本发明基于2005年9月1日提交的印度专利申请第2335DEL2005号(2006 年8月22日提交的PCT申请第PCT/IB2006/002270号)的分案申请。
发明领域
本发明涉及一种从九里香(Murrya koenigii)的叶子或任何其它植株部分获 取的草药提取物，该提取物适用于治疗对象的前列腺癌。
而且，本发明涉及治疗对象的前列腺癌的方法。
本发明还涉及制备药物组合物的方法，该药物组合物包含适用于治疗前列 腺癌的、从九里香的叶子或任何其它植株部分获取的提取物；所述方法包括以 1∶1的比例与水匀浆化九里香的干燥叶子或任何其它植株部分，然后冻干。
更具体地说，本发明涉及从九里香分离九里香碱(mahanine)的方法。
本发明还涉及九里香碱化合物以及获自九里香的提取物在治疗前列腺癌 中的新应用。
本发明的背景和现有技术
前列腺癌是困扰65岁以上男子的常见肿瘤之一。前列腺癌致死是由骨和 淋巴结的转移所导致的。前列腺特异性抗原(PSA)血清试验的早期检测、改善 外科干预、放射治疗、雄激素阻断都没有解决患者癌症复发或残余的问题 (Chinni SR，Li Y等，吲哚3原醇(I3C)引发前列腺癌细胞的细胞生长抑制、G1 细胞周期停滞与凋亡(Indole 3 carbinol(I3C)induced cell growth inhibition，G1 cell cycle arrest and Apoptosis in prostate cancer cells)，Oncogene； 20：2927-2936(2001)。一般，现有的雄激素阻断疗法几乎必然导致酪氨酸激酶及 相关配体的异常表达和相互作用。一些近来研究发现，在前列腺癌中，促有丝 分裂和细胞存活的信号传导通路组成型活化。这种细胞畸变影响了细胞增殖与 凋亡的微妙关系。主要机制(即前列腺癌旁路凋亡)是通过上调PI3激酶/Akt存 活通路(Li Y，Sarkar FH，PC-3细胞中染料木甙通过Akt信号传导通路介导抑 制核因子κB活性(Inhibition of nuclear factorκB activation in PC-3 cells by genistin is mediated via Akt signaling pathway)，Clin.Cancer.Res；8： 2369-2377(2002))。信号传导级联中调节细胞存活的Akt相关丝氨酸-苏氨酸是 癌症发病的重要因素(Chinni SR，Sarkar FH，Akt失活是PC-3细胞中吲哚3原 醇诱导的凋亡的关键事件(Akt inactivation is a key event in Inole 3 carbinol induced apoptosis in PC-3 cells，Clin.Cancer Res；8：1228-1236(2002)。它可以使 如Bad、叉头转录因子(forkhead transcription factor)、半胱天冬酶9(caspase-9) 等许多促凋亡蛋白失活(Green DR，Reed JC，线粒体与凋亡(Mitochondria and Apoptosis).Science；281：1309-1312(1998)；Thornberry NA，Lazebnik Y，半胱 天冬酶：内部敌人(Caspases：enemies within).Science；281：1312-1316(1998))； 同时激活Bcl-2(Adams JM，Cory S，Bcl-2蛋白家族：细胞存活的仲裁者(The Bcl-2 protein family：Arbiters of cell survival).Science；281：1322-1326(1998))、 NFγB样抗凋亡蛋白(Datta SR，Brunet A，Greenberg ME，细胞存活：三种Akt 的游戏(Cellular survival：A play in three Akts).Genes and Dev；13： 2905-2927(1999))。在本发明中，我们从九里香(芸香科)植物的叶子中分离、纯 化了活性成分九里香碱。九里香的叶子提取物部分及纯化的化合物九里香碱(咔 唑生物碱)在非雄激素依赖性前列腺癌细胞株PC-3和雄激素依赖性前列腺癌细 胞株LNCaP的两种细胞中都具有诱导凋亡的显著活性。
