一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜及其制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810004105.2 (22)申请日 2018.01.03 (71)申请人 华南理工大学 地址 510640 广东省广州市天河区五山路 381号 (72)发明人 吴虹 李晨 冯坤 韦昀姗 宗敏华 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 罗啸秋 (51)Int.Cl. A61K 9/70(2006.01) A61K 38/23(2006.01) A61K 9/127(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61P 19。

2、/10(2006.01) A61P 19/08(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 3/14(2006.01) D04H 1/4382(2012.01) D04H 1/4309(2012.01) D01D 5/00(2006.01) (54)发明名称 一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜及其制 备方法和应用 (57)摘要 本发明属于药物缓释材料领域， 公开了一种 含降钙素脂质体的纳米纤维膜及其制备方法和 应用。 将大豆卵磷脂、 胆固醇和有机溶剂通过旋 转蒸发得到类脂薄膜， 然后加入降钙素磷酸盐缓 冲溶液制备载降钙素纳米脂质体， 再加入到果胶 溶液中， 得到载降钙素果胶。

3、包覆脂质体； 将所得 载降钙素果胶包覆脂质体加入到聚乙烯醇和海 藻酸钠的混合溶液中， 通过静电纺丝制备成膜， 得到所述含降钙素脂质体的纳米纤维膜。 本发明 通过添加载降钙素脂质体和果胶包覆， 可以提高 降钙素的生物利用度和稳定性。 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 108096225 A 2018.06.01 CN 108096225 A 1.一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜的制备方法， 其特征在于包括如下制备步骤： (1)将大豆卵磷脂和胆固醇加入到有机溶剂中， 置于旋转蒸发器中旋转蒸发直至完全 除去有机溶剂， 在器壁上形成均匀类脂薄膜， 然后加入降钙素磷酸盐缓冲溶液使类脂薄膜 混合分。

4、散均匀， 得到混悬液， 将所得混悬液依次经水浴孵育、 超声处理和微孔膜过滤， 得到 载降钙素纳米脂质体， 再将所得载降钙素纳米脂质体加入到果胶溶液中， 搅拌混合均匀， 得 到载降钙素果胶包覆脂质体； (2)将聚乙烯醇水溶液与海藻酸钠水溶液搅拌混合均匀， 然后加入步骤(1)所得载降钙 素果胶包覆脂质体， 搅拌混合均匀， 得到静电纺丝溶液； 将所得静电纺丝溶液通过静电纺丝 制备成膜， 得到所述含降钙素脂质体的纳米纤维膜。 2.根据权利要求1所述的一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜的制备方法， 其特征在于： 步骤(1)中所述的有机溶剂是指体积比为8:1的乙醚:甲醇的混合溶剂； 所述降钙素是指鲑 鱼降钙素。

5、。 3.根据权利要求1所述的一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜的制备方法， 其特征在于： 步骤(1)中所述大豆卵磷脂与胆固醇加入量的质量比为2:17:1， 所述类酯薄膜与加入的 降钙素磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为20:145:1。 4.根据权利要求1所述的一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜的制备方法， 其特征在于： 步骤(1)中所述水浴孵育是指置于10水浴孵育1h， 所述超声处理的时间为3min， 所述微孔 膜过滤是指采用0.22 m孔径的微孔膜过滤。 5.根据权利要求1所述的一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜的制备方法， 其特征在于： 步骤(1)中所述果胶溶液的浓度为16g/L； 所述载降钙素纳米脂质体。

6、与果胶溶液混合的体 积比为1:1。 6.根据权利要求1所述的一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜的制备方法， 其特征在于： 步骤(2)中所述聚乙烯醇的平均分子量为180000200000， 所述聚乙烯醇水溶液的质量分 数为10； 所述海藻酸钠水溶液的质量分数为13。 7.根据权利要求1所述的一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜的制备方法， 其特征在于： 步骤(2)中所述静电纺丝溶液中载降钙素果胶包覆脂质体的质量分数为3050。 8.根据权利要求1所述的一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜的制备方法， 其特征在于 步骤(2)中所述静电纺丝的条件为： 针头直径为0.60.8mm， 溶液流速为0.11.0mL/h， 。

7、针 头到接收板的距离为1025cm， 电压为1020kV， 静电纺丝时间为1020h。 9.一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜， 其特征在于： 通过权利要求18任一项所述的 方法制备得到。 10.权利要求9所述的一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜在活性多肽药物缓释中的应 用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108096225 A 2 一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于药物缓释材料领域， 具体涉及一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜及其 制备方法和应用。 背景技术 0002 随着生物化学与生物技术的发展， 大量具有较强生物学活性的蛋白及多肽类药物 不断。

