干燥后用10mmol/L Tris150μL/孔溶解，振荡5min，使用酶标仪(EL× 800)测定，所用波长为490nm。
抑制率的计算 抑制率按如下公式计算：
药效结果见表1。根据HL 60肿瘤细胞抑制率结果，当归有效组分对抑制 HL 60肿瘤细胞增殖有非常显著效果。
表1
当归组分 阴性 空白 阳性 平均细胞存活数 0.105 0.383 0.059 0.104 抑制率(％) 85.957 0 100 86.188 RSD(％) 6.560 4.359 4.689 6.165
2.2药理模型：K562肿瘤细胞
细胞培养与种板 细胞培养：使用RPMI 1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氢 钠]90％，小牛血清(赛乐)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％混合培养K 562 细胞。计算需要细胞总量NT＝ρcell·mL-1×VT(ρ＝8×103个/mL)，其中VT＝0.1 mL×孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10μL， 加10μL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N 为：NL/4×104×2×V个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min， 10min)，吸去上清液，加入培养液V1 mL，吹打，使细胞混匀，吸取V2 mL 加入到细胞槽中，使V2＝NT/N×V1。在细胞槽中再加入VT-V2 mL的培养液， 用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100μL，孵育24h。种板后选取4孔加 入培养液作为空白对照，剩余孔加入100μL PBS，以减少培养液的蒸发。
给药方案 当归有效组分加入相应体积的DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。 震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。可储存-20℃。96孔板换液，每 孔加入新鲜培养液150μL。在新的96孔板中加入220μL/孔的培养液，将吸取 0.88μL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔 加入50μL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50μg/mL。孵育48h。每个浓 度设4(2)个平行复孔，每板设阴性对照组(细胞中加入空白溶液，空白溶液 配法——加入200μL的培养液，将吸取0.88μL DMSO加入混匀)，阳性对照组 (阿霉素终浓度4μg/mL)。SRB染色：细胞培养结束后，取出培养板，每孔加 入40％(质量/体积)的三氯乙酸(TCA)70μL固定细胞，4℃冰箱中放置1h。 培养板各孔用去离子水洗涤5遍，以去除TCA。在空气中干燥后，每孔加0.4％ 的SRB100μL(1％色谱纯乙酸溶解)，室温下放置20min，弃去各孔内液体后 用1％乙酸洗涤5遍，去除未结合的染料，空气中干燥后用10mmol/L Tris150μL/孔溶解，振荡5min，使用酶标仪(EL×800)测定，所用波长为490nm。
抑制率的计算 抑制率按如下公式计算：
药效结果见表2。根据K562肿瘤细胞抑制率结果，当归有效组分对抑制 K562肿瘤细胞增殖有非常显著效果。
表2
当归组分 阴性 空白 阳性 平均细胞存活数 0.142 0.733 0.122 0.131 抑制率(％) 96.60 0 100 98.47 RSD(％) 3.450 4.906 8.108 3.942
2.3药理模型：MCF-7肿瘤细胞
细胞培养与种板 细胞培养：使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸 氢钠]90％，小牛血清(赛乐)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％混合培养MCF-7 细胞。计算需要细胞总量NT＝ρcell·mL-1×VT(ρ＝2×103个/mL)，其中VT＝0.1 mL×孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10μL， 加10μL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N 为：NL/4×104×2×V个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min， 10min)，吸去上清液，加入培养液V1 mL，吹打，使细胞混匀，吸取V2 mL 加入到细胞槽中，使V2＝NT/N×V1。在细胞槽中再加入VT-V2 mL的培养液， 用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100μL，孵育24h。种板后选取4孔加 入培养液作为空白对照，剩余孔加入100μL PBS，以减少培养液的蒸发。
给药方案 当归有效组分根据所称量的药品的重量，加入相应体积的DMSO 溶解，浓度为约50mg/mL。震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。可 储存-20℃。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150μL。在新的96孔板中加入 220μL/孔的培养液，将吸取0.88μL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释 好的药物向种有细胞的孔每孔加入50μL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为 50μg/mL。孵育48h。每个浓度设4(2)个平行复孔，每板设阴性对照组(细 胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200μL的培养液，将吸取0.88μL DMSO加入混匀)，阳性对照组(阿霉素终浓度4μg/mL)。MTT比色法测定： 取出培养板，去除每孔上清，加入培养液-MTT混合溶液(培养液∶MTT溶 液＝10∶1)100μL，孵育4h。吸弃培养液，每孔加入1 50μL的DMSO，振荡 10min，550nm酶标仪(El×800)测定。
抑制率的计算 抑制率按如下公式计算：