九里香的叶子提取物及纯化分子九里香碱都能以时间和剂量依赖的方式 诱导非雄激素依赖性和雄激素依赖性的前列腺癌细胞凋亡。200μg/ml剂量的叶 子提取物可导致所有这些细胞株显著凋亡(96小时内75％细胞死亡)。九里香叶 子提取物以时间和剂量依赖的方式诱导非雄激素依赖性和雄激素依赖性前列 腺癌细胞凋亡。测定提取物和纯化的化合物对作为对照细胞的其它细胞(即新生 骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞)的作用。结果提示，提取物和九里香碱特异性 地诱导前列腺癌细胞的凋亡。体内试验中，九里香碱处理对小鼠(表2a、b)没有 产生任何毒性。检测九里香碱对动物的急性毒性；1个月内该数据不变。基于 所述活性，纯化了单一化合物九里香碱。它能诱导半胱天冬酶级联反应并下调 Akt的磷酸化(pAkt)和Bcl-xl的表达，这是癌细胞中最重要的存活信号。
发明目的
本发明的主要目的是提供用于治疗对象的前列腺癌的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供化合物九里香碱在治疗前列腺癌中的新应用。
本发明的又一个目的是提供治疗对象的前列腺癌的方法。
本发明的又一个目的是提供制备所述药物组合物的方法，该药物组合物包 含适用于治疗前列腺癌的、从九里香的叶子或任何其它植株部分获取的提取 物；所述方法包括以1∶1的比例与水匀浆化九里香的干燥叶子或任何其它植株 部分，然后冻干。
本发明的又一个目的是提供从九里香分离九里香碱的方法。
本发明的又一个目的是对于从九里香获取的提取物和化合物九里香碱，测 定细胞死亡、细胞色素C的释放、半胱天冬酶级联的活化、PARP DNA修复酶 的切割，以及Bcl-xl和pAkt的下调。
发明概述
本发明提供了用于治疗对象的前列腺癌的药物组合物，所述组合物包含治 疗有效量的从九里香的任何植株部分获取的提取物；或治疗有效量的化合物九 里香碱、或其衍生物、或类似物、或药学上可接受的盐；以及一种或多种药学 上可接受的载体。本发明还涉及化合物九里香碱在治疗前列腺癌中的新应用。 而且，本发明还涉及从九里香的叶子或任何其它植株部分制备提取物和九里香 碱分子的方法，所述提取物和九里香碱分子能有效杀死雄激素依赖性和非雄激 素依赖性的前列腺癌细胞。
附图简要说明
图1示出了九里香碱的结构。
图2示出了PC-3和LNCaP细胞株对九里香碱的剂量反应曲线。九里香碱 以剂量和时间依赖的方式杀死非雄激素依赖性细胞株PC-3和雄激素依赖性细 胞株LNCP。两种细胞株中，所用剂量为1、2、3μg/ml，而对照未处理细胞为 0。
图3示出了用九里香碱处理的细胞存活率评价。为了评估九里香碱的特异 性，检测了9μg/ml的九里香碱对诸如肝细胞、心肌细胞和骨骼肌细胞等其它 原代培养细胞的作用。九里香碱不会杀死其它细胞，因而提示其对前列腺癌细 胞的特异性。
图4示出了九里香碱抑制Akt的磷酸化。九里香碱以剂量和时间依赖的方 式抑制Akt的磷酸化。九里香碱并不影响Akt蛋白的表达水平，但处理24小 时后抑制了其丝氨酸473的磷酸化，36小时时完全抑制其活化。
图5示出了九里香碱抑制Bcl-xl的表达。九里香碱诱导PC-3细胞的凋亡 通过Bcl-xl发挥作用。Bcl-xl是一种抗凋亡线粒体膜蛋白，能阻止细胞色素c 的释放。处理36小时后，Bcl-xl显著下调，从而诱导凋亡。
图6(a)示出了九里香碱诱导半胱天冬酶-9的活化。用相同剂量的九里香碱 (3μg/ml)处理，在相同的时间点测定半胱天冬酶9的活化。早在处理6小时后 即可检测到切割的半胱天冬酶9，在12小时和24小时时稳定增加，36小时时 下降。
图6(b)示出了九里香碱诱导半胱天冬酶-3的活化。半胱天冬酶3的活化在 处理48小时时显著增加，60小时时检测到活性峰值。