8、涌现。 这类药物具有活性高、 用量少、 不良反应小等优点， 但这类药物也存在着相对分 子质量大、 多数为水溶性、 半衰期短、 膜透过性差、 易降解不稳定、 对制剂处方工艺要求高等 缺点， 极大的限制其在临床中的应用。 因此， 研制开发蛋白质及多肽类药物新剂型和制剂新 技术以提高药物的稳定性、 延长其半衰期、 增加它的膜通透性， 使其更好地应用于疾病的预 防和治疗， 已成为现代药剂学的热点之一。 0003 降钙素作为一种由32个氨基酸组成的活性多肽， 它具有维持血钙平衡、 抑制破骨 细胞活性等功效， 因而能有效地降低血钙、 促进骨骼对钙的吸收， 其在临床上被广泛用于治 疗和预防骨质疏松、 骨折、。

9、 变形性骨炎、 高血钙等多种疾病。 相比于其他类降钙素， 鲑鱼降钙 素(salmon calcitonin， sCT)以其比活性高(约是人降钙素的30倍)、 作用时间长(半衰期是 人降钙素的36倍)、 稳定性好， 副作用小等优势而被广泛应用于临床。 目前临床上使用的 降钙素制剂多为注射剂和喷雾剂。 然而由于频繁注射会引发病人的不顺从性， 相比之下， 鼻 腔给药更为方便和易于被患者所接受。 然而， 鲑鱼降钙素水溶液鼻腔给药后生物利用度较 低， 比如上市的密钙息喷雾剂的生物利用度仅为3， 因此其临床应用受到一定的限制。 因 此迫切需要研制开发一种新的降钙素给药体系来提高其生物利用度。 0004 小。

10、肠是营养物质消化吸收的主要场所， 但对于多肽而言， 由于胃和小肠中存在大 量蛋白酶， 易使其水解失活， 导致生物利用度低。 近年来， 随着肠道菌群的发现及其重要功 能的明确， 结肠营养得到了空前重视与关注。 和小肠相比， 结肠中蛋白酶水平和活力很低； 结肠壁蠕动缓慢， 食物在结肠中运转时间较长， 结肠上皮对大分子物质的穿透阻力较小肠 上皮小， 因而更容易吸收， 经结肠吸收还可避免肝脏的首过效应， 提高大分子活性物质的生 物利用度； 另外， 结肠存在大量的有益菌群， 能够促进营养物质的吸收利用。 因此， 利用口服 结肠靶向给药体系运输多肽， 提高其稳定性和生物利用度受到了广泛关注。 结肠靶向运输。

11、 体系是基于结肠的结构与生理特点设计与构建的， 可分为pH敏感型、 时间依赖型、 菌群/酶 触发型、 压力控制型等。 其中， 菌群/酶触发型是将结肠菌群作为一种理想的触发物来构建 结肠靶向运输体系。 它以非淀粉多糖或抗性淀粉作为活性物质的运输载体， 载体在胃和小 肠中因缺乏相应的酶而不被降解， 到达结肠后， 能被结肠菌群所感应而激活相关酶系、 降解 载体材料， 从而实现活性物质在结肠部位的靶向释放。 菌群/酶触发型结肠靶向运输体系不 仅靶向性高， 而且不受内外微环境变化干扰， 因此极具开发潜力。 0005 近年来， 降钙素以其独特的生物学功能成为国内外医药领域的研究热点， 而其中 如何保证降钙。

12、素稳定性、 提高其生物利用度成为降钙素研究的两个关键性问题。 目前， 提高 蛋白或多肽口服生物利用度的方法包括使用酶抑制剂、 应用吸收促进剂、 采用新型给药载 说 明 书 1/6 页 3 CN 108096225 A 3 体与传递系统， 如脂质体、 纳米粒、 微粒等。 脂质体作为一种药物载体， 其具有靶向性、 缓释 性等优点、 载药脂质体可以提高药物的稳定性、 降低药物的毒性， 从而提高药物的生物利用 度。 但是脂质体的稳定性较差， 因此需要通过其他方法来提高脂质体的稳定性。 静电纺丝是 目前能够直接连续制备纳米纤维简单有效且操作方式温和的方法。 所得的纤维直径在50nm 1000nm之间， 。

