技术领域
本发明涉及一种医药工程技术领域的药物及其合成方法，具体是一种叶酸改 性壳聚糖亲核NO供体及其合成方法。
背景技术
一氧化氮NO是内皮诱导松弛因子，在调节血管紧张度、血压、平滑肌繁殖 和血小板聚集等方面有重要的作用。目前，NO在损伤部位处的控制释放已经被 确定是防止再狭窄的最有前途的一种途径。有效治疗心血管疾病患者的举措是使 用抗凝血制剂和抗血小板制剂，这些制剂能够防止更深入缺血事件的发生和减少 由血栓导致相关动脉疾病死亡的概率。含有亲核一氧化氮供体[N(O)NO]-官能团 的化合物是近几年发展起来的一种最重要的NO供体药物，它既可在生理条件下 自发的释放NO分子，经O2取代后又可在靶器官和靶细胞中被特定酶脱离，具有 靶向性的功能，它还具有良好的可调控性，另外它可制备成各种形态，根据需要 应用于不同的医学领域。虽然大量的体外试验已经证明了它可有效的预防成型术 后再狭窄，提高医疗装置的抗血栓性能，减轻肺部高压和血管痉挛然等用途，但 亲核试剂(多胺)的细胞毒性和致癌性副产物亚硝胺的生成是限制其临床应用的 主要难题。
在最近的十年中，国外对基于含有[N(O)NO]-官能团的NO供体控释材料进行 了大量的研究。最初的研究集中于将离子型的亲核NO供体NONOate分散于各种 疏水性聚合物中，通过NO的释放增强这些材料的血液相容性。但亲水性的NO 供体会从聚合物中渗出，在血液中形成致癌性的N-亚硝胺物质。将这类材料应 用于临床，还必须考虑作为聚合物基体材料的生物相容性和生物可降解性、亲核 试剂的细胞毒性和生物相容性。因此要选用无毒的有良好生物相容性的NO载体， 其中的解决办法之一就是采用对身体无害的具有仲胺基团的亲核载体。
叶酸(FA)是一种B族维生素，可特异性地与细胞表面的叶酸受体(FR)作用 形成复合物，通过受体介导内吞被细胞吸收且顺利到达细胞核。FR可被许多肿 瘤细胞超量表达(如卵巢癌、子宫内膜癌、直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、神经 内分泌癌和脑转移癌等)，叶酸已被当作抗癌药物的靶向分子而受到广泛重视。
壳聚糖是唯一天然存在且是阳离子的可生物降解的多糖，具有良好的生物相 容性和生物可降解性，有抗菌消炎、促进伤口愈合、抗酸抗溃疡及直接抑制肿瘤 细胞的作用，与抗癌药合用可增强抗癌效果。近年来壳聚糖作为一种新型药用辅 料在缓释给药系统中得到了越来越广泛的应用，且壳聚糖来源丰富，价格低廉。 另外，由于壳聚糖具有良好的生物相容性，生物可降解性，大分子正电性，无毒 性以及生物粘附性，使得壳聚糖可以作为理想的药物输送材料。
经对现有技术的文献检索发现，Smith等人在美国专利中(USP6261594， Chitosan-based nitric oxide donor compositions，2001；USP6451337， Chitosan-based nitric oxide donor compositions，2002)提出了将改性壳聚 糖作为亲核NO载体，合成出系列壳聚糖-NO加成物。壳聚糖的具体的改性分为 两类：(1)亲水基团改性：N-羧丁基壳聚糖，N-羧乙基壳聚糖，N-羧甲基壳聚糖。 (2)疏水性基团改性：N-丙基壳聚糖，N-羧乙基壳聚糖甲酯。其不足在于NO 的负载程度较低，原因有两点：(1)NO的释放不具有针对性，使得NO的利用度 极地低。(2)这些壳聚糖改性产物同NO的反应后生成的亲核NO供体的释放量和 释放半衰期较低。因此限制了其在医学上的用途。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种叶酸改性壳聚糖亲核NO 供体及其合成方法。