图7示出了九里香碱导致的PARP切割。聚ADP核糖基聚合酶(PARP)是 一种DNA修复酶，负责检测和修复缺口。它是半胱天冬酶3的靶蛋白之一。 PC-3细胞中，由于九里香碱的作用，活化的半胱天冬酶3将PARP切割形成 89kDa的片段。处理36小时切割活化的PARP量达到最大。
发明详述
因此，本发明提供了可用于治疗对象的前列腺癌的药物组合物，所述组合 物包括治疗有效量的从九里香的任何植株部分获取的提取物；或治疗有效量的 化合物九里香碱、或其衍生物、或类似物、或其药学上可接受的盐；以及任选 地一种或多种药学上可接受的载体。
在本发明的一个实施方式中，所述组合物包含治疗有效量的从九里香任何 植株部分获取的提取物，以及任选地一种或多种药学上可接受的载体。
在本发明的另一个实施方式中，所述组合物药剂是以至少10-15毫克/公斤 体重的单位剂量给药的。
在本发明的又一个实施方式中，所述组合物还包含治疗有效量的化合物九 里香碱、或其衍生物、或类似物、或其药学上可接受的盐，以及任选地一种或 多种药学上可接受的载体。
在本发明的又一个实施方式中，所用九里香碱是从九里香的提取物获得的 或是合成制备的。
在本发明的又一个实施方式中，所述组合物药剂是以至少0.1-5毫克/公斤 体重的单位剂量给药的。
在本发明的又一个实施方式中，所述组合物药剂优选是以水溶性剂型给药 的。
在本发明的又一个实施方式中，选择所述载体，使其不会干扰九里香提取 物部分的活性。
在本发明的又一个实施方式中，所述载体选自：蛋白质、碳水化合物、糖、 滑石粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙和淀粉-明胶糊剂以及药学上可接受的载体、 赋形剂、稀释剂或溶剂。
在本发明的又一个实施方式中，给药途径选自：口服、静脉内、肌内和皮 下途径。
在本发明的又一个实施方式中，所述口服给药的剂型选自：胶囊、糖浆剂、 浓缩剂、粉末剂和颗粒剂。
而且，本发明提供了治疗对象的前列腺癌的方法，所述方法包括给予对象 药物组合物的步骤，所述组合物包含治疗有效量的从九里香任何植株部分获取 的提取物，或治疗有效量的化合物九里香碱、或其衍生物、或类似物、或其药 学上可接受的盐，以及任选地一种或多种药学上可接受的载体。
在本发明的一个实施方式中，所述方法包括给予对象药物组合物的步骤， 该组合物包含治疗有效量的从九里香任何植株部分获取的提取物、以及任选地 一种或多种药学上可接受的载体。
在本发明的另一个实施方式中，上述组合物药剂是以至少10-15毫克/公斤 体重的单位剂量给药的。
并且，在本发明的一个实施方式中，所述方法包括给予对象药物组合物的 步骤，该组合物包含治疗有效量的化合物九里香碱、或其衍生物、或类似物、 或其药学上可接受的盐，以及任选地一种或多种药学上可接受的载体的。
在本发明的又一个实施方式中，所用九里香碱是从九里香提取物获得的或 是合成制备的。
在本发明的又一个实施方式中，上述制剂药剂是以至少0.1-5.0毫克/公斤 体重的单位剂量给药的。
在本发明的又一个实施方式中，所述组合物药剂优选是以水溶性的剂型给 药的。
在本发明的又一个实施方式中，所述载体选自：蛋白质、碳水化合物、糖、 滑石粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙和淀粉-明胶糊剂以及药学上可接受的载体、 赋形剂、稀释剂或溶剂。
在本发明的又一个实施方式中，给药途径选自：口服、静脉内、肌内和皮 下途径。
在本发明的又一个实施方式中，所述口服给药的剂型选自：胶囊、糖浆剂、 浓缩剂、粉末剂和颗粒剂。
在本发明的又一个实施方式中，所述组合物以剂量和时间依赖的方式杀死 非雄激素依赖性细胞株PC 3和雄激素依赖性细胞株LNCaP。
在本发明的又一个实施方式中，所述组合物以剂量和时间依赖的方式抑制 Akt的磷酸化。
在本发明的又一个实施方式中，所述组合物不能杀死诸如肝细胞、心肌细 胞和骨骼肌细胞等其它细胞。
本发明还提供了制备药物组合物的方法，该药物组合物包含适用于治疗前 列腺癌的、从九里香的叶子或任何其它植株部分获取的提取物；所述方法包括 以1∶1的比例与水匀浆化九里香的干燥叶子或任何其它植株部分，然后冻干。