13、比常规方法得到的纤维直径小， 具有超高的特异性、 比表面积和孔隙率。 随 着许多传统的药物载体材料(合成的或天然的生物可降解材料)通过静电纺丝得到了纳米 纤维， 促进了电纺纳米纤维在药物缓释领域的发展。 纳米纤维作为药物载体时， 能够缩短药 物的扩散距离、 促进药物溶解和提高药效， 且能够实现药物的定向输送， 减少服药次数， 减 轻患者痛苦。 因此具有良好生物相容性的聚合物形成的电纺纤维膜在药物控释领域具有极 高的应用价值。 发明内容 0006 针对以上现有技术存在的缺点和不足之处， 本发明的首要目的在于提供一种含降 钙素脂质体的纳米纤维膜的制备方法。 0007 本发明的另一目的在于提供一种通。

14、过上述方法制备得到的含降钙素脂质体的纳 米纤维膜。 0008 本发明的再一目的在于提供上述含降钙素脂质体的纳米纤维膜在药物缓释材料 中的应用。 0009 本发明目的通过以下技术方案实现： 0010 一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜的制备方法， 包括如下制备步骤： 0011 (1)将大豆卵磷脂和胆固醇加入到有机溶剂中， 置于旋转蒸发器中旋转蒸发直至 完全除去有机溶剂， 在器壁上形成均匀类脂薄膜， 然后加入降钙素磷酸盐缓冲溶液使类脂 薄膜混合分散均匀， 得到混悬液， 将所得混悬液依次经水浴孵育、 超声处理和微孔膜过滤， 得到载降钙素纳米脂质体， 再将所得载降钙素纳米脂质体加入到果胶溶液中， 搅拌混合。

15、均 匀， 得到载降钙素果胶包覆脂质体； 0012 (2)将聚乙烯醇水溶液与海藻酸钠水溶液搅拌混合均匀， 然后加入步骤(1)所得载 降钙素果胶包覆脂质体， 搅拌混合均匀， 得到静电纺丝溶液； 将所得静电纺丝溶液通过静电 纺丝制备成膜， 得到所述含降钙素脂质体的纳米纤维膜。 0013 优选地， 步骤(1)中所述的有机溶剂是指体积比为8:1的乙醚:甲醇的混合溶剂。 0014 优选地， 所述降钙素是指鲑鱼降钙素。 0015 优选地， 步骤(1)中所述大豆卵磷脂与胆固醇加入量的质量比为2:17:1， 所述类 酯薄膜与加入的降钙素磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为20:145:1(mg/mL)。 0016 优选。

16、地， 步骤(1)中所述水浴孵育是指置于10水浴孵育1h， 所述超声处理的时间 为3min， 所述微孔膜过滤是指采用0.22 m孔径的微孔膜过滤。 0017 优选地， 步骤(1)中所述果胶溶液的浓度为16g/L。 0018 优选地， 步骤(1)中所述载降钙素纳米脂质体与果胶溶液混合的体积比为1:1。 0019 优选地， 步骤(2)中所述聚乙烯醇的平均分子量为180000200000， 所述聚乙烯醇 水溶液的质量分数为10。 0020 优选地， 步骤(2)中所述海藻酸钠水溶液的质量分数为13。 说 明 书 2/6 页 4 CN 108096225 A 4 0021 优选地， 步骤(2)中所述静电纺。

17、丝溶液中载降钙素果胶包覆脂质体的质量分数为 3050。 0022 优选地， 步骤(2)中所述静电纺丝的条件为： 针头直径为0.60.8mm， 溶液流速为 0.11.0mL/h， 针头到接收板的距离为1025cm， 电压为1020kV， 静电纺丝时间为10 20h。 0023 一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜， 通过上述方法制备得到。 0024 上述含降钙素脂质体的纳米纤维膜在活性多肽药物缓释中的应用。 0025 本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果： 0026 (1)本发明通过添加载降钙素脂质体， 可以提高降钙素的生物利用度和稳定性。 0027 (2)载降钙素果胶包覆脂质体相于没。

18、有果胶包覆的载降钙素纳米脂质体具有更大 的粒径、 更低的Zeta电位以及相近的包封率， 因此具有更优异的稳定性。 0028 (3)本发明利用静电纺丝技术制备含降钙素脂质体的纳米纤维膜， 用于降钙素的 结肠靶向释放， 该靶向体系可以提高降钙素的稳定性， 实现降钙素的结肠靶向释放， 进而提 高降钙素的生物利用度， 为降钙素口服新剂型的开发提供新的思路， 拓展了静电纺丝技术 在药物缓释领域的应用空间。 附图说明 0029 图1为实施例1步骤(1)所得载降钙素果胶包覆脂质体(a)与未加入果胶包覆的载 降钙素纳米脂质体(b)的TEM图。 0030 图2为实施例1最终所得含降钙素脂质体的纳米纤维膜的SEM。