本发明通过对壳聚糖进行羧基化改性，产生NH亲核位点， 同NO反应后，得到一系列以壳聚糖叶酸改性产物为载体的含有[N(O)NO]-官能 团的新型的NO供体，解决了目前此类亲核NO供体应用于临床时存在的问题(利 用率较低)。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明所涉及的叶酸改性壳聚糖亲核NO供体，用壳聚糖作为基体材料，采 用羧化改性产生仲胺亲核位点(NH基团)，与NO反应产生[N(O)NO]-官能团，亲 核NO供体的结构式如下：
其中N[N(O)NO]-基团为NH基团同NO反应形成。而NH基团来自于叶酸改性 的壳聚糖和叶酸分子本身；叶酸分子本身就具有NH集团，而且叶酸分子上的羧 基基团-COOH跟壳聚糖上的NH2基团发生羧基反应后就可以直接生成NH基团。
本发明所涉及的叶酸改性壳聚糖亲核NO供体合成方法，具体为：对壳聚糖 上的NH2基团进行羧化改性，使其产生能够与NO反应的亲核NH基团。羧化改性 壳聚糖分子同NO气体分子在甲醇钠的甲醇溶液中进行反应，要求Na+/NH＝2/1， 压力为5-10atm，室温反应3-7天，产生[N(O)NO]-基团。将合成产物用甲醇乙醚 分别清洗多次，室温真空干燥，储存于-20℃的干燥器内。
所述的对壳聚糖上的NH2基团进行羧化改性，是采用壳聚糖上的NH2基团同 叶酸上的羧基基团发生羧基化反应，生成酰胺键，从而产生了NH基团。具体为：
称取壳聚糖(分子量40-188万)样品，加醋酸搅拌至溶解完全，将溶液pH 值调到4.7，用一次性针头式过滤器将溶液过滤后加入圆底烧瓶中。称取叶酸溶 于二甲亚砜(DMSO)中，用磁力搅拌至完全溶解后，向叶酸液液中加入二环己基 碳二亚胺(EDC)，混合至溶解。将加有EDC的叶酸溶液加入上述壳聚糖溶液中， 于37℃下水浴搅拌反应7天。调节pH值到9.0使反应终止，将反应产物用pH 值为7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)透析3天，然后用超纯水透析4天，除去未 反应完全的反应物。将透析产物于冷冻干燥机中冻干，产物于干燥器内保存。
本发明NO供体生成反应式如下：
本发明得到的叶酸改性壳聚糖亲核NO供体为黄色细粉末，储存于-20℃的干 燥器内。在室温下能够稳定存在，在酸性或中性水溶液中能够自发分解释放出 NO和叶酸改性壳聚糖分子。
本发明制备的叶酸改性壳聚糖亲核NO供体，具有稳定的化学性质和较长的 释放半衰期，可广泛的应用于治疗心血管系统疾病，肺部高压，促进伤口愈合， 有效的预防成型术后再狭窄，提高医疗装置的抗血栓性能。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限 于下述的实施例。
实施例1：叶酸(FA)改性40万分子量壳聚糖(CS)/NO的合成(摩尔比： FA/CS＝2/1)
准确称取1.61g的壳聚糖(分子量40万)样品，加100ml 1％醋酸搅拌至溶 解完全，将溶液pH值调到4.7，用一次性针头式过滤器将溶液过滤后加入圆底 烧瓶中。称取2.17g叶酸溶于30ml二甲亚砜中，用磁力搅拌至完全溶解后，向 叶酸溶液中加入二环己基碳二亚胺0.5g，混合至溶解。将加有二环己基碳二亚 胺的叶酸溶液加入上述壳聚糖溶液中，于37℃下水浴搅拌反应7天。调节pH 值到9.0使反应终止，将反应产物用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液透析3天， 然后用超纯水透析4天，除去未反应完全的反应物。将透析产物于冷冻干燥机中 冻干，最后烘干得到淡黄色细粉末2.04g，经计算得接枝率为10％，产物于干燥 器内保存。