在本发明的一个实施方式中，植株部分选自：叶、茎、果实或九里香的任 何其它部分。
在本发明的另一个实施方式中，九里香叶子是从印度西孟加拉不同区域收 集的。
在本发明的又一个实施方式中，所用叶子取自新鲜的和/或遮阳干燥的九里 香叶子。
在本发明的又一个实施方式中，所述提取物的抗癌活性经体内试验证实。
在本发明的又一个实施方式中，所述提取物用于治疗前列腺癌。
并且，本发明还提供了从九里香分离化合物九里香碱的方法，所述方法包 括以下步骤：
a)用甲醇浸提新鲜的九里香叶子；
b)浓缩来自步骤(a)的甲醇提取物，得残留物I；
c)将来自步骤(b)的残留物I悬浮在水中，然后用乙酸乙酯和正丁醇萃取；
d)浓缩来自步骤(c)的乙酸乙酯层，得残留物II；
e)采用石油醚-氯仿(100∶00→00∶100)作为洗脱剂，在硅胶上色谱分离来自步 骤(d)的乙酸乙酯馏分，得到四种馏分；
f)将来自步骤(e)的馏分4在硅胶上色谱纯化，然后在汽油中结晶，得到所 需产物。
在本发明的一个实施方式中，通过与标准样品的物理数据以及红外、核磁 共振和质谱数据进行比较，证实了所述化合物的结构。
在本发明的另一个实施方式中，所述化合物的抗癌活性经体内试验证实。
并且，在本发明的一个实施方式中，化合物九里香碱用于治疗前列腺癌。
本发明通过说明的方式给出下述实施例，它们不应限制本发明的范围。
实施例1-15关于从九里香(芸香科)获取的提取物及其生物活性。
实施例1
九里香(芸香科)来源
九里香(芸香科)的叶子是从印度西孟加拉不同区域收集的。凭证标本存放 在印度化学生物学协会的药物化学部门(Department of MedicinalChemistry， Indian Institute of Chemical Biology，Kolkata，印度)。
实施例2
分离九里香(芸香科)的提取物
在混合器中，将新鲜叶子和九里香的所有其它植株部分(1.2Kg)加入水(1.5 升)进行匀浆，并冻干。在前列腺癌细胞株上检测冻干物质的活性。
实施例3
人前列腺癌细胞株PC-3的培养
人前列腺癌细胞株PC-3(PTEN-ve，非雄激素依赖性)得自美国典型培养物 机构(American Type Culture Collection，马纳萨斯，弗吉尼亚洲，美国)。将细 胞在添加有10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)中培养。细胞在37℃，5％CO2的条件下培养。
大鼠新生心肌细胞的原代培养
采用现有的Yoshihiro Kimura(1994)所述方法并进行改良后，从2天龄新 生大鼠分离心肌细胞。简言之，切除心脏并在预先温热(37℃)的Ads缓冲液 (1.2M NaCl，198mM HEPES，54mM KCl，8.3mM MgSO4，55.4mM葡萄糖， 95mM NaH2PO4)中切碎，在II型胶原酶0.05％和胰酶中消化，连续3次消化， 每次15分钟。收集上清液并将细胞在2000g下离心10分钟。用含10％胎牛血 清和1％抗生素-抗真菌剂的M199培养液重新悬浮细胞，并接种到预先用胶原 包被的T-25培养瓶中。
大鼠新生肝细胞的原代培养
采用现有的William E Russell(1997)所述方法并进行改良后，从2天龄新 生大鼠分离肝细胞。简言之，用150mM NaCl、2.8mM KCl、5.5mM葡萄糖 和25mM HEPES(pH 7.6)构成的不含钙的的溶液经门静脉灌注肝脏10分钟， 然后在含有0.05％IV型胶原酶的DMEM中切碎和消化。将细胞离心(2000g， 10分钟)并分散在添加10％胎牛血清、1％抗生素-抗真菌剂的DMEM中。
新生大鼠骨骼肌的原代培养
采用现有的William E Russell(1997)所述方法并进行改良后，从2天龄新 生大鼠分离骨骼肌。简言之，将比目鱼肌切下、切碎，并在含0.2％II型胶原酶 和0.05％胰酶的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.4、含0.15M NaCl)中消化。将分散 的骨骼肌细胞离心(1000g，10分钟)，洗涤并重新悬浮在含有1％抗生素-抗真菌 剂的磷酸盐缓冲液(PBS)中。细胞在37℃、95％空气/5％CO2下预孵育30分钟。 将漂浮的肌细胞接种到用胶原包被的T-25培养瓶中，加入含10％胎牛血清和 1％抗生素-抗真菌剂的DMEM培养基。