19、图(左)及纤维直径分 布图(右)。 0031 图3为实施例2最终所得含降钙素脂质体的纳米纤维膜的SEM图(左)及纤维直径分 布图(右)。 0032 图4为实施例3最终所得含降钙素脂质体的纳米纤维膜的SEM图(左)及纤维直径分 布图(右)。 0033 图5为本发明所得纳米纤维膜(Q2)与未加入果胶包覆的载降钙素纳米脂质体所制 备的纳米纤维膜(Q1)作为对比， 在体外模拟胃液、 小肠液和结肠液中的连续释放曲线图。 0034 图6为本发明所得纳米纤维膜在不同模拟液中(模拟胃液、 模拟小肠液和模拟结肠 液)的释放曲线图。 具体实施方式 0035 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发。

20、明的实施方式不限 于此。 0036 实施例1 0037 本实施例的一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜的制备方法， 具体步骤如下： 0038 (1)称取大豆卵磷脂150mg， 胆固醇25mg， 加入到乙醚-甲醇(8:1,v/v)混合溶剂中， 于35恒温水浴中旋转蒸发直至完全除去有机溶剂， 直至在茄形瓶壁上形成均匀类脂薄 膜。 然后向所得类脂薄膜中加入鲑鱼降钙素磷酸盐缓冲溶液4ml， 在70恒温水浴中浸浴 10s， 涡旋洗脱， 重复3次， 得到混悬液。 将所得混悬液置于10水浴孵育1h， 然后冰水浴条件 说 明 书 3/6 页 5 CN 108096225 A 5 下探头超声3min(超声功率200W。

21、， 超声3s， 停3s)， 过0.22 m微孔滤膜， 即得载降钙素纳米脂 质体。 将所得载降钙素纳米脂质体缓慢滴入浓度为4g/L的果胶溶液中(体积比为1:1)， 室温 下磁力搅拌2h， 即得载降钙素果胶包覆脂质体。 0039 (2)取8g质量分数为10的聚乙烯醇水溶液与2g质量分数为1的海藻酸钠水溶 液， 室温下搅拌至完全混合， 然后加入8mL步骤(1)的载降钙素果胶包覆脂质体， 室温搅拌 0.5h， 得到静电纺丝溶液。 将得静电纺丝溶液吸入5mL的注射器中， 采用0.6mm的针头， 调整 针头到接收器的距离为15cm， 调节电压为20kV， 流速为0.4mL/h， 温度为25， 湿度为40，。

22、 纺丝20h， 得到含降钙素脂质体的纳米纤维膜。 0040 本实施例步骤(1)所得载降钙素果胶包覆脂质体(a)与未加入果胶包覆的载降钙 素纳米脂质体(b)的TEM图如图1所示。 其粒径、 Zeta电位和包封率结果如表1所示。 0041 表1 0042 0043 表1中的粒径是采用马尔文激光纳米粒度仪来测定， 其检测原理如下： 采用动态光 散射原理和光子相关光谱技术， 根据颗粒在液体中的布朗运动的速度测定颗粒大小； 小颗 粒布朗运动速度快， 大颗粒布朗运动速度慢， 激光照射这些颗粒， 不同大小的颗粒将使散射 光发生快慢不同的涨落起伏； 光子相关光谱法就根据特定方向的光子涨落起伏分析其颗粒 大小。。

23、 从表1中的结果可以看出， 本发明制备的载降钙素果胶包覆脂质体相比载降钙素纳米 脂质体具有更大的粒径(图1中a、 b中的粒子直径分别大约为40nm和20nm)、 更低的Zeta电位 以及相近的包封率， 从Zeta电位的对比中可以看出， 本发明制备的载降钙素果胶包覆脂质 体相比载降钙素纳米脂质体具有更优异的稳定性。 0044 本实施例最终所得含降钙素脂质体的纳米纤维膜的SEM图及纤维直径分布如图2 所示。 0045 实施例2 0046 本实施例的一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜的制备方法， 与实施例1相比， 不同 之处在于海藻酸钠水溶液的质量分数为2， 其余步骤及参数完全相同。 0047 本实施例。

24、最终所得含降钙素脂质体的纳米纤维膜的SEM图及纤维直径分布如图3 所示。 0048 实施例3 0049 本实施例的一种含降钙素脂质体的纳米纤维膜的制备方法， 与实施例1相比， 不同 之处在于海藻酸钠水溶液的质量分数为3， 其余步骤及参数完全相同。 0050 本实施例最终所得含降钙素脂质体的纳米纤维膜的SEM图及纤维直径分布如图4 所示。 0051 一、 对发明所得含降钙素脂质体的纳米纤维膜在体外模拟胃肠道环境下释放率的 考察， 具体实施步骤如下： 说 明 书 4/6 页 6 CN 108096225 A 6 0052 参考中国药典2010版二部附录体外释放度测定法第二法(浆法)并做适当修改， 。