将上述反应产物2.04g(0.01mol)加入到含有2.15g(0.02mol)甲醇钠的 100ml无水甲醇溶液中，在高压釜中与NO反应，维持压力5atm，反应3天，反 应结束后分别用无水甲醇和乙醚洗涤，室温真空干燥，得到黄色粉末约2.12g。
[N(O)NO]-官能团最直观和有效地表征方法是在230-280处的紫外特征吸收， 合成产物CS-FA/NO中[N(O)NO]-官能团的特征吸收在262nm，测定了在磷酸盐缓 冲液中其吸光率随时间的变化，通过释放曲线的函数拟合求出其半衰期是20h。
实施例2：叶酸(FA)改性124万分子量壳聚糖(CS)/NO的合成(摩尔比： FA/CS＝1/1)
准确称取1.61g的壳聚糖(分子量124万)样品，加100ml 1％醋酸搅拌至溶 解完全，将溶液pH值调到4.7，用一次性针头式过滤器将溶液过滤后加入圆底 烧瓶中。称取4.34g叶酸溶于30ml二甲亚砜中，用磁力搅拌至完全溶解后，向 叶酸溶液中加入二环己基碳二亚胺0.5g，混合至溶解。将加有二环己基碳二亚 胺的叶酸溶液加入上述壳聚糖溶液中，于37℃下水浴搅拌反应7天。调节pH 值到9.0使反应终止，将反应产物用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液透析3天， 然后用超纯水透析4天，除去未反应完全的反应物。将透析产物于冷冻干燥机中 冻干，最后烘干得到黄色细粉末2.48g，算得接枝率为20％。产物于干燥器内保 存。
将上述反应产物2.48g(0.01mol)加入到含有2.15g(0.02mol)甲醇钠的 100ml无水甲醇溶液中，在高压釜中与NO反应，维持压力7atm，反应5天，反 应结束后分别用无水甲醇和乙醚洗涤，室温真空干燥，得到黄褐色粉末约2.60g。
[N(O)NO]-官能团最直观和有效地表征方法是在230-280处的紫外特征吸收， 合成产物CS-FA/NO中[N(O)NO]-官能团的特征吸收在262nm，测定了在磷酸盐缓 冲液中其吸光率随时间的变化，通过释放曲线的函数拟合求出其半衰期是28h。
实施例3：叶酸(FA)改性188万分子量壳聚糖(CS)/NO的合成(摩尔比： FA/CS＝1/2)
准确称取1.61g的壳聚糖(分子量188万)样品，加100ml醋酸搅拌至溶解 完全，将溶液pH值调到4.7，用一次性针头式过滤器将溶液过滤后加入圆底烧 瓶中。称取8.68g叶酸溶于30ml二甲亚砜中，用磁力搅拌至完全溶解后，向叶 酸溶液中加入二环己基碳二亚胺0.5g，混合至溶解。将加有二环己基碳二亚胺 的叶酸溶液加入上述壳聚糖溶液中，于37℃下水浴搅拌反应7天。调节pH值 到9.0使反应终止，将反应产物用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液透析3天，然 后用超纯水透析4天，除去未反应完全的反应物。将透析产物于冷冻干燥机中冻 干，最后烘干得到淡黄色细粉末2.94g，算得接枝率为31％。产物于干燥器内保 存。
将上述反应产物2.91g(0.01mol)加入到含有2.15g(0.02mol)甲醇钠的 100ml无水甲醇溶液中，在高压釜中与NO反应，维持压力10atm，反应7天，反 应结束后分别用无水甲醇和乙醚洗涤，室温真空干燥，得到黄褐色粉末约3.16g。
[N(O)NO]-官能团最直观和有效地表征方法是在230-280处的紫外特征吸收， 合成产物CS-FA/NO中[N(O)NO]-官能团的特征吸收在262nm，测定了在磷酸盐缓 冲液中其吸光率随时间的变化，通过释放曲线的函数拟合求出其半衰期是35h。