实施例4
采用Cell Titre 96 AQueous单溶液细胞增殖检测(普洛麦格公司(Promega， Corp.)Madison，WI)根据生产商方法，通过MTT试验检测处理指定时间后PC-3 的存活率。简言之，将10,000个细胞三复孔接种到96孔培养板中，在完全培 养液中培养12小时。根据规定，在更换新鲜的完全培养液时加入化合物MK-3， 并孵育不同的持续时间直到96小时。然后每孔加入20μlCell Titre 96 AQoueus 单溶液试剂。将培养板在37℃、5％CO2湿润环境下孵育1-4小时。用96孔酶 标仪读取在490nm处的吸光度。采用630nm参比波长来降低由细胞碎片非特 异吸收导致的背景。
实施例5
电泳与免疫印迹
用完全培养基培养PC-3细胞(1×106个细胞)。采用西格玛化学公司(Sigma Chemical company，圣路易斯，MO，美国)的细胞裂解液分离细胞。1500g下离 心10分钟，收集细胞，并加入十二烷基硫酸钠(SDS)缓冲液(pH 6.8)沸水浴加热 5-7分钟。取含60μg细胞总蛋白的试样，用10％SDS-PAGE分离，并转移至 PVDF膜(密理博公司(MILIPORE)，Bedford，MA，美国)。室温下用封闭缓冲 剂(blocking buffer)封闭膜1小时，并用所需的一抗标记4℃孵育过夜，然后用 碱性磷酸酶偶联的二抗反应，并检测。所述一抗为：半胱天冬酶-9、Bcl-xl、 pAktl/2/3(ser 473)、抗PARP、细胞色素C的抗体(美国SC生物技术有限公司 (Santa-Cruz Biotechnology，Inc.，USA)；识别前半胱天冬酶-3(procaspase-3)(32 kDa)和有活性的、切割后的半胱天冬酶-3(caspase-3)(17kDa)的抗半胱天冬 酶-3抗体(BD生物科学公司(BD Biosciences)，Mountainview，CA)；Akt、切 割后的半胱天冬酶-9的抗体(细胞信号传导技术公司(Cell Signaling technology)，B everly，MA)。
实施例6
为了探究印度药用植物的抗癌活性，我们选择九里香叶子提取物，并观察 到其有效杀死非雄激素依赖性的前列腺癌细胞株PC-3。下面为PC-3细胞株的 数据。
九里香提取物通过诱导凋亡降低了PC-3细胞存活率
相同剂量下(即培养液中的九里香总量为100μg/ml至200μg/ml)，提取物对 新生骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞没有任何毒性作用，提示混合提取物特异 性地诱导前列腺癌细胞的凋亡。
证实体外结果的体内试验
根据WHO的指导方针进行急性毒性试验。
试验对象：小鼠、Balb/C、雄性、雌性、体重约25克
将16只小鼠分成2组。8只小鼠以每公斤体重2克混合提取物的剂量给药。 8只小鼠给予等体积的赋形剂(DMSO)，口服单次给药，处理后15天处死小鼠 并检查血液学参数。
表1：粗品提取物的血液学试验
红细胞 RBC 白细胞 WBC 血红蛋白 Hb(gm/dl) 对照组 1029 92 10.69 处理组 1032 89 10.713
处理小鼠中未显示任何毒性(表1)。
实施例7
从九里香获取的双草药提取物处理抑制了PC-3细胞中的细胞存活通路
在细胞存活通路中，Akt激酶通过抑制凋亡过程而起到重要作用。Akt磷 酸化对其失活存在不良影响的如促凋亡蛋白等下游效应分子，使其不能与 Bcl-xl二聚化，从而抑制凋亡过程。双草药提取物能够以剂量和时间依赖的方 式抑制Akt的磷酸化。在24小时时并不影响Akt蛋白表达水平，但抑制了其 丝氨酸473的磷酸化，在36小时时完全抑制了其活性。在PC-3细胞株中，丝 氨酸473的基础磷酸化水平比较高。在处理的PC-3细胞中，Akt磷酸化的失活 可能是因为细胞存活通路的失活，随后诱导凋亡。
然后研究从九里香获取的九里香碱双草药提取物诱导PC-3细胞凋亡是否 通过Bcl-xl发挥作用。Bcl-xl是线粒体膜蛋白，在存活信号通路中维持线粒体 膜的完整性。处理36小时后，双草药提取物能显著降低Bcl-xl的表达。
这就表明，Bcl-xl表达下调启动的凋亡通路使得线粒体外膜解体，导致细 胞色素c渗出，而启动半胱天冬酶级联反应。处理48小时后检测到半胱天冬酶 3的活化，60小时时其活性达到顶峰。
实施例8
评价联合九里香叶提取物而开发的制剂在治疗前列腺癌中的疗效(由注册 的印度草药医生进行)。每天3个胶囊口服给药(每个胶囊含有330mg)。
患者 治疗前前列腺重量 治疗2个月后的前列腺重量 A B C D E F 39gm 46gm 34gm 42gm 29gm 41gm 21gm 25gm 18gm 27gm 16gm 19gm
服用胶囊2个月后，所有上述患者在白天和晚上的排尿情况顺畅。
实施例9
化合物九里香碱的分离
九里香(芸香科)的叶子是从印度西孟加拉不同区域收集的。凭证标本存放 在印度化学生物学协会的药物化学部门(Department of MedicinalChemistry， Indian Institute of Chemical Biology，Kolkata，印度)。
在混合器中用甲醇浸提新鲜的九里香叶子(3Kg)。甲醇提取物浓缩至干得到 残留物(188g)，将残留物重新悬浮在水中，然后相继用乙酸乙酯和正丁醇萃取。 浓缩乙酸乙酯层得到残留物(70g)。测定乙酸乙酯提取物的生物活性。采用石油 醚-氯仿(100∶00→00∶100)作为洗脱剂，将一部分乙酸乙酯馏分(16g)在硅胶上进 行色谱分离，得到四种馏分1-4。将馏分4(1.5g)在硅胶上再次色谱纯化，最后 在汽油中结晶，得到化合物(0.15g)，m.p.94-95℃，[α]D+31(氯仿)，与九里香 碱的结构相同(图1)。通过与标准样品的物理数据以及红外(IR)、1H核磁共振、 13C核磁共振和质谱数据进行比较证实了所述化合物的身份(Tian-shung Wu，月 桔碱A，B，C和(+)九里香碱，来自九里香属的咔唑类生物碱(Murrayamine A，B，C and(+)mahanine，carbazole alkaloid from Murraya euchrestifolia)， Phytochemistry，30，1048(1991))。测定九里香碱的生物活性。
实施例10
在混合器中将新鲜的九里香叶子和所有其它植株部分(1.2Kg)与氯仿(1.5升) 匀浆化，然后在超声浴中超声波处理3次，每次15分钟，并使其萃取过夜。 用Whatman 1号滤纸过滤分离经氯仿萃取的物质。萃取过程重复三次。40℃减 压下，在闪蒸器中将混合的萃取物蒸发至干。然后高度真空下干燥残留物质。
如实施例9中所述，在硅胶柱上色谱分离氯仿提取物(14g)。得到纯结晶形式的 九里香碱(0.12g)并测定其生物活性。
实施例11
人前列腺癌细胞株PC-3(PTEN-ve，非雄激素依赖性)得自美国典型培养物 机构(American Type Culture Collection，马纳萨斯，弗吉尼亚洲，美国)。将细 胞在添加有10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂的DMEM培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)中培养。细胞在37℃，5％CO2的条件下培养。
大鼠新生心肌细胞的原代培养
采用现有的Yoshihiro Kimura(1994)所述方法并进行改良后，从2天龄新 生大鼠分离心肌细胞。简言之，切除心脏并在预先温热(37℃)的Ads缓冲液 (1.2M NaCl，198mM HEPES，54mM KCl，8.3mM MgSO4，55.4mM葡萄糖， 95mM NaH2PO4)中切碎，在II型胶原酶0.05％和胰酶中消化，连续3次消化， 每次15分钟。收集上清液并将细胞在2000g下离心10分钟。用含10％胎牛血 清和1％抗生素-抗真菌剂的M199培养液重新悬浮细胞，并接种到用胶原包被 的T-25培养瓶中。
大鼠新生肝细胞的原代培养
采用现有的William E Russell(1997)所述方法并进行改良后，从2天龄新 生大鼠分离肝细胞。简言之，用150mM NaCl、2.8mM KCl、5.5mM葡萄糖 和25mM HEPES(pH 7.6)构成的不含钙的的溶液经门静脉灌注肝脏10分钟， 然后在含有0.05％IV型胶原酶的DMEM中切碎和消化。将细胞离心(2000g， 10分钟)并分散在添加10％胎牛血清、1％抗生素-抗真菌剂的DMEM中。
新生大鼠骨骼肌的原代培养
采用现有的William E Russell(1997)所述方法并进行改良后，从2天龄新 生大鼠分离骨骼肌。简言之，将比目鱼肌切下、切碎，并在含0.2％II型胶原酶 和0.05％胰酶的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.4、含0.15M NaCl)中消化。将分散 的骨骼肌细胞离心(1000g，10分钟)，洗涤并重新悬浮在含有1％抗生素-抗真菌 剂的磷酸盐缓冲液(PBS)中。细胞在37℃、95％空气/5％CO2下预孵育30分钟。 将漂浮的肌细胞接种到用胶原包被的T-25培养瓶中，加入含10％胎牛血清和 1％抗生素-抗真菌剂的DMEM培养基。
实施例12
采用Cell Titre 96 AQueous单溶液细胞增殖检测(普洛麦格公司(Promega， Corp.)Madison，WI)根据生产商方法，通过MTT试验检测处理指定时间后PC-3 的存活率。简言之，将10,000个细胞三复孔接种到96孔培养板中，在完全培 养液中培养12小时。根据规定，在更换新鲜的完全培养液时加入化合物MK-3， 并孵育不同的持续时间直到72小时。然后每孔加入20μlCell Titre 96 AQoueus 单溶液试剂。将培养板在37℃、5％CO2湿润环境下孵育1-4小时。用96孔酶 标仪读取在490nm处的吸光度。采用630nm参比波长来降低由细胞碎片非特 异吸收导致的背景。
实施例13
电泳与免疫印迹
PC-3细胞(1×106个细胞)，单独使用完全培养基培养，或加入3μg/ml九里 香碱(MK-3)共培养。采用西格玛化学公司(Sigma Chemical company，圣路易斯， MO，美国)的细胞裂解液分离细胞。1500g下离心10分钟，收集细胞，并加入 十二烷基硫酸钠(SDS)缓冲液(pH 6.8)、沸水浴加热5-7分钟。取含60μg细胞总 蛋白的试样，用10％SDS-PAGE分离，并转移至PVDF膜(密理博公司 (MILIPORE)，Bedford，MA，美国)。室温下用封闭缓冲剂(blocking buffer)封 闭膜1小时，并用所需的一抗标记4℃孵育过夜，然后用碱性磷酸酶偶联的二 抗反应，并检测。所述一抗为：半胱天冬酶-9、Bcl-xl、pAktl/2/3(ser 473)、抗 PARP、细胞色素C的抗体(美国SC生物技术有限公司(Santa-Cruz Biotechnology，Inc.，USA)；识别前半胱天冬酶-3(procaspase-3)(32kDa)和有活 性、切割后的半胱天冬酶-3(caspase-3)(17kDa)的抗半胱天冬酶-3抗体(BD 生物科学公司(BD Biosciences)，Mountainview，CA)；Akt、切割后的半胱天冬 酶-9的抗体(细胞信号传导技术公司(Cell Signaling technology)，Beverly，MA)。
实施例14
免疫荧光
细胞在玻璃盖片上培养。4℃，用含有4％多聚甲醛的PBS将对照和处理细 胞固定2小时。用0.1％Triton X-100的PBS溶液通透细胞，然后与兔源抗-细 胞色素c多克隆抗体(Santa cruz，USA，1∶50稀释)孵育3小时，再与FITC-偶 联的二抗(羊抗兔抗体，Santa Cruz，1∶50)孵育1小时，所有上述步骤中用PBS 严格洗涤。每组中各自加入1μg/ml的DAPI。荧光显微镜(奥林巴斯BX51显微 镜，东京，日本)下观察染色细胞，并用Cool Snap Pro相机拍摄图像。
九里香碱通过诱导凋亡降低了PC-3细胞存活率
从九里香提取物经HPLC纯化得到的九里香碱可诱导PC-3细胞死亡。然 后通过二维核磁共振(2D NMR)和质谱确定化学结构，发现是九里香碱，其 结构已有报道(Tian-shungWu，1991 Phytochemistry)(图1)。
九里香碱以剂量和时间依赖的方式杀死非雄激素依赖性细胞株PC-3和雄 激素依赖性细胞株LNCaP细胞(图2)。
为了评价九里香碱的特异性，测定了对如肝细胞、心肌细胞和骨骼肌细胞 等其它原代培养细胞的作用。图3显示，九里香碱不会杀死其它细胞，因而提 示其对前列腺癌细胞的特异性。
证实体外结果的体内试验
根据WHO的指导方针进行急性毒性试验。
试验对象：小鼠、Balb/C、雄性、雌性、体重约25克
将16只小鼠分成2组。8只小鼠以每公斤体重2克化合物的剂量给药。8 只小鼠给予等体积的赋形剂(DMSO)，口服单次给药，处理后15天处死小鼠并 检查血液学和生物化学参数。
表2(a)：化合物九里香碱的血液学试验
红细胞 RBC 白细胞 WBC 血红蛋白 Hb(gm/dl) 对照组 1029 92 10.69 处理组 1032 89 10.713
评价纯的分子九里香碱的生物化学参数。由于它是纯的分子，所以需要观 察其生物化学指标，因而我们只关注生物化学参数。下面的试验过程与混合提 取物中的相同。
表2(b)：生物化学试验
血清谷草转氨酶 SGOT(单位/ml) 血清谷丙转氨酶 SGPT(单位/ml) 尿素(ml/dl) 肌酸酐(ml/dl) 对照组 147.5 32.0 35.4 3.82 处理组 174.0 30.7 48.6 3.72
而且，九里香碱处理小鼠中未观察到任何毒性(表2(a)、(b))。
实施例15
九里香碱处理的PC-3细胞中细胞存活通路的抑制
在细胞存活通路中，Akt激酶通过抑制凋亡过程而起到重要作用。Akt磷 酸化对其失活存在不良影响的如促凋亡蛋白等下游效应分子。使其不能与 Bcl-xl二聚化，从而抑制凋亡过程。九里香碱能够以剂量和时间依赖的方式抑 制Akt的磷酸化。在24小时时并不影响Akt蛋白表达水平，但抑制了其丝氨 酸473的磷酸化，36小时时完全抑制了其活性(图4)。
在PC-3细胞株中，丝氨酸473的基础磷酸化水平比较高。在九里香碱处 理的PC-3细胞中，Akt磷酸化的失活可能是因为细胞存活通路的失活，随后诱 导凋亡。
然后研究九里香碱诱导PC-3细胞凋亡是否通过Bcl-xl发挥作用。Bcl-xl 是线粒体膜蛋白，在存活信号通路中维持线粒体膜的完整性。处理36小时后， 九里香碱能显著降低Bcl-xl的表达(图5)。
这就表明，Bcl-xl表达下调启动的凋亡通路使得线粒体外膜解体，导致细 胞色素c渗出，而启动半胱天冬酶级联反应。在PC-3细胞中，九里香碱导致 细胞色素c从线粒体渗出。用相同剂量的九里香碱(3μg/ml的培养液)处理，在 相同时间点测定半胱天冬酶9的活化。早在处理6小时后即可检测到切割的半 胱天冬酶9，在12小时和24小时稳定增加，36小时时下降(图6a)。半胱天冬 酶3的活化在48小时时显著增加，60小时时其活性达到顶峰(图6b)。
九里香碱对半胱天冬酶9和半胱天冬酶3的作用表明活化了死亡通路，并 且半胱天冬酶9的活化时间与凋亡通路再下游的半胱天冬酶3的活化时间同 步。
聚ADP核糖基聚合酶(PARP)是一种DNA修复酶，负责检测和修复缺口。 它是半胱天冬酶3的靶蛋白之一。PC-3细胞中，由于九里香碱的作用，活化的 半胱天冬酶3将PARP切割形成89kDa的片段。处理36小时时切割活化的PARP 的量达到最大(图7)。
根据上述结果，可以得出结论，九里香碱能有效诱导雄激素依赖性和非雄 激素依赖性前列腺癌细胞的凋亡。
优点：
本发明的主要优点在于：
1.本发明提供了制备生物活性提取物的简便方法，以及制备生物活性相当 高的九里香碱部分的简单快速且便宜的方法，可用于治疗、缓解和救治前列腺 癌。
2.本发明还提供了一种药物组合物，该组合物与人类食品高度相容并且可 用于治疗、缓解和救治前列腺癌。