25、具 体条件为： 温度370.5， 释放介质为模拟人工胃液， 模拟人工小肠液和模拟人工结肠液。 取实施例1最终所得纳米纤维膜先置于模拟胃液2h， 然后转移至模拟小肠液4h， 最后转移到 模拟结肠液16h， 于设定时间取样， 取出样品用0.45 m微孔滤膜过滤， 采用液相色谱法测定 降钙素浓度， 计算溶出率。 0053 部分溶液的配置如下： 0054 人工胃液： 配置pH 1.2的盐酸溶液， 加入10mg/ml胃蛋白酶即得。 0055 人工小肠液： 配置pH6.8的磷酸缓冲液， 然后加入10mg/ml胰蛋白酶即得。 0056 人工结肠液： 配置pH7.4的磷酸缓冲液， 然后加入5U/ml果胶酶即得。

26、。 0057 参考药典规定的释放度模拟试验， 模拟胃、 小肠及结肠部位的环境， 并根据实物在 各段胃肠道内的转运时间， 研究蛋白质的释放。 结果如图5中Q2所示。 由图可见， 载药纳米纤 维膜在模拟胃液中释放较快， 主要是因为纤维表面部分载药脂质体在低pH条件下被破坏， 导致部分降钙素得到释放， 同时纤维表面的部分游离降钙素也会释放到体系中； 在模拟小 肠液中， 由于纤维膜的吸水溶胀， 导致部分降钙素从膜骨架中释放出来， 但由于果胶的保护 作用， 阻止了部分降钙素的释放； 在模拟结肠液中， 由于纤维膜的进一步溶胀、 裂解， 以及果 胶在果胶酶作用下被降解， 导致Q2的释放速率加快， 最终Q2在。

27、模拟结肠液中16h的释放量大 约为49.6。 以未加入果胶包覆的载降钙素纳米脂质体所制备的纳米纤维膜作为对比， 以 同样的方法在体外模拟胃肠道环境下释放率， 结果如图5中Q1所示。 通过和Q2进行对比， 结果 表明Q1中的降钙素在模拟胃液和模拟小肠液中释放速率明显大于Q2； 然而在模拟结肠液中， Q1中降钙素的释放速率及释放量明显低于Q2。 由此可见： 本发明所得含降钙素脂质体的纳米 纤维膜具有更优异的结肠靶向释放效果。 0058 二、 对发明所得含降钙素脂质体的纳米纤维膜在体外模拟胃肠道环境下释放机制 的研究， 具体实施步骤如下： 0059 取实施例1最终所得纳米纤维膜分别置于模拟胃液9h，。

28、 模拟小肠液9h， 模拟结肠液 16h， 其在不同模拟液中的释放曲线图如图6所示。 0060 采用一级动力学模型， Higuchi模型， Weibull模型和Ritger-pepper模型对纳米纤 维膜在不同模拟液中的累积释放率进行拟合， 进而确定其释放机制。 结果表明降钙素在模 拟胃液和模拟小肠液中的释放最符合Fickian扩散机制， 而在模拟结肠液中的释放最符合 case II释放机制， 因此降钙素在模拟结肠液中的释放行为较复杂， 包括扩散、 溶胀和侵蚀 等行为。 0061 三、 对发明所得含降钙素脂质体的纳米纤维膜中降钙素的活性研究， 具体实施步 骤如下： 0062 取实施例1最终所得纳。

29、米纤维膜置于模拟结肠液中23h进行体外释放实验， 然后取 少量释放液分别用反相高效液相色谱法在210nm波长下测定峰面积， 计算样品浓度。 用鲑鱼 降钙素ELISA检测试剂盒在450nm波长下测定吸光值， 计算样品浓度。 两种方法所得释放液 中降钙素浓度分别为100.24.0 g/mL和97.01.5 g/mL， 因此， 含降钙素脂质体的纳米纤 维膜中的降钙素在释放后其活性基本未发生改变。 0063 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 说 明 书 5/6 页 7 CN 108096225 A 7 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 6/6 页 8 CN 108096225 A 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 9 CN 108096225 A 9 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 10 CN 108096225 A 10 图5 图6 说 明 书 附 图 3/3 页 11 CN 108096225 A 11 。