药效结果见表3。根据MCF-7肿瘤细胞抑制率结果，当归有效组分对抑制 MCF-7肿瘤细胞增殖有非常显著效果。
表3
当归组分 阴性 空白 阳性 平均细胞存活数 0.109 0.293 0.103 0.125 抑制率(％) 97.105 0 100 88.421 RSD(％) 7.119 8.755 4.327 6.299
2.4药理模型：KB肿瘤细胞
细胞培养与种板 细胞培养：使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸 氢钠]90％，小牛血清(赛乐)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％混合培养KB 细胞。计算需要细胞总量NT＝ρcell·mL-1×VT(ρ＝2×103个/mL)，其中VT＝0.1 mL×孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10μL， 加10μL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N 为：NL/4×104×2×V个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min， 10min)，吸去上清液，加入培养液V1 mL，吹打，使细胞混匀，吸取V2 mL 加入到细胞槽中，使V2＝NT/N×V1。在细胞槽中再加入VT-V2 mL的培养液， 用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100μL，孵育24h。种板后选取4孔加 入培养液作为空白对照，剩余孔加入100μLPBS，以减少培养液的蒸发。
给药方案 当归有效组分根据所称量的药品的重量，加入相应体积的DMSO 溶解，浓度为约50mg/mL。震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。可 储存-20℃。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150μL。在新的96孔板中加入 220μL/孔的培养液，将吸取0.88μL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释 好的药物向种有细胞的孔每孔加入50μL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为 50μg/mL。孵育48h。每个浓度设4(2)个平行复孔，每板设阴性对照组(细 胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200μL的培养液，将吸取 0.88μLDMSO加入混匀)，阳性对照组(阿霉素终浓度4μg/mL)。MTT比色法 测定：取出培养板，去除每孔上清，加入培养液-MTT混合溶液(培养液∶ MTT溶液＝10∶1)100μL，孵育4h。吸弃培养液，每孔加入150μL的DMSO， 振荡10min，550nm酶标仪(El×800)测定。
抑制率的计算 抑制率按如下公式计算：
药效结果见表4。根据KB肿瘤细胞抑制率结果，当归有效组分对抑制KB 肿瘤细胞增殖有非常显著效果。
表4
当归组分 阴性 空白 阳性 平均细胞存活数 0.061 0.489 0.058 0.063 抑制率(％) 99.362 0 100 98.956 RSD(％) 5.916 2.219 2.160 2.066
2.5药理模型：Hep G2肿瘤细胞
细胞培养与种板 细胞培养：使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L 碳酸氢钠]90％，胎牛血清(四季青)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％混合培 养Hep G2细胞。计算需要细胞总量NT＝ρcell·mL-1×VT(ρ＝2×103个/mL)，其 中VT＝0.1mL×孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管 中。取10μL，加10μL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心 管中的细胞数N为：NL/4×104×2×V个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。 离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液V1 mL，吹打，使细胞 混匀，吸取V2 mL加入到细胞槽中，使V2＝NT/N×V1。在细胞槽中再加入VT -V2 mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100μL，孵育24h。 种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100uL PBS，以减少培 养液的蒸发。
给药方案 当归有效组分根据所称量的药品的重量，根据所称量的药品的 重量，加入相应体积的DMSO溶解，浓度为约50 mg/mL。震荡溶解，若有大 量液滴粘壁，可适当离心。可储存-20℃。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液 150μL。在新的96孔板中加入220μL/孔的培养液，将吸取0.88μL药液加入混 匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50μL，此时 药物稀释1000倍，即终浓度为50μg/mL。孵育48h。每个浓度设4(2)个平 行复孔，每板设阴性对照组(细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入 200μL的培养液，将吸取0.88μL DMSO加入混匀)，阳性对照组(阿霉素终浓 度4μg/mL)。MTT比色法测定：取出培养板，去除每孔上清，加入培养液- MTT混合溶液(培养液∶MTT溶液＝10∶1)100μL，孵育4h。吸弃培养液， 每孔加入150μL的DMSO，振荡10min，550nm酶标仪(El×800)测定。
抑制率的计算 抑制率按如下公式计算：
药效结果见表5。根据Hep G2肿瘤细胞抑制率结果，当归有效组分对抑 制Hep G2肿瘤细胞增殖有非常显著效果。
表5
当归组分 阴性 空白 阳性 平均细胞存活数 0.177 0.662 0.173 0.208 抑制率(％) 99.130 0 100 92.940 RSD(％) 6.455 9.711 3.974